CN118480480A - 一种辣椒黄萎病病原菌分离纯化及室内抗性鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种辣椒黄萎病病原菌分离纯化及室内抗性鉴定方法，包括病株采集、培养基制备、病原菌分离与纯化、菌株基因DNA提取、原菌分子生物学鉴定、病原菌回接及病原菌确定等步骤。本发明结合物理培养分离、形态学鉴定及分子生物学鉴定，实现对尖孢镰刀菌和大丽轮枝菌的分离鉴定、接种以及病情调查，实现对植株黄化萎蔫的病原菌进行分离与系统鉴定，为进一步开展辣椒抗病育种提供较为准确的参考；本发明首次利用宏观变温调控方法，通过低温‑常温交替抑制大丽轮枝菌的生殖生长，逐步分离出尖孢镰刀菌和大丽轮枝菌，避免DNA测试取菌时因病原菌形态学分离不清楚而造成取菌失败，规避发病症状易混淆的辣椒黄萎病与辣椒枯萎病的误判。
Description
技术领域
本发明涉及辣椒黄萎病室内抗性鉴定技术领域，尤其涉及一种辣椒黄萎病病原菌分离纯化及室内抗性鉴定方法。
背景技术
辣椒黄萎病(Pepper Verticillium Wilt，PVW)一般由大丽轮枝菌(Verticiliumdahliae)引起，在内蒙古巴彦淖尔市首次发现。
辣椒黄萎病是土传维管束病害，土壤中微菌核萌发后，菌丝体侵染幼苗根系并进入根系维管束组织，随着水分和养分的运输，逐渐对地上部造成侵染；植株多在坐果中后期显症，辣椒植株矮小，叶片边缘干枯上卷，叶脉间叶肉褪绿，部分植株呈现“半边疯”症状，其中一侧叶片全部脱落；剖开茎基部，木质部维管束变褐严重，但不腐烂。部分发病植株根系变黑，根系活力降低。
由于辣椒黄萎病的症状与辣椒枯萎病易混淆，且黄萎病扩展较慢，一般多造成病株矮化、节间缩短、生长停滞，造成不同程度的减产。为避免错认病症而导致应对方法的不对症，需要将黄萎病与枯萎病进行分离检测。
从病原看，黄萎病的致病菌为大丽轮枝菌，而枯萎病的致病菌为尖孢镰刀菌；但传统的病原学检测方法是通过显微镜观察病原菌形态特征以确定病害的类型。而真菌子实体形态特征容易受到培养条件和其他因素的影响，大丽轮枝菌和尖孢镰刀菌难以得到完全鉴定分离。
近年来，利用PCR扩增病原真菌ITS基因区段进行病原菌鉴定、检测及病害诊断技术得到了广泛应用，一些研究以传统形态学特征为基础，结合分子生物学手段对引起植株黄化萎蔫的病原菌进行分离与系统鉴定，旨在为进一步开展辣椒抗病育种提供参考。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种辣椒黄萎病病原菌分离纯化及室内抗性鉴定方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种辣椒黄萎病病原菌分离纯化及室内抗性鉴定方法，包括以下步骤：
S1，病株采集：
选取发病植株的病根、茎部用无菌水冲洗干净，作为分离标本；
S2，培养基制备：
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato D-glucose Agar，PDA）：即PDA培养基，马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂14 g，水1000 mL，高压湿热灭菌121℃、25 min备用；
水琼脂培养基（water agar，WA）：即WA培养基，琼脂15 g、蒸馏水1 L，高压湿热灭菌121℃、25 min备用；
麦麸培养基：在麦麸中加入适量的水，使其刚好成团，装入罐头瓶（容积为250mL），高压湿热灭菌121℃、45 min，冷却到室温备用；
查比克培养基（Czapek，CDB）：即CDB培养基，2 g NaNO3、1 g K2HPO4、0.5 g KCl、0.5 g MgSO4·7H2O、0.01 g FeSO4、30 g蔗糖，蒸馏水定容至1000 mL，121℃高温灭菌30min；
S3，病原菌分离与纯化：
通过手术刀将分离标本刨削成厚度≤1mm的薄片，再纵横切成0.5cm×0.3cm大小的矩形薄片，经75％酒精处理2s，再用0.1%升汞处理2-3min，取出用无菌水清洗3遍，置于PDA培养基上通过变温培养5-7d，并经过病原菌形态学鉴定，得到菌株FW001和菌株VW002；
S4，菌株基因DNA提取：
