CN118286303A - 一种七味回阳汤及其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药制剂技术领域，主要涉及一种用于回阳益气的回阳汤，具体涉及一种七味回阳汤及其制备方法。本发明使用植物乳杆菌CICC‑21827和酵母菌CICC‑32636对炮制改性的附子、红参、炼蜜改性的麻黄和升麻进行发酵，搭配茯苓和黄芩熬制出七味回阳汤。使用植物乳杆菌CICC‑21827和酵母菌CICC‑32636进行发酵的方法使回阳汤功效增加了缓解痛经的功效，同时在发酵条件下，红参和升麻的发酵物起到协同作用，增加了补血益气的效果。本发明制得的七味回阳救逆汤，在急救领域有很大的发展前景。

Description

一种七味回阳汤及其制备方法及应用

技术领域

本发明属于中药制剂技术领域，主要涉及一种回阳汤及其制备方法，具体涉及一种七味回阳汤及其制备方法及应用。

背景技术

回阳汤，具有益气回阳兼化瘀之功，用于治上吐下泻转筋一症。

回阳汤出自清代王清任《医林改错》之下卷，方由党参八钱，附子八钱，干姜四钱，白术四钱，甘草三钱，桃仁二钱，红花二钱构成，具有益气回阳兼化瘀之功，王氏用治上吐下泻转筋一症。类风湿关节炎患者，多系阳气不足之体，患病日久，风寒湿之邪由表及里，伤及阳气，邪气留恋筋骨之间难以速去，阳虚营运血脉无权，而见血脉痹阻，阻遏阳气布散，阳失布散则血瘀有加，阳气不足与血脉不通互为因果，回阳汤益气温阳、化瘀蠲痹相得益彰。方中党参益气固脱，附子振奋阳气而主寒湿痹痛，干姜助附子温阳而逐风湿痹，白术健脾燥湿而主风寒湿痹，甘草和中而坚筋骨、长肌肉，桃仁活血祛瘀，红花活血通经而止痛。概言之，参、附、姜、术、草诸药扶阳益气温中，以达回阳行血之效，桃、红二药，通经化瘀而止痛。但原本的汤方无清热作用，无法调节人体阴阳平衡。

我国很早就将微生物应用于中药的生产与炮制,至今已有上千年的历史。中药炮制发酵法是一种将中药材通过发酵过程进行处理的方法。这种方法将中药材与特定的微生物接种进行共同发酵,以改变中药材的性质和功效。

本发明人的研究方向是通过微生物炮制改性七味回阳汤中的药材，进行了大量试验后，筛选出具有良好效果的微生物炮制方法。本团队相关在先申请曾公开了使用乳酸菌和枯草芽孢杆菌进行发酵的方法不仅可以使回阳汤功效增加，并且由于甘草的改性，还有意想不到的清热温补的作用。发明中使用的人参和附子起到协同作用，回阳固脱的效果大大增强。

在此基础上，发明人团队进一步进行研究，通过微生物炮制改性来拓宽七味回阳汤的疗效，以及增强七味回阳汤的功效。

发明内容

有鉴于此，本发明选用天然植物附子、红参、麻黄和升麻通过用植物乳杆菌CICC-21827和酵母菌CICC-32636协同发酵改善性能，达到缓解并治疗伴随月经周期规律性发作的以小腹疼痛为主要症状的原发性痛经，同时在发酵条件下，红参和升麻的发酵物，即天然发酵液协同作用下具有极强的补血益气效果。

植物乳杆菌CICC-21827和酵母菌CICC-32636都是好氧菌，但是其适合的温度不同，在大量实验中发现，通过温度先低后高进行发酵能取得极佳的改性炮制效果。具体为，先30℃低温发酵，此时酵母菌CICC-32636达到最佳温度，增殖和代谢活跃，其产生的代谢次生物等活性物质为接下来的植物乳杆菌发酵做准备。低温发酵后，升温至39℃，此时酵母活性开始降低，植物乳杆菌则达到最佳生理活性温度。在整个过程中，通过控制温度和条件，两种菌协同作用，达到了预想不到的炮制改性效果。

