CN117721026A - 一株黄绿木霉及其应用 - Google Patents
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Abstract
一株黄绿木霉及其应用，它涉及中药材病原菌防治领域，本发明的黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2023年07月05日，保藏编号为CGMCC NO.40724。本发明的黄绿木霉能够预防苍术根腐病、促进苍术幼苗根茎生物量累积以及有效成分累积。
Description
技术领域
本发明属于中药材病原菌防治领域，具体涉及一株黄绿木霉及其应用。
背景技术
苍术以菊科苍术属多年生草本植物苍术(Atractylodeslancea)的干燥根茎入药。其味辛、苦，性温，归脾、胃、肝经，有燥湿健脾、祛风散寒、明目等功效。随着苍术需求量的不断增加，苍术野生资源已经供不应求，因此苍术逐渐由采挖野生苍术转变为人工种植，北至内蒙古北部、南至长江流域均可种植。由于苍术多年生的特征以及需连续栽培2年以上方可采收的特征，我国苍术种植实践中大范围存在根腐病导致苍术减产、品质下降的难题，一些种植区域的根腐病发病率可高达约50％～80％，已经成为制约苍术种植产业发展的主要问题。苍术根腐病的主要发病部位为苍术的根和茎，发病后根及根茎变褐腐烂，散发臭气，逐渐引起苍术地上部分叶片萎蔫，最终枯死，导致苍术块茎产量和品质下降。同时，《中华人民共和国中医药法》第二十三条规定严格管理农药、肥料等农业投入品在中药材种植中的使用，并建议加强道地中药材生产基地生态环境保护。对于中药材病害的防治主要有农业防治方法、物理防治方法、化学防治方法及生物防治方法，其中生物防治方法是在具有同等防治作用下对环境污染最小的方法，且符合“预防为主，综合防治”的病虫害防治原则。
CN116716192A，发明名称《一株拟康氏木霉及其应用》，公开了一株拟康氏木霉TZ2107RHs2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年10月17日，保藏编号为CGMCCNo.40332。该发明还公开了其在预防苍术根腐病中的应用及在促进苍术根茎发育及地下部分生物量累积中的应用。该发明拟康氏木霉TZ2107RHs2处理不仅可以高效降低根腐病导致的植株死亡率，而且有保障药材生物量提升后品质不劣化的巨大的潜力，克服中药材种植过程中施用化肥导致生物量提升但药效成分产量大幅降低、品质劣化的困难。但是，该专利的拟康氏木霉对镰刀菌属的苍术根腐病菌Fusariumoxysporum、Fusarium solani抑制效果不显著，对苍术酮、苍术素、苍术醇、β-桉叶醇的促进效果不显著。地下部分生物量累积效果不理想。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够预防苍术根腐病、促进苍术幼苗根茎生物量累积以及有效成分累积的黄绿木霉。
本发明的一株黄绿木霉为黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2023年07月05日，保藏编号为CGMCC NO.40724。
本发明的一株黄绿木霉应用，所述的黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2在预防苍术根腐病或提高苍术对根腐病的抵抗力中的应用。
本发明的一株黄绿木霉应用，所述的黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2在促进苍术幼苗根茎生物量累积中的应用。
本发明的一株黄绿木霉应用，所述的黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2在促进苍术有效成分累积中的应用。
进一步地，所述的促进苍术有效成分累积是促进苍术根茎中有效成分累积。
进一步地，所述的有效成分为苍术醇、β-桉叶醇、苍术酮和苍术素。
本发明使用木霉菌对栽培前的苍术幼苗进行诱导处理后再栽培入土，从而使苍术植株在幼苗期即提升对土壤中根腐病原菌的抵御能力，可在不使用任何农药及肥料的条件下，大幅提升苍术植株种植于含根腐病原菌土壤中的存活率；另外，可提升种植于不含大量根腐病原菌的正常土壤中后苍术根茎的发育及地下部分生物量累积。
本发明的优点：与CN116716192A，发明名称《一株拟康氏木霉及其应用》的拟康氏木霉TZ2107RHs2相比，
