CN109234433A - 一种冬瓜籽型基因的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种冬瓜籽型基因的SNP分子标记，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第1120位碱基是SNP位点，其碱基为T或C。还公开了用于扩增上述的SNP分子标记的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，该引物对能产生单边籽材料特异性标记和双边籽材料特异性标记，重复性好，特异性强；还公开了一种冬瓜籽型的鉴定方法，该方法准确、快速、成本低、鉴定周期短，操作简便。还进一步公开了上述SNP分子标记以及引物对在鉴定冬瓜籽型中的应用。

Description

一种冬瓜籽型基因的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种冬瓜籽型基因的SNP分子标记及其应用。

背景技术

根据冬瓜种皮形状和结构的不同，可将成熟种子分为无棱光籽(俗称单边籽)和有棱扁籽(俗称双边籽)。单边籽通常具有不同程度的休眠，其发芽率一般在60％以下、发芽慢且不整齐，而双边籽种子发芽速度快、整齐，且发芽率超过90％。根据国家种子标准，冬瓜商品种子的发芽率仅为60％，而其他葫芦科作物的发芽率标准为90％以上。因此，籽型是冬瓜重要的性状，双边籽品种因其高发芽率而深受种子公司及种植户喜爱，是现代冬瓜育种的重要方向。

然而，只有将成熟期果实切口才能辨别冬瓜籽型，在果实为成熟前无法区分。因此，如何在早期鉴定冬瓜籽型，并减少工作量成为了难题。单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism,SNP)是指由于单个核苷酸的变异所形成的遗传标记，其数量多、多态性丰富、适于快速、自动化分析。衍生型酶切扩增多态性序列(derived cleavedamplified polymorphic sequence,dCAPS)技术通过在扩增引物中加入错配碱基，并结合SNP位点引入限制性内切酶位点，从而可以酶切检测几乎所有SNPs。dCAPS技术自发明以来大量应用于分子遗传学及种质资源品种品系鉴定等方面研究，但目前还未有人将其用于冬瓜籽型方面。

本发明开发与籽型相关的SNP分子标记，能够在苗期进行分子标记辅助选择，可提高选择的准确性，缩小育种群体，从而加速育种进程，提高育种效率。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种冬瓜籽型基因的SNP分子标记，根据该分子标记能设计特异性引物，进而区分冬瓜籽型。

本发明的第二个目的在于提供用于一种冬瓜籽型的鉴定方法，该方法准确、快速、成本低、鉴定周期短，操作简便。

本发明的第三个目的在于提供上述冬瓜籽型基因的SNP分子标记及上述引物对在鉴定冬瓜籽型中的应用。

本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种冬瓜籽型基因的SNP分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第1120位碱基是SNP位点，其碱基为T或C。

用于扩增上述的SNP分子标记的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步的，所述引物对为dCAPS引物对。

本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种冬瓜籽型的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)提取冬瓜叶片的基因组DNA；

(2)以冬瓜基因组DNA为模板，采用上述的引物对进行PCR扩增，得PCR扩增产物；

(3)取PCR扩增产物，进行酶切；

(4)将酶切产物进行电泳；

(5)当仅产生173bp的单边籽亲本特异性标记SS173时，该冬瓜为单边籽冬瓜；当同时产生173bp的单边籽亲本特异性标记SS173和199bp的双边籽亲本特异性标记SS199时，该冬瓜为双边籽冬瓜；当仅产生199bp的双边籽亲本特异性标记SS199时，该冬瓜为双边籽冬瓜。

优选的，步骤(3)中采用限制性内切酶SphI进行酶切。

优选的，步骤(4)中采用聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。

因此，进一步的，该冬瓜籽型的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)提取冬瓜叶片的基因组DNA；

(2)以冬瓜基因组DNA为模板，采用上述的引物对进行PCR扩增；

(3)取PCR扩增产物，利用限制性内切酶SphI进行酶切；

(4)将酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；

(5)当扩增产物能被SphI限制性内切酶酶切并产生173bp的单边籽亲本特异性标记SS173时，该冬瓜为单边籽冬瓜；当扩增产物能部分被SphI限制性内切酶酶切并同时产生199bp的双边籽亲本特异性标记SS199和173bp的单边籽亲本特异性标记SS173时，该冬瓜为双边籽冬瓜；当扩增产物不能被SphI限制性内切酶酶切同时产生199bp的双边籽亲本特异性标记SS199时，该冬瓜为双边籽冬瓜。

