CN117825587A - 一种基于高效液相色谱法测定火麻仁中大麻二酚含量的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于高效液相色谱法测定火麻仁中大麻二酚含量的方法，本发明涉及一种基于高效液相色谱法测定火麻仁中大麻二酚含量的方法。本发明目的是为了解决现有测定火麻仁中大麻二酚含量的方法不够准确的问题，本发明方法快速、灵敏、准确性高。整个分析方法不到10min就完成了CBD及CBDA的测定，提高了工作效率；定量限及检测限都是ng级别，灵敏性高；标准曲线回归方程相关系数r均大于0.999，表明在相应的适用范围内线性关系良好；本发明检测方法精密度实验RSD均在2％之内，表明其精密度良好；加样回收率实验回收率大于98％，RSD<2％，表明其准确度良好。本发明应用于火麻仁中大麻二酚的质量控制领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于高效液相色谱法测定火麻仁中大麻二酚含量的方法。
背景技术
火麻仁为桑科大麻植物Cannabissativa L.的干燥成熟果实，具有润燥滑肠通便之功效。最早出自《神农本草经》，1953年被收录中国药典，1987年列入药食同源品种名单，2002年又被列入“既是食品又是药品”的物品名单。然而，药典只是列出了它的性状、鉴别、炮制、性味与归经、功能与主治、用法与用量、贮藏等，并未见火麻仁中有效成分的测定。现代药理研究表明桑科大麻植物中的主要活性物质为大麻二酚，它具有神经保护、镇痛、抗炎、抗氧化以及抗癫痫等药理作用。为了保证火麻仁食用和药用的安全性、有效性，测定火麻仁中的大麻二酚是必要的。目前测定火麻仁中大麻二酚主要为高效液相色谱法，但是大麻二酚(CBD)的前体物质是大麻二酚酸(CBDA)，它的稳定性差，通过光照、加热就可以脱羧转化成大麻二酚，所以大麻二酚的总量应该是大麻二酚本身的量和大麻二酚酸转化成大麻二酚的量。因此，单一测定大麻二酚的含量是不准确的。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有测定火麻仁中大麻二酚含量的方法不够准确的问题，而提供一种基于高效液相色谱法测定火麻仁中大麻二酚含量的方法。
本发明一种基于高效液相色谱法测定火麻仁中大麻二酚含量的方法，按照以下步骤实现：
一、将干燥后的火麻仁进行粉碎，加入有机溶剂作为提取溶剂，涡旋，0-80℃下恒温超声提取，减压过滤，滤液收集到容量瓶，用有机溶剂洗涤残渣，过滤，再收集滤液至容量瓶，然后用有机溶剂定容，得到供试品溶液；
二、配制同时含有相同质量浓度的CBD及CBDA混合标准品溶液，混合标准品溶液质量浓度依次为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/ml；
三、液相色谱条件：C18反相柱；柱温：30～40℃；检测波长：220～280nm；以乙腈为流动相A，以体积浓度为0.05-0.15％的磷酸溶液为流动相B，流速为每分钟0.8～1.2ml/min，进行梯度洗脱；
四、将各浓度混合标准品溶液依次采用步骤三高效液相色谱条件进行检测，以保留时间定性，根据各浓度所测峰面积的大小与其浓度的对应关系绘制标准曲线，其中，CBD标准曲线回归方程为Y＝4199.57392X,相关系数r＝0.9999；CBDA标准曲线回归方程为Y＝3118.6X+0.1348,相关系数r＝0.9998；Y为峰面积，X为质量浓度，X范围为0.3125～20μg/ml；
五、将步骤一的供试品溶液进行膜过滤，然后采用步骤三高效液相色谱条件进行检测，测得供试品溶液中各组分的峰面积，以保留时间定性，根据步骤四的标准曲线回归方程定量，计算供试品溶液中CBD及CBDA的含量；
六、利用步骤五得到的大麻二酚及大麻二酚酸的含量，通过公式为：CBD总含量＝CBD+0.887*CBDA计算出CBD总含量。
本发明采用的是C18色谱柱，其原理是基于CBD及CBDA在C18填充物表面上的亲疏水性差异、通过溶剂梯度洗脱来实现化合物的分离。C18填充物是由含有18个碳原子的烷基链修饰的硅胶颗粒制成的，其具有较大的二异丁基侧链基团。这些烷基链可以与非极性分子相互作用，从而使其保持在固定相中，相反，极性分子则与固定相交互较少，因此以更快的速度通过固定相移动，这样，化合物就可以通过控制洗脱、溶液组成和温度来实现有效的分离。在使用C18色谱柱进行分离时，样品进入色谱柱后，通过不同比列的有机溶剂和水的混合物在柱中移动，以逐步改变溶剂的极性，从而逐渐分离出所需的化合物，最后，通过检测器来确定化合物的的出峰位置及含量。
