CN117925669A - 克拉维胺合酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高克拉维酸生产菌发酵产能的方法，包括下述步骤：使克拉维酸生产菌过表达野生克拉维胺合酶SEQ ID NO:2的酶活力提高的突变体。本发明的方法有助于提高克拉维酸生产效率。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种克拉维胺合酶突变体，具体涉及一种用于提高克拉维酸生产菌发酵产能的克拉维胺合酶突变体。
背景技术
β-内酰胺类抗生素(Beta-lactam antibiotic)包括青霉素及其衍生物、头孢菌素、单酰胺环类等，故临床应用广泛，但长期使用会使病原菌产生耐药性。产生耐药性的主要机制是由于病原菌产生了β-内酰胺酶，水解β-内酰胺类抗生素分子结构中的酰胺环，从而导致药物失效。因此，β-内酰胺类抗生素联用β-内酰胺酶抑制剂是克服耐药性产生的优选途径之一。
1971年，克拉维酸(Clavulanic acid)首次由Higgens和Kastner在棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)中发现(International Journal of SystematicBacteriology.1971,21(4):326-330)，并在后续的研究中被证实是一种不可逆的β-内酰胺酶抑制剂。由于巨大的商业价值，自克拉维酸被发现起，相关工业菌株开发、发酵工艺优化以及成品药开发从未间断。2006年以后荷兰帝斯曼(DSM)公司停止克拉维酸菌株开发工作，后续研究均是通过发酵工艺优化来提高产量。
发明内容
发明人构思出通过基因工程或者代谢工程等途径从菌体内部生物合成环境、而不是从外部条件来提高克拉维酸生产能力即提升克拉维酸发酵单位的策略，并且通过对克拉维酸生物合成途径中一个重要酶-克拉维胺合酶的改造，显著提高了克拉维酸生产菌的发酵产能。因此，本发明包括如下技术方案。
一种提高克拉维酸生产菌发酵产能的方法，包括下述步骤：使克拉维酸生产菌过表达野生克拉维胺合酶SEQ ID NO:2(GenBank登录号为CP027858.1)的酶活力提高的突变体。
所述发酵产能也称发酵水平，是指通过发酵生产克拉维酸的能力即克拉维酸的生物合成能力。
优选地，上述克拉维酸生产菌是棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)。
更优选地，上述克拉维酸生产菌是棒状链霉菌工程菌，宿主菌是棒状链霉菌ATCC27064(Streptomyces clavuligerus ATCC 27064)。
本发明的第二个方面提供了一种克拉维胺合酶突变体，其为选自下述的多肽：
(a)氨基酸序列为SEQ ID NO:4的多肽，是野生克拉维胺合酶SEQ ID NO:2(GenBank登录号为CP027858.1)的L174R/E114K/G208S突变体；
(b)氨基酸序列与SEQ ID NO:4有90％以上、优选92％以上、优选95％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性、且酶活力相比SEQ ID NO:4提高的多肽。
所述SEQ ID NO:4的氨基酸序列为：
MASPIVDCTPYRDELLALASELPEVPRADLHGFLDEAKTLAARLPEGLAAALDTFNAVGSEDGYLLLRGLPVDDSELPETPTSTPAPLDRKRLVMEAMLALAGRRLGLHTGYQKLRSGTVYHDVYPSPGAHYLSSETSETLLEFHTEMAYHILQPNYVMLACSRADHENRAETRVGSVRKALPLLDEKTRARLFDRKVPCCVDVAFRSGVDDPGAIANVKPLYGDANDPFLGYDRELLAPEDPADKEAVAHLSQALDDVTVGVKLVPGDVLIIDNFRTTHARTPFSPRWDGKDRWLHRVYIRTDRNGQLSGGERAGDTISFSPRR(SEQ ID NO:4)。
本发明的另一方面还提供了编码上述克拉维胺合酶突变体的基因。
例如，编码克拉维胺合酶突变体SEQ ID NO:4的基因可以是核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示的多核苷酸、或者核苷酸序列与SEQ ID NO:3有90％以上、优选92％以上、优选95％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性的多核苷酸。