①本发明的黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2的挥发性物质对Fo、Fs的抑制作用显著高于拟康氏木霉TZ2107RHs2。
②本发明的黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2能够显著促进四种有效成分苍术酮、苍术素、苍术醇、β-桉叶醇的浓度。
本发明包含以下有益效果：
1、黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2对环境友好，采用黄绿木霉对栽培入土前的苍术幼苗进行诱导处理，无需任何其他药剂施用，即可使苍术从苗期即提升根腐病抵御力；
2、能定植在苍术苗根表面，仅经一次种植前的诱导处理，其防病效果明显，使用2株致病力强的根腐病原菌发酵液等体积混合物作为染病组并用于对比：使用2株根腐病发酵液等体积混合物浸根侵染苍术组培苗24小时后再移栽至土壤里种植，发病死亡率为25％(将发酵液中的大团菌丝过滤去除后再浸根)至96％(不去除菌丝团而直接浸根侵染)；根腐病菌液浸根侵染24小时后再使用此木霉发酵液(将发酵液中的大团菌丝过滤去除后再浸根)浸根处理24小时，然后移栽至土壤，发病死亡率降为0％；
3、采用本发明制备木霉发酵液，处理方法简单，无需生物专业实验室设备，便于在农村、田间等开展诱导处理操作，不具备生物学专业知识的药农及工人等也可完成便捷的诱导处理。
附图说明
图1为本发明黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2的形态学鉴定图；其中，A图为30℃暗培养10天后菌落正面外观，B图为A图中菌落的背面外观，C-D，木霉Tci的显微形态；C-D箭头：1，菌丝体；2，分生孢子梗；3、分生孢子；4、瓶梗，比例尺：100μm；
图2为本发明黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2的系统发育树图；图中ITS为黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2；
图3为本发明黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2对2株苍术根腐病原菌(尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌)的抑菌率柱状图及对2株苍术根腐病原菌(尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌)的抑菌显微图；
图4为本发明黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2与拟康氏木霉TZ2107RHs2的挥发性物质对2株苍术根腐病原菌(尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌)的抑菌率柱状图；
图5为本发明黄绿木霉、苍术根腐病原菌-尖孢镰刀菌、苍术根腐病原菌-茄病镰刀菌发酵培养菌液图以及黄绿木霉定植苍术幼苗根部图；A：尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)在28℃、200rpm条件下发酵7天所得菌液；B：茄病镰刀菌(Fusarium solani)在28℃、200rpm条件下发酵7天所得菌液；C：黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2在28℃、200rpm条件下发酵5天所得菌液；D：在木霉菌液中浸泡24h后，苍术幼苗根部可见明显菌丝附着(箭头所指)，表明木霉定植成功；
图6、图7为原产于江苏省的苍术组培苗经木霉诱导处理、染根腐病处理等多种处理后植株外观的对比图；其中CK代表对照组，Tci代表本发明中的一株黄绿木霉，Fo、Fs分别代表镰刀菌属的苍术根腐病菌Fusarium oxysporum、Fusarium solani，Fo+Fs代表使用两株根腐病原菌发酵物的等比混合物进行了染根腐病处理，Fo+Fs_Tci代表经过等量混合病原菌浸根24h，再经木霉浸根24小时后再进行染根腐病处理；Autoclaved Fo+Fs代表经过高温灭菌的等量混合病原菌浸根24h；Merchandise代表山东木鱼石生物科技有限公司市售的哈茨木霉浸根24h；