菌株VW002和菌株FW001的DNA提取如下：取0.1g菌株FW001或菌株VW002的菌丝体用液氮研磨成粉状，加入600μL的CTAB提取缓冲液，转人2.0mL离心管中，迅速混匀后65℃水浴1h；加入等体积氯仿-异戊醇，混匀后10000r/min离心10min；在离心液中加入等体积氯仿-异戊醇，混匀后10000r/min离心10min；加入等体积异丙醇，混匀后-20℃静置，沉淀30-60min；10000r/min离心10min弃上清，用75%乙醇洗涤2次，风干沉淀后，加入40-80μL超纯水溶解DNA，-20℃保存备用；
S5，病原菌分子生物学鉴定：
通过引物ITS1（5ʹ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ʹ）/ITS4（5ʹ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3ʹ）对菌株FWO07进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，获得1条600bp左右的清晰条带，经测序得到了长度为532bp的序列，在GenBank核酸序列数据库中进行BLAST搜索发现，该序列与镰孢菌属的ITS序列具有同源性，即菌株FW001与尖孢镰刀菌的菌株一致性高达99%；
通过引物ITS1（5ʹ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ʹ）/ITS4（5ʹ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3ʹ）对菌株VW002进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，获得1条650-700bp左右的清晰条带，经测序得到了长度为582bp的序列，在GenBank核酸序列数据库中进行BLAST搜索发现，该序列与大丽轮枝菌的ITS序列具有同源性，断定与大丽轮枝菌的菌株一致性高达99%；
S6，病原菌回接：
将分离到的菌株FWO07接种到PDA培养基中在25℃恒温条件下培养2d后，制成分子孢子液，以灌根接种形式接种到健康植株上以确认主要致病菌；将分离到的菌株VW002接种到PDA培养基中在28℃恒温条件下培养3d后，以灌根和伤口接种形式接种到健康植株上以确认主要致病菌；
S7，病原菌确定：
将S6回接后植株状态与S1选取的发病植株状态进行对比，收集病态状态对比，最终确定致病菌，并进行抗病性评价。
优选地，所述病原菌形态学鉴定的过程如下：
病原菌孢子悬浮液5μL轻轻滴于PDA平板中央，25℃恒温黑暗培养15d后，观察分离物在培养基上的菌落形状、颜色、菌丝致密度以及是否产生黑色微菌核等。发现病原菌生长速度较慢，菌落初期正面呈白色，背面黑灰色，后期由于产生大量微菌核，菌落正面变黑，菌落背面未见皱折或角变。同时，用接种针分别在菌落边缘和中央挑取少量菌丝和黑色微菌核，分别置于含有少许无菌水的载玻片上，加盖玻片后并轻轻按压制成临时玻片，然后在BX51显微镜下观察病原菌的分生孢子梗、分生孢子和微菌核形态。
优选地，所述变温培养过程如下：①将培养箱温度控制为25℃和-15℃交替，25℃控制45min，-15℃控制15min，3d后培养基长出少量纯白色点状菌落；②将培养箱温度控制为25℃恒温，2.5-3d后长出椭圆形菌落，菌落直径在30-40mm之间，菌落气生菌丝茂盛，呈白色絮状，小型分生孢子团生，卵圆形至椭圆形，大小为(4.0-12.8）μm×（2.0-3.8）μm，大型分生孢子呈镰刀形，2-5分隔，两端细胞尖或稍弯，大小为（17.6-48.3）μm×(1.4-2.5)μm，分离出菌株FW001，分离的病菌为尖孢镰刀菌；③将培养箱温度控制为25℃和35℃交替，25℃控制45min，35℃控制15min，2d后长出圆形菌落，菌落直径在27~40mm之间，开始菌落为白色，1d后菌落中间逐渐变为黑褐色，周围一圈仍为白色，1d后全转变成黑色，呈同心轮纹状，分生孢子呈椭圆形，大小为（2.3-7.2)μm×（1.9-3.6）μm，分生孢子梗直立，轮枝状分支，分离出菌株VW002，鉴定为大丽轮枝菌。
更进一步地，所述菌株FW001在椭圆形菌落边界处通过毛细管蘸取单孢分离纯培养物，所述菌株VW002在圆形菌落边界处通过毛细管蘸取单孢分离纯培养物。
