CN117887893A - 一种与冬瓜种子大小紧密连锁的kasp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与冬瓜种子大小紧密连锁的KASP分子标记，根据冬瓜基因组第10染色体上第16823593位SNP位点设计，该SNP位点存在G/C的碱基突变，其中G:G和G:C基因型表现为大种子的基因型，C:C基因型表现为小种子的基因型。还公开了一种检测所述KASP分子标记的引物和试剂盒以及利用所述引物鉴定冬瓜种子大小的方法，还公开了检测上述分子标记的试剂、引物、试剂盒或方法在苗期鉴定冬瓜种子大小表型以及冬瓜分子标记辅助育种中的应用。本发明中的引物或试剂盒可在苗期快速鉴定冬瓜的种子大小表型，并具有准确、快速、成本低、鉴定周期短、操作简便等优点，能够辅助冬瓜新品种选育，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于蔬菜分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种与冬瓜种子大小紧密连锁的KASP分子标记及其应用。
背景技术
冬瓜（Benincasa hispida Cogn.）是葫芦科(Cucurbitaceae)重要蔬菜作物，其产量高、耐贮存，在保障蔬菜周年供应及农产品加工等方面发挥重要作用。种子大小能够在一定程度上影响冬瓜的种子产量、发芽率和发芽势，因此，对冬瓜种子大小进行基因定位，开发紧密连锁的分子标记，通过分子标记对冬瓜种子大小性状进行苗期辅助选择，将有效的节省育种时间和用地，加快育种进程，对冬瓜品种选育具有重要的实践意义。
KASP（Kompetitive Allele-Specific PCR），即竞争性等位基因特异性PCR，与传统PCR方法相比，KASP技术具有通量高、成本低、效率高、无需电泳检测等优点。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种与冬瓜种子大小紧密连锁的KASP分子标记、检测所述KASP分子标记的引物和试剂盒。
本发明的目的还在于提供一种冬瓜种子大小的鉴定方法。
本发明的最后一个目的在于提供检测上述KASP分子标记的试剂、引物、试剂盒或方法在在苗期鉴定冬瓜种子大小表型中的应用以及在冬瓜分子标记辅助育种中的应用。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种与冬瓜种子大小紧密连锁的KASP分子标记，所述KASP分子标记根据冬瓜基因组第10染色体上第16823593位的SNP位点设计，该SNP位点存在G/C的碱基突变，对应的基因型包括G:G、G:C和C:C，其中G:G和G:C基因型表现为大种子的基因型，C:C基因型表现为小种子的基因型，所述KASP分子标记可通过如SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.3所示的引物扩增得到。
本发明第16823593位的SNP位点在大种子中该SNP位点为G，在小种子中该SNP位点为C。
其中冬瓜基因组的版本号为Wax gourd (Benincasahispida cv. B227) genome。
本发明还提供了一种检测与冬瓜种子大小紧密连锁的KASP分子标记的引物，所述引物包括两条特异性上游引物BhSSA1和BhSSA2，以及一条通用下游引物BhSSC1，其中所述上游引物BhSSA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述上游引物BhSSA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物BhSSC1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述上游引物BhSSA1的5’端添加有FAM荧光标签序列，所述上游引物BhSSA2的5’端添加有HEX荧光标签序列。
具体地，本发明提供的检测与冬瓜种子大小紧密连锁的KASP分子标记的引物，包含三条引物，其中两条上游引物BhSSA1和BhSSA2是根据SNP位点设计的特异性引物，引物3’末端为变异的碱基，5’端分别连接羧基荧光素FAM（GAAGGTGACCAAGTTCATGCT）和六氯荧光素氨基磷酸酯HEX（GAAGGTCGGAGTCAACGGATT）荧光信号标签序列，下游引物BhSSC1是一条通用引物，三条引物序列如下所示：
BhSSA1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGCCAATCCCACGGCGGG-3’（SEQ ID NO.1），下划线部分为荧光素FAM的序列。
BhSSA2：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGCCAATCCCACGGCGGC-3’（SEQ ID NO.2），下划线部分为荧光素HEX的序列。
BhSSC1：
5’-GGTTAAAGTGGGCTACATTCTTGGCTT-3’（SEQ ID NO.3）。
采用该引物进行PCR扩增，对扩增产物进行荧光检测，将荧光信号结合标记信息，完成基因分型。
大种子材料的基因型有2种，其中基因型为“G:G”类型的大种子材料荧光信号呈蓝色，聚集在靠近Y轴位置，基因型为“G:C”类型的大种子材料荧光信号呈绿色，聚集在靠近中间位置，小种子材料的基因型有1种为“C:C”，荧光信号呈橙色，聚集在靠近X轴位置。
本发明还进一步提供了一种检测与冬瓜种子大小紧密连锁的KASP分子标记的试剂盒，包括所述的引物。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种冬瓜种子大小的鉴定方法，包括以下步骤：
（1）提取待测冬瓜的DNA；