atggcctctccgatagttgactgcaccccgtaccgcgacgagctgctcgcgctcgcctccgagcttcccgaggtgccgcgcgcggacctccatggcttcctcgacgaggcgaagacgctggccgcccgtctcccggaggggctggccgccgctctcgacaccttcaacgccgtgggcagcgaggacggttatctgctgctgcgcgggctgcccgtcgacgacagcgagctgcccgagacgccgacctccaccccggccccgctggaccgcaagcggctggtgatggaggccatgctcgcgctggccggccgccggctcggtctgcacacggggtaccagaagctgcgctcgggcacggtctaccacgacgtgtacccgtcgcccggcgcgcactacctgtcctcggagacctccgagacgctgctggagttccacacggagatggcgtaccacatcctccagccgaactacgtcatgctggcctgctcccgcgcggaccacgagaaccgggcggagacgcgggtcggctcggtccgcaaggcgctgcccctgctggacgagaagacccgggcccgtctcttcgaccgcaaggtgccctgctgcgtggacgtggccttccgcagcggggtcgacgacccgggcgcgatcgccaacgtcaagccgctctacggggacgcgaacgacccgttcctcgggtacgaccgcgagctgctggcgccggaggaccccgcggacaaggaggccgtcgcccatctgtcccaggcgctcgacgatgtgaccgtcggggtgaagctcgtccccggtgacgtcctcatcatcgacaacttccgcaccacgcacgcgcggacgccgttctcgccccgctgggacgggaaggaccgctggctgcaccgcgtctacatccgcaccgaccgcaatggacagctctccggcggcgagcgcgcgggcgacaccatctcgttctcgcc gcgccgctga(SEQ ID NO:3)。
本发明的另一方面还提供了一种DNA分子，包含上述的编码基因。
进一步地，本发明还提供了一种包含上述DNA分子的质粒。所述质粒载体是适合于在棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)中表达外源基因的质粒，例如为质粒pIB139。
优选地，所述质粒上包括两个以上拷贝、优选四个以上、六个以上、八个以上拷贝的克拉维胺合酶突变体SEQ ID NO:4编码基因。
本发明的另一方面还提供了一种过表达上述转氨酶突变体的棒状链霉菌工程菌，其在宿主菌基因组中整合了如上述突变体的编码基因，或者在宿主菌中转化了上述的质粒。优选所述棒状链霉菌工程菌是转化了上述质粒的转化子。
优选地，宿主菌基因组中整合的所述突变体编码基因的拷贝数为两个以上拷贝、优选四个以上、六个以上、八个以上拷贝、更优选十个以上拷贝的上述编码基因。在该质粒转化入宿主菌细胞后，这些编码基因可以整合在染色体上的多拷贝序列位点或者多个位点。
在一种实施方式中，将所述编码基因整合于宿主菌基因组中的方式选自质粒转化和基因编辑技术，其中所述质粒转化选自化学转化法、热激转化法(Heat ShockTransformation)、接合转移、PEG介导的原生质体转化或者电转化等方法，所述质粒可以包括两个以上拷贝的所述编码基因；
所述基因编辑技术选自下组：同源双交换，TALEN系统，CRISPR-Cas9系统，CRISPR-Cpf1系统，CRISPR-Cas12系统，CRISPR-BEST系统，MuGENT(multiplex genome editing bynatural transformation，通过自然转化进行多重基因组编辑)，MUCICAT系统等。其中MUCICAT系统是专利文献CN113249400A中报道的细菌染色体目的基因多拷贝插入系统。
应理解，上述质粒转化宿主菌细胞后，还可以仍以质粒形式存在来表达上述编码基因，而不是将上述编码基因整合在染色体上，这是本领域技术人员熟知的。
进一步地，本发明的另一方面还提供了一种上述棒状链霉菌工程菌在发酵法生产克拉维酸中的用途。
本发明发现的克拉维胺合酶突变体SEQ ID NO:4能使克拉维酸生产菌发酵生产的克拉维酸产量提高2倍以上，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是用于表达野生克拉维胺合酶的质粒pIB139-cas2-0的结构图谱。
图2是检测两株表达克拉维胺合酶的菌株发酵生产克拉维酸的HPLC谱图。
具体实施方式
