CN118033007A - 一种液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，包括如下步骤：样本提取；衍生化反应：向提取后的样本中加入3‑硝基苯肼、N‑(3‑二甲基氨基丙基)‑N'‑乙基碳二亚胺盐酸盐和吡啶进行衍生化反应；LC‑MS检测：质谱检测选择SRM模式进行采集；待测脂肪酸的检测母离子质荷比可通过公式计算得到，检测子离子的质荷比为137.04和152.05。本发明采用衍生化技术对脂肪酸衍生化后，对于没有标准品的脂肪酸，可采用特定公式进行计算衍生化后在质谱中的母离子质核比，并可以在质谱中产生两个可以定量的诊断峰，实现多种脂肪酸的靶向定量，具有较高的检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及检测方法技术领域，尤其是涉及一种液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法。
背景技术
脂肪酸是人体必需的营养物质，是构成细胞膜、合成激素、维持神经系统功能等的重要组成部分。不同类型的脂肪酸对健康有不同影响，如饱和脂肪酸与心血管疾病风险增加相关，而Omega-3脂肪酸则被认为对心脏健康有益，有助于降低心血管疾病风险；此外，Omega-3脂肪酸也具有抗炎和调节免疫功能的作用。脂肪酸也是大脑的主要结构成分之一，与脑功能、认知能力和情绪调节密切相关。肠道微生物可以通过发酵膳食纤维等物质产生短链脂肪酸（如丙酸、丁酸和乳酸等），有些短链脂肪酸对人体的健康具有重要的作用。通过深入研究脂肪酸在不同健康领域的作用机制，可以为制定个性化膳食建议、预防和治疗相关疾病提供科学依据。
脂肪酸的定量检测对于脂肪酸的研究具有重要的意义，液相色谱-质谱联用法（LC-MS）是目前常用的定量检测脂肪酸的方法，例如，公开号为CN113138246A的专利中公开的一种靶向测定生物样本中短链脂肪酸的检测方法；公开号为CN109298115A的专利中公开的一种生物样品中多种代谢物定量检测方法及代谢芯片。但现有技术中的液质联用法可以定量的脂肪酸数量比较少，主要针对短链脂肪酸进行定量；并且很多脂肪酸是没有标准品的，难以确定其母离子和子离子的质荷比；再加上一些长链脂肪酸在质谱中很难碎裂，即使在较高的能量下，产生的信号的也很低，导致这些脂肪酸检测灵敏度较低。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中的脂肪酸定量检测方法存在的上述问题，提供一种液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，采用衍生化技术对脂肪酸衍生化后，对于没有标准品的脂肪酸，可采用特定公式进行计算衍生化后在质谱中的母离子质核比，并可以在质谱中产生两个可以定量的诊断峰，可实现多种脂肪酸的靶向定量，具有较高的检测灵敏度。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，包括如下步骤：
（1）样本提取：用甲醇对血浆或粪便样本进行提取，得到提取后的样本；
（2）衍生化反应：向提取后的样本中加入3-硝基苯肼、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和吡啶进行衍生化反应，干燥后得到干粉样品；
（3）LC-MS检测：将干粉样品用甲醇水溶液复溶后进行LC-MS检测，得到各待测脂肪酸的含量；其中，质谱检测选择SRM模式进行采集；
待测脂肪酸的检测母离子质荷比通过以下公式计算：
Q1=14.0156n-2.0156m+165.9347；
其中，n为脂肪酸碳链长度，m为脂肪酸中的碳碳双键个数；
检测子离子的质荷比为137.04和152.05。
现有技术中用LC-MS法对待测物质进行检测时，一般是通过待测物质的标准品来确定其母离子和子离子的质荷比，这对于没有标准品的脂肪酸来说，就无法对其进行定量，限制了所能检测脂肪酸的数量。为了能够提高可定量脂肪酸的数量，本发明先加入3-硝基苯肼、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和吡啶对样本中的脂肪酸进行衍生化，根据对衍生化产物的研究发现，其母离子的质荷比可以通过其碳链长度和双键个数根据一定的公式进行计算，并可以同时监测两个子离子137.04和152.05，作为可以定量的诊断峰。对于没有标准品的脂肪酸，可按此进行定量，大大拓展了可定量脂肪酸的数量，并且两个诊断峰处只要在有一处有信号，就可以实现目标脂肪酸的定量，能够实现多种脂肪酸的靶向定量，且衍生化产物的信号较强，具有较高的检测灵敏度。同时，本发明仅需用甲醇对样本进行提取即可，提取后的样本无需为干粉状态，在液体状态下可以直接加入衍生化试剂反应，提取和衍生化过程操作简单。
作为优选，步骤（1）时样本提取时，样本和甲醇的体积比为1:4~5。