（2）采用所述引物或所述试剂盒进行PCR扩增，得到PCR产物；
（3）所述PCR产物经荧光检测后进行基因分型，所述KASP分子标记的分型中，基因型为G:G类型，判定为大种子纯合材料；基因型为G: C类型，判定为大种子杂合材料；基因型为C:C，判定为小种子纯合材料。
本发明所述PCR产物经荧光检测后，对PCR扩增产物进行分型检测，并以图表的形式呈现出来；图表分为X、Y轴，每一个数据点代表一个独立的DNA样品，相同基因型的样品会聚堆在一起，其中基因型为G:G类型，荧光信号呈蓝色，聚集在靠近Y轴的材料，判定为大种子纯合材料；基因型为G: C类型，荧光信号呈绿色，聚集在靠近中间位置，判定为大种子杂合材料；基因型为C:C，荧光信号呈橙色，聚集在靠近X轴，判定为小种子纯合材料。
本发明的上述最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：检测所述KASP分子标记的试剂在苗期鉴定冬瓜种子大小表型中的应用。
本发明还提供了检测所述KASP分子标记的试剂在冬瓜分子标记辅助育种中的应用。
本发明还提供了上述检测所述KASP分子标记的引物或试剂盒在苗期鉴定冬瓜种子大小表型中的应用以及在冬瓜分子标记辅助育种中的应用。
本发明还进一步提供了上述方法在苗期鉴定冬瓜种子大小表型中的应用以及在冬瓜分子标记辅助育种中的应用。
具体地，上述检测与冬瓜种子大小紧密连锁的KASP标记的引物、试剂盒或方法用于冬瓜种子大小辅助选择时，群体单株种子大小表型与上述分子标记的引物或试剂盒扩增的带型一致。
本发明具有以下优点：本发明中的KASP分子标记引物可在苗期快速鉴定冬瓜的种子大小表型，并具有准确、快速、成本低、鉴定周期短、操作简便等优点，能够辅助冬瓜新品种选育，具有广阔的应用前景。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1是实施例1中冬瓜种子大小基因初定位结果；
图2是实施例1中冬瓜种子大小基因精细定位结果；
图3是实施例2中采用KASP分子标记引物对大种子冬瓜B227、小种子冬瓜HF3以及F2分离群体部分单株的基因分型图，基因型为G:G类型，荧光信号呈蓝色，聚集在靠近Y轴的材料，判定为大种子纯合材料；基因型为G: C类型，荧光信号呈绿色，聚集在靠近中间位置，判定为大种子杂合材料；基因型为C:C，荧光信号呈橙色，聚集在靠近X轴，判定为小种子纯合材料，下同；
图4是实施例2中采用KASP分子标记引物对不同种质材料的基因分型图。
具体实施方式
下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
本实施例以小种子自交系材料HF3为母本，大种子自交系材料B227为父本，杂交获得F1（大种子），F1自交获得F2分离群体，随后，在F2群体中选择极端大、小种子单株各30株构建基因池，进行BSA-seq，将种子大小基因初步定位于冬瓜第10染色体13.55~18.24 Mb区间（如图1所示）。进一步构建包含1486个单株的F2群体进行标记加密，将该基因定位于16.809-16.857MB之间47.098 kb区间内（如图2所示），在该区间检测SNP位点，在第16823593位（基因组版本号：Wax gourd (Benincasahispida cv. B227) genome）的SNP基因型与表型吻合，确定该SNP变异位点与冬瓜种子大小性状紧密连锁。在大种子亲本中该位点为G:G，在小种子亲本中该位点为C:C，在F1中该位点为G:C。
根据该SNP位点信息，使用PrimerPicker Lite for KASPar Version 0.26（https://www.biosearchtech.com/）开发KASP标记，该标记共包含3条引物，其中两条上游引物BhSSA1和BhSSA2是根据SNP位点设计的特异性引物，引物3’末端为变异的碱基，5’端分别连接FAM和HEX荧光接头，下游引物BhSSC1是一条通用引物，3条引物序列如下所示：
BhSSA1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGCCAATCCCACGGCGGG-3’（SEQ ID NO.1），下划线部分为荧光素FAM的序列。
BhSSA2：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGCCAATCCCACGGCGGC-3’（SEQ ID NO.2），下划线部分为荧光素HEX的序列。
BhSSC1：
5’-GGTTAAAGTGGGCTACATTCTTGGCTT-3’（SEQ ID NO.3）。
还可以将该引物开发成试剂盒使用。
实施例2
利用上述标记的引物对两个亲本、F2群体单株及不同种质材料进行PCR扩增及PCR产物的应该检测，包括以下步骤：
（1）冬瓜DNA提取
实验材料为大种子冬瓜B227和小种子冬瓜HF3，F2群体单株以及种子大小和来源不同的冬瓜种质资源材料的新鲜叶片，提取基因组DNA步骤如下：
①取少量新鲜叶片放入2mL离心管中，加入钢珠，在磨样机上研磨，每秒震荡30次，震荡2min，加入800μL 2%CTAB提取液，混匀后置于65℃水浴1h（每隔10min摇匀一次）；
②静置至室温后，加入800μL的氯仿：异戊醇（体积比24：1），轻柔混匀10min后离心，12000rpm，15min，取上清（约600μL）转移至新的1.5mL离心管；
③加入上清液2/3体积的异丙醇，轻柔混匀后置于-20℃，30min~1h；
④12000rmp，离心10min，弃上清；
⑤向离心管中加入无水乙醇洗涤DNA沉淀1次，再用75%（体积百分含量）乙醇乙醇洗1次，放在超净工作台上吹干；
⑥加入50μL TE（或ddH2O）溶解，作为冬瓜基因组DNA备用。
（2）以冬瓜基因组DNA为模板，采用实施例1中筛选出的KASP分子标记引物进行PCR扩增。