第一方面，本发明提供一种七味回阳汤的制备方法，具体步骤如下：

S1、中药的预处理：附子、红参、麻黄、升麻、茯苓、黄芩、甘草先用水短暂浸泡再洗净晾干，待用；

S2、改性附子的后处理：取步骤S1中预处理后的附子30-40g去皮、切段，放入甘草水中完全浸泡，取出，再放入砂锅中慢火炒至金黄，然后摊在泥地(雨后很潮但没有泥的土地)上，放置一晚，待用；该步骤在泥地上放置一晚可以有效去除附子内的火毒，所述甘草水优选为在1L纯净水中加入10g甘草浸泡12小时即得；

S3、麻黄的后处理：取步骤S1中预处理后的麻黄20-25g，用纯净水润透，切段，干燥，然后用装有50-60mL开水的砂锅将5-6g炼熟蜂蜜稀释，稀释后加入净麻黄段拌匀，

焖透，再用文火炒至深黄色，不粘手，取出，放凉，待用；该步骤用炼熟蜂蜜炮制麻黄，经炮制改性后的麻黄，药性由凉变温，药味由辛变甘，并且蜂蜜与麻黄协同作用具有止咳平喘的功效，改变了原有的药性；

S4、菌液的制备：取植物乳杆菌接种于MRS琼脂培养基，于37℃培养箱中进行培养48h，得到活化的植物乳杆菌，转接于800mLMRS液体培养基的摇瓶中发酵6h后得到浓度为1.2-1.5×10⁸cfu/mL，的植物乳杆菌菌液；取酵母菌接种于麦芽汁琼脂培养基，于28℃培养箱中进行培养48h，得到活化的酵母菌，接种于800mL麦芽汁液体培养基的摇瓶中发酵6h后得到浓度为1.2-1.5×10⁸cfu/mL的酵母菌菌液，并将两种菌液均放在菌液裝缸中待用；

S5、附子、红参、麻黄和升麻的发酵：取步骤S1中红参5-8g，升麻15-20g，取步骤S2中附子10-15g和取步骤S3中麻黄15-25g共同粉碎至50-60目，置于装有步骤S4中制备的10-20mL植物乳杆菌CICC-21827菌液和10-20mL酵母菌CICC-32636菌液的发酵缸中，在温度为30℃下发酵20-24h，期间不断翻动确保重组氧气；随后升温至39℃，继续发酵12～15h后结束发酵，期间翻动3-5次，发酵结束后用3％H₂O₂溶液对所得发酵物中的植物乳杆菌和酵母菌菌液进行灭活，得到附子、红参、麻黄和升麻的发酵物，待用；该步骤使用植物乳杆菌和酵母菌对中药进行发酵，目的是为了获取中药中更多的有利物质，提升中药温阳补气的功效；

S6、取所述步骤S5中制备的30-40mL中药发酵物、步骤S1中8-12g黄芩、5-11g甘草和8-12g茯苓，用纱布包好后，置于砂锅中，加入250-300mL水，煮沸后煎煮8min，然后再加入100mL水，再次煮沸，煮沸后再煎煮15-20min，过滤取溶液即可得到七味回阳汤；

S7、将120-150mL的七味回阳汤灌装到专用中药包装袋中，密封，贴签，确认无误后即可得到袋装七味回阳汤。

第二方面，发酵条件下，红参和升麻的发酵物，即天然发酵液具有极强的补血益气效果。

优选地：本发明所述步骤S2中处理后的附子称取量为35g。

优选地：本发明所述步骤S2经炮制改性并在泥土中放置一晚后的附子，可以有效去除附子内的毒素，并且使药性变得更加温和。

优选地：本发明所述步骤S3中麻黄25g，炼熟蜂蜜6g，开水55mL。

优选地：本发明所述步骤S3经炼熟蜂蜜炮制改性后的麻黄，药性由凉变温，药味由辛变甘，并且蜂蜜与麻黄协同作用具有止咳平喘的功效，改变了原有的药性；

优选地：本发明所述步骤S4所用的MRS琼脂培养基各组成分为：蛋白胨10g，牛肉浸粉10g，酵母浸粉5g，葡萄糖20g，吐温1g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，磷酸氢二钾2g，七水合硫酸镁0.2g，四水合硫酸0.05g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，调节pH为6.2-6.5；麦芽汁琼脂培养基各组成分为：蛋白胨2.5g，牛肉膏1.5g，麦芽汁10g，琼脂18，蒸馏水1000mL，pH值7.1±0.1。