更进一步地，所述重复步骤①-③3次，纯化培养后采用试管斜面4℃冷冻保存，得到菌株FW001和菌株VW002的纯化物。
更进一步地，所述菌株FW001和菌株VW002的病原鉴定依据Booth鉴定方法：将单孢分离纯培养物，接在PDA培养基上，25℃培养4d，测定单孢菌落的生长速度，取培养15d的菌丝体进行孢子形态及产孢细胞观察，测量各类型分生孢子长度与宽度。
优选地，所述S5中，PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测过程具体如下：
1）取孢子悬浮液5 μL轻轻滴于PDA平板中央，25℃恒温黑暗培养15 d后收集菌丝，按照真菌DNA提取试剂盒说明书提取病原菌基因组的DNA，并利用超微量分光光度计测定菌株基因组的DNA 质量和浓度，当 OD260 nm/OD280 nm比值在 1.7~1.9之间视为合格；
2）将菌株基因组 DNA 浓度稀释至50 ng/μL 作为模板，50 μL 反应体系：2×TaqPCR Master Mix 25 μL、5 μmol/L 引物 ITS1/ITS4 混合物2 μL、50 ng/μL DNA 模板 2 μL、ddH2O 21 μL；
反应程序：94℃预变性 5 min；94℃变性 40 s，55℃退火40 s，72℃延伸40 s，35个循环；72℃再延伸10 min。利用PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化后，取 5 μL PCR产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，筛选阳性克隆送北京厚生博泰科技有限公司测序，将测序结果在 NCBI 网站进行比对，根据比对结果确定病原菌的种类；
3）利用PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化后，取 5 μL PCR 产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，筛选阳性克隆送北京厚生博泰科技有限公司测序，将测序结果在 NCBI网站进行比对，根据比对结果确定病原菌的种类。
优选地，所述S6包括以下过程：
1）分子孢子液的制备：
取甘油中保存的菌株FW001或菌株VW002于PDA培养基中活化培养1~2次后，用灭菌的手术刀将表面长满大丽轮枝菌或尖孢镰刀菌的PDA培养基切成碎块，置于CDB培养基中，黑暗条件下，25℃、220 r·min-1震荡培养2~3 d后，取分生孢子液5~10 mL接种到灭菌的麦麸培养基中进行促孢培养；3~5 d后待菌丝长满瓶后用无菌水冲洗麦麸，双层纱布过滤，调整分生孢子液浓度为1×107个·mL-1备用。
2）抗性鉴定辣椒材料准备：
对照品种选择：感病对照品种：‘北星一号’，内蒙古自治区农业科学院蔬菜花卉研究所提供；
抗病对照品种：‘PBC932’，亚洲蔬菜中心提供，采用50孔育苗穴盘进行育苗，幼苗长至6-8片真叶时进行移栽，移栽至大小为15*15cm的苗钵中；
3）接种方法：
分生孢子液浓度1×107个/mL，将鉴定材料辣椒幼苗移栽至新的苗钵中，苗钵大小15×15 cm，移栽后沿茎基部浇灌制备好的分生孢子液25 mL，再浇水50 mL，每个鉴定材料接种10株，重复3次，对照植株10株，接种后辣椒幼苗于室内缓苗2 d后，置于日光温室中培养，接种后30 d统计发病情况。
进一步地，所述1）中所用PDA培养基和CDB培养基均需加入卡那霉素50 mg·L-1。
优选地，所述S7包括以下统计计算过程：
根据辣椒黄萎病发病程度分级标准（表1），记录接种辣椒植株黄萎病发病情况，计算病情指数，病情指数（DI）=∑(各级病株数×该病级代表数值)／(调查病株总数×调查最高级值)×100。测量植株株高和株展，计算萎缩程度，萎缩率（%）=[1-（每一株病原菌处理植株的株展-1）/（对照植株平均株展-5）]×100。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明结合物理培养分离、形态学鉴定及分子生物学鉴定，实现对尖孢镰刀菌和大丽轮枝菌的分离鉴定、接种以及病情调查，从而实现对植株黄化萎蔫的病原菌进行分离与系统鉴定，为进一步开展辣椒抗病育种提供较为准确的参考。