PCR扩增在BIO-RAD公司的CFX96荧光定量仪中进行，10μL反应体系包括：浓度为100ng•μL-1的基因组DNA1μL，2×KASP Master Mix 5μL，浓度为10mmol•L-1的上游引物BhSSA1和BhSSA2各0.1μL，浓度为10mmol•L-1的下游引物BhSSC1浓度为0.3μL，ddH2O3.5μL。
PCR扩增的程序为：95℃预变性10min后，95℃变性15s，61-55℃退火1min，退火温度每循环降低0.6℃，共10个循环，然后95℃变性15s，55℃延伸1min，28个循环后，30℃运行1min进行荧光信号读取。
（3）扩增结果：PCR产物经荧光读取后，大种子纯合单株荧光为蓝色聚集在靠近Y轴、杂合单株为绿色聚集在靠近中间位置，小种子单株中荧光为橙色，聚集在靠近X轴。
具体为：大种子亲本B227（G:G）呈蓝色荧光，小种子亲本HF3（C:C）呈橙色荧光，93个F2群体单株中，呈蓝色荧光的纯合（G:G）大种子单株20株，呈绿色荧光的杂合（G:C）大种子单株49株，呈橙色荧光的小种子（C:C）单株24株，荧光聚类与表型结果完全一致，如图3所示。
在95个不同种来源的冬瓜种质材料中，呈蓝色荧光的纯合（G:G）材料75份，经表型鉴定75份材料均为大种子类型。呈绿色荧光的杂合（G:C）材料12份，经表型鉴定其中7份材料为大种子类型，5份材料（RDG13、RDG19、RDG20、RDG89和RDG92）为小种子类型。呈橙色荧光的（C:C）材料8份，经表型鉴定全部为小种子类型（表1），如图4所示。
基于上述结果，该KASP在遗传群体中的检测符合率为100%，在不同种质资源中的鉴定符合率为94.7%。
表1 95个不同种来源的冬瓜种质材料的表型和基因型对比结果
| 编号 | 来源 | 基因型 | 表型 | 编号 | 来源 | 基因型 | 表型 | 编号 | 来源 | 基因型 | 表型 |
| RDG1 | 云南 | G:G | 大 | RDG33 | 广东 | G:G | 大 | RDG65 | 广东 | G:C | 大 |
| RDG2 | 云南 | G:G | 大 | RDG34 | 广东 | G:G | 大 | RDG66 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG3 | 云南 | G:G | 大 | RDG35 | 湖南 | G:G | 大 | RDG67 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG4 | 云南 | G:C | 大 | RDG36 | 广东 | G:G | 大 | RDG68 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG5 | 云南 | G:G | 大 | RDG37 | 广东 | G:G | 大 | RDG69 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG6 | 云南 | G:G | 大 | RDG38 | 四川 | G:G | 大 | RDG70 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG7 | 云南 | C:C | 小 | RDG39 | 四川 | G:G | 大 | RDG71 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG8 | 云南 | C:C | 小 | RDG40 | 广东 | G:G | 大 | RDG72 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG9 | 云南 | G:G | 大 | RDG41 | 广东 | G:G | 大 | RDG73 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG10 | 云南 | C:C | 小 | RDG42 | 广东 | G:C | 大 | RDG74 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG11 | 云南 | C:C | 小 | RDG43 | 广东 | G:G | 大 | RDG75 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG12 | 云南 | G:C | 大 | RDG44 | 广东 | G:G | 大 | RDG76 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG13 | 云南 | G:C | 小 | RDG45 | 广东 | G:G | 大 | RDG77 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG14 | 云南 | G:G | 大 | RDG46 | 广东 | G:G | 大 | RDG78 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG15 | 云南 | C:C | 小 | RDG47 | 广东 | G:G | 大 | RDG79 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG16 | 云南 | G:G | 大 | RDG48 | 广东 | G:G | 大 | RDG80 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG17 | 云南 | G:G | 大 | RDG49 | 广东 | G:G | 大 | RDG81 | 广东 | G:C | 大 |
