CN117737161A

CN117737161A - 一种脂联素抗体磁性微球及脂联素测定试剂盒

Info

Publication number: CN117737161A
Application number: CN202410084027.7A
Authority: CN
Inventors: 钟铃; 周鹏程; 赖华; 吴秋凤; 丘招胜
Original assignee: Guangdong Uniten Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Uniten Biotechnology Co ltd
Priority date: 2024-01-19
Filing date: 2024-01-19
Publication date: 2024-03-22

Abstract

本发明属于体外诊断技术领域，公开了一种脂联素抗体磁性微球及脂联素测定试剂盒。所述脂联素抗体磁性微球是通过功能化MQ硅树脂包覆磁性微球与链亲和素溶液混合孵育得到的链亲和素包被的磁性微球，与生物素与脂联素抗体混合反应得到的生物素化脂联素抗体经混合孵育得到。所述脂联素测定试剂盒包括脂联素抗体磁性微球溶液、脂联素抗体荧光素标记物和样本稀释液。本发明的脂联素抗体磁性微球采用功能性MQ硅树脂原位包覆一步实现磁性纳米颗粒的壳层保护及表面功能化修饰，制备简单、成本低。所得试剂盒可显著增强免疫磁性分离的效果，提高检测准确性。

Description

一种脂联素抗体磁性微球及脂联素测定试剂盒

技术领域

本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种脂联素抗体磁性微球及脂联素测定试剂盒。

背景技术

免疫磁性微球(IMB)是免疫学和磁载体技术结合而发展起来的一类新型材料。IMB是包被有单克隆抗体的磁性微球，可与含有相应抗原的靶物质特异性地结合形成新的复合物。通过磁场时，这种复合物可被滞留，与其它组分相分离，该过程称为免疫磁性分离法。免疫磁性分离简便易行，分离纯度高，保留靶物质活性，且高效、快速、低毒，可广泛应用于细胞分离和提纯、免疫检测、核酸分析和基因工程、作靶向释药的载体等领域。

磁性微球一般由磁性内核和保护性壳组成，目前主要应用的磁性微球主要有磁性琼脂糖微球、磁性二氧化硅微球、磁性聚丙烯酰胺/聚丙烯酸/聚苯乙烯类高分子微球等。为增强磁性微球与包被生物高分子的结合效率，一般需要对磁性微球进行表面功能化基团修饰，磁性微球表面功能化的基团能与生物高分子的多种活性基团如-OH、-COOH、-NH₂共价连接，可在其表面稳定地固定生物活性物质(如抗体、抗原、受体、酶、核酸和药物等)，因此磁性微球表面功能化基团的活性及均匀性对结合的稳定性及免疫检测的准确性至关重要。

CN112877387A公开了采用SiO₂包裹的磁性材料为磁性微球本体，利用氨基化硅烷偶联剂对磁性微球本体进行化学修饰，将氨基引入到磁性微球本体的外表面，形成氨基修饰磁性微球A；利用羧基与氨基之间的共价反应将丙烯酸分子共价偶联到所述磁性微球A的外表面，引入碳碳双键，形成含碳碳双键磁性微球B；在不加交联剂的条件下，利用碳碳双键的聚合反应，将丙烯酸类单体分子进行聚合，获得的丙烯酸类聚合物具有线性主链和含有功能基团的支链，聚合物通过线性主链的一端共价偶联于磁性微球B的外表面；形成丙烯酸类聚合物修饰磁性微球C；通过所述聚合物支链含有的功能基团，将生物素或生物素类似物共价偶联到聚合物支链末端，得到所述生物磁性微球。然而，采用氨基化硅烷偶联剂进行表面修饰的可控性较差，其本身易产生自聚交联反应会使活性基团包埋并降低表面修饰效果，从而导致活性和反应性的降低，因此与生物活性物质的结合性降低。

MQ硅树脂是由含有四官能度硅氧烷链节(SiO_4/2,Q)的有机硅化合物与含有单官能度硅氧烷链节(R₃SiO_1/2,M)的有机硅化合物进行共水解-缩聚反应生成的三维球型结构的硅树脂。其是一种具有双层结构的紧密球状物，符合磁性微球为均匀球形的要求；其球芯为硅氧键连接密度较高的笼状二氧化硅，具备生理惰性和与无机磁性材料结合力较强的要求；其球壳为密度较低的R₃SiO_1/2层，通过调节封端剂种类可以实现表面均匀分布不同活性基团。因此，采用MQ硅树脂以同时实现磁性微球的壳层保护及表面功能化修饰是一项非常有前景的工作。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种脂联素抗体磁性微球的制备方法。

