CN117801130A - 一种从牡丹皮中提取多种功效物的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从牡丹皮中提取多种功效物的方法，包括以下步骤：粉碎，酶解，水蒸气蒸馏，醇提，树脂吸附。本发明采用脂肪酶酶解法对植物进行脱脂预处理，作用条件温和，对油脂的去除较彻底，并且不存在后续的有机溶剂回收及带来环境污染的问题。并且采用多步酶解法‑水蒸气蒸馏‑醇提法结合，使用较少的无毒有机溶剂就能获取高收率和高纯度的目标功效物，减少了有机溶剂的使用，绿色环保。
Description
技术领域
本发明涉及一种从牡丹皮中提取多种功效物的方法及其应用，涉及C07C，具体涉及分离，纯化领域。
背景技术
随着人们对中医，中药的重视程度加深，采用现代科学方法提取中药中的有效成分成为研究热点。牡丹皮中含有的牡丹多糖，芍药苷，丹皮酚等成分具有重要的药效效果，在中药，食品，化妆品等领域应用广泛。但是牡丹皮提取目前还存在问题，比如牡丹皮的提取工艺步骤复杂，不易掌控无法实现工厂化转化。并且牡丹皮提取的效率较低，牡丹皮中的功效组分不能被充分提取，纯度不高，牡丹皮原料不能被充分利用。并且需要有机溶剂的大量使用，有机溶剂不易回收，对环境的破坏较大。
目前采用的水蒸气蒸馏法提取牡丹皮挥发油，耗时长、提取率低、牡丹皮原料没有充分利用，会增加工厂生产的成本。离子液体辅助提取，在提取过程中引入了阴阳离子，后续的去除步骤需要用到乙酸乙酯，会产生溶剂残留和环境污染问题，后处理步骤较多，成本高。
专利CN104313083A公开了一种微波法和生物酶法结合从牡丹皮中提取牡丹皮多糖的方法，牡丹皮粗粉依次经过脂肪酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、无花果蛋白酶和淀粉酶进行酶解，得牡丹皮多糖。但是操作条件复杂，过程需要加酸碱溶液进行pH的调整，并且仅对牡丹皮多糖进行提取，对牡丹皮原料的利用不够充分，造成原料的浪费，增加工厂生产的成本。
专利CN 104983816 B公开了一种从牡丹皮中提取多种功效物的制备方法，对牡丹皮进行加热酶解，酶解后采取水蒸气蒸馏法收集蒸馏液，用Sevage法对牡丹皮多糖脱蛋白，最后得到丹皮酚、多糖和总苷混合，但是需要使用氯仿和正丁醇有机溶剂，毒性大，成本高。
发明内容
为了开发一种经济环保，且提取物使用安全的提取方法，并且全成分利用牡丹皮原料，本发明的第一个方面提供了一种从牡丹皮中提取多种功效物的方法，包括以下步骤：
S1将牡丹皮烘干后，粉碎，得牡丹皮粗粉；
S2将牡丹皮粗粉浸泡于纯水中，温浸，加入脂肪酶进行酶解；
S3加入纤维素酶和果胶酶继续酶解；
S4加入木瓜蛋白酶继续酶解；
S5加入淀粉酶继续酶解，得酶解液；
S6采用水蒸气蒸馏法对酶解液进行蒸馏，收集馏分，过滤蒸馏剩余物，得药渣和滤液；
S7所得馏分快速低温冷藏析晶，过滤，取晶体用乙醇溶解，再次过滤，滤液低温挥干乙醇，得丹皮酚；
S8步骤S6所得滤液加入乙醇醇沉，搅拌后静置，离心，得沉淀和上清液，取醇沉沉淀部分，用无水乙醇除水，烘干，粉碎，得牡丹皮多糖；
S9用乙醇溶液浸泡步骤S6所得药渣，合并醇沉上清液，减压浓缩至小体积，得浓缩液；
S10浓缩液上柱，填料为大孔树脂，用醇水洗脱液进行洗脱，分别收集水洗部分和醇洗部分；
S11水洗部分减压浓缩成浓缩液，得牡丹皮多糖；
S12醇洗部分低温烘干，粉碎，得芍药苷和黄酮类化合物。
作为一种优选的实施方式，所述步骤S1中牡丹皮粗粉的粒径为30-100目，所述步骤S2中牡丹皮粗粉与纯水的质量比为1：(8-15)。