2.本发明首次利用变温的物理宏观方法，即通过低温-常温交替抑制大丽轮枝菌的生殖生长，逐步分离出尖孢镰刀菌和大丽轮枝菌，避免现有DNA测试取菌时因病原菌形态学分离不清楚而造成取菌失败，也规避了发病症状易混淆的辣椒黄萎病与辣椒枯萎病的误判。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：
一种辣椒黄萎病病原菌分离纯化及室内抗性鉴定方法，包括以下步骤：
S1，病株采集：
选取发病植株的病根、茎部用无菌水冲洗干净，作为分离标本；
S2，培养基制备：
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato D-glucose Agar，PDA）：即PDA培养基，马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂14 g，水1000 mL，高压湿热灭菌121℃、25 min备用；
水琼脂培养基（water agar，WA）：即WA培养基，琼脂15 g、蒸馏水1 L，高压湿热灭菌121℃、25 min备用；
麦麸培养基：在麦麸中加入适量的水，使其刚好成团，装入罐头瓶（容积为250mL），高压湿热灭菌121℃、45 min，冷却到室温备用；
查比克培养基（Czapek，CDB）：即CDB培养基，2 g NaNO3、1 g K2HPO4、0.5 g KCl、0.5 g MgSO4·7H2O、0.01 g FeSO4、30 g蔗糖，蒸馏水定容至1000 mL，121℃高温灭菌30min；
S3，病原菌分离与纯化：
通过手术刀将分离标本刨削成厚度≤1mm的薄片，再纵横切成0.5cm×0.3cm大小的矩形薄片，经75％酒精处理2s，再用0.1%升汞处理2-3min，取出用无菌水清洗3遍，置于PDA培养基上通过培养5-7d，并经过病原菌形态学鉴定，得到菌株FW001和菌株VW002；
S4，菌株基因DNA提取：
菌株VW002和菌株FW001的DNA提取如下：取0.1g菌株FW001或菌株VW002的菌丝体用液氮研磨成粉状，加入600μL的CTAB提取缓冲液，转人2.0mL离心管中，迅速混匀后65℃水浴1h；加入等体积氯仿-异戊醇，混匀后10000r/min离心10min；在离心液中加入等体积氯仿-异戊醇，混匀后10000r/min离心10min；加入等体积异丙醇，混匀后-20℃静置，沉淀30-60min；10000r/min离心10min弃上清，用75%乙醇洗涤2次，风干沉淀后，加入40-80μL超纯水溶解DNA，-20℃保存备用；
S5，病原菌分子生物学鉴定：
通过引物ITS1（5ʹ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ʹ）/ITS4（5ʹ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3ʹ）对菌株FWO07进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，获得1条600bp左右的清晰条带，经测序得到了长度为532bp的序列，在GenBank核酸序列数据库中进行BLAST搜索发现，该序列与镰孢菌属的ITS序列具有同源性，即菌株FW001与尖孢镰刀菌的菌株一致性高达99%；
通过引物ITS1（5ʹ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ʹ）/ITS4（5ʹ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3ʹ）对菌株VW002进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，获得1条650-700bp左右的清晰条带，经测序得到了长度为582bp的序列，在GenBank核酸序列数据库中进行BLAST搜索发现，该序列与大丽轮枝菌的ITS序列具有同源性，断定与大丽轮枝菌的菌株一致性高达99%；
S6，病原菌回接：