本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的脂联素抗体磁性微球。

本发明的再一目的在于提供一种含有上述脂联素抗体磁性微球的脂联素测定试剂盒。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种脂联素抗体磁性微球的制备方法，包括如下制备步骤：

(1)将硅酸酯、活性封端剂和磁性纳米颗粒加入到溶剂中搅拌混合均匀，惰性气氛保护下升温至60～90℃，然后滴加酸催化剂溶液进行搅拌反应，反应完成后经过滤、洗涤、干燥，得到功能化MQ硅树脂包覆磁性微球；

(2)将步骤(1)所得功能化MQ硅树脂包覆磁性微球与链亲和素溶液混合孵育，得到链亲和素包被的磁性微球；

(3)将生物素与脂联素抗体混合反应，得到生物素化脂联素抗体；

(4)将步骤(2)所得链亲和素包被的磁性微球与步骤(3)的生物素化脂联素抗体混合孵育，得到脂联素抗体磁性微球。

进一步地，步骤(1)中所述硅酸酯为硅酸钠、正硅酸甲酯和正硅酸乙酯中的至少一种。

进一步地，步骤(1)中所述活性封端剂为1,3-双(氨丙基)四甲基二硅氧烷、1,3-双(3-羧基丙基)四甲基二硅氧烷、1,3-双(3-羟基丙基)四甲基二硅氧烷、1,3-二(3-缩水甘油丙基)四甲基二硅氧烷、1,3-二乙烯基四甲基二硅氧烷、四甲基二硅氧烷中的至少一种。

进一步地，步骤(1)中所述磁性纳米颗粒选自磁性四氧化三铁纳米颗粒。

进一步地，步骤(1)中所述硅酸酯、活性封端剂和磁性纳米颗粒加入的质量比为10:0.5～2:10～40。

进一步地，步骤(1)中所述溶剂选择为能溶解或部分溶解反应原料硅酸酯和活性封端剂，但不溶解反应产物MQ硅树脂的溶剂。具体可选择为水和小分子醇的混合溶剂，如水和乙醇的混合溶剂、水和异丙醇的混合溶剂等；所述水和小分子醇混合的体积比为4～7:6～3。

本发明通过采用能溶解或部分溶解反应原料硅酸酯和活性封端剂，但不溶解反应产物MQ硅树脂的溶剂进行反应，通过加入不溶性的磁性纳米颗粒，MQ硅树脂的生成过程中其内核硅氧键与无机磁性纳米颗粒具有较强结合力，反应生成的MQ硅树脂在无机磁性纳米颗粒表面原位析出，实现对磁性纳米颗粒的良好包覆。产物经简单过滤即可分离，具有工艺简单、成本低的优势。

进一步地，步骤(1)中所述酸催化剂溶液选自盐酸溶液或硫酸溶液；所述搅拌反应的时间为1～4h。

进一步地，步骤(2)中所述链亲和素溶液的浓度为0.1～1mg/mL。

进一步地，步骤(3)中所述生物素与脂联素抗体混合的摩尔比为1:1～5。

进一步地，步骤(3)中所述脂联素抗体是指抗人脂联素单克隆抗体或抗人脂联素多克隆抗体。

进一步地，步骤(4)中所述链亲和素包被的磁性微球与生物素化脂联素抗体混合孵育的质量比为100:5～10。

一种脂联素抗体磁性微球，通过上述方法制备得到。

一种含有上述脂联素抗体磁性微球的脂联素测定试剂盒，包括脂联素抗体磁性微球溶液、脂联素抗体荧光素标记物和样本稀释液。

进一步地，所述脂联素抗体荧光素标记物为脂联素抗体吖啶酯标记物。

进一步地，所述样本稀释液为含有牛血清白蛋白、酪蛋白、表面活性剂和防腐剂的磷酸盐缓冲液。

进一步地，所述脂联素测定试剂盒还包括预激发液和激发液；所述预激发液为浓度为0.05～0.25mol/L的NaOH溶液，所述激发液为浓度为0.05～0.2mol/L的H₂O₂溶液。