作为优选，步骤（1）中的样本提取方法为：将冷冻保存的血浆或粪便样本解冻后，加入甲醇中，涡旋并离心提取后取上清液，得到提取后的样本。
作为优选，涡旋时间25~35s；离心时的温度为0~4℃，转速13000~15000rpm，离心时间10~20min。
作为优选，步骤（2）中的3-硝基苯肼、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐及吡啶以甲醇溶液的方式加入提取后的样本中，3-硝基苯肼溶液的浓度为150~250mmol/L，N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度为100~150 mmol/L，吡啶溶液的质量浓度为2~3%；提取后的样本与3-硝基苯肼溶液、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、吡啶溶液的体积比为4:0.8~1.5:0.8~1.2: 0.8~1.2。
作为优选，步骤（2）中的衍生化反应温度为4~35℃，反应时间25~35min。
作为优选，步骤（2）中所得干粉样品在-20℃以下保存。
作为优选，步骤（3）中，液相色谱测试时的色谱条件为：
色谱柱：T3柱或氨基柱；
柱温：50~60℃；
进样量：2μL；
流速：0.3~0.5mL/min。
作为优选，步骤（3）中，液相色谱测试时采用梯度洗脱法；采用梯度洗脱的方法，便于各脂肪酸的分离。
当色谱柱为T3柱时，流动相A为含有8~12mmol/L乙酸铵的0.15~0.25wt%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，洗脱梯度为：
0.0~1.0 min：5%体积分数的流动相B；
1.0~7.5 min：流动相B的体积分数从5% 到50%；
7.5~8.5 min：流动相B的体积分数从50% 到90%；
8.5~11.5 min：90%体积分数的流动相B；
11.5~12.0 min：流动相B的体积分数从90% 到5%；
12.0~17.0 min：5%体积分数的流动相B。
当色谱柱为氨基柱时，流动相A为含有18~22mmol/L乙酸铵的4~6wt%乙腈水溶液，流动相B为乙腈，洗脱梯度为：
0 min：流动相B的体积分数为85%；
0~3 min：流动相B的体积分数从85%到30%；
3~12 min：流动相B的体积分数从30%到2%；
12~15 min：流动相B的体积分数为2%；
15~16 min：流动相B的体积分数从2%到85%；
16~20 min：流动相B的体积分数为85%。
作为优选，步骤（3）中的质谱条件为：
气帘气：20~30psi；
离子源温度：450~500℃；
第一离子源气体：30~35 psi；
第二离子源气体：30~35 psi；
离子喷雾电压：±4500V；
碰撞池出口电位：±10V；
入口电位：±10V。
因此，本发明具有如下有益效果：
（1）加入3-硝基苯肼、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和吡啶对样本中的脂肪酸进行衍生化，根据对衍生化产物的性质限定其母离子的质荷比的计算公式，并可以同时监测两个子离子作为可以定量的诊断峰，可以对没有标准品的脂肪酸进行定量，拓展了可定量脂肪酸的数量；
（2）用甲醇对样本进行提取，提取过程操作简单；
（3）样本无需为干粉状态，液体状态可以直接加入衍生化试剂反应，反应操作便捷。
附图说明
图1是采用实施例1中的方法得到的十四烷酸标准品衍生化后的质谱图。
图2是采用对比例1中的方法得到的十四烷酸标准品质谱图。
图3是采用实施例1中的方法得到的十七烷酸标准品衍生化后的质谱图。
图4是采用对比例1中的方法得到的十七烷酸标准品质谱图。
图5是采用实施例1中的方法得到的十四烷酸衍生化后子离子质荷比为137.04的色谱定量图。
图6是采用实施例1中的方法得到的十四烷酸衍生化后子离子质荷比为152.05的色谱定量图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步的描述。
在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
总实施例：
一种液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，包括如下步骤：
（1）样本提取：用甲醇对血浆或粪便样本进行提取，得到提取后的样本；
（2）衍生化反应：向提取后的样本中加入3-硝基苯肼、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和吡啶进行衍生化反应，干燥后得到干粉样品；
（3）LC-MS检测：将干粉样品用甲醇水溶液复溶后进行LC-MS检测，得到各待测脂肪酸的含量；其中，质谱检测选择SRM模式进行采集；
待测脂肪酸的检测母离子质荷比通过以下公式计算：