将分离到的菌株FWO07接种到PDA培养基中在25℃恒温条件下培养2d后，制成分子孢子液，以灌根接种形式接种到健康植株上以确认主要致病菌；将分离到的菌株VW002接种到PDA培养基中在28℃恒温条件下培养3d后，以灌根和伤口接种形式接种到健康植株上以确认主要致病菌；
S7，病原菌确定：
将S6回接后植株状态与S1选取的发病植株状态进行对比，收集病态状态对比，最终确定致病菌，并进行抗病性评价。
其中，所述病原菌形态学鉴定的过程如下：
病原菌孢子悬浮液5μL轻轻滴于PDA平板中央，25℃恒温黑暗培养15d后，观察分离物在培养基上的菌落形状、颜色、菌丝致密度以及是否产生黑色微菌核等。发现病原菌生长速度较慢，菌落初期正面呈白色，背面黑灰色，后期由于产生大量微菌核，菌落正面变黑，菌落背面未见皱折或角变。同时，用接种针分别在菌落边缘和中央挑取少量菌丝和黑色微菌核，分别置于含有少许无菌水的载玻片上，加盖玻片后并轻轻按压制成临时玻片，然后在BX51显微镜下观察病原菌的分生孢子梗、分生孢子和微菌核形态。
其中，所述S5中，PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测过程具体如下：
1）取孢子悬浮液5 μL轻轻滴于PDA平板中央，25℃恒温黑暗培养15 d后收集菌丝，按照真菌DNA提取试剂盒说明书提取病原菌基因组的DNA，并利用超微量分光光度计测定菌株基因组的DNA 质量和浓度，当 OD260 nm/OD280 nm比值在 1.7~1.9之间视为合格；
2）将菌株基因组 DNA 浓度稀释至50 ng/μL 作为模板，50 μL 反应体系：2×TaqPCR Master Mix 25 μL、5 μmol/L 引物 ITS1/ITS4 混合物2 μL、50 ng/μL DNA 模板 2 μL、ddH2O 21 μL；
反应程序：94℃预变性 5 min；94℃变性 40 s，55℃退火40 s，72℃延伸40 s，35个循环；72℃再延伸10 min。利用PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化后，取 5 μL PCR产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，筛选阳性克隆送北京厚生博泰科技有限公司测序，将测序结果在 NCBI 网站进行比对，根据比对结果确定病原菌的种类；
3）利用PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化后，取 5 μL PCR 产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，筛选阳性克隆送北京厚生博泰科技有限公司测序，将测序结果在 NCBI网站进行比对，根据比对结果确定病原菌的种类。
其中，所述S6包括以下过程：
1）分子孢子液的制备：
取甘油中保存的菌株FW001或菌株VW002于PDA培养基中活化培养1~2次后，用灭菌的手术刀将表面长满大丽轮枝菌或尖孢镰刀菌的PDA培养基切成碎块，置于CDB培养基中，黑暗条件下，25℃、220 r·min-1震荡培养2~3 d后，取分生孢子液5~10 mL接种到灭菌的麦麸培养基中进行促孢培养；3~5 d后待菌丝长满瓶后用无菌水冲洗麦麸，双层纱布过滤，调整分生孢子液浓度为1×107个·mL-1备用。
2）抗性鉴定辣椒材料准备：
对照品种选择：感病对照品种：‘北星一号’，内蒙古自治区农业科学院蔬菜花卉研究所提供；
抗病对照品种：‘PBC932’，亚洲蔬菜中心提供，采用50孔育苗穴盘进行育苗，幼苗长至6-8片真叶时进行移栽，移栽至大小为15*15cm的苗钵中；
3）接种方法：
分生孢子液浓度1×107个/mL，将鉴定材料辣椒幼苗移栽至新的苗钵中，苗钵大小15×15 cm，移栽后沿茎基部浇灌制备好的分生孢子液25 mL，再浇水50 mL，每个鉴定材料接种10株，重复3次，对照植株10株，接种后辣椒幼苗于室内缓苗2 d后，置于日光温室中培养，接种后30 d统计发病情况。
其中，所述1）中所用PDA培养基和CDB培养基均需加入卡那霉素50 mg·L-1。
实施例2：
在实施例1的基础上，将实施例1之S3中的培养改为变温培养，具体过程如下：