进一步地，所述脂联素测定试剂盒还包括校准品；所述校准品为含有脂联素重组抗原、蛋白稳定剂和防腐剂的磷酸盐缓冲液。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明的脂联素抗体磁性微球采用功能性MQ硅树脂原位包覆一步实现磁性纳米颗粒的壳层保护及表面功能化修饰，具有制备工艺简单、成本低的优势。

(2)本发明的脂联素抗体磁性微球因具有MQ硅树脂独特的内层紧密、外层疏散球状结构，其内层与无机磁性纳米颗粒紧密结合，包覆效果好；功能基团均匀分布于微球最外层，与抗体、抗原等生物活性物质结合效率高，可显著增强免疫磁性分离的效果，提高检测准确性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本实施例的一种脂联素测定试剂盒，包括脂联素抗体磁性微球溶液(3.0mL/瓶)、脂联素抗体吖啶酯标记物(6.0mL/瓶)、样本稀释液(13.0mL/瓶)、预激发液(1.0mL/瓶)、激发液(1.0mL/瓶)和校准品(0.5mL/支，3支)。

本实施例所述脂联素抗体磁性微球溶液通过如下方法制备得到：

(1)将10g正硅酸甲酯、1.2g活性封端剂1,3-双(氨丙基)四甲基二硅氧烷和20g磁性四氧化三铁纳米颗粒加入到60g水和乙醇的混合溶剂中(V_水:V_乙醇＝5:5)搅拌混合均匀，氮气保护下升温至80±5℃，然后滴加盐酸催化剂溶液进行搅拌反应2h，反应过程维持搅拌速度为200～250r/min，反应完成后经过滤、水和乙醇依次洗涤、气流干燥，得到功能化MQ硅树脂包覆磁性微球。

(2)将步骤(1)所得功能化MQ硅树脂包覆磁性微球与0.5mg/mL链亲和素溶液在常温摇床下混合孵育，得到链亲和素包被的磁性微球。

(3)将生物素(商品化已活化产品)与脂联素抗体混合，活化生物素与脂联素抗体混合的摩尔比设置为1:2，室温下反应，离心，取上清液在4℃下置于PBS缓冲液中透析，得到生物素化脂联素抗体。

(4)将步骤(2)所得链亲和素包被的磁性微球与步骤(3)的生物素化脂联素抗体按质量比为100:6在常温摇床条件下混合孵育2h，得到脂联素抗体磁性微球溶液。取所得脂联素抗体磁性微球溶液经pH为7.4的磷酸盐缓冲液稀释至2mg/mL后使用。

本实施例所述脂联素抗体荧光素标记物为脂联素抗体吖啶酯标记物，其可通过将吖啶酯与脂联素抗体在磷酸盐缓冲溶液中混合孵育得到。

本实施例所述样本稀释液为pH为7.4的磷酸盐缓冲液，内含1％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白、0.1％TritonX-100、0.1％叠氮钠防腐剂。

本实施例所述预激发液为浓度为0.1mol/L的NaOH溶液，所述激发液为浓度为0.1mol/L的H₂O₂溶液。

本实施例所述校准品为自制含有脂联素重组抗原(不存在人源性物质)、蛋白稳定剂BSA和防腐剂叠氮钠的磷酸盐缓冲液。

采用本实施例的脂联素测定试剂盒利用磁微粒化学发光技术的双抗体夹心免疫测试法进行检测(采用全自动化学发光免疫分析仪，检测前用工作校准品校准测量系统，得到校准曲线)，具体检测步骤如下：

(1)第一步孵育：加入样本和样本稀释液经自动稀释后，取预稀释的样本和脂联素抗体磁性微球溶液。样本中的特异性的脂联素和磁性微粒上包被的脂联素抗体1反应，形成抗原-抗体1复合物。