优选地：本发明所述步骤S4所得的植物乳杆菌CICC-21827菌和酵母菌CICC-32636菌液浓度为1.5×10⁸cfu/mL。

优选地：本发明所述步骤S5附子、红参、麻黄和升麻按质量比2:1:4:3粉碎后混合均匀。

优选地：本发明所述步骤S7中煎煮时采用纱布包煎，防止煎煮时汤药溅出，流失药效，并且用80目网筛过滤，防止饮用时喝到药渣，引起咳嗽。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明采用酵母菌和植物乳杆菌对附子、红参、麻黄和升麻进行发酵改性，它能缓解并治疗伴随月经周期规律性发作的以小腹疼痛为主要症状的原发性痛经；

2、本发明采用植物乳杆菌CICC-21827菌和酵母菌CICC-32636对发酵中药有协同作用，二者同时使用可以获取中药中更多的有利物质，有效提升中药中温阳补气治疗脾虚的功效；

3、本发明中使用的红参和升麻的发酵物，协同作用下具有极强的补血益气效果；

4、本发明将炮制后的附子在泥土中放置一晚，可以有效去除附子内的火毒，并且使药性变得更加温和；

5、本发明经炼熟蜂蜜炮制改性后的麻黄，药性由凉变温，药味由辛变甘，并且蜂蜜与麻黄协同作用具有止咳平喘的功效，改变了原有的药性；

6、本发明制备的回阳汤采用七种中药，功效增加、可以起到一定补阳益气的效果,能够用于改善气血气虚的症状，缓解腹泻，贫血，失眠多梦等表现。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例1与对比例1-4在灌药第4d和第8d的腹泻等级评分对比图。

图2是实施例3与对比例6-7在连续注射7d后血红蛋白浓度对比图。

图3是本发明实施例1-4与对比例1-7服用七味回阳汤小鼠扭体次数对比图。

图4是本发明实施例1-4与对比例1-7服用七味回阳汤小鼠子宫子宫内Ca²⁺含量对比图。

图5是本发明研发的七味回阳汤的实物图片。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

本实施例证明植物乳杆菌CICC-21827菌和酵母菌CICC-32636对发酵中药有协同作用，二者同时使用可以有效提升中药温阳补气，治疗脾虚疗效。

本实施例提供了一种七味回阳汤，其具体步骤如下：

S1、中药的预处理：附子、红参、麻黄、升麻、茯苓、黄芩、甘草先用水短暂浸泡再洗净晾干，待用；

S2、附子的后处理：取步骤S1中预处理后的附子35g去皮、切段，放入甘草水中完全浸泡，取出，再放入砂锅中用慢火炒至金黄，然后摊在泥地(雨后很潮但没有泥的土地)上，放置一晚，粉碎得到后处理附子，待用；该步骤在泥地上放置一晚可以有效去除附子内的火毒；所述甘草水为在1L纯净水中加入10g甘草浸泡12小时即得。

S3、麻黄的后处理：取步骤S1中预处理后的麻黄25g，用纯净水润透，切段，干燥，然后用装有55mL开水的砂锅将6g炼熟蜂蜜稀释，稀释后加入净麻黄段拌匀，焖透，再用文火炒至深黄色，不粘手，取出，放凉，粉碎得到后处理麻黄，待用；该步骤用炼熟蜂蜜炮制麻黄，经炮制改性后的麻黄，药性由凉变温，药味由辛变甘，并且蜂蜜与麻黄协同作用具有止咳平喘的功效，改变了原有的药性；

S4、菌液的制备：取植物乳杆菌(保藏编号CICC-21827购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)接种于MRS琼脂培养基，于37℃培养箱中进行培养48h，得到活化的植物乳杆菌，转接于800mLMRS液体培养基的摇瓶中发酵6h后得到浓度为1.5×10⁸cfu/mL的植物乳杆菌CICC-21827菌液；取酵母菌(保藏编号CICC-32636购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)接种于麦芽汁琼脂培养基，于28℃培养箱中进行培养48h，得到活化的酵母菌，接种于800mL麦芽汁液体培养基的摇瓶中发酵6h后得到浓度为1.5×10⁸cfu/mL的酵母菌CICC-32636菌液，并将两种菌液均放在菌液裝缸中待用；