①将培养箱温度控制为25℃和-15℃交替，25℃控制45min，-15℃控制15min，3d后培养基长出少量纯白色点状菌落；②将培养箱温度控制为25℃恒温，2.5-3d后长出椭圆形菌落，菌落直径在30-40mm之间，菌落气生菌丝茂盛，呈白色絮状，小型分生孢子团生，卵圆形至椭圆形，大小为(4.0-12.8）μm×（2.0-3.8）μm，大型分生孢子呈镰刀形，2-5分隔，两端细胞尖或稍弯，大小为（17.6-48.3）μm×(1.4-2.5)μm，分离出菌株FW001，分离的病菌为尖孢镰刀菌；③将培养箱温度控制为25℃和35℃交替，25℃控制45min，35℃控制15min，2d后长出圆形菌落，菌落直径在27~40mm之间，开始菌落为白色，1d后菌落中间逐渐变为黑褐色，周围一圈仍为白色，1d后全转变成黑色，呈同心轮纹状，分生孢子呈椭圆形，大小为（2.3-7.2)μm×（1.9-3.6）μm，分生孢子梗直立，轮枝状分支，分离出菌株VW002，鉴定为大丽轮枝菌。
其中，所述菌株FW001在椭圆形菌落边界处通过毛细管蘸取单孢分离纯培养物，所述菌株VW002在圆形菌落边界处通过毛细管蘸取单孢分离纯培养物。
其中，所述重复步骤①-③3次，纯化培养后采用试管斜面4℃冷冻保存，得到菌株FW001和菌株VW002的纯化物。
其中，所述菌株FW001和菌株VW002的病原鉴定依据Booth鉴定方法：将单孢分离纯培养物，接在PDA培养基上，25℃培养4d，测定单孢菌落的生长速度，取培养15d的菌丝体进行孢子形态及产孢细胞观察，测量各类型分生孢子长度与宽度。
本发明首次利用变温的物理宏观方法，即通过低温-常温交替抑制大丽轮枝菌的生殖生长，逐步分离出尖孢镰刀菌和大丽轮枝菌，避免现有DNA测试取菌时因病原菌形态学分离不清楚而造成取菌失败，也规避了发病症状易混淆的辣椒黄萎病与辣椒枯萎病的误判。
病情调查：
对实施例1和实施例2的接种发病情况进行统计调查，具体过程如下：
根据辣椒黄萎病发病程度分级标准（表1），记录接种辣椒植株黄萎病发病情况，计算病情指数，病情指数（DI）=∑(各级病株数×该病级代表数值)／(调查病株总数×调查最高级值)×100。测量植株株高和株展，计算萎缩程度，萎缩率（%）=[1-（每一株病原菌处理植株的株展-1）/（对照植株平均株展-5）]×100。
表1.辣椒黄萎病发病程度分级标准
| 级别 | 发病程度 | 代表数值 |
| 1 | 健株，植株叶片无褪绿及枯死症状 | 0 |
| 2 | 植株叶片表现褪绿，<25%叶片枯死症状 | 1 |
| 3 | 25～50%叶片表现为叶片边缘干枯上卷，少部分叶片凋落，茎秆维管束不变色 | 2 |
| 4 | 50%以上叶片表现为叶片边缘干枯上卷，大量叶片凋落，茎秆维管束褐化 | 3 |
| 5 | 全株萎蔫枯死 | 4 |
抗病性评价方法：
当感病对照的病情指数DI＞30，抗炭疽病鉴定即为有效。
依据病情指数对不同辣椒品种抗性级别进行划分，划分标准见表2。
表2.辣椒黄萎病抗性分级标准
| 抗病型 | 病情指数 |
| 免疫（I） | 0 |
| 高抗（HR） | 0＜DI≦10 |
| 中抗（MR） | 10＜DI≦20 |
| 中感（MS） | 20＜DI≦35 |
| 高感（HS） | DI＞30 |
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种辣椒黄萎病病原菌分离纯化及室内抗性鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，病株采集：
选取发病植株的病根、茎部用无菌水冲洗干净，作为分离标本；
S2，培养基制备：
马铃薯葡萄糖琼脂培养基：即PDA培养基，马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂14 g，水1000mL，高压湿热灭菌121℃、25 min备用；
水琼脂培养基：即WA培养基，琼脂15 g、蒸馏水1 L，高压湿热灭菌121℃、25 min备用；
麦麸培养基：在麦麸中加入适量的水，使其刚好成团，装入罐头瓶，高压湿热灭菌121℃、45 min，冷却到室温备用；
查比克培养基：即CDB培养基，2 g NaNO3、1 g K2HPO4、0.5 g KCl、0.5 g MgSO4·7H2O、0.01 g FeSO4、30 g蔗糖，蒸馏水定容至1000 mL，121℃高温灭菌30 min；
S3，病原菌分离与纯化：