作为一种优选的实施方式，所述步骤S2中牡丹皮粗粉在纯水中的浸泡时间为8-24h，浸泡温度为20-30℃。
作为一种优选的实施方式，所述脂肪酶的用量为牡丹皮粗粉重量的0.03-0.06％；酶解pH为4-5，酶解时间为1-3h，酶解温度为40-50℃。
作为一种优选的实施方式，所述纤维素酶和果胶酶的总用量为牡丹皮粗粉重量的0.3-0.6％；酶解pH为4-5，酶解时间为1-3h，酶解温度为40-50℃。
作为一种优选的实施方式，所述纤维素酶预先溶解，纤维素酶先用10倍体积的纯水溶解，得到纤维素酶水溶液，然后加入果胶酶。
作为一种优选的实施方式，所述纤维素酶和果胶酶的重量比为1：(0.5-1.5)。优选的，所述纤维素酶和果胶酶的重量比为1：1。
作为一种优选的实施方式，所述木瓜蛋白酶的用量为牡丹皮粗粉重量的0.03-0.06％，酶解pH为4-5，酶解时间为1-3h，酶解温度为40-50℃。
本申请中纤维素酶和果胶酶协同作用，破坏牡丹皮的细胞壁，分解纤维素和果胶，促进牡丹皮中的功效组分流出，使牡丹皮中的不溶于水的纤维素分解为水溶性的葡萄糖，木瓜蛋白酶分解细胞壁上的壳聚糖和水解细胞膜上的糖蛋白，利于功效组分的溶出，提高多种功效物质的提取效率。
作为一种优选的实施方式，所述淀粉酶的用量为牡丹皮粗粉重量的0.3-0.6％，酶解pH为4-5，酶解时间为1-3h，酶解温度为40-50℃。
本申请中采用多步酶法-水蒸气蒸馏-醇提法结合，先采用脂肪酶进行酶解，然后采用纤维素酶和果胶酶酶解，最后采用木瓜蛋白酶，淀粉酶酶解，可以实现全组分利用，实现制备高含量脂溶性小分子和多糖共存的应用型提取物，去除蛋白杂质，获得高纯度的牡丹皮多糖和高纯度的丹皮酚，芍药苷，黄酮类物质。猜测可能的原因是：牡丹皮物质的表面脂含量较高，其存在会影响牡丹皮提取物的提取，本申请中采用脂肪酶先进行前处理，可以较彻底的去除牡丹皮表面的油脂，相较于采用大量有机溶剂处理作用条件更温和，并且后续分离较容易，减少了有机溶剂带来的环境污染。
作为一种优选的实施方式，所述步骤S6的水蒸气蒸馏时当馏出液由乳白色变为澄清停止收集。
作为一种优选的实施方式，所述步骤S7中低温为1-10℃。
本申请中通过水蒸气蒸馏可以使水蒸气和丹皮酚共同蒸馏出来，丹皮酚在冷水中的溶解度较小，因此馏出物经过冷凝后呈乳白色液体。并且丹皮酚在低温环境下会析出丹皮酚晶体，可以对丹皮酚进一步纯化。
作为一种优选的实施方式，所述步骤S8中滤液在进行醇沉前，50-70℃减压浓缩至原体积的1/3。
作为一种优选的实施方式，所述步骤S9中乙醇溶液的体积浓度为65-75％，牡丹皮粗粉与乙醇溶液的重量比为1：(8-15)，浸泡温度为50-70℃，浸泡时间为1-3h。
本申请中采用酶解法与水蒸气蒸馏和醇提法结合，制备得到的牡丹多糖，牡丹酚的纯度较高，猜测可能的原因是：酶解后的酶解液经过水蒸气蒸馏就可以将丹皮酚与牡丹皮多糖分离，实现了脱蛋白除杂，一次处理就可以获得理想的效果，避免了多糖结构的破坏，减少多糖损失，并且醇提后纯度高。
作为一种优选的实施方式，所述大孔树脂的型号为AB-8，大孔树脂的使用量为牡丹皮粗粉重量的0.5-1。
作为一种优选的实施方式，所述步骤S10的具体步骤为：先用纯水进行洗脱，得到水洗部分；然后用95vol％的乙醇水溶液洗脱得到醇洗部分。
作为一种优选的实施方式，所述步骤S11 50-70℃减压浓缩，步骤S12 30-50℃低温烘干。