S5、附子、红参、麻黄和升麻的发酵：取步骤S1中红参5g，升麻15g，取步骤S2中后处理附子10g和取步骤S3中后处理麻黄15g共同粉碎至50目，置于装有步骤S4中制备的10mL植物乳杆菌CICC-21827菌液和10mL酵母菌CICC-32636菌液的发酵缸中，在温度为30℃下发酵20h，期间不断翻动确保重组氧气；随后升温至39℃，继续发酵12h后结束发酵，期间翻动5次，发酵结束后用3％H₂O₂溶液对所得发酵物中的植物乳杆菌和酵母菌菌液进行灭活，得到附子、红参、麻黄和升麻的发酵物，待用；

该步骤使用植物乳杆菌和酵母菌对中药进行发酵，目的是为了获取中药中更多的有利物质，提升中药温阳补气的功效；

S6、取所述步骤S5中制备的30mL中药发酵物、步骤S1中8g黄芩、5g甘草和8g茯苓，用纱布包好后，置于砂锅中，加入250mL水，煮沸后煎煮8min，然后再加入100mL水，再次煮沸，煮沸后再煎煮15min，过滤取溶液即可得到七味回阳汤；

S7、将120mL的七味回阳汤灌装到专用中药包装袋中，密封，贴签，确认无误后即可得到袋装七味回阳汤。

对比例1：除步骤S4中不加植物乳杆菌CICC-21827菌液外，其余的各个步骤均与实施例1相同。

对比例2：除步骤S4中不加酵母菌CICC-32636菌液外，其余的各个步骤均与实施例1相同。

对比例3：除步骤S4中将植物乳杆菌CICC-21827替换为乳酸菌(保藏编号CICC-22222，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)外，其余的各个步骤均与实施例2相同。

对比例4：除步骤S4中将酵母菌CICC-32636替换为酵母菌Candidaguilliermondii var.guilliermondii(保藏编号CICC-1274，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)外，其余的各个步骤均与实施例2相同。

七味回阳汤对脾虚泄泻小鼠肠道的影响

分组：SPF级Balb/c雌性小鼠56只(由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供)，随机分为8组，每组7只，分别为正常组、模型组、给药组(实施例1组、对比例1-4组)、阳性对照组；除正常组外，其他组的小鼠均进行造模处理，空白组用蒸馏水灌服。

造模采用朱妍锦方法进行建模，具体实施方法为：取10g大黄加入50mL蒸馏水浸泡30min，再微煮1h，静置，过滤，浓缩制备成1g/mL大黄水煎液给小鼠灌服，每天早晚各灌服0.01mL/g大黄浓缩液，连续10d，出现大便溏稀、肛门污秽、食欲减退等现象，建模成功。正常组和模型组小鼠均给予蒸馏水灌服，实施例1组、对比例1-4组给药相对应的七味回阳汤，阳性对照组采用乳酸菌素片，按1.2g/(kg·d)进行给药；灌服量均按一天一次一次0.01mL/g，连续8d，在第4d和第8d早上给药前观察各组小鼠腹泻程度相关变化并统计每组的腹泻等级，结果如图1所示。腹泻等级评分标准：0分表示无腹泻:分表示有腹泻发生，粪便仅黏附于肛周；2分表示有腹泻发生，粪便黏附肛周及大腿部位；3分表示有腹泻发生，粪黏附于肛周、腿部及腹部。

与空白组小鼠对比，第4d和第8d模型组小鼠大便稀溏、肛周污秽、精神姜靡、摄食量及活动减少，腹泻等级评分显著升高。图1是实施例1与对比例1-4在灌药第4d和第8d的腹泻等级评分对比图，与模型组小鼠对比，第4、8天给药组小鼠的腹泻等级评分均显著降低，给药组小鼠大便基本成形、腹泻程度减轻、摄食量增加、活动增加腹泻程度减轻，其中给药组实施例组小鼠的腹泻等级评分明显低于对比例组，证实了实施例1所得七味回阳汤具有更好的提升中药温阳补气，治疗脾虚的疗效。