本发明从改进克拉维酸生产菌的生物合成“内在环境”出发，设计并尝试了对野生克拉维胺合酶(GenBank登录号为CP027858.1，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)进行突变改造，通过提高酶活力来强化克拉维酸代谢途径，实验证实了该“内在环境”改善能够有效提高菌株的克拉维酸产能，体现在酶活力提高的突变体的表达促进了克拉维酸生产。
在本文中，术语“野生(型)”、“野生酶”、“野生型酶”表示相同的意义，都是指Streptomyces clavuligerus ATCC 27064来源的野生型克拉维胺合酶(氨基酸序列如SEQID NO:2所示)。类似地，术语“克拉维胺合酶突变体”、“突变体克拉维胺合酶”、“突变克拉维胺合酶”和“突变酶”表示相同的意义，都是指克拉维胺合酶氨基酸序列中个别氨基酸残基发生突变后形成的突变体比如L174R/E114K/G208S突变体。有时为了表述方便起见，在本文中可以将野生酶与其突变体比如L174R/E114K/G208S突变体等统称为“克拉维胺合酶”。
本文中，上述所用术语“(酶活力、产能)提高”或“增加”表示相较于参考水平提高至少50％以上，例如相较于参考水平的至少80％以上、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、或至少约5倍的提高。
所述的“突变”包括但不限于氨基酸残基的替换、删除、插入、化学修饰，优选是正向突变即酶活力提高的突变。所述取代可以是非保守取代、保守取代或非保守取代和保守取代的组合。“保守的”氨基酸取代或突变是指具有相似侧链的残基的可互换性，并且因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。然而，如本文所用，如果保守的突变可以代替地为脂肪族至脂肪族、非极性至非极性、极性至极性、酸性至酸性、碱性至碱性、芳族至芳族、或限制残基至限制残基的取代，则保守的突变不包括亲水至亲水、疏水至疏水、含羟基至含羟基或小残基至小残基的取代。本技术领域公知，保守性置换的常见情况包括：芳香族氨基酸F、W、Y之间的相互置换；疏水性氨基酸L、I、V之间的相互置换，极性氨基酸Q、N之间的相互置换，碱性氨基酸K、R、H之间的相互置换，酸性氨基酸D、E之间的相互置换，羟基的氨基酸S、T之间的相互置换。此外，A、V、L或I可以保守地突变为另一脂肪族残基或另一非极性残基。示例性的保守取代例如可以根据下表来进行，其中在第二列中属于同一个分区的氨基酸可以相互取代，在优选的情况下第三列中同一行的氨基酸可互相取代：
“非保守取代”是指用具有显著不同的侧链特性的氨基酸进行的多肽中氨基酸的取代或突变。非保守取代可以使用上面所列的定义组之间而不是之内的氨基酸。在一个实施方案中，非保守突变影响(a)取代区域中肽主链的结构(例如，脯氨酸取代甘氨酸)、(b)电荷或疏水性、或(c)侧链体积。
“缺失”是指通过从参考多肽移除一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。缺失可以包括移除1个或多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸、或20个或更多个氨基酸、多达构成参考酶的氨基酸总数的10％，同时保留酶活性和/或保留工程化醛缩酶的改良特性。缺失可以针对多肽的内部和/或端部。在多个实施方案中，缺失可以包含连续的区段或者可以是不连续的。
“插入”是指通过从参考多肽添加一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。在一些实施方案中，改良的工程化醛缩酶包括将一个或多个氨基酸插入天然存在的醛缩酶中以及将一个或多个氨基酸插入其他改良的醛缩酶多肽中。插入可以是在多肽的内部，或羧基端或氨基端。如本文所用的插入包括如本领域中已知的融合蛋白。插入可以是连续氨基酸区段或者被天然存在的多肽中的一个或多个氨基酸分隔开。
为了进行定点突变，可以基于生物信息学技术对克拉维胺合酶进行立体模型构建(建模)，推断其酶催化活性中心、刚性/柔性结构区域等，选定可能的结构影响位点并尝试饱和突变。
本发明采用定点突变结合易错PCR随机突变方法对野生型克拉维胺合酶SEQ IDNO:2进行了多轮突变和高通量筛选，获得了一些酶活力显著提高的突变体，包括突变体SEQID NO:4以及氨基酸序列与SEQ ID NO:4具有高度同源性的其他突变酶，这些酶都属于本发明的保护范围。其中突变体SEQ ID NO:4相对于野生酶发生了L174R、E114K、G208S共3个位点突变。
为简要起见，本文中的氨基酸缩写既可以使用英文三字母、也可以采用英文单字母，这是本领域技术人员熟知的，这些缩写列于如下表1中：
表1、氨基酸中英文对照及缩写
| 丙氨酸 | Alanine | A或Ala | 脂肪族类 |