本发明的第二个方面提供了一种从牡丹皮中提取多种功效物的方法的应用，应用于牡丹皮功效物质的提取中。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所述从牡丹皮中提取多种功效物的方法，采用脂肪酶酶解法对植物进行脱脂预处理，作用条件温和，对油脂的去除较彻底，并且不存在后续的有机溶剂回收及带来环境污染的问题。
(2)本发明所述从牡丹皮中提取多种功效物的方法，采用多步酶解法-水蒸气蒸馏-醇提法结合，使用较少的无毒有机溶剂就能获取高收率和高纯度的目标功效物，减少了有机溶剂的使用，绿色环保。
(3)本发明所述从牡丹皮中提取多种功效物的方法，采用酶解法结合醇沉和大孔树脂柱层析的方法，不仅能够高效地去除蛋白质等杂质，获得纯度较高的牡丹皮多糖，而且能同时获得其他纯度较高的功效物。
附图说明
图1为本申请从牡丹皮中提取多种功效物的方法的工艺流程图。
具体实施方式
实施例1
一种从牡丹皮中提取多种功效物的方法，包括下述步骤：
S1将牡丹皮烘干，粉碎，得到30目的牡丹皮粗粉；
S2取牡丹皮粗粉100g，浸泡于1000mL纯水中，80℃浸泡提取3h，得水提物；
S3采用水蒸气蒸馏法对水提物进行蒸馏，收集馏分，馏分澄清则停止收集，过滤蒸馏剩余物，得药渣和滤液；
S4所得馏分于5℃快速低温冷藏放置24h，过滤，取晶体用无水乙醇溶解，再次过滤，滤液低温40℃挥干乙醇，得高纯度丹皮酚；
S5用1000mL 70vol％乙醇浸泡药渣，60℃温浸提取1h，合并蒸馏剩余物滤液，60℃减压浓缩至无醇味，得浓缩液；
S6浓缩液上柱，填料为大孔树脂AB-8，用乙醇-水进行洗脱，先用纯水洗脱至糖度为0，再用95vol％乙醇洗脱，分别收集水洗部分和醇洗部分；
S7水洗部分60℃减压浓缩成浓缩液，得牡丹皮多糖；
S8醇洗部分40℃低温烘干，粉碎，得芍药苷和总黄酮。
实施例2
一种从牡丹皮中提取多种功效物的方法，包括下述步骤：
S1将牡丹皮烘干，粉碎，得到30目的牡丹皮粗粉；
S2取牡丹皮粗粉100g，浸泡于1000mL纯水中，25℃静置浸泡12h，加入0.05g脂肪酶进行酶解，pH值为4.5，温度为50℃，酶解时间为1h；
S3加入0.5g纤维素酶和0.5g果胶酶继续酶解，pH值为4.5，温度为50℃，酶解时间为1h；
S4加入木瓜蛋白酶0.05g，pH值为4.5，温度为50℃，酶解时间为1h；
S5加入淀粉酶0.5g，pH值为4.5，温度为50℃，酶解时间为2h；
S6采用水蒸气蒸馏法对酶解液进行蒸馏，收集馏分，馏分澄清则停止收集，过滤蒸馏剩余物，得药渣和滤液；
S7所得馏分于5℃快速低温冷藏放置24h，过滤，取晶体用无水乙醇溶解，再次过滤，滤液低温40℃挥干乙醇，得高纯度丹皮酚；
S8用1000mL 70vol％乙醇浸泡药渣，60℃温浸提取1h，合并蒸馏剩余物滤液，60℃减压浓缩至无醇味，得浓缩液；
S9浓缩液上柱，填料为大孔树脂AB-8，用乙醇-水进行洗脱，先用纯水洗脱至糖度为0，再用95vol％乙醇洗脱，分别收集水洗部分和醇洗部分；
S10水洗部分60℃减压浓缩成浓缩液，得牡丹皮多糖；
S11醇洗部分40℃低温烘干，粉碎，得芍药苷和总黄酮。
所述纤维素酶预先溶解，纤维素酶先用10倍体积的纯水溶解，得到纤维素酶水溶液，然后加入果胶酶混匀后加入步骤S3中。
实施例3
一种从牡丹皮中提取多种功效物的方法，包括下述步骤：
S1将牡丹皮烘干，粉碎，得到30目的牡丹皮粗粉；
S2取牡丹皮粗粉100g，浸泡于1000mL纯水中，25℃静置浸泡12h，加入0.05g脂肪酶进行酶解，pH值为4.5，温度为50℃，酶解时间为1h；
S3加入0.5g纤维素酶和0.5g果胶酶继续酶解，pH值为4.5，温度为50℃，酶解时间为1h；
S4加入木瓜蛋白酶0.05g，pH值为4.5，温度为50℃，酶解时间为1h；