| RDG18 | 云南 | C:C | 小 | RDG50 | 广东 | G:G | 大 | RDG82 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG19 | 云南 | G:C | 小 | RDG51 | 广东 | G:G | 大 | RDG83 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG20 | 云南 | G:C | 小 | RDG52 | 广东 | G:G | 大 | RDG84 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG21 | 广东 | G:G | 大 | RDG53 | 广东 | G:G | 大 | RDG85 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG22 | 广东 | G:G | 大 | RDG54 | 广东 | G:G | 大 | RDG86 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG23 | 广东 | G:G | 大 | RDG55 | 广东 | G:G | 大 | RDG87 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG24 | 广东 | G:G | 大 | RDG56 | 广东 | G:G | 大 | RDG88 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG25 | 广东 | G:G | 大 | RDG57 | 广东 | G:G | 大 | RDG89 | 广东 | G:C | 小 |
| RDG26 | 广东 | G:G | 大 | RDG58 | 广东 | G:G | 大 | RDG90 | 广东 | C:C | 小 |
| RDG27 | 广东 | G:G | 大 | RDG59 | 广东 | G:G | 大 | RDG91 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG28 | 广东 | G:C | 大 | RDG60 | 广东 | G:C | 大 | RDG92 | 广东 | G:C | 小 |
| RDG29 | 云南 | G:G | 大 | RDG61 | 广东 | G:G | 大 | RDG93 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG30 | 安徽 | G:G | 大 | RDG62 | 广东 | G:G | 大 | RDG94 | 广东 | C:C | 小 |
| RDG31 | 江苏 | G:G | 大 | RDG63 | 广东 | G:G | 大 | RDG95 | 广东 | G:G | 大 |
| RDG32 | 江苏 | G:G | 大 | RDG64 | 广东 | G:G | 大 |
以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。
Claims (10)
1.一种与冬瓜种子大小紧密连锁的KASP分子标记，其特征在于：所述KASP分子标记根据冬瓜基因组第10染色体上第16823593位的SNP位点设计，该SNP位点存在G/C的碱基突变，对应的基因型包括G:G、G:C和C:C，其中G:G和G:C基因型表现为大种子的基因型，C:C基因型表现为小种子的基因型，所述KASP分子标记可通过如SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.3所示的引物扩增得到。
2.一种检测与冬瓜种子大小紧密连锁的KASP分子标记的引物，其特征在于：所述引物包括两条特异性上游引物BhSSA1和BhSSA2，以及一条通用下游引物BhSSC1，其中所述上游引物BhSSA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述上游引物BhSSA2的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述下游引物BhSSC1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述上游引物BhSSA1的5’端添加有FAM荧光标签序列，所述上游引物BhSSA2的5’端添加有HEX荧光标签序列。
3.一种检测与冬瓜种子大小紧密连锁的KASP分子标记的试剂盒，其特征在于：包括权利要求2所述的引物。
4.一种冬瓜种子大小的鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）提取待测冬瓜的DNA；
（2）采用权利要求2所述引物或权利要求3所述试剂盒进行PCR扩增，得到PCR产物；
（3）所述PCR产物经荧光检测后进行基因分型，所述KASP分子标记的分型中，基因型为G:G类型，判定为大种子纯合材料；基因型为G: C类型，判定为大种子杂合材料；基因型为C:C，判定为小种子纯合材料。
5.检测权利要求1所述KASP分子标记的试剂在苗期鉴定冬瓜种子大小表型中的应用。
6.检测权利要求1所述KASP分子标记的试剂在冬瓜分子标记辅助育种中的应用。
7.权利要求2所述的引物或权利要求3所述的试剂盒在苗期鉴定冬瓜种子大小表型中的应用。
8.权利要求2所述的引物或权利要求3所述的试剂盒在冬瓜分子标记辅助育种中的应用。
9.权利要求4所述方法在苗期鉴定冬瓜种子大小表型中的应用。
10.权利要求4所述方法在冬瓜分子标记辅助育种中的应用。
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