图8为原产于江苏省的苍术组培苗经木霉诱导处理、染根腐病处理等多种处理后植株生物量测定结果的对比图；其中CK代表对照组，Tci代表本发明中的一株黄绿木霉，Fo、Fs分别代表镰刀菌属的苍术根腐病菌Fusarium oxysporum、Fusarium solani，Fo+Fs代表使用两株根腐病原菌发酵物的等比混合物进行了染根腐病处理，Fo+Fs_Tci代表经过等量混合病原菌浸根24h，再经木霉浸根24小时后再进行染根腐病处理；Autoclaved Fo+Fs代表经过高温灭菌的等量混合病原菌浸根24h；Merchandise代表山东木鱼石生物科技有限公司市售的哈茨木霉浸根24h；
图9为原产于江苏省的苍术组培苗经木霉诱导处理、染根腐病处理等多种处理后植株地下部分冻干后测定其中主要药效成分苍术醇、β-桉叶醇、苍术酮、苍术素浓度(μg/gDW)的结果对比图；其中DW代表冻干后的苍术地下部分干重，CK代表对照组，Tci代表本发明中的一株黄绿木霉，Fo、Fs分别代表镰刀菌属的苍术根腐病菌Fusarium oxysporum、Fusarium solani，Fo+Fs代表使用两株根腐病原菌发酵物的等比混合物进行了染根腐病处理，Fo+Fs_Tci代表经过等量混合病原菌浸根24h，再经木霉浸根24小时后再进行染根腐病处理；Autoclaved Fo+Fs代表经过高温灭菌的等量混合病原菌浸根24h；Merchandise代表山东木鱼石生物科技有限公司市售的哈茨木霉木霉浸根24h。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1本发明的黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2筛选过程如下：
本发明在2022年夏季从河北省承德市采集了栽培苍术，从其须根的根际土壤中分离得到了黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2；
首先，在从上述栽培苍术分离得到的木霉菌株中筛选出7天后菌落正面呈黄绿色、大量产孢的菌株。
然后，通过与2株病原菌(即Fusarium oxysporum、Fusarium solani)分别进行对峙培养实验，筛选出对2株病原菌的抑菌率均较高的菌株。对峙培养方法如下：在PDA平板的一条直径线上相距9cm且各自与平皿边缘等距的两点处分别接种(摆放)木霉PDA菌饼与病原菌PDA菌饼(由打孔器取自培养了10天的PDA边缘，直径4mm)，倒置于30摄氏度保温箱，在黑暗中静置培养天后观察结果：测量病原菌菌落直径。对照组不接种木霉菌饼。
抑菌率＝(对照组直径-实验组直径)÷对照组直径×100％。
最终筛选得到抑菌率高的黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2。TCY2204R2菌株经形态鉴定(图1)及基于ITS序列构建的进化树(如图2所示)鉴定，经形态鉴定及ITS分子鉴定为黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)，最终命名为黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2。保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期是2023年07月05日，保藏编号为CGMCC NO.40724。
实施例2本发明的黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2的发酵液，作为用于诱导的木霉菌剂的制备如下：
(1)制备PDA平板，将黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2接种于平板中心；
(2)在20至30℃的环境条件下培养至菌丝铺满PDA平板；
(3)使用新鲜未变质的土豆(用量200g加热后熟透的土豆泥/L培养基)和工业品质的葡萄糖(用量20g/L)加自来水充分混匀制备成液体土豆培养基，煮沸灭菌后灌入10升以上容积大桶；
(4)将PDA平板中的木霉切碎后投入桶中，在20至30℃的环境温度下使用带有除菌过滤器的空气泵通气培养至液体肉眼可见混浊后，继续培养，当所得的发酵液呈黄绿色，即可作为木霉菌剂用于诱导处理苍术幼苗。
对本发明的黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2功能验证如下：
实施例3苍术根腐病原菌对峙培养