在该冬瓜籽型的鉴定方法中：

优选的，步骤(2)中PCR扩增时，PCR反应体系包括1μL基因组DNA、2μL含Mg²⁺的10×PCR buffer、1.5μL dNTPs、1μL上游引物、1μL下游引物、1U Taq酶，添加ddH₂O至20μL。

更佳的，PCR反应体系包括1μL浓度为200ng·μL^-1的基因组DNA、2μL含Mg²⁺的10×PCR buffer、1.5μL浓度为2.5mM的dNTPs、1μL浓度为10mM的上游引物SS-F、1μL浓度为10mM的下游引物SS-R、1U Taq酶、添加ddH₂O至20μL。

优选的，步骤(2)中PCR扩增时，扩增程序为：94℃预变性3min后，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃终延伸7min，4℃保存。

优选的，步骤(3)中PCR扩增酶切时，酶切反应体系为2μL PCR扩增产物，1U SphI内切酶，添加ddH₂O至10μL；扩增程序为：37℃酶切3小时。

优选的，步骤(4)中凝胶电泳时采用质量百分含量为8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

本发明的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：上述冬瓜籽型基因的SNP分子标记、引物对在鉴定冬瓜籽型中的应用。

本发明通过对电泳结果进行分析，该用于扩增所述SNP分子标记的引物对能产生199bp的双边籽亲本B214特异性标记SS₁₉₉和173bp的单边籽亲本B227特异性标记SS₁₇₃。由于该标记为共显性标记，同时具有亲本特异性条带的单株为杂合体。

因此，当SNP分子标记引物对仅产生199bp的双边籽亲本特异性标记SS₁₉₉时，该冬瓜为双边籽冬瓜；当该分子标记引物对能同时产生199bp的双边籽亲本特异性标记SS₁₉₉和173bp的单边籽亲本特异性标记SS₁₇₃时，该冬瓜为双边籽冬瓜；当该分子标记引物对仅产生173bp的单边籽亲本特异性标记SS₁₇₃时，该冬瓜为单边籽冬瓜。

因此，本发明中的冬瓜籽型基因的SNP分子标记、引物对能用于籽型鉴定。

本发明具有如下优点：

(1)本发明中的用于扩增SNP分子标记的引物对能同时产生单边籽材料特异性标记和双边籽材料特异性标记，且特异性强；

(2)本发明的方法可在苗期快速鉴定冬瓜的籽型表型；

(3)本发明方法具有准确、快速、成本低、鉴定周期短，操作简便等优点，能够辅助冬瓜新品种选育，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例1中遗传图谱、重测序以及GWAS定位对照图，其中a图是遗传图谱定位，b图是双边和单边在重测序资源中的分布，c图是GWAS定位结果；

图2是实施例1-2中冬瓜籽型基因SNP标记的PCR扩增产物酶切后的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱(M：100bp Ladder Ⅰ分子量标准；B227：单边籽亲本，B214：双边籽亲本代)；

图3为实施例3中该标记在第1-96号F_4:5家系单株中的扩增结果；

图4为实施例3中该标记在不同生态型冬瓜资源中的扩增结果。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供的冬瓜籽型基因的SNP分子标记以及用于扩增SNP分子标记的引物对(dCAPS引物对)的开发及验证过程如下：

材料：亲本的来源：B227：单边籽亲本，B214：双边籽亲本。

以单边籽冬瓜B227与双边籽冬瓜B214为亲本构建6世代分离群体，研究冬瓜籽型的遗传规律，结果显示双边与单边为一对核基因控制的质量性状，双边对单边为显性。随后，利用F₂群体构建冬瓜高密度遗传图谱，将籽型基因定位于第4号染色体，与两侧标记间的遗传距离分别为0.4cM和0.8cM。

根据冬瓜全基因组De Novo测序(包括B227)和146份核心资源(包含B214)的基因组重测序信息，通过GWAS分析同样定位了籽型基因，其定位结果与上述基于遗传图谱的定位结果完全一致(如图1所示)。

综合比较定位区间，获得一个候选基因YABBY4转录因子，将其命名为BhYABBY4。通过比较双边籽材料与单边籽材料基因组中BhYABBY4序列，发现在两者间存在1个SNP(单核苷酸的多态性)的改变。