通过手术刀将分离标本刨削成厚度≤1mm的薄片，再纵横切成0.5cm×0.3cm大小的矩形薄片，经75％酒精处理2s，再用0.1%升汞处理2-3min，取出用无菌水清洗3遍，置于PDA培养基上通过变温培养5-7d，并经过病原菌形态学鉴定，得到菌株FW001和菌株VW002；
所述变温培养过程如下：①将培养箱温度控制为25℃和-15℃交替，25℃控制45min，-15℃控制15min，3d后培养基长出少量纯白色点状菌落；②将培养箱温度控制为25℃恒温，2.5-3d后长出椭圆形菌落，菌落直径在30-40mm之间，菌落气生菌丝茂盛，呈白色絮状，小型分生孢子团生，卵圆形至椭圆形，大小为(4.0-12.8）μm×（2.0-3.8）μm，大型分生孢子呈镰刀形，2-5分隔，两端细胞尖或稍弯，大小为（17.6-48.3）μm×（1.4-2.5）μm，分离出菌株FW001，分离的病菌为尖孢镰刀菌；③将培养箱温度控制为25℃和35℃交替，25℃控制45min，35℃控制15min，2d后长出圆形菌落，菌落直径在27~40mm之间，开始菌落为白色，1d后菌落中间逐渐变为黑褐色，周围一圈仍为白色，1d后全转变成黑色，呈同心轮纹状，分生孢子呈椭圆形，大小为（2.3-7.2)μm×（1.9-3.6）μm，分生孢子梗直立，轮枝状分支，分离出菌株VW002，鉴定为大丽轮枝菌；
S4，菌株基因DNA提取：
菌株VW002和菌株FW001的DNA提取如下：取0.1g菌株FW001或菌株VW002的菌丝体用液氮研磨成粉状，加入600μL的CTAB提取缓冲液，转人2.0mL离心管中，迅速混匀后65℃水浴1h；加入等体积氯仿-异戊醇，混匀后10000r/min离心10min；在离心液中加入等体积氯仿-异戊醇，混匀后10000r/min离心10min；加入等体积异丙醇，混匀后-20℃静置，沉淀30-60min；10000r/min离心10min弃上清，用75%乙醇洗涤2次，风干沉淀后，加入40-80μL超纯水溶解DNA，-20℃保存备用；
S5，病原菌分子生物学鉴定：
通过引物ITS1/ITS4对菌株FWO07进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，获得1条600bp左右的清晰条带，经测序得到了长度为532bp的序列，在GenBank核酸序列数据库中进行BLAST搜索发现，该序列与镰孢菌属的ITS序列具有同源性，即菌株FW001与尖孢镰刀菌的菌株一致性高达99%；
通过引物ITS1/ITS4对菌株VW002进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，获得1条650-700bp左右的清晰条带，经测序得到了长度为582bp的序列，在GenBank核酸序列数据库中进行BLAST搜索发现，该序列与大丽轮枝菌的ITS序列具有同源性，断定与大丽轮枝菌的菌株一致性高达99%；
S6，病原菌回接：
将分离到的菌株FWO07接种到PDA培养基中在25℃恒温条件下培养2d后，制成分子孢子液，以灌根接种形式接种到健康植株上以确认主要致病菌；将分离到的菌株VW002接种到PDA培养基中在28℃恒温条件下培养3d后，以灌根和伤口接种形式接种到健康植株上以确认主要致病菌；
S7，病原菌确定：
将S6回接后植株状态与S1选取的发病植株状态进行对比，收集病态状态对比，最终确定致病菌，并进行抗病性评价。
2.根据权利要求1所述的一种辣椒黄萎病病原菌分离纯化及室内抗性鉴定方法，其特征在于，所述病原菌形态学鉴定的过程如下：
病原菌孢子悬浮液5μL轻轻滴于PDA平板中央，25℃恒温黑暗培养15d后，观察分离物在培养基上的菌落形状、颜色、菌丝致密度以及是否产生黑色微菌核。
3.根据权利要求2所述的一种辣椒黄萎病病原菌分离纯化及室内抗性鉴定方法，其特征在于，所述菌株FW001在椭圆形菌落边界处通过毛细管蘸取单孢分离纯培养物，所述菌株VW002在圆形菌落边界处通过毛细管蘸取单孢分离纯培养物。
4.根据权利要求1所述的一种辣椒黄萎病病原菌分离纯化及室内抗性鉴定方法，其特征在于，所述重复步骤①-③3次，纯化培养后采用试管斜面4℃冷冻保存，得到菌株FW001和菌株VW002的纯化物。