| 精氨酸 | Arginine | R或Arg | 碱性氨基酸类 |
| 天冬酰胺 | Asparagine | N或Asn | 酰胺类 |
| 天冬氨酸 | Aspartic acid | D或Asp | 酸性氨基酸类 |
| 半胱氨酸 | Cysteine | C或Cys | 含硫类 |
| 谷氨酰胺 | Glutamine | Q或Gln | 酰胺类 |
| 谷氨酸 | Glutamic acid | E或Glu | 酸性氨基酸类 |
| 甘氨酸 | Glycine | G或Gly | 脂肪族类 |
| 组氨酸 | Histidine | H或His | 碱性氨基酸类 |
| 异亮氨酸 | Isoleucine | I或Ile | 脂肪族类 |
| 亮氨酸 | Leucine | L或Leu | 脂肪族类 |
| 赖氨酸 | Lysine | K或Lys | 碱性氨基酸类 |
| 甲硫氨酸 | Methionine | M或Met | 含硫类 |
| 苯丙氨酸 | Phenylalanine | F或Phe | 芳香族类 |
| 脯氨酸 | Proline | P或Pro | 亚氨基酸 |
| 丝氨酸 | Serine | S或Ser | 羟基类 |
| 苏氨酸 | Threonine | T或Thr | 羟基类 |
| 色氨酸 | Tryptophan | W或Trp | 芳香族类 |
| 酪氨酸 | Tyrosine | Y或Tyr | 芳香族类 |
| 缬氨酸 | Valine | V或Val | 脂肪族类 |
本发明的克拉维胺合酶突变体SEQ ID NO:4的氨基酸数量有325个，结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
为了在Streptomyces clavuligerus工程菌中最佳地表达克拉维胺合酶突变体，可以对该酶的表达基因进行了密码子优化。密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在Streptomycesclavuligerus工程菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成，氨基酸的低频率密码子可以被用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在Streptomyces clavuligerus工程菌中得以改良。
例如，为了在Streptomyces clavuligerus工程菌中过表达克拉维胺合酶，经密码子优化的克拉维胺合酶突变体SEQ ID NO:4编码基因的核苷酸序列可以是SEQ ID NO:3。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
材料和方法
实施例中的引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉)。
2×孢子预萌发培养基：酵母提取物10g/L、酪蛋白氨基酸10g/L、氯化钙0.01M，121℃灭菌20min，用于接合转移实验链霉菌孢子萌发培养。
TES(0.05M，pH8.0)溶液：1.15g N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸定容到100mL纯水中，调pH值至8.0。121℃灭菌20min备用。用于链霉菌接合转移孢子萌发。
MS培养基：4g/L大豆超细粉、10g/L玉米淀粉、5g/L酵母自溶物、0.8g/L磷酸氢二钾，调pH值至6.9～7.1。分装至250mL摇瓶中，每瓶装液量为50mL，每瓶再加入0.5mL甘油酸三油酯，121℃灭菌20min，用于摇瓶种子培养。
BLF培养基：36g/L大豆超细粉、10g/L玉米淀粉、12g/L大豆蛋白提取物、1.95g/L磷酸氢二钾、1.5g/L氯化钾、1.0g/L六水氯化镁、0.38g/L二水氯化钙、0.18g/L氯化钠、0.08g/L六水三氯化铁、0.02g/L氯化铜、0.01g/L氯化锌、200mL/L MOPS溶液，调pH值至6.9～7.1。分装至250mL摇瓶中，每瓶装液量为50mL，每瓶再加入0.8mL甘油酸三油酯，121℃灭菌20min，用于摇瓶发酵培养。其中MOPS溶液：42g MOPS加入50mL纯化水，再加入88.5mL 1M氢氧化钠溶液，定容至200mL，调pH值7.1～7.3。
BLGZ培养基：24g/L高温豆粉、10g/L玉米淀粉、5g/L酵母浸粉、0.8g/L磷酸氢二钾，0.5g/L碳酸钙、0.2g/L氯化镁，调pH值至6.9～7.1。分装至1L摇瓶中，每瓶装液量为200mL，121℃灭菌20min，用于发酵罐种子培养。