本发明的有益效果为：
1、本发明建立了一种基于高效液相色谱法测定火麻仁中大麻二酚含量的方法，可以对火麻仁中的CBD及CBDA进行定性、定量分析，为火麻仁食用、药用的质量控制提供科学依据。
2、此方法解决了火麻仁中大麻二酚的含量测定问题，大麻二酚的含量包括大麻二酚本身的量及大麻二酚酸转化的量。
3、此方法快速、灵敏、准确性高。整个分析方法不到10min就完成了CBD及CBDA的测定，提高了工作效率；定量限及检测限都是ng级别，灵敏性高；标准曲线回归方程相关系数r均大于0.999，表明其在相应的适用范围内线性关系良好；本发明检测方法精密度实验RSD均在2％之内，表明其精密度良好；本发明检测方法加样回收率实验回收率大于98％，RSD<2％，表明其准确度良好。
4、本发明采用恒温超声提取，此方法具有温度可控，随着超声时间的增加，水温不会上升，由于提取过程中温度对CBD及CBDA的提取含量具有重要影响，这样就保证了实验结果的准确性。
附图说明
图1是CBDA脱羧转化成CBD的结构图；
图2是CBD标准曲线；
图3是CBDA标准曲线；
图4是CBD及CBDA高效液相色谱图；
图5是火麻仁高效液相色谱图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式一种基于高效液相色谱法测定火麻仁中大麻二酚含量的方法，按照以下步骤实现：
一、将干燥后的火麻仁进行粉碎，加入有机溶剂作为提取溶剂，涡旋，0-80℃下恒温超声提取，减压过滤，滤液收集到容量瓶，用有机溶剂洗涤残渣，过滤，再收集滤液至容量瓶，然后用有机溶剂定容，得到供试品溶液；
二、配制同时含有相同质量浓度的CBD及CBDA混合标准品溶液，混合标准品溶液质量浓度依次为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/ml；
三、液相色谱条件：C18反相柱；柱温：30～40℃；检测波长：220～280nm；以乙腈为流动相A，以体积浓度为0.05-0.15％的磷酸溶液为流动相B，流速为每分钟0.8～1.2ml/min，进行梯度洗脱；
四、将各浓度混合标准品溶液依次采用步骤三高效液相色谱条件进行检测，以保留时间定性，根据各浓度所测峰面积的大小与其浓度的对应关系绘制标准曲线，其中，CBD标准曲线回归方程为Y＝4199.57392X,相关系数r＝0.9999；CBDA标准曲线回归方程为Y＝3118.6X+0.1348,相关系数r＝0.9998；Y为峰面积，X为质量浓度，X范围为0.3125～20μg/ml；
五、将步骤一的供试品溶液进行膜过滤，然后采用步骤三高效液相色谱条件进行检测，测得供试品溶液中各组分的峰面积，以保留时间定性，根据步骤四的标准曲线回归方程定量，计算供试品溶液中CBD及CBDA的含量；
六、利用步骤五得到的大麻二酚及大麻二酚酸的含量，通过公式为：CBD总含量＝CBD+0.887*CBDA计算出CBD总含量。
大麻二酚的前体物质是大麻二酚酸，它的稳定性差，通过光照、加热就可以脱羧转化成大麻二酚(如图1所示)，所以大麻二酚的总量应该是大麻二酚本身的量和大麻二酚酸转化成大麻二酚的量。本实施方式建立了一种基于高效液相色谱法测定火麻仁中大麻二酚含量的方法，可以对火麻仁中的CBD及CBDA进行定性、定量分析，为火麻仁食用、药用的质量控制提供科学依据。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同点是：步骤一中火麻仁在37℃烘箱干燥，干燥至含水量＜10％。其他步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同点是：于超声提取时间为10～50min，料液比1:5～40，功率120-300W，频率45～100KHz。其他步骤与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同点是：有机溶剂为甲醇、乙腈或乙醇。其他步骤与具体实施方式二或三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同点是：步骤三的梯度洗脱工艺为：时间从0～8.2分钟，流动相A的体积浓度75.0％，流动相B的体积浓度25％；从8.2～11分钟，流动相A的体积浓度75％→85％，流动相B的体积浓度25％→15％；从11～12分钟，流动相A的体积浓度85％→75％，流动相B的体积浓度15％→25％；从12～13分钟，流动相A的体积浓度75％，流动相B的体积浓度25％。