S5加入淀粉酶0.5g，pH值为4.5，温度为50℃，酶解时间为2h；
S6采用水蒸气蒸馏法对酶解液进行蒸馏，收集馏分，馏分澄清则停止收集，过滤蒸馏剩余物，得药渣和滤液；
S7所得馏分于5℃快速低温冷藏放置24h，过滤，取晶体用无水乙醇溶解，再次过滤，滤液低温40℃挥干乙醇，得高纯度丹皮酚；
S8步骤S6所得蒸馏剩余滤液减压浓缩至小体积，缓慢加入95vol％乙醇，边加边搅拌，使整个溶液体系醇含量体积百分比为80％，静置2h，离心(20min，转速4000r/min)，沉淀部分弃去，得醇沉上清液；
S9用1000mL 70vol％乙醇浸泡步骤S6所得药渣，60℃温浸提取1h，合并醇沉上清液，减压浓缩至无醇味，得浓缩液；
S10浓缩液上柱，填料为大孔树脂AB-8，用乙醇-水进行洗脱，先用纯水洗脱至糖度为0，再用95vol％乙醇洗脱，分别收集水洗部分和醇洗部分；
S11水洗部分60℃减压浓缩成浓缩液，得牡丹皮多糖；
S12醇洗部分40℃低温烘干，粉碎，得芍药苷和总黄酮。
所述纤维素酶预先溶解，纤维素酶先用10倍体积的纯水溶解，得到纤维素酶水溶液，然后加入果胶酶混匀后加入步骤S3中。
对比例1
一种从牡丹皮中提取多种功效物的方法，包括下述步骤：
S1将牡丹皮烘干，粉碎，得到30目的牡丹皮粗粉；
S2取牡丹皮粗粉100g，浸泡于1000mL纯水中，25℃静置浸泡12h，加入0.05g脂肪酶进行酶解，pH值为4.5，温度为50℃，酶解时间为1h；
S3加入0.5g纤维素酶和0.5g果胶酶继续酶解，pH值为4.5，温度为50℃，酶解时间为1h；
S4加入淀粉酶0.5g，pH值为4.5，温度为50℃，酶解时间为2h；
S5采用水蒸气蒸馏法对酶解液进行蒸馏，收集馏分，馏分澄清则停止收集，过滤蒸馏剩余物，得药渣和滤液；
S6所得馏分于5℃快速低温冷藏放置24h，过滤，取晶体用无水乙醇溶解，再次过滤，滤液低温40℃挥干乙醇，得高纯度丹皮酚；
S7所得蒸馏物剩余滤液减压浓缩至原体积的1/3，采用sevage法脱蛋白，滤液与氯仿-正丁醇溶液(预先配制体积比为5:1的氯仿-正丁醇混合溶液)体积比为4:1，混合物剧烈振摇20min，蛋白质变性生成凝胶，离心分离，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白，水层继续加入氯仿-正丁醇溶液，重复上述过程3次；
S8水层减压浓缩至小体积，缓慢加入95vol％乙醇，边加边搅拌，使整个溶液体系醇含量体积百分比为80％，静置2h，离心(20min，转速4000r/min)，沉淀部分经95vol％乙醇多次除水后，烘干，粉碎，得牡丹皮多糖；
S9用1000mL 70vol％乙醇浸泡药渣，60℃温浸提取1h，合并醇沉上清液，减压浓缩至无醇味，得浓缩液；
S10浓缩液上柱，填料为大孔树脂AB-8，用乙醇-水进行洗脱，先用纯水洗脱至糖度为0，再用95vol％乙醇洗脱，收集醇洗部分；
S11水洗部分减压浓缩成浓缩液，得牡丹皮多糖；
S12醇洗部分40℃低温烘干，粉碎，得芍药苷和总黄酮。
性能测试
采用高效液相色谱(HPLC)检测丹皮酚、芍药苷的含量；采用亚硝酸钠-硝酸铝法检测总黄酮的含量；采用苯酚-硫酸法检测牡丹皮多糖的含量；采用凯氏定氮法检测牡丹皮多糖中蛋白质(用氮含量表征)的含量。
牡丹皮多糖的得率＝(含量×浸膏重量)/原料重量
浸膏重量指步骤S11中得到的浓缩液的重量。原料重量指牡丹皮粗粉的质量。
芍药苷和总黄酮的得率＝(含量×固体重量A)/原料重量
固体重量A指步骤S12中醇洗部分粉碎后的固体重量。原料重量指牡丹皮粗粉的质量。