BLGF培养基：36g/L大豆浓缩蛋白粉、10g/L玉米淀粉、3g/L甘油、0.8g/L磷酸氢二钾、1.0g/L六水氯化镁、0.5g/L氯化钠、0.38g/L二水氯化钙、0.1g/L六水三氯化铁、0.05g/L氯化锌、0.01g/L氯化铜，调pH值至6.9～7.1，用于发酵罐培养。5L生物反应器初始装液量为2L，发酵温度控制在28℃，pH值为6.9～7.1，搅拌转速500rpm空气流量为0.8～1.2vvm，溶氧不低于20％，当发酵液菌丝浓度高于28％时适当补水。
克拉维酸HPLC检测条件：安捷伦Agilent 1260液相色谱仪，色谱柱C18(4.6×250mm，5μm)，流动相：流动相A(10mmol四丁基硫酸氢铵，11.5％乙腈，pH＝6.0)：流动相C(乙腈)＝90：10(V/V)，检测波长：210nm，柱温：33℃，流速：1ml/min，进样量：20μl。
接合转移方法：
(1)供体菌准备：将含有接合质粒的大肠杆菌ET12567/pIB139-cas2-X(X表示质粒编号)接种至含50μg/ml阿泊拉霉素、25μg/ml氯霉素、25μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中，在37℃、220rpm条件下过夜培养作为种子。按1v/v％的接种量转接至10mL新鲜的液体LB培养基(含50μg/mL Apra；25μg/ml cm；25μg/ml kana)中，在37℃、220rpm条件下培养至OD600nm值为0.4-0.6。转移培养液到无菌离心管中，4000rpm条件下离心5min，弃上清。加入10mL不添加抗生素的液体LB培养基重悬菌体，4000rpm条件下离心5min，弃上清，再重复此步骤一次。向离心管中加入500μL不添加抗生素的液体LB培养基重悬菌体备用。
(2)链霉菌孢子预萌发：从平板上收集新鲜的棒状链霉菌孢子，约107个孢子，至50mL无菌离心管中，在4000rpm条件下离心5min，弃上清，用5mL TES(0.05M，pH8.0)溶液重悬孢子。将离心管放入50℃水浴中热击10min，随后用流动的自来水冷却至室温。向管中加入5mL 2×孢子预萌发培养基，随后在37℃、200rpm条件下孵育3h。孵育完成后在4000rpm条件下离心10min，弃上清，随后向管中加入250μL不添加抗生素的液体LB培养基。
(3)接合转移：取250μL孢子悬液与250μL大肠杆菌ET12567/pIB139-cas2-X菌悬液混合，涂布于含10mM MgCl2固体MS培养基，正置于28℃中孵育20h。取1mL含有1μg萘啶酮酸和1.2μg Apra的无菌水，均匀覆盖于平板表面，倒置于28℃培养箱中培养5～6天，挑取接合子单菌落进行验证。
需说明的是，为描述方便起见，在实施例中，可将菌株编号、质粒编号、酶编号、酶编码基因编号共用一个编号，这是本领域技术人员容易理解的，即同一个编号在不同环境中可以指代不同的生物形式。
实施例1：野生克拉维胺合酶表达菌株的构建
克拉维胺合酶来源于棒状链霉菌Streptomyces clavuligerus ATCC 27064，GenBank登录号为CP027858.1，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2，对应的克拉维胺合酶编号为cas2-0，对应的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。以棒状链霉菌ATCC 27064基因组为模板，设计引物CAS-1和CAS-2：
CAS-1：5’-GGAATTCCATATGGCCTCTCCGATAGTTGA-3’，
CAS-2：5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTCAGCGGCGCGGCGAGAA-3’。
利用KOD-plus DNA聚合酶PCR扩增：94℃5min；98℃10s，60℃30s，68℃1min/kb，25个循环；68℃10min。对PCR产物电泳、胶回收(Axygen DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50)。
利用限制性内切酶NdeI、NotI双酶切后，利用爱思进生物技术(杭州)有限公司的PCR清洁试剂盒除去一步克隆反应体系中的缓冲液和酶，纯化DNA后，连接到质粒pIB139的NdeI、NotI位点，获得质粒pIB139-cas2-0，质粒图谱如图1所示。
将质粒pIB139-cas2-0接合转移至棒状链霉菌ATCC 27064中，获得菌株Sc-0。
实施例2：克拉维胺合酶单点突变体及表达菌株的构建
基于针对野生克拉维胺合酶构建的立体模型，推断其酶催化活性中心、刚性/柔性结构区域等，选定可能的结构影响位点并尝试定点突变。如下列举出部分正向突变位点的实例。