其他步骤与具体实施方式一至四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同点是：步骤三的柱温为40℃。其他步骤与具体实施方式一至五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同点是：步骤三的检测波长为220nm。其他步骤与具体实施方式一至六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同点是：步骤三中流动相B为体积浓度为0.05％的磷酸溶液。其他步骤与具体实施方式一至七相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同点是：步骤三中流速为1.0mL/min。其他步骤与具体实施方式一至八相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同点是：步骤五采用0.22μm有机滤膜过滤供试品溶液。其他步骤与具体实施方式一至九相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一：本实施例一种基于高效液相色谱法测定火麻仁中大麻二酚含量的方法，按照以下步骤实现：
一、将火麻仁在37℃烘箱干燥，保证含水量小于10％，25000r/min下高速破碎，然后取1.01131g火麻仁粉末使用甲醇作为提取溶剂，以料液比1:20加入甲醇涡旋30s，50℃下恒温超声提取，过滤，收集滤液至容量瓶，然后以料液比1:5用甲醇洗涤滤渣后，过滤再收集滤液至容量瓶，然后定容至25mL，上机前采用0.22μm有机滤膜过滤。
二、分别取1mL质量浓度均为1mg/mL的CBD、CBDA标准品溶液于50mL容量瓶并以甲醇定容，得到同时含有相同质量浓度的CBD及CBDA的储备液，然后稀释至质量浓度依次为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/ml，得到混合标准品溶液；
三、液相色谱条件：C18反相柱；柱温：40℃；检测波长：220nm；以乙腈为流动相A，以体积浓度为0.05％的磷酸溶液为流动相B，流速为1ml/min，进行梯度洗脱；
流动相的梯度洗脱程序见下表：
表1
四、将各浓度混合标准品溶液依次采用步骤三高效液相色谱条件进行检测，以保留时间定性，根据各浓度所测峰面积的大小与其浓度的对应关系绘制标准曲线(图2和图3)，其中，CBD标准曲线回归方程为Y＝4199.57392X，相关系数r＝0.9999；CBDA标准曲线回归方程为Y＝3118.6X+0.1348，相关系数r＝0.9998；Y为峰面积，X为质量浓度，X范围为0.3125～20μg/ml；
五、将步骤一的供试品溶液进行膜过滤，然后采用步骤三高效液相色谱条件进行检测，测得供试品溶液中各组分的峰面积，以保留时间定性，保留时间为：CBD 7.681min,CBDA9.183min，根据步骤四的标准曲线回归方程定量，计算供试品溶液中CBD及CBDA的含量；CBD及CBDA高效液相色谱图如图4所示；
六、利用步骤五得到的大麻二酚及大麻二酚酸的含量，通过公式为：CBD总含量＝CBD+0.887*CBDA计算出CBD总含量。
本实施例进行3次平行实验，采用安捷伦1260高效液相色谱仪，配有四元泵，柱温箱，二极管阵列检测器，数据处理软件。涡旋采用VM-500S涡旋混匀器(群安仪器实验有限公司)；恒温超声提取采用KQ-300GVDV三频恒温数控超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司)。
实施例2、本发明方法的精密度实验
取样品连续测定6次，结果见表2，CBD及CBDA含量测定结果的RSD分别为1.69％和1.47％，实验结果表明此方法精密度良好。
表2
实施例3、本发明方法的检测限及定量限
以S/N为3确定检测限，以S/N为10确定定量限。CBD的检出限、定量限结果分别为0.25ng、1.25ng；CBDA的检出限、定量限分别为0.2ng、0.8ng。
实施例4、本发明的混合标准品溶液的稳定性
取等量20μg/ml的CBD和CBDA混合标准溶液6份，其中3份于室温下分别放置3、6、12、24、48、96h，分别进样5μL，2种标准品峰面积的RSD分别为0.83％、0.93％；3份于-20℃和室温间反复冻融3次，2种标准品峰面积的RSD分别为0.32％、0.64％。结果如表3，结果表明上述混合标准品在室温放置96h，在室温和-20℃反复冻融3次的条件下均可保持稳定。