Q1=14.0156n-2.0156m+165.9347；
其中，n为脂肪酸碳链长度，m为脂肪酸中的碳碳双键个数；
检测子离子的质荷比为137.04和152.05。
作为一种优选方案，步骤（1）中的样本提取方法为：将冷冻保存的血浆或粪便样本解冻后加入甲醇中，样本和甲醇的体积比为1:4~5；涡旋25~35s后离心提取，离心时的温度为0~4℃，转速13000~15000rpm，离心时间10~20min，取上清液得到提取后的样本。
作为一种优选方案，步骤（2）中的3-硝基苯肼、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐及吡啶以甲醇溶液的方式加入提取后的样本中，3-硝基苯肼溶液的浓度为150~250mmol/L，N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度为100~150mmol/L，吡啶溶液的质量浓度为2~3%；提取后的样本与3-硝基苯肼溶液、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、吡啶溶液的体积比为4:0.8~1.5:0.8~1.2: 0.8~1.2；衍生化反应温度为4~35℃，反应时间25~35min；所得干粉样品在-20℃以下保存。
作为一种优选方案，步骤（3）中，液相色谱测试时的色谱条件为：
色谱柱：T3柱或氨基柱；
柱温：50~60℃；
进样量：2μL；
流速：0.3~0.5mL/min；
当色谱柱为T3柱时，流动相A为含有8~12mmol/L乙酸铵的0.15~0.25wt%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，洗脱梯度为：
0.0~1.0 min：5%体积分数的流动相B；
1.0~7.5 min：流动相B的体积分数从5% 到50%；
7.5~8.5 min：流动相B的体积分数从50% 到90%；
8.5~11.5 min：90%体积分数的流动相B；
11.5~12.0 min：流动相B的体积分数从90% 到5%；
12.0~17.0 min：5%体积分数的流动相B；
当色谱柱为氨基柱时，流动相A为含有18~22mmol/L乙酸铵的4~6wt%乙腈水溶液，流动相B为乙腈，洗脱梯度为：
0 min：流动相B的体积分数为85%；
0~3 min：流动相B的体积分数从 85%到30%；
3~12 min：流动相B的体积分数从30%到2%；
12~15 min：流动相B的体积分数为2%；
15~16 min：流动相B的体积分数从2%到85%；
16~20 min：流动相B的体积分数为85%。
作为一种优选方案，步骤（3）中的质谱条件为：
气帘气：20~30psi；
离子源温度：450~500℃；
第一离子源气体：30~35 psi；
第二离子源气体：30~35 psi；
离子喷雾电压：±4500V；
碰撞池出口电位：±10V；
入口电位：±10V。
实施例1（血浆，T3柱）：
一种液质联用定量检测血浆中多种脂肪酸的方法，包括如下步骤：
（1）样本提取：将-80℃保存的血浆在冰上解冻后，取50μL样本加入200μL的甲醇，涡旋30s后，在4℃离心机中14000rpm条件下离心15分钟，离心后观察是否有乳白色蛋白沉淀；取200μL上清液转入新管，不要吸到沉淀，得到提取后的血浆样本；
（2）衍生化反应：向步骤（1）新管中的血浆样本中加入50μL 200mmol/L的 3-硝基苯肼甲醇溶液、50μL 120mmol/L的 N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐甲醇溶液和50μL 2.5wt%的吡啶甲醇溶液，涡旋30s充分混合，在35℃下进行衍生化反应30min，利用氮吹仪吹干后得到干粉样品，放入-20℃保存；
（3）LC-MS检测：将干粉样品用50μL的50wt%甲醇水溶液复溶，超声5min，进行LC-MS检测，
液相色谱条件为：
色谱柱：3.5μm 4.6×250mm Waters XBridge T3 色谱柱；
柱温：55℃；
进样量：2μL；
流速：0.4mL/min；
流动相A为pH=8、含有10mmol/L乙酸铵的0.2wt%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，洗脱梯度为：
0.0~1.0 min：5%体积分数的流动相B；
1.0~7.5 min：流动相B的体积分数从5% 线性升高到50%；
7.5~8.5 min：流动相B的体积分数从50% 线性升高到90%；
8.5~11.5 min：90%体积分数的流动相B；
11.5~12.0 min：流动相B的体积分数从90% 线性下降到5%；
12.0~17.0 min：5%体积分数的流动相B；
质谱条件为：
气帘气：25 psi；
离子源温度：475℃；
第一离子源气体：33 psi；
第二离子源气体：33 psi；