以质粒pIB139-cas2-0为模板，PCR环扩约6.9kb的DNA产物，DpnI消化质粒模板，直接将PCR产物化学转化至Trans1-T1化学感受态细胞(北京全式金生物技术股份有限公司)中，获得质粒pIB139-cas2-1，对应的克拉维胺合酶突变体为cas2-1，突变位点为A86D。
设计如下引物对CAS-15/CAS-13：
CAS-15：5’-gacgccgacctccaccccggacccgctggaccgcaagcggc-3’，
CAS-13：5’-gccgcttgcggtccagcgggtccggggtggaggtcggcgtc-3’。
质粒pIB139-cas2-1测序无误后，将其接合转移至棒状链霉菌ATCC 27064中，获得菌株Sc-1。
以质粒pIB139-cas2-0为模板，PCR环扩约6.9kb的DNA产物，DpnI消化质粒模板，直接将PCR产物化学转化至Trans1-T1化学感受态细胞(北京全式金生物技术股份有限公司)中，获得质粒pIB139-cas2-2，对应的克拉维胺合酶突变体为cas2-2，突变位点为E114K。
设计如下引物对CAS-25/CAS-23：
CAS-25：5’-gtctgcacacggggtaccagaagctgcgctcgggcacggtc-3’，
CAS-23：5’-gaccgtgcccgagcgcagcttctggtaccccgtgtgcagac-3’。
质粒pIB139-cas2-2测序无误后，将其接合转移至棒状链霉菌ATCC 27064中，获得菌株Sc-2。
以质粒pIB139-cas2-0为模板，PCR环扩约6.9kb的DNA产物，DpnI消化质粒模板，直接将PCR产物化学转化至Trans1-T1化学感受态细胞(北京全式金生物技术股份有限公司)中，获得质粒pIB139-cas2-3，对应的克拉维胺合酶突变体为cas2-3，突变位点为P155S。
设计如下引物对CAS-35/CAS-33：
CAS-35：5’-tggcgtaccacatcctccagtcgaactacgtcatgctggcc-3’，
CAS-33：5’-ggccagcatgacgtagttcgactggaggatgtggtacgcca-3’。
质粒pIB139-cas2-3测序无误后，将其接合转移至棒状链霉菌ATCC 27064中，获得菌株Sc-3。
以质粒pIB139-cas2-0为模板，PCR环扩约6.9kb的DNA产物，DpnI消化质粒模板，直接将PCR产物化学转化至Trans1-T1化学感受态细胞(北京全式金生物技术股份有限公司)中，获得质粒pIB139-cas2-4，对应的克拉维胺合酶突变体为cas2-4，突变位点为L174R。
设计如下引物对CAS-45/CAS-43：
CAS-45：5’-cgagaaccgggcggagacgcgggtcggctcggtccgcaagg-3’，
CAS-43：5’-ccttgcggaccgagccgacccgcgtctccgcccggttctcg-3’。
质粒pIB139-cas2-4测序无误后，将其接合转移至棒状链霉菌ATCC 27064中，获得菌株Sc-4。
以质粒pIB139-cas2-0为模板，PCR环扩约6.9kb的DNA产物，DpnI消化质粒模板，直接将PCR产物化学转化至Trans1-T1化学感受态细胞(北京全式金生物技术股份有限公司)中，获得质粒pIB139-cas2-5，对应的克拉维胺合酶突变体为cas2-5，突变位点为G208S。
设计如下引物对CAS-55/CAS-53：
CAS-55：5’-gcgtggacgtggccttccgcagcggggtcgacgacccgggc-3’，
CAS-53：5’-gcccgggtcgtcgaccccgctgcggaaggccacgtccacgc-3’。
质粒pIB139-cas2-5测序无误后，将其接合转移至棒状链霉菌ATCC 27064中，获得菌株Sc-5。
以质粒pIB139-cas2-0为模板，PCR环扩约6.9kb的DNA产物，DpnI消化质粒模板，直接将PCR产物化学转化至Trans1-T1化学感受态细胞(北京全式金生物技术股份有限公司)中，获得质粒pIB139-cas2-6，对应的克拉维胺合酶突变体为cas2-6，突变位点为Q308K。
设计如下引物对CAS-65/CAS-63：
CAS-65：5’-tccgcaccgaccgcaatggaaagctctccggcggcgagcgc-3’，
CAS-63：5’-gcgctcgccgccggagagctttccattgcggtcggtgcgga-3’。
质粒pIB139-cas2-6测序无误后，将其接合转移至棒状链霉菌ATCC 27064中，获得菌株Sc-6。
实施例3：表达克拉维胺合酶单点突变体棒状链霉菌合成克拉维酸