将本发明的黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2与2株苍术根腐病原菌(尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌)对峙培养，验证黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2具有直接抑制病原菌生长的作用；对峙培养方法如下：在PDA平板的一条直径线上相距9cm且各自与平皿边缘等距的两点处分别接种(摆放)木霉PDA菌饼与病原菌PDA菌饼(由打孔器取自培养10天的PDA边缘，直径5mm)，倒置于30摄氏度保温箱，在黑暗中静置培养10天后观察结果：测量病原菌菌落直径。对照组不接种木霉菌饼。
抑菌率＝(对照组直径-实验组直径)÷对照组直径×100％。
与2株苍术根腐病原菌(尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌)对峙培养(如图3所示)，显微观察发现此株木霉可以通过对病原菌的菌丝进行重寄生而直接抑制病原菌生长。
实施案例4黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2挥发性物质抑菌作用将本发明的黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2与2株苍术根腐病原菌(尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌)对扣培养，验证黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2挥发性物质具有抑制病原菌生长的作用；对扣培养方法如下：在直径为9cm的培养皿底倒入一定量的PDA培养基，制成平板，在平板中央接入直径为4mm的黄绿木霉(Trichodermaaureoviride)TCY2204R2菌饼，放入30℃培养箱中培养7d。另取空白平板，在平板中央分别接入直径为4mm的2株苍术根腐病原菌(尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌)菌饼，然后与培养7d的黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2平板两皿底对扣，用封口膜密封，黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2在下，病原真菌在上，以仅接种病原真菌的培养皿为对照，3次重复，30℃条件下培养，3d后采用十字交叉法测量病原真菌菌落直径，计算黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2挥发性物质对植物病原真菌生长抑制率。
抑菌率＝(对照组直径-实验组直径)÷对照组直径×100％。
与2株苍术根腐病原菌(尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌)对扣培养(如图4所示)，发现此株木霉挥发性物质对病原菌生长具有抑制作用。
实施例5对苍术组培苗进行接种处理。
(1)取根长约2cm、苗高(不含根部)约4cm的苍术幼苗，去除苍术组培苗根部的固体培养基，随机分成5组，每组8至10株苗(处理步骤涉及病原菌及山东木鱼石生物科技有限公司市售的哈茨木霉的组10株，其他组8株)，将苗用吸水软纸擦干，称量每组内每株苗的鲜重，确保每组间苗的平均鲜重无显著差异(P<0.05)，将苗装入容器(透明杯)使其根部浸泡在无菌水(家用净水机制的水即可)中并给容器加盖防止幼苗干枯，在20至30℃的环境温度下静置炼苗48小时；
(2)将无菌水置换成木霉菌剂(即发酵液；为避免发酵过程中产生的个别过大的混丝团对幼苗造成过度接种以至于伤害，发酵液使用前应使用1至2层纱布过滤去除体积过大、致密的菌丝团)，继续在20至30℃的环境温度下静置24小时，即完成了诱导处理；
(3)判断最适接种时长的方法：诱导处理超过18小时后，每隔4小时观察一次，观察方法：将诱导中的幼苗移至透明容器内使其根部浸入清澈的水中，轻轻摇动；若肉眼可见定植于幼苗根部的絮状或丝状物(如图5示)，最长的长度可达约1cm，此时即可停止诱导，将幼苗栽培入土。过久的诱导处理反而可能对苍术苗的生长产生不良作用。
实施例6对接种后的苍术幼苗进行生长、抗病能力的观察。
1)实验条件：
此实验是在位于北京市东城区的中国中医科学院中药资源中心实验室条件下完成的。
2)苍术苗种质来源：
本实施例使用的苍术为江苏省常州市金坛区金牛洞山(31°46′37″N，119°18′52″W)的“茅苍术”。
3)苍术苗的诱导及种植方法：