实施例2

本实施例证明使用的改性麻黄，提升了汤剂的温补性，药味由辛变甘，并且蜂蜜与麻黄协同作用具有止咳平喘的功效。

本实施例提供了一种七味回阳汤，其具体步骤如下：

S1、中药的预处理：附子、红参、麻黄、升麻、茯苓、黄芩、甘草先用水短暂浸泡再洗净晾干，待用；

S2、改性附子的制备：取步骤S1中预处理后的附子35g去皮、切段，放入10g/mL甘草水中完全浸泡，取出，再放入砂锅中用慢火炒至金黄，然后摊在泥地(雨后很潮但没有泥的土地)上，放置一晚，待用；该步骤在泥地上放置一晚可以有效去除附子内的火毒；

S3、改性麻黄的制备：取步骤S1中预处理后的麻黄25g，用纯净水润透，切段，干燥，然后用装有55mL开水的砂锅将6g炼熟蜂蜜稀释，稀释后加入净麻黄段拌匀，焖透，再用文火炒至深黄色，不粘手，取出，放凉，待用；该步骤用炼熟蜂蜜炮制麻黄，经炮制改性后的麻黄，药性由凉变温，药味由辛变甘，并且蜂蜜与麻黄协同作用具有止咳平喘的功效，改变了原有的药性；

S4、菌液的制备：取植物乳杆菌(保藏编号CICC-21827购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)接种于MRS琼脂培养基，于37℃培养箱中进行培养48h，得到活化的植物乳杆菌，转接于800mLMRS液体培养基的摇瓶中发酵6h后得到浓度为1.5×10⁸cfu/mL的植物乳杆菌CICC-21827菌液；取酵母菌(保藏编号CICC-32636购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)接种于麦芽汁琼脂培养基，于28℃培养箱中进行培养48h，得到活化的酵母菌，接种于800mL麦芽汁液体培养基的摇瓶中发酵6h后得到浓度为1.5×10⁸cfu/mL的酵母菌CICC-32636菌液，并将两种菌液均放在菌液裝缸中待用；

S5、附子、红参、麻黄和升麻的发酵：取步骤S1中红参5g，升麻15g，取步骤S2中后处理附子10g和取步骤S3中后处理麻黄15g共同粉碎至55目，置于装有步骤S4中制备的15mL植物乳杆菌CICC-21827菌液和15mL酵母菌CICC-32636菌液的发酵缸中，在温度为30℃下发酵22h，期间不断翻动确保重组氧气；随后升温至39℃，继续发酵13h后结束发酵，期间翻动3-5次，发酵结束后用3％H₂O₂溶液对所得发酵物中的植物乳杆菌和酵母菌菌液进行灭活，得到附子、红参、麻黄和升麻的发酵物，待用；

S6、取所述步骤S5中制备的35mL附子、红参、升麻和麻黄的发酵物、步骤S1中11g黄芩、9g甘草和11g茯苓，用纱布包好后，置于砂锅中，加入280mL水，煮沸后煎煮8min，然后再加入100mL水，再次煮沸，煮沸后再煎煮15min，即可得到七味回阳汤；

S7、将140mL的七味回阳汤灌装到专用中药包装袋中，密封，贴签，确认无误后即可得到袋装七味回阳汤。

对比例5：除步骤S3中不对麻黄进行后处理外，其余的各个步骤均与实施例3相同。

七味回阳汤镇咳作用性能的研究

检测方法：SPF级Balb/c28只(由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供)，随机分为4组，每组7只；分别为1个空白组、3个给药组，给药组包含实施例2组(10ml·kg^-1)、对比例5组(10ml·kg^-1)和阳性对照组(枸橼酸喷托维林片13.00mg·kg^-1)。空白组不给药，给药组每天给药1次，共7d；最后1次给药1h后使用诱咳引喘仪，雾化浓氨水13s，记录小鼠的咳嗽潜伏期和2min内咳嗽次数。实验结果如下表1所示