在摇瓶水平上，利用表达克拉维胺合酶单点突变体棒状链霉菌Sc-1、Sc-2、Sc-3、Sc-4、Sc-5、Sc-6发酵合成克拉维酸，对照为Sc-0。按将106孢子接种于含有50mL液体SCZ培养基的250mL摇瓶中，在25℃、220rpm条件下孵育48h得到发酵种子培养液。取2mL种子培养液转接至50mL(250mL摇瓶)SCF培养基，在25℃、220rpm条件下孵育120h。取发酵培养物适当稀释，在12,000rpm、4℃条件下离心5min，取上清用0.22μm滤膜过滤后立即进行HPLC检测。
克拉维酸发酵检测结果如下表1所示，在克拉维酸提升倍数最高的突变体基础上进一步改造。
表1、表达克拉维胺合酶单点突变体棒状链霉菌的克拉维酸发酵结果
由表1中可知，L174R突变体cas2-4的表达菌株Sc-4的克拉维酸发酵水平最高，提示突变体cas2-4酶活力最高，以其为基础做进一步组合突变改造尝试。
实施例4：表达克拉维胺合酶双点突变体的棒状链霉菌菌株构建
参照实施例2的方法构建表达克拉维胺合酶双点突变体的棒状链霉菌菌株。
以质粒pIB139-cas2-4为模板，以CAS-15/CAS-13为引物，PCR环扩约6.9kb的DNA产物，DpnI消化质粒模板，直接将PCR产物化学转化至Trans1-T1化学感受态细胞(北京全式金生物技术股份有限公司)中，获得质粒pIB139-cas2-7，对应的克拉维胺合酶突变体为cas2-7，突变位点为L174R、A86D。质粒pIB139-cas2-7测序无误后，将其接合转移至棒状链霉菌ATCC 27064中，获得菌株Sc-7。
以质粒pIB139-cas2-4为模板，以CAS-25/CAS-23为引物，PCR环扩约6.9kb的DNA产物，DpnI消化质粒模板，直接将PCR产物化学转化至Trans1-T1化学感受态细胞(北京全式金生物技术股份有限公司)中，获得质粒pIB139-cas2-8，对应的克拉维胺合酶突变体为cas2-8，突变位点为L174R、E114K。质粒pIB139-cas2-8测序无误后，将其接合转移至棒状链霉菌ATCC 27064中，获得菌株Sc-8。
以质粒pIB139-cas2-4为模板，以CAS-35/CAS-33为引物，PCR环扩约6.9kb的DNA产物，DpnI消化质粒模板，直接将PCR产物化学转化至Trans1-T1化学感受态细胞(北京全式金生物技术股份有限公司)中，获得质粒pIB139-cas2-9，对应的克拉维胺合酶突变体为cas2-9，突变位点为L174R、P155S。质粒pIB139-cas2-9测序无误后，将其接合转移至棒状链霉菌ATCC 27064中，获得菌株Sc-9。
以质粒pIB139-cas2-4为模板，以CAS-55/CAS-53为引物，PCR环扩约6.9kb的DNA产物，DpnI消化质粒模板，直接将PCR产物化学转化至Trans1-T1化学感受态细胞(北京全式金生物技术股份有限公司)中，获得质粒pIB139-cas2-10，对应的克拉维胺合酶突变体为cas2-10，突变位点为L174R、G208S。质粒pIB139-cas2-10测序无误后，将其接合转移至棒状链霉菌ATCC 27064中，获得菌株Sc-10。
以质粒pIB139-cas2-4为模板，以CAS-65/CAS-63为引物，PCR环扩约6.9kb的DNA产物，DpnI消化质粒模板，直接将PCR产物化学转化至Trans1-T1化学感受态细胞(北京全式金生物技术股份有限公司)中，获得质粒pIB139-cas2-11，对应的克拉维胺合酶突变体为cas2-11，突变位点为L174R、Q308K。质粒pIB139-cas2-11测序无误后，将其接合转移至棒状链霉菌ATCC 27064中，获得菌株Sc-11。
实施例5：表达克拉维胺合酶双点突变体棒状链霉菌合成克拉维酸
参照实施例3的方法在摇瓶水平上，利用表达克拉维胺合酶双点突变体棒状链霉菌Sc-7、Sc-8、Sc-9、Sc-10、Sc-11发酵合成克拉维酸，对照为Sc-4。按将106孢子接种于含有50mL液体SCZ培养基的250mL摇瓶中，在25℃、220rpm条件下孵育48h得到发酵种子培养液。取2mL种子培养液转接至50mL(250mL摇瓶)SCF培养基，在25℃、220rpm条件下孵育120h。取发酵培养物适当稀释，在12,000rpm、4℃条件下离心5min，取上清用0.22μm滤膜过滤后立即进行HPLC检测。
克拉维酸发酵检测结果如下表2所示，在克拉维酸提升倍数最高的突变体基础上进一步改造。
表2、表达克拉维胺合酶双点突变体棒状链霉菌的克拉维酸发酵结果
由表1中可知，L174R/E114K突变体cas2-8的表达菌株Sc-8的克拉维酸发酵水平最高，提示突变体cas2-8酶活力最高，以其为基础做进一步组合突变改造尝试。
实施例6：表达克拉维胺合酶三点突变体的棒状链霉菌菌株构建