该SNP位于BhYABBY4序基因的1120bp处，单边籽亲本为胸腺嘧啶核苷酸(T)(如序列表SEQ ID NO.1所示)，而双边籽亲本为胞嘧啶核苷酸(C)(如序列表SEQ ID NO.1所示，不同的是第1120bp位置处为C)。

在SNP位点两侧设计一对特异性引物，包括上游引物SS-F和下游引物SS-R。

上游引物和下游引物的具体核苷酸序列分别如下：

SS-F：5’-AATGATAAGAGAGATGGAGGCGCA’(如SEQ ID NO.2所示)；

SS-R：5’-CAATGTGTCAGCCAAAGGAG’(如SEQ ID NO.3所示)。

根据冬瓜籽型基因定位及候选基因筛选等前期研究结果，使用该对特异dCAPS标记对单边籽亲本B227和双边籽亲本B214进行扩增，该dCAPS标记能产生199bp的双边籽亲本B214特异性标记SS₁₉₉(SEQ ID NO.5)和173bp的单边籽亲本B227特异性标记SS₁₇₃(SEQ IDNO.4)，结果该标记带型清晰、重复性好。

具体过程为：以冬瓜基因组DNA为模板，使用上述SNP分子标记引物对进行PCR扩增—扩增产物酶切—对酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳—特异性片段(聚丙烯酰胺非变性胶)回收DNA—PCR扩增—琼脂糖胶回收—TA克隆测序后，结果如图2所示，分析图2中结果得知：该标记能产生199bp的双边籽亲本B214特异性标记SS₁₉₉和173bp的单边籽亲本B227特异性标记SS₁₇₃。

实施例2

本实施例提供的冬瓜籽型的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)冬瓜DNA的提取

实验材料为B227及B214的新鲜叶片，提取基因组DNA步骤如下：

①取少量新鲜叶片放入2mL离心管中，加入液氮用研磨杵研磨，在液氮快蒸干时迅速加入800μL 2％CTAB提取液，混匀后置于65℃水浴45min(每隔10min摇匀一次)；

②静置至室温后，加入800μL的氯仿：异戊醇(24:1)，轻柔混匀，静置2min后离心，12000rmp，15min，取上清(约510μL)转移至新的1.5mL离心管；

③加入上清液1/3体积的NaAc(3mol/L)，加入上清液1.5倍体积的无水乙醇(-20℃预冷)，轻柔混匀后置于-20℃30min-1h；

④12000rmp，离心10min，弃上清；

⑤向离心管中加入75％乙醇(预冷的)洗涤DNA沉淀2次，再用无水乙醇洗1次，放在超净工作台上吹干；

⑥加入50μL TE(或ddH₂O)溶解，作为冬瓜基因组DNA备用。

(2)以冬瓜基因组DNA为模板，采用实施例1中设计出的SNP分子标记引物对进行PCR扩增。

PCR体系(20μL)

PCR扩增的程序为：94℃预变性3min后，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃终延伸7min，置于4℃保存。

(3)对PCR扩增产物进行酶切，取2μLPCR产物，1μL10×Buffer，1U SphI限制性内切酶，添ddH₂O至10μl。扩增程序为：37℃酶切3小时。

(4)酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测

①将酶切产物加入4μL 6×Loading buffer，甩下后涡旋混匀；

②取2μL扩增产物用8％(质量百分比)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，180V稳压60min；

③将PAGE胶拆下，先用蒸馏水洗一遍，再用0.1％AgNO₃溶液染色10min；

④用蒸馏水洗2遍，再用2％NaOH、0.04％Na₂CO₃、0.4％甲醛显色10min，显色后用自来水洗两遍，然后在灯箱上拍照分析。

(4)扩增结果

该SNP分子标记引物对在单边籽亲本B227中扩增出173bp的条带，在双边籽亲本B214中扩增出199bp的条带(见图2)。

回收特异条带，送生工公司测序。173bp、199bp条带的序列如SEQ ID NO.4和SEQID NO.5所示，分别与B227和B214扩增产物的序列相符。

当SNP分子标记引物对仅产生199bp的双边籽亲本特异性标记SS₁₉₉时，该冬瓜为双边籽冬瓜；当该标记引物对能同时产生199bp的双边籽亲本特异性标记SS₁₉₉和173bp的单边籽亲本特异性标记SS₁₇₃时，该冬瓜为双边籽冬瓜；当该标记引物对仅产生173bp的单边籽亲本特异性标记SS₁₇₃时，该冬瓜为单边籽冬瓜。