表1

组别	咳嗽次数(次)
		空白组	38.6±7.2
实施例2	23.2±9.5
		对比例5	31.5±10.1
阳性对照组	21.9±11.5

表1是实施例2与对比例5注射汤剂7d使用诱咳引喘仪后咳嗽次数对比图，可以看出实施例2咳嗽次数明显低于对比例，具有更好的止咳平喘的功效。

实施例3

本实施例证明七味回阳汤中使用的红参和升麻在发酵条件下起到协同作用，增强了汤剂的补血益气效果。

本实施例提供了一种七味回阳汤，其具体步骤如下：

S1、中药的预处理：附子、红参、麻黄、升麻、茯苓、黄芩、甘草先用水短暂浸泡再洗净晾干，待用；

S2、改性附子的制备：取步骤S1中预处理后的附子35g去皮、切段，放入10g/mL甘草水中完全浸泡，取出，再放入砂锅中用慢火炒至金黄，然后摊在泥地(雨后很潮但没有泥的土地)上，放置一晚，待用；该步骤在泥地上放置一晚可以有效去除附子内的火毒；

S3、改性麻黄的制备：取步骤S1中预处理后的麻黄25g，用纯净水润透，切段，干燥，然后用装有55mL开水的砂锅将6g炼熟蜂蜜稀释，稀释后加入净麻黄段拌匀，焖透，再用文火炒至深黄色，不粘手，取出，放凉，待用；该步骤用炼熟蜂蜜炮制麻黄，经炮制改性后的麻黄，药性由凉变温，药味由辛变甘，并且蜂蜜与麻黄协同作用具有止咳平喘的功效，改变了原有的药性；

S4、菌液的制备：取植物乳杆菌(保藏编号CICC-21827购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)接种于MRS琼脂培养基，于37℃培养箱中进行培养48h，得到活化的植物乳杆菌，转接于800mLMRS液体培养基的摇瓶中发酵6h后得到浓度为1.5×10⁸cfu/mL的植物乳杆菌CICC-21827菌液；取酵母菌(保藏编号CICC-32636购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)接种于麦芽汁琼脂培养基，于28℃培养箱中进行培养48h，得到活化的酵母菌，接种于800mL麦芽汁液体培养基的摇瓶中发酵6h后得到浓度为1.5×10⁸cfu/mL的酵母菌CICC-32636菌液，并将两种菌液均放在菌液裝缸中待用；

S5、附子、红参、麻黄和升麻的发酵：取步骤S1中红参5g，升麻15g，取步骤S2中后处理附子10g和取步骤S3中后处理麻黄15g共同粉碎至60目，置于装有步骤S4中制备的20mL植物乳杆菌CICC-21827菌液和20mL酵母菌CICC-32636菌液的发酵缸中，在温度为30℃下发酵24h，期间不断翻动确保重组氧气；随后升温至39℃，继续发酵15h后结束发酵，期间翻动3-5次，发酵结束后用3％H₂O₂溶液对所得发酵物中的植物乳杆菌和酵母菌菌液进行灭活，得到附子、红参、麻黄和升麻的发酵物，待用；

S6、取所述步骤S5中制备的40mL附子、红参、升麻和麻黄的发酵物、步骤S1中12g黄芩、11g甘草和12g茯苓，用纱布包好后，置于砂锅中，加入300mL水，煮沸后煎煮8min，然后再加入100mL水，再次煮沸，煮沸后再煎煮15min，即可得到七味回阳汤；

S7、将150mL的七味回阳汤灌装到专用中药包装袋中，密封，贴签，确认无误后即可得到袋装七味回阳汤。

对比例6：除步骤S5中采用植物乳杆菌CICC-21827和酵母菌CICC-32636进行发酵时，不加入红参外，其余的各个步骤均与实施例4相同。

对比例7：除步骤S5中采用植物乳杆菌CICC-21827和酵母菌CICC-32636进行发酵时，不加入升麻外，其余的各个步骤均与实施例4相同。,

七味回阳汤对化疗贫血小鼠的影响

分组：SPF级Balb/c小鼠42只(由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供)，随机分为6组，每组7只，分别为正常组(正常小鼠注射等体积生理盐水)、模型组、实施例3组、对比例6组、对比例7组、阳性对照组(150U/kg剂量的红细胞生成刺激剂)；除正常组外，其他组的小鼠均进行造模处理。