参照实施例2的方法构建表达克拉维胺合酶三点突变体的棒状链霉菌菌株。
以质粒pIB139-cas2-8为模板，以CAS-15/CAS-13为引物，PCR环扩约6.9kb的DNA产物，DpnI消化质粒模板，直接将PCR产物化学转化至Trans1-T1化学感受态细胞(北京全式金生物技术股份有限公司)中，获得质粒pIB139-cas2-12，对应的克拉维胺合酶突变体为cas2-12，突变位点为L174R、E114K、A86D。质粒pIB139-cas2-12测序无误后，将其接合转移至棒状链霉菌ATCC 27064中，获得菌株Sc-12。
以质粒pIB139-cas2-8为模板，以CAS-55/CAS-53为引物，PCR环扩约6.9kb的DNA产物，DpnI消化质粒模板，直接将PCR产物化学转化至Trans1-T1化学感受态细胞(北京全式金生物技术股份有限公司)中，获得质粒pIB139-cas2-13，对应的克拉维胺合酶突变体为cas2-13，突变位点为L174R、E114K、G208S。质粒pIB139-cas2-13测序无误后，将其接合转移至棒状链霉菌ATCC 27064中，获得菌株Sc-13。
实施例7：表达克拉维胺合酶三点突变体棒状链霉菌合成克拉维酸
参照实施例3的方法在摇瓶水平上，利用表达克拉维胺合酶三点突变体棒状链霉菌Sc-12、Sc-13发酵合成克拉维酸，对照为Sc-8。按将106孢子接种于含有50mL液体SCZ培养基的250mL摇瓶中，在25℃、220rpm条件下孵育48h得到发酵种子培养液。取2mL种子培养液转接至50mL(250mL摇瓶)SCF培养基，在25℃、220rpm条件下孵育120h。取发酵培养物适当稀释，在12,000rpm、4℃条件下离心5min，取上清用0.22μm滤膜过滤后立即进行HPLC检测。
克拉维酸发酵检测结果如下表3所示。
表3、表达克拉维胺合酶三点突变体棒状链霉菌的克拉维酸发酵结果
由表1中可知，L174R/E114K/G208S突变体cas2-13的表达菌株Sc-13的克拉维酸发酵水平有了更进一步提高，提示突变体cas2-13酶活力进一步提高。
实施例8：棒状链霉菌工程Sc-13的5L生物反应器水平发酵实验
分别进行棒状链霉菌Sc-0和Sc-13的发酵罐培养。在25℃、相对湿度为40～60％的条件下斜面培养8～10天。将3/4斜面培养的孢子接种至种子罐培养基，在25℃、搅拌转速400rpm、罐压0.05MPa条件下培养48h，随后将种子液转接至发酵培养基培养108h，取样并进行HPLC检测。棒状链霉菌Sc-0的发酵水平为798.3mg/L，而Sc-13的发酵水平为2465.2mg/L(图2)。
两个菌株的发酵罐发酵对比证实了工程菌Sc-13的克拉维酸发酵产能至少是原始菌株Sc-0的3倍，提示突变体L174R/E114K/G208S(氨基酸序列为SEQ ID NO:4)的酶活力比野生酶提高了至少2倍。
Claims (10)
1.提高克拉维酸生产菌发酵产能的方法，包括下述步骤：使克拉维酸生产菌过表达野生克拉维胺合酶SEQ ID NO:2的酶活力提高的突变体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述克拉维酸生产菌是棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述克拉维酸生产菌是棒状链霉菌工程菌，宿主菌是棒状链霉菌ATCC 27064(Streptomyces clavuligerus ATCC 27064)。
4.一种如权利要求1中所述的克拉维胺合酶突变体，其为选自下述的多肽：
(a)氨基酸序列为SEQ ID NO:4的多肽；
(b)氨基酸序列与SEQ ID NO:4有90％以上同源性、且酶活力相比SEQ ID NO:4提高的多肽。
5.编码如权利要求4所述克拉维胺合酶突变体的基因。
6.如权利要求7所述的基因，其特征在于，编码克拉维胺合酶突变体SEQ ID NO:4的基因是核苷酸序列为SEQ ID NO:3的多核苷酸、或者核苷酸序列与SEQ ID NO:3有90％以上同源性的多核苷酸。
7.一种DNA分子，其特征在于，包含如权利要求6所述的基因。
8.包含如权利要求7所述DNA分子的质粒。所述质粒载体是适合于在棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)中表达外源基因的质粒，例如为质粒pIB139。
9.一种过表达如权利要求4所述转氨酶突变体的棒状链霉菌工程菌，其特征在于，在宿主菌基因组中整合了如权利要求5所述的基因，或者在宿主菌中转化了如权利要求8所述的质粒。
10.如权利要求9所述棒状链霉菌工程菌在发酵法生产克拉维酸中的用途。
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