表3标准样品稳定性
实施例5、本发明的回收率实验
称取已知含量的样品9份，分别加入已知含量的80％、100％、120％标准品，每个浓度重复测定3次，计算回收率。结果如表4、5，CBD、CBDA的加标回收率分别为98.00％、98.25％，RSD分别为1.19％、0.98％，说明该方法准确度良好。
表4CBD回收率实验(n＝9)
表5CBDA回收率实验(n＝9)
实施例六、实际样品测定
按照本发明方法对3个火麻仁样品进行分析测试，大麻二酚的含量按照以下公式计算：CBD含量＝CBD+0.887*CBDA，结果见表6。
表6火麻仁样品的含量测定
样品YP1的高效液相色谱图如图5所示，从谱图中可以看到CBDA及CBD的色谱峰，不到10min就完成了样品的检测，此方法可以应用到火麻仁样品的含量测定，为火麻仁的质量控制提供保障。
Claims (10)
1.一种基于高效液相色谱法测定火麻仁中大麻二酚含量的方法，其特征在，所述方法按照以下步骤实现：
一、将干燥后的火麻仁进行粉碎，加入有机溶剂作为提取溶剂，涡旋，0-80℃下恒温超声提取，减压过滤，滤液收集到容量瓶，用有机溶剂洗涤残渣，过滤，再收集滤液至容量瓶，然后用有机溶剂定容，得到供试品溶液；
二、配制同时含有相同质量浓度的CBD及CBDA混合标准品溶液，混合标准品溶液质量浓度依次为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/ml；
三、液相色谱条件：C18反相柱；柱温：30～40℃；检测波长：220～280nm；以乙腈为流动相A，以体积浓度为0.05-0.15％的磷酸溶液为流动相B，流速为每分钟0.8～1.2ml/min，进行梯度洗脱；
四、将各浓度混合标准品溶液依次采用步骤三高效液相色谱条件进行检测，以保留时间定性，根据各浓度所测峰面积的大小与其浓度的对应关系绘制标准曲线，其中，CBD标准曲线回归方程为Y＝4199.57392X,相关系数r＝0.9999；CBDA标准曲线回归方程为Y＝3118.6X+0.1348,相关系数r＝0.9998；Y为峰面积，X为质量浓度，X范围为0.3125～20μg/ml；
五、将步骤一的供试品溶液进行膜过滤，然后采用步骤三高效液相色谱条件进行检测，测得供试品溶液中各组分的峰面积，以保留时间定性，根据步骤四的标准曲线回归方程定量，计算供试品溶液中CBD及CBDA的含量；
六、利用步骤五得到的大麻二酚及大麻二酚酸的含量，通过公式为：CBD总含量＝CBD+0.887*CBDA计算出CBD总含量。
2.根据权利要求1所述的一种基于高效液相色谱法测定火麻仁中大麻二酚含量的方法，其特征在于步骤一中火麻仁在37℃烘箱干燥，干燥至含水量＜10％。
3.根据权利要求1所述的一种基于高效液相色谱法测定火麻仁中大麻二酚含量的方法，其特征在于超声提取时间为10～50min，料液比1:5～40，功率120-300W，频率45～100KHz。
4.根据权利要求1所述的一种基于高效液相色谱法测定火麻仁中大麻二酚含量的方法，其特征在于有机溶剂为甲醇、乙腈或乙醇。
5.根据权利要求1所述的一种基于高效液相色谱法测定火麻仁中大麻二酚含量的方法，其特征在于步骤三的梯度洗脱工艺为：时间从0～8.2分钟，流动相A的体积浓度75.0％，流动相B的体积浓度25％；从8.2～11分钟，流动相A的体积浓度75％→85％，流动相B的体积浓度25％→15％；从11～12分钟，流动相A的体积浓度85％→75％，流动相B的体积浓度15％→25％；从12～13分钟，流动相A的体积浓度75％，流动相B的体积浓度25％。
6.根据权利要求1所述的一种基于高效液相色谱法测定火麻仁中大麻二酚含量的方法，其特征在于步骤三的柱温为40℃。
7.根据权利要求1所述的一种基于高效液相色谱法测定火麻仁中大麻二酚含量的方法，其特征在于步骤三的检测波长为220nm。
8.根据权利要求1所述的一种基于高效液相色谱法测定火麻仁中大麻二酚含量的方法，其特征在于步骤三中流动相B为体积浓度为0.05％的磷酸溶液。
9.根据权利要求1所述的一种基于高效液相色谱法测定火麻仁中大麻二酚含量的方法，其特征在于步骤三中流速为1.0mL/min。
10.根据权利要求1所述的一种基于高效液相色谱法测定火麻仁中大麻二酚含量的方法，其特征在于步骤五采用0.22μm有机滤膜过滤供试品溶液。
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