环磷酰胺(CTX)建立贫血小鼠的建模方案：小鼠连续3d每日腹腔注射环磷酰胺(CTX)100mg/kg，第4d腹腔注射CTX 150mg/kg，第5d腹腔注射CTX 200mg/kg完成化疗贫血模型制备后，分别按组注射或灌服相对应的汤剂，连续给药7d，每天注射或灌服量为0.1mL/10g，实施例3组、对比例6组、对比例7组分别灌服相应的七味回阳汤，阳性对照每天注射150U/kg剂量的红细胞生成刺激剂(ESAs)，模型组注射等体积生理盐水，正常组为正常小鼠注射等体积生理盐水；末次注射24小时后取血后采用全自动血红蛋白检测仪检测血红蛋白含量，结果如图2所示。

图2是实施例3与对比例6-7在连续注射7d后血红蛋白对比图，可以看出化疗后的小鼠未经治疗，仅注射生理盐水，其血红蛋白度较低，经红细胞生成刺激剂治疗后，血红蛋白浓度显著升高，而注射了实施例3组与对比例6-7组的相应药物后，血红蛋白浓度也都显著提升，并且实施例3的血红蛋白浓度明显高于对比例6-7，证明了实施例3具有更好的补血益气的疗效。

七味回阳汤对治疗原发性痛经的研究

SPF级Balb/c未孕雌性小鼠(由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供)，日龄100日，体重每只18-22g。动物饲养在12h明暗交替，温度25±2℃和湿度50％±10％恒定的环境中，自由饮水及摄食，适应性饲养7d后开始实验。

分组：将91只小鼠随机分为13组，每组7只，分别为正常组、模型组、实施例1-3组、对比例1-7组、阳性对照组，除正常组外，其他组均进行造模。

寒湿凝滞型原发性痛经模型的建模：给除正常组外各组小鼠按照表2进行灌胃，每次在灌胃1h后腹腔注射苯甲酸雌二醇(10mg/kg)，然后将小鼠(除头外)浸入20℃冷水中进行10min寒冷刺激，如此连续3d。

表2

(1)扭体实验：从第1天起到造模结束，正常对照组给予生理盐水0.1mL/10g，除正常组外的各组小鼠在建模第4d对小鼠按表2进行灌胃，30min后腹腔注射缩宫素(0.4mL/只)，并记录30min内小鼠扭体次数。

图3是实施例1-3组与对比例1-7组中的七味回阳汤对小鼠腹腔注射缩宫素后的扭体次数对比图，该实验模拟临床寒湿凝滞型原发性痛经的发病情况，实验结果显示，正常组小鼠的扭体次数为0，与正常组小鼠对比模型组小鼠扭体次数大幅度增高，与模型组小鼠对比实施例1-3与对比例1-7组小鼠的扭体次数均显著降低，并且实施例1-3组扭体次数明显低于对比例1-7组，且与阳性对照组扭体次数接近，说明了实施例1-3组能有效降低小鼠对镇痛感觉知能力，与目前治疗原发性痛经的一线药物桂枝茯苓丸的药效相当。

(2)小鼠子宫内Ca²⁺含量的测定：扭体结束后脱颈椎处死小鼠，迅速摘取子宫，剔除周围脂肪组织，加入9倍生理盐水后用匀浆机制成10％组织匀浆，低温离心10min.分离出上清液用于Ca²⁺含量的测定，采用甲基百里香酚蓝比色法和硝酸还原酶法，测定小鼠子宫匀浆中Ca²⁺的含量均按照试剂盒说明书严格操作。

图4是实施例1-3组与对比例1-7组中的七味回阳汤对小鼠子宫内Ca²⁺含量影响图，可以看出与正常组相比，模型组小鼠子宫内Ca²⁺含量显著升高；与模型组相比，实施例1-3组与对比例1-7组小鼠子宫内Ca²⁺含量均有降低，但实施例1-3组小鼠子宫内Ca²⁺含量明显低于对比例1-7组，且与阳性对照组小鼠子宫内Ca²⁺含量接近，而Ca²⁺含量减少可以让平滑肌松弛，说明实施例1-3组能有效缓解子宫平滑肌痉挛，与目前治疗原发性痛经的一线药物桂枝茯苓丸的药效相当。