(1)取具有活力的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄病镰刀菌(Fusariumsolani)菌种，各取等量，分别接种入1L经过了高温灭菌的液体土豆培养基中，在28℃的恒温下(对光照条件无要求)以200rpm转速持续震荡培养7天；
(2)取混匀后的发酵液在光学显微镜下观察，使用血细胞计数板统计两种菌液浓度(cfu/L)，将两种菌液浓度使用纯净水调节至基本一致后，等体积混合，作为染根腐病处理所使用的病原菌液；
(3)取240mL的塑料杯，在杯底部中心灼烧三至五个直径约3mm的洞，作为育苗容器，在其中填塞手感微湿的灭菌土与蛭石混合物(体积比约3:1)至杯与内部的土共重约180g，保障育苗容器内土对苗根部产生的机械压力基本一致；
(4)CK组：将仅经过清水炼苗的苍术幼苗直接栽培入杯土，一杯一苗；Fo+Fs组：将10株苍术苗根浸泡在100mL病原菌混合菌液中诱导24h后直接栽培入杯土，一杯一苗；Fo+Fs_Tci组：将经Fo、Fs混合菌液诱导24小时的苍术幼苗根在100mL木霉菌液中诱导24h后栽培入杯土，一杯一苗；Autoclaved Fo+Fs代表经过高温灭菌的等量混合病原菌浸根24h后栽培入杯土，一杯一苗；Merchandise代表山东木鱼石生物科技有限公司市售的哈茨木霉浸根24h后栽培入杯土，一杯一苗。
(5)将不同组的育苗杯分别放入不同托盘，避免通过杯底部漏孔产生的木霉或病原菌交叉污染，给杯土中浇纯净水至饱和，置入人工气候箱，在25℃、70％湿度条件下，给幼苗罩杯保持早期幼苗不受干旱胁迫，保持充分浇水(纯净水)，培养150天(如图6至8所示)，期间观察苍术苗长势及染根腐病处理所导致的死亡率，150天后取样，进行生物量(图8)及苍术的四种主要药效成分即苍术醇、β-桉叶醇、苍术酮、苍术素含量的测定(如图9所示)，与拟康氏木霉TZ2107RHs2对比，本发明黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2对苍术苗生物量具有明显促进作用，与CK相比，苗总重增加倍数Fo+Fs_Tci组增加0.38倍，Tci组增加0.25倍；地下部分干重Fo+Fs_Tci组增加0.20倍，Tci组增加0.06倍；根茎干重Fo+Fs_Tci组增加0.42倍，Tci组增加0.25倍。并且本发明黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2对苍术酮、苍术素产量提升幅度更大：拟康氏木霉TZ2107RHs2与其CK对比的诱导效果：苍术素产量无提升；而本发明黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2与CK对比的诱导效果：苍术素单株绝对产量Fo+Fs_Tci组增加0.45倍，Tci组增加0.12倍，苍术酮单株绝对产量Fo+Fs_Tci组增加0.39倍，Tci组增加0.08倍；苍术醇单株绝对产量Fo+Fs_Tci组增加0.75倍，Tci组增加0.09倍；β-桉叶醇单株绝对产量Fo+Fs_Tci组增加0.73倍，Tci组增加0.07倍。可知，本申请黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2显著提升了苍术素、苍术酮、苍术醇、β-桉叶醇产量。
Claims (6)
1.一株黄绿木霉，其特征在于它为黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)TCY2204R2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2023年07月05日，保藏编号为CGMCC NO.40724。
2.如权利要求1所述的一株黄绿木霉应用，其特征在于所述的黄绿木霉(Trichodermaaureoviride)TCY2204R2在预防苍术根腐病或提高苍术对根腐病的抵抗力中的应用。
3.如权利要求1所述的一株黄绿木霉应用，其特征在于所述的黄绿木霉(Trichodermaaureoviride)TCY2204R2在促进苍术幼苗根茎生物量累积中的应用。
4.如权利要求1所述的一株黄绿木霉应用，其特征在于所述的黄绿木霉(Trichodermaaureoviride)TCY2204R2在促进苍术有效成分累积中的应用。
5.根据权利要求4所述的一株黄绿木霉应用，其特征在于所述的促进苍术有效成分累积是促进苍术根茎中有效成分累积。
6.根据权利要求4或5所述的一株黄绿木霉应用，其特征在于所述的有效成分为苍术醇、β-桉叶醇、苍术酮和苍术素。
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