离子喷雾电压：±4500V；
碰撞池出口电位：±10V；
入口电位：±10V；
质谱检测选择SRM模式进行采集；
待测脂肪酸的检测母离子质荷比通过以下公式计算：
Q1=14.0156n-2.0156m+165.9347；
其中，n为脂肪酸碳链长度，m为脂肪酸中的碳碳双键个数；
检测子离子的质荷比为137.04和152.05；
（4）定性和定量分析：将步骤（3）得到的检测结果，使用SCIEX OS软件进行定量。
实施例2（粪便，T3柱）：
一种液质联用定量检测粪便中多种脂肪酸的方法，包括如下步骤：
（1）样本提取：将-80℃保存的粪便在冰上解冻后，取50μL样本加入200μL的甲醇，涡旋30s后，在4℃离心机中14000rpm条件下离心15分钟，离心后观察是否有乳白色蛋白沉淀；取200μL上清液转入新管，不要吸到沉淀，得到提取后的粪便样本；
（2）衍生化反应：向步骤（1）新管中的粪便样本中加入50μL 200mmol/L的 3-硝基苯肼甲醇溶液、50μL 120mmol/L的 N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐甲醇溶液和50μL 2.5wt%的吡啶甲醇溶液，涡旋30s充分混合，在35℃下进行衍生化反应30min，利用氮吹仪吹干后得到干粉样品，放入-20℃保存；
（3）LC-MS检测：将干粉样品用50μL的50wt%甲醇水溶液复溶，超声5min，进行LC-MS检测，液相色谱条件和质谱条件与实施例1中相同；
（4）定性和定量分析：将步骤（3）得到的检测结果，使用SCIEX OS软件进行定量。
实施例3（血浆，氨基柱）：
实施例3与实施例1的区别在于，步骤（3）中的液相色谱条件为：
色谱柱：3.5μm 4.6×250mm Waters XBridge Amide 氨基柱；
柱温：55℃；
进样量：2μL；
流速：0.4mL/min；
流动相A为pH=8、含有20mmol/L乙酸铵的5wt%乙腈水溶液，流动相B为乙腈，洗脱梯度为：
0 min：流动相B的体积分数为85%；
0~3 min：流动相B的体积分数从85%到30%；
3~12 min：流动相B的体积分数从30%到2%；
12~15 min：流动相B的体积分数为2%；
15~16 min：流动相B的体积分数从2%到85%；
16~20 min：流动相B的体积分数为85%；
质谱条件及其余步骤均与实施例1中相同。
实施例4（粪便，氨基柱）：
实施例4与实施例3的区别在于，步骤（1）中采用粪便作为样本；样本提取、衍生化反应及LC-MS检测方法均与实施例3中相同。
对比例1（不进行衍生化反应）：
一种液质联用定量检测血浆中多种脂肪酸的方法，包括如下步骤：
（1）样本提取：将-80℃保存的血浆在冰上解冻后，取50μL样本加入200μL的甲醇，涡旋30s后，在4℃离心机中14000rpm条件下离心15分钟，离心后观察是否有乳白色蛋白沉淀；取200μL上清液转入新管，不要吸到沉淀，得到提取后的血浆样本；利用氮吹仪吹干后得到干粉样品，放入-20℃保存；
（2）LC-MS检测：将干粉样品用50μL的50wt%甲醇水溶液复溶，超声5min，进行LC-MS检测；液相色谱条件和质谱条件与实施例1中相同。
以有标准品的十四烷酸和十七烷酸为例，分别用其标准品配制成标准溶液，采用实施例1和对比例1中的方法对标准溶液进行分析，结果如图1~图4中所示。从图1和图2中可以看出，对比例1中不对样本进行衍生化，十四烷酸只有母离子峰227，没有子离子峰；实施例1中采用本发明中的方法对样本进行衍生化后，十四烷酸衍生化后母离子变成362，137.04和152.05处产生明显子离子峰，两个子离子峰处的色谱定量图如图5和图6中所示。同样，从图3和图4中可以看出，对比例1中不对样本进行衍生化，十七烷酸只有母离子峰270，没有子离子峰，而实施例1中采用本发明中的方法对样本进行衍生化后，十七烷酸的母离子变成404，137.04和152.05处产生明显子离子峰。十四烷酸和十七烷酸的母离子峰与采用本发明中的公式计算结果相同，在本发明限定的两处子离子峰处均有明显信号，说明本发明中的方法可检测没有标准品的脂肪酸。
实施例1~实施例4的样本中各脂肪酸含量的检测结果如表1中所示。
表1：脂肪酸定量检测结果（含量为相对含量）
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从上述数据中可以看出，采用本发明中的方法可有效对血浆和粪便中的各种脂肪酸进行定量检测，对于没有标准品的脂肪酸可直接根据公式计算其母离子质荷比，子离子质荷比只要在137.04和152.05中的一处有信号，就可以实现脂肪酸的定量，大大拓展了可以检测的脂肪酸种类。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，包括如下步骤：
（1）样本提取：用甲醇对血浆或粪便样本进行提取，得到提取后的样本；