5.根据权利要求1所述的一种辣椒黄萎病病原菌分离纯化及室内抗性鉴定方法，其特征在于，所述菌株FW001和菌株VW002的病原鉴定依据Booth鉴定方法：将单孢分离纯培养物，接在PDA培养基上，25℃培养4d，测定单孢菌落的生长速度，取培养15d的菌丝体进行孢子形态及产孢细胞观察，测量各类型分生孢子长度与宽度。
6.根据权利要求1所述的一种辣椒黄萎病病原菌分离纯化及室内抗性鉴定方法，其特征在于，所述S5中，PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测过程具体如下：
1）取孢子悬浮液5 μL轻轻滴于PDA平板中央，25℃恒温黑暗培养15 d后收集菌丝，按照真菌DNA提取试剂盒说明书提取病原菌基因组的DNA，并利用超微量分光光度计测定菌株基因组的DNA 质量和浓度，当 OD260 nm/OD280 nm比值在 1.7~1.9之间视为合格；
2）将菌株基因组 DNA 浓度稀释至50 ng/μL 作为模板，50 μL 反应体系：2×Taq PCRMaster Mix 25 μL、5 μmol/L 引物 ITS1/ITS4 混合物2 μL、50 ng/μL DNA 模板 2 μL、ddH2O 21 μL；
反应程序：94℃预变性 5 min；94℃变性 40 s，55℃退火40 s，72℃延伸40 s，35个循环；72℃再延伸10 min。利用PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化后，取 5 μL PCR 产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，筛选阳性克隆送北京厚生博泰科技有限公司测序，将测序结果在 NCBI 网站进行比对，根据比对结果确定病原菌的种类；
3）利用PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化后，取 5 μL PCR 产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，筛选阳性克隆送北京厚生博泰科技有限公司测序，将测序结果在 NCBI 网站进行比对，根据比对结果确定病原菌的种类。
7.根据权利要求1所述的一种辣椒黄萎病病原菌分离纯化及室内抗性鉴定方法，其特征在于，所述S6包括以下过程：
1）分子孢子液的制备：
取甘油中保存的菌株FW001或菌株VW002于PDA培养基中活化培养1~2次后，用灭菌的手术刀将表面长满大丽轮枝菌或尖孢镰刀菌的PDA培养基切成碎块，置于CDB培养基中，黑暗条件下，25℃、220 r·min-1震荡培养2~3 d后，取分生孢子液5~10 mL接种到灭菌的麦麸培养基中进行促孢培养；3~5 d后待菌丝长满瓶后用无菌水冲洗麦麸，双层纱布过滤，调整分生孢子液浓度为1×107个·mL-1备用；
2）抗性鉴定辣椒材料准备：
对照品种选择：感病对照品种：‘北星一号’，内蒙古自治区农业科学院蔬菜花卉研究所提供；
抗病对照品种：‘PBC932’，亚洲蔬菜中心提供，采用50孔育苗穴盘进行育苗，幼苗长至6-8片真叶时进行移栽，移栽至大小为15*15cm的苗钵中；
3）接种方法：
分生孢子液浓度1×107个/mL，将鉴定材料辣椒幼苗移栽至新的苗钵中，苗钵大小15×15 cm，移栽后沿茎基部浇灌制备好的分生孢子液25 mL，再浇水50 mL，每个鉴定材料接种10株，重复3次，对照植株10株， 接种后辣椒幼苗于室内缓苗2 d后，置于日光温室中培养，接种后30 d统计发病情况。
8.根据权利要求7所述的一种辣椒黄萎病病原菌分离纯化及室内抗性鉴定方法，其特征在于，所述1）中所用PDA培养基和CDB培养基均需加入卡那霉素50 mg·L-1。
9.根据权利要求1所述的一种辣椒黄萎病病原菌分离纯化及室内抗性鉴定方法，其特征在于，所述S7包括以下统计计算过程：
根据辣椒黄萎病发病程度分级标准（表1），记录接种辣椒植株黄萎病发病情况，计算病情指数，病情指数（DI）=∑(各级病株数×该病级代表数值)／(调查病株总数×调查最高级值)×100。测量植株株高和株展，计算萎缩程度，萎缩率（%）=[1-（每一株病原菌处理植株的株展-1）/（对照植株平均株展-5）]×100。
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