(2)清洗：在磁场作用下，磁微粒吸附到反应管壁，未结合的物质被清洗液洗去。

(3)第二步孵育：加入脂联素抗体2-吖啶酯标记物，与第一步形成的抗原-抗体1复合物反应，形成抗体1-抗原-抗体2复合物。

(4)再次清洗。

(5)激发和读数：在反应复合物中加入预激发液和激发液，通过相对发光强度测定化学发光反应。

(6)样本中脂联素的含量和测定仪光学系统测定到的相对发光强度呈正相关。

(7)测试结果通过校准曲线确定。

一、线性范围测试

取本实施例试剂盒分别对线性范围内(0.05mg/L～60.00mg/L)5个不同浓度的脂联素企业参考品进行检测，每个企业参考品重复检测3次并计算每个浓度的平均值，按公式(1)、(2)、(3)，计算直线方程y＝a+bx(y:试剂的检测值，x:企业参考品的实际值)，以及相关系数r。

式中：

b-回归线的斜率；

|a|-回归线截距的绝对值；

r-相关系数；

X_i-企业参考品的实际值；

Y_i-企业参考品的3次重复测量均值；

i-1，2，3，……，n；

n-测定样本数。

结果显示在试剂盒检测范围0.05～60.00mg/L内，线性相关系数r为0.9992。

二、检出限测试

选择5份浓度接近0.05mg/L的低值样本进行检测，每份样本重复测定5次，对测定结果按照大小进行排序，结果显示检测结果均<3.0mg/L，且无低于空白限(0.03mg/L)的检测结果。说明试剂盒检出限不大于0.05mg/L。

三、重复性测试

在重复性条件下，用试剂盒分别测定生理正常值(0.50mg/L)与生理异常值(20.6mg/L)的脂联素企业参考品，分别重复测定10次，分别计算测量值的平均值(X)和标准差(S)。按公式(4)计算变异系数(CV)。

CV＝S/X*100％...........................(4)；

重复测量结果显示生理正常值参考品的变异系数(CV)为1.6％，生理异常值参考品的变异系数(CV)为0.82％。

四、准确度测试

用本实施例试剂盒分别测定线性范围内高(60.00mg/L)、中(10.00mg/L)、低(0.05mg/L)三个不同浓度的脂联素企业参考品，每个企业参考品重复测定3次，计算样本测定结果均值，按公式(5)计算相对偏差(Bias％)。

Bias％＝(X-X)/X*100％............................(5)；

X-样本测定结果均值；

X-测定样本理论值。

结果显示高、中、低浓度的企业参考品相对偏差结果分别为-2.3％、0.95％、-1.8％。

五、校准品测量准确度测试

以试剂盒配套校准品作为样本进行检测，各重复测定3次后，根据公式(6)计算CAL1(标示值0.50mg/L)的绝对偏差(M_D)，及根据公式(7)计算CAL2(标示值5.00mg/L)和CAL3(标示值50.00mg/L)的相对偏差(B_i)。

M_D＝|Xi-T|..........................(6)；

Bi＝(Xi-T)/T×100％........................(7)；

式中：

X_i—测定浓度值；

T—配套校准品标示值。

其中CAL1校准品3次测定M_D结果分别为0.02mg/L、0.01mg/L、0.01mg/L；CAL2校准品3次测定Bi结果分别为-1.27％、-2.35％、0.66％；CAL3校准品3次测定Bi结果分别为-3.46％、1.96％、-2.60％。

通过以上结果可以看出，本发明的脂联素测定试剂盒具有较好的线性范围、较低的检出限、较好的重复稳定性及较高的准确度。

对比例1

本对比例与实施例1相比，采用氨基修饰的二氧化硅(包覆)磁性微球替代功能化MQ硅树脂包覆磁性微球，所述脂联素抗体磁性微球溶液通过如下方法制备得到：

(1)将20g二氧化硅磁性微球(市购，二氧化硅包覆四氧化三铁磁性微球，平均粒径200nm)加入到60g水和乙醇的混合溶剂中(V_水:V_乙醇＝5:5)搅拌混合均匀，然后加入1.2g3-氨丙基三甲氧基硅烷偶联剂进行搅拌反应2h，反应完成后经过滤、水和乙醇依次洗涤、气流干燥，得到氨基修饰的二氧化硅磁性微球。