实施例3

采用实施例2的方法对B227与B214的F4:5家系群体(F2群体自交一代是F2:3家系、再自交一代是F3:4、然后是F4:5)的96个单株进行验证。对各单株分别编号，提取单株DNA进行检测(见图3)；两条带是杂合的带型是双边，一条带的，大片段是双边，小片段是单边。

通过标记检测结果发现，199bp带型的单株有60个(双边纯合)，173bp带型的单株8个(单边纯合)，杂合带型20个(双边杂合)，其余8个未扩增出条带。

田间性状鉴定结果与标记检测结果一致，准确率达到100％。

实施例4

采用实施例2的方法对45份不同生态型冬瓜种质资源进行验证(表1)。每份资源混合取样，DNA进行检测(见图4)；两条带是杂合的带型是双边，一条带的，大片段是双边，小片段是单边。

表1不同生态型冬瓜资源及种子表型

通过标记检测结果(图3)与田间性状鉴定结果完全一致，准确率达到100％。

以上实施例表明，本发明的方法可将双边籽与单边籽材料进行有效区分，准确并快速检测出材料的冬瓜籽型。

本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。

序列表

<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所

<120> 一种冬瓜籽型基因的SNP分子标记及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1948

<212> DNA

<213> 冬瓜(Benincasa hispida )