（2）衍生化反应：向提取后的样本中加入3-硝基苯肼、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和吡啶进行衍生化反应，干燥后得到干粉样品；
（3）LC-MS检测：将干粉样品用甲醇水溶液复溶后进行LC-MS检测，得到各待测脂肪酸的含量；其中，质谱检测选择SRM模式进行采集；
待测脂肪酸的检测母离子质荷比通过以下公式计算：
Q1=14.0156n-2.0156m+165.9347；
其中，n为脂肪酸碳链长度，m为脂肪酸中的碳碳双键个数；
检测子离子的质荷比为137.04和152.05。
2.根据权利要求1所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，步骤（1）时样本提取时，样本和甲醇的体积比为1:4~5。
3.根据权利要求1或2所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，步骤（1）中的样本提取方法为：将冷冻保存的血浆或粪便样本解冻后，加入甲醇中，涡旋并离心提取后取上清液，得到提取后的样本。
4.根据权利要求3所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，涡旋时间25~35s；离心时的温度为0~4℃，转速13000~15000rpm，离心时间10~20min。
5.根据权利要求1所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，步骤（2）中的3-硝基苯肼、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐及吡啶以甲醇溶液的方式加入提取后的样本中，3-硝基苯肼溶液的浓度为150~250mmol/L，N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度为100~150 mmol/L，吡啶溶液的质量浓度为2~3%；提取后的样本与3-硝基苯肼溶液、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、吡啶溶液的体积比为4:0.8~1.5:0.8~1.2: 0.8~1.2。
6.根据权利要求1或5所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，步骤（2）中的衍生化反应温度为4~35℃，反应时间25~35min。
7.根据权利要求1所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，步骤（2）中所得干粉样品在-20℃以下保存。
8.根据权利要求1所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，步骤（3）中，液相色谱测试时的色谱条件为：
色谱柱： T3柱或氨基柱；
柱温：50~60℃；
进样量：2μL；
流速：0.3~0.5mL/min。
9.根据权利要求8所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，步骤（3）中，液相色谱测试时采用梯度洗脱法；
当色谱柱为T3柱时，流动相A为含有8~12mmol/L乙酸铵的0.15~0.25wt%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，洗脱梯度为：
0.0~1.0 min：5%体积分数的流动相B；
1.0~7.5 min：流动相B的体积分数从5% 到50%；
7.5~8.5 min：流动相B的体积分数从50% 到90%；
8.5~11.5 min：90%体积分数的流动相B；
11.5~12.0 min：流动相B的体积分数从90% 到5%；
12.0~17.0 min：5%体积分数的流动相B；
当色谱柱为氨基柱时，流动相A为含有18~22mmol/L乙酸铵的4~6wt%乙腈水溶液，流动相B为乙腈，洗脱梯度为：
0 min：流动相B的体积分数为85%；
0~3 min：流动相B的体积分数从85%到30%；
3~12 min：流动相B的体积分数从30%到2%；
12~15 min：流动相B的体积分数为2%；
15~16 min：流动相B的体积分数从2%到85%；
16~20 min：流动相B的体积分数为85%。
10.根据权利要求1所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，步骤（3）中的质谱条件为：
气帘气：20~30psi；
离子源温度：450~500℃；
第一离子源气体：30~35 psi；
第二离子源气体：30~35 psi；
离子喷雾电压：±4500V；
碰撞池出口电位：±10V；
入口电位：±10V。
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