(2)将步骤(1)所得氨基修饰的二氧化硅磁性微球与0.5mg/mL链亲和素溶液在常温摇床下混合孵育，得到链亲和素包被的磁性微球。

采用本对比例的脂联素抗体磁性微球溶液按实施例的1规格和试剂制备脂联素测定试剂盒。按实施例1中步骤四的方法进行准确度测试，结果显示高、中、低浓度的企业参考品相对偏差结果分别为-11.5％、-12.6％、-12.1％。按实施例1中步骤五的方法进行校准品测量准确度测试，结果显示CAL1校准品3次测定M_D结果分别为0.07mg/L、0.08mg/L、0.08mg/L；CAL2校准品3次测定Bi结果分别为-10.37％、-12.84％、-11.52％；CAL3校准品3次测定Bi结果分别为-12.75％、-14.56％、-13.90％。

通过本对比例与实施例1的准确度测试比较结果可以看出，本发明试剂盒采用功能化MQ硅树脂包覆磁性微球可以明显提高检测准确性。其原因在于MQ硅树脂包覆具有独特的内层紧密、外层功能基团疏散球状结构，其内层与无机磁性纳米颗粒紧密结合，包覆效果好；功能基团均匀分布于微球最外层，与抗体、抗原等生物活性物质结合效率高，可显著提高磁性分离的效果，从而提高检测准确性。而采用氨基硅烷偶联剂进行表面修饰的可控性较差，其本身易产生自聚交联反应会使活性基团包埋并降低表面修饰效果，从而导致活性和反应性的降低，因此与生物活性物质的结合性降低，磁性分离的效果降低，从而导致检测结果的偏低。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种脂联素抗体磁性微球的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：

2.根据权利要求1所述的一种脂联素抗体磁性微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述硅酸酯为硅酸钠、正硅酸甲酯和正硅酸乙酯中的至少一种；所述活性封端剂为1,3-双(氨丙基)四甲基二硅氧烷、1,3-双(3-羧基丙基)四甲基二硅氧烷、1,3-双(3-羟基丙基)四甲基二硅氧烷、1,3-二(3-缩水甘油丙基)四甲基二硅氧烷、1,3-二乙烯基四甲基二硅氧烷、四甲基二硅氧烷中的至少一种；所述磁性纳米颗粒选自磁性四氧化三铁纳米颗粒。

3.根据权利要求2所述的一种脂联素抗体磁性微球的制备方法，其特征在于，所述硅酸酯、活性封端剂和磁性纳米颗粒加入的质量比为10:0.5～2:10～40。

4.根据权利要求1所述的一种脂联素抗体磁性微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述溶剂为水和小分子醇的混合溶剂，所述水和小分子醇混合的体积比为4～7:6～3；所述酸催化剂溶液选自盐酸溶液或硫酸溶液；所述搅拌反应的时间为1～4h。

5.根据权利要求1所述的一种脂联素抗体磁性微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述链亲和素溶液的浓度为0.1～1mg/mL；步骤(3)中所述生物素与脂联素抗体混合的摩尔比为1:1～5；步骤(3)中所述脂联素抗体是指抗人脂联素单克隆抗体或抗人脂联素多克隆抗体；步骤(4)中所述链亲和素包被的磁性微球与生物素化脂联素抗体混合孵育的质量比为100:5～10。

6.一种脂联素抗体磁性微球，其特征在于，通过权利要求1～5任一项所述的方法制备得到。

7.一种脂联素测定试剂盒，其特征在于，包括权利要求6所述的脂联素抗体磁性微球溶液、脂联素抗体荧光素标记物和样本稀释液。

8.根据权利要求7所述的一种脂联素测定试剂盒，其特征在于，所述脂联素抗体荧光素标记物为脂联素抗体吖啶酯标记物；所述样本稀释液为含有牛血清白蛋白、酪蛋白、表面活性剂和防腐剂的磷酸盐缓冲液。

9.根据权利要求7所述的一种脂联素测定试剂盒，其特征在于，所述脂联素测定试剂盒还包括预激发液和激发液；所述预激发液为浓度为0.05～0.25mol/L的NaOH溶液，所述激发液为浓度为0.05～0.2mol/L的H₂O₂溶液。

10.根据权利要求7所述的一种脂联素测定试剂盒，其特征在于，所述脂联素测定试剂盒还包括校准品；所述校准品为含有脂联素重组抗原、蛋白稳定剂和防腐剂的磷酸盐缓冲液。