综上所述：采用酵母菌和植物乳杆菌对附子、红参、麻黄和升麻进行发酵改性，可以有效降低镇痛的感知能力，缓解子宫平滑肌痉挛，具有缓解并治疗原发性痛经的功效。

以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种七味回阳汤的制备方法，具体制备方法如下：

S1、中药的预处理：附子、红参、麻黄、升麻、茯苓、黄芩、甘草先用水短暂浸泡再洗净晾干，待用；

S2、改性附子的后处理：取步骤S1中预处理后的附子30-40g去皮、切段，放入甘草水中完全浸泡，取出，再放入砂锅中慢火炒至金黄，然后摊在泥地上，放置一晚，待用；

S3、麻黄的后处理：取步骤S1中预处理后的麻黄20-25g，用纯净水润透，切段，干燥，然后用装有50-60mL开水的砂锅将5-6g炼熟蜂蜜稀释，稀释后加入净麻黄段拌匀，焖透，再用文火炒至深黄色，不粘手，取出，放凉，待用；

S4、菌液的制备：取植物乳杆菌(保藏编号CICC-21827，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)接种于MRS琼脂培养基，于37℃培养箱中进行培养48h，得到活化的植物乳杆菌，转接于800mLMRS液体培养基的摇瓶中发酵6h后得到浓度为1.2-1.5×10⁸cfu/mL的植物乳杆菌菌液；取酵母菌酵母菌(保藏编号CICC-32636购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)接种于麦芽汁琼脂培养基，于28℃培养箱中进行培养48h，得到活化的酵母菌，接种于800mL麦芽汁液体培养基的摇瓶中发酵6h后得到浓度为1.2-1.5×10⁸cfu/mL的酵母菌菌液，并将两种菌液均放在菌液裝缸中待用；

S5、附子、红参、麻黄和升麻的发酵：取步骤S1中红参5-8g，升麻15-20g，取步骤S2中附子10-15g和取步骤S3中麻黄15-25g共同粉碎至50-60目，置于装有步骤S4中制备的10-20mL植物乳杆菌CICC-21827菌液和10-20mL酵母菌CICC-32636菌液的发酵缸中，在温度为30℃下发酵20-24h，期间不断翻动确保重组氧气；随后升温至39℃，继续发酵12～15h后结束发酵，期间翻动3-5次，发酵结束后用3％H₂O₂溶液对所得发酵物中的植物乳杆菌和酵母菌菌液进行灭活，得到附子、红参、麻黄和升麻的发酵物，待用；

S6、取所述步骤S5中制备的30-40mL中药发酵物、步骤S1中8-12g黄芩、5-11g甘草和8-12g茯苓，用纱布包好后，置于砂锅中，加入250-300mL水，煮沸后煎煮8min，然后再加入100mL水，再次煮沸，煮沸后再煎煮15-20min，过滤取溶液即可得到七味回阳汤；

S7、将120-150mL的七味回阳汤灌装到专用中药包装袋中，密封，贴签，确认无误后即可得到袋装七味回阳汤。

2.根据权利要求1所述的一种七味回阳汤的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中处理后的附子称取量为35g。

3.根据权利要求2所述的一种七味回阳汤的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中所述甘草水为在1L纯净水中加入10g甘草浸泡12小时即得。

4.根据权利要求3所述的一种七味回阳汤的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中麻黄25g，炼熟蜂蜜6g，开水55mL。

5.根据权利要求4所述的一种七味回阳汤的制备方法，其特征在于：所述步骤S4所得的植物乳杆菌CICC-21827菌液和酵母菌CICC-32636菌液浓度均为1.5×10⁸cfu/mL。

6.根据权利要求5所述的一种七味回阳汤的制备方法，其特征在于：本发明所述步骤S5中后处理附子、红参、后处理麻黄和升麻按质量比2:1:4:3粉碎后混合均匀。

7.根据权利要求6所述的一种七味回阳汤的制备方法，其特征在于：本发明所述步骤S6所用的茯苓是多孔菌科真菌的干燥菌核，在煎制过程中打碎成粗颗粒后煎煮。

8.根据权利要求7所述的一种七味回阳汤的制备方法，其特征在于：所述步骤S7中过滤采用80目网筛过滤。

9.根据权利要求1-8任一项所述的一种七味回阳汤的制备方法制得的七味回阳汤。