丹皮酚的得率＝(含量×固体重量B)/原料重量
固体重量B指步骤S6中滤液挥干乙醇后的重量。原料重量指牡丹皮粗粉的质量。
测试结果见表1。
表1
Claims (10)
1.一种从牡丹皮中提取多种功效物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1将牡丹皮烘干后，粉碎，得牡丹皮粗粉；
S2将牡丹皮粗粉浸泡于纯水中，温浸，加入脂肪酶进行酶解；
S3加入纤维素酶和果胶酶继续酶解；
S4加入木瓜蛋白酶继续酶解；
S5加入淀粉酶继续酶解，得酶解液；
S6采用水蒸气蒸馏法对酶解液进行蒸馏，收集馏分，过滤蒸馏剩余物，得药渣和滤液；
S7所得馏分快速低温冷藏析晶，过滤，取晶体用乙醇溶解，再次过滤，滤液低温挥干乙醇，得丹皮酚；
S8步骤S6所得滤液加入乙醇醇沉，搅拌后静置，离心，得沉淀和上清液，取醇沉沉淀部分，用无水乙醇除水，烘干，粉碎，得牡丹皮多糖；
S9用乙醇溶液浸泡步骤S6所得药渣，合并醇沉上清液，减压浓缩至小体积，得浓缩液；
S10浓缩液上柱，填料为大孔树脂，用醇，水洗脱液进行洗脱，分别收集水洗部分和醇洗部分；
S11水洗部分减压浓缩成浓缩液，得牡丹皮多糖；
S12醇洗部分低温烘干，粉碎，得芍药苷和黄酮类化合物。
2.根据权利要求1所述从牡丹皮中提取多种功效物的方法，其特征在于，所述步骤S1中牡丹皮粗粉的粒径为30-100目，所述步骤S2中牡丹皮粗粉与纯水的质量比为1：(8-15)。
3.根据权利要求1所述从牡丹皮中提取多种功效物的方法，其特征在于，所述脂肪酶的用量为牡丹皮粗粉重量的0.03-0.06％；酶解pH为4-5，酶解时间为1-3h，酶解温度为40-50℃。
4.根据权利要求1所述从牡丹皮中提取多种功效物的方法，其特征在于，所述纤维素酶和果胶酶的总用量为牡丹皮粗粉重量的0.3-0.6％；酶解pH为4-5，酶解时间为1-3h，酶解温度为40-50℃。
5.根据权利要求1所述从牡丹皮中提取多种功效物的方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶的用量为牡丹皮粗粉重量的0.03-0.06％，酶解pH为4-5，酶解时间为1-3h，酶解温度为40-50℃。
6.根据权利要求1所述从牡丹皮中提取多种功效物的方法，其特征在于，所述淀粉酶的用量为牡丹皮粗粉重量的0.3-0.6％，酶解pH为4-5，酶解时间为1-3h，酶解温度为40-50℃。
7.根据权利要求1所述从牡丹皮中提取多种功效物的方法，其特征在于，所述步骤S6的水蒸气蒸馏时当馏出液由乳白色变为澄清停止收集。
8.根据权利要求1所述从牡丹皮中提取多种功效物的方法，其特征在于，所述步骤S7中低温为1-10℃。
9.根据权利要求1所述从牡丹皮中提取多种功效物的方法，其特征在于，所述步骤S9中乙醇溶液的体积浓度为65-75％，牡丹皮粗粉与乙醇溶液的重量比为1：(8-15)，浸泡温度为50-70℃，浸泡时间为1-3h。
10.一种根据权利要求1-9任一项所述从牡丹皮中提取多种功效物的方法的应用，其特征在于，应用于牡丹皮功效物质的提取中。
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| CN118286491A (zh) * | 2024-04-03 | 2024-07-05 | 美尔健（深圳）生物科技有限公司 | 一种灵芝黄酮的制备工艺及其应用 |
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