<400> 1

ttggtgtgtt cgtgtcagga tgaaattaat atgtttcatt gtcgttgggg gcgcagatcc 60

aaagcaggca ggcagtaggg gagttttaag aagcagactt tgacctatga attatgaaac 120

caaaaaaaca taaataaata aataagaaga aaaaagggca ttatcatatt atattatatt 180

atactataga gaggattaat ttgaatttag ttgaggtgaa aagggagaca ccaatctcaa 240

tctcaatctc aatctcaatc tcagtggcat ccattcaatt actgtaaaca gagagaatag 300

aagtaattat tcataaattc tgtattaaag tgtgatttca tttcaggaaa atggacttgg 360

atgtggtcgt tggctcaatt accctttctt tttttaccct tttaaattat aaatcatcac 420

acactagcta gggaaaataa atactttcca atcccattta tatttactct ctcaaatttc 480

ttactcaaca ttaatgtttt gtctactcat atataatatg tgttaattaa tcaatcgggt 540

gaccttaatt ttcaacaata tatttacctg attaagttaa ttaacatcca ggctccccct 600

ttggctacat tacgtttctc ttcctcatca tcatgtaacc ggctccttgg ccttgggcat 660

tgaccggagg aagatgagcc cactgcaccg ccatcccaac caatttgttt cattaatatt 720

aatttctctt tcatcattaa tgcaacatac acacaaagct tacatttttt gcagctgtct 780

tgaatgcttc tttatgagcc attgctggat tctccgcttt cagcctccga atctcttccc 840

tgcatttttc aatttttcaa tttttcaata attatatgca tgaaaccaat tcaccctacc 900

tcccaaccct tttgtcaaac tctctcttac gtgcatatat aaataataat aacatatgtc 960

ttacttgatg aattggttat aagctgacgg ggctcgctgt ttcttctccg gggcttaatt 1020

ttcagagacc agaatcaaaa tgatttaaac aattagaaaa aataaaaaat ttcacgtaga 1080

ataataataa caaaaaatga taagagagat ggaggcgtat gcttgttaac aactggagtg 1140

gtgggtggaa taatgctgac atcatcatct tcatgatttt ggataatgtt atggtacgag 1200

gttacgaggt cggatgtgtt gctgaggctg tccaagcagt agtgtttctg gaggttaaac 1260

tcctgcccca aaccctcctt tggctgacac attgtaataa tttagaacca aacttagaag 1320

ttaattagaa aaattaaaga gaaagataaa gaagaaaatg aagaggttgg ttaattggta 1380

ccaagttatg agagagggaa gtgagaagat caaaagggat aaaagtgggc ttagccatgt 1440

tgacagagag aaggccagtg cagttgccgc atcttacgct caccaccatc gacaagttgc 1500

tgtatggcac atttacctgt gcgtatatat acttgcctca tattcattat attcaacatt 1560

tatatataac acttgaagaa ttcaaatcaa atcatcatca aacaaaacca tattatatgc 1620

attattatca ttattatgac taatttacta cttaattacc tcatttaaat ttgttatata 1680

tatatgatct taccaacaat atagtgctac aaagaccaca ttgcacatag cgaatctgtt 1740

cagaggaatc gccctggagc tgctccactg tcgacatatc aacgccctta tatttctaga 1800

caaaactgat aattaaaaga gagagaaatg aagaagacct aaccacgata tgtctatgag 1860

acaacaacac caagtccaat ttatatacct cattttggtt gccattatta tcaaatatca 1920

tacttccctt tcaattaatg gtttcctt 1948

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 冬瓜(Benincasa hispida )

<400> 2

aatgataaga gagatggagg cgca 24

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 冬瓜(Benincasa hispida )

<400> 3

caatgtgtca gccaaaggag 20

<210> 4

<211> 173

<212> DNA

<213> 冬瓜(Benincasa hispida)

<400> 4

cttgttaaca actggagtgg tgggtggaat aatgctgaca tcatcatctt catgattttg 60

gataatgtta tggtacgagg ttacgaggtc ggatgtgttg ctgaggctgt ccaagcagta 120

gtgtttctgg aggttaaact cctgccccaa accctccttt ggctgacaca ttg 173

<210> 5

<211> 199

<212> DNA

<213> 冬瓜(Benincasa hispida)

<400> 5

aatgataaga gagatggagg cgcacgcttg ttaacaactg gagtggtggg tggaataatg 60

ctgacatcat catcttcatg attttggata atgttatggt acgaggttac gaggtcggat 120

gtgttgctga ggctgtccaa gcagtagtgt ttctggaggt taaactcctg ccccaaaccc 180

tcctttggct gacacattg 199

Claims (10)

1.一种冬瓜籽型基因的SNP分子标记，其特征是：所述分子标记的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第1120位碱基是SNP位点，其碱基为T或C。

2.用于扩增权利要求1所述的SNP分子标记的引物对，其特征是：所述引物对包括上游引物和下游引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述引物对为dCAPS引物对。

4.一种冬瓜籽型的鉴定方法，其特征是包括以下步骤：

(1)提取冬瓜叶片的基因组DNA；

(2)以冬瓜基因组DNA为模板，采用权利要求2中的引物对进行PCR扩增，得PCR扩增产物；

(3)取PCR扩增产物，进行酶切；

(4)将酶切产物进行电泳；

(5)当仅产生173bp的单边籽亲本特异性标记SS₁₇₃时，该冬瓜为单边籽冬瓜；当同时产生173bp的单边籽亲本特异性标记SS₁₇₃和199bp的双边籽亲本特异性标记SS₁₉₉时，该冬瓜为双边籽冬瓜；当仅产生199bp的双边籽亲本特异性标记SS₁₉₉时，该冬瓜为双边籽冬瓜。

5.根据权利要求4所述的冬瓜籽型的鉴定方法，其特征是：步骤(2)中PCR扩增时，PCR反应体系包括：1μL基因组DNA、2μL含Mg²⁺的10×PCR buffer、1.5μL dNTPs、1μL上游引物、1μL下游引物、1U Taq酶，添加ddH₂O至20μL。

6.根据权利要求4所述的冬瓜籽型的鉴定方法，其特征是：步骤(2)中PCR扩增时，扩增程序为：94℃预变性3min后，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃终延伸7min，4℃保存。

7.根据权利要求4所述的冬瓜籽型的鉴定方法，其特征是：步骤(3)中进行酶切时，酶切体系包括2μL PCR扩增产物，1μL10×Buffer，1U SphI内切酶，添加ddH₂O至10μL；扩增程序为：37℃酶切3小时。

8.根据权利要求4所述的冬瓜籽型的鉴定方法，其特征是：步骤(3)中采用限制性内切酶SphI进行酶切。

9.根据权利要求4所述的冬瓜籽型的鉴定方法，其特征是：步骤(4)中采用聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，所述聚丙烯酰胺凝胶为质量百分含量为8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

10.权利要求1所述的冬瓜籽型基因的SNP分子标记、权利要求2或权利要求3中所述引物对在鉴定冬瓜籽型中的应用。