CN117660577A - LtaSA蛋白或其编码基因在核黄素生产中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及LtaSA蛋白或其编码基因在核黄素生产中的应用。本发明提供了LtaSA蛋白或其编码基因在核黄素生产中的应用。本发明从250多个膜蛋白中筛选出了可以提高基因工程菌株核黄素产量的LtaSA蛋白，并因此构建了重组基因工程菌株，以用于工业化生产核黄素。本发明提供的包含LtaSA编码基因的重组基因工程菌株，可显著提高核黄素的产量，与对照菌株相比，核黄素产量提高了约54.3％，在工业化生产核黄素中意义重大。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及LtaSA蛋白或其编码基因在核黄素生产中的应用。
背景技术
核黄素(riboflavin)，又称维生素B2，是一种B族维生素。人和动物不能自身产生核黄素，需要外源摄入，在人和动物体内核黄素被转化成FMN和FAD。FMN和FAD为氧化还原酶的辅酶，广泛参与细胞氧化还原系统传递氢的反应，促进脂肪、糖、蛋白质的代谢。
枯草芽孢杆菌生产核黄素的历史比较悠久。在公开报道中得知，目前枯草芽孢杆菌产核黄素的生产菌是经过物理诱变，化学诱变，基因工程方法扩增核黄素基因簇等获得，其基因改造困难(Paracchini V,Petrillo M,Reiting R,Angers-Loustau A,Wahler D,Stolz A,B,Matthies A,Bendiek J,Meinel DM,Pecoraro S,Busch U,Patak A,Kreysa J,Grohmann L.Molecular characterization of an unauthorized geneticallymodified Bacillus subtilis production strain identified in a vitamin B2 feedadditive.Food Chem.2017Sep 1；230:681-689.)。近年来，多个已公开的研究团队通过合成生物学方法改造枯草芽孢杆菌获得了许多产核黄素的基因工程菌。但由于我们对微生物代谢和复杂的代谢调控机制认识的局限性，运用基因工程技术也面临很多困难，很难再使枯草芽孢杆菌核黄素的产量进一步大幅度提升。
中国专利申请202310669754.5公开了一种通过ARTP提高Ashbyagossypii核黄素生产能力的方法，涉及真菌技术领域，以棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii ATCC10859)为出发菌株，经常压室温等离子体(ARTP)诱变后筛选得到AG-85菌株，再通过AG-85菌株提高核黄素生产能力。
中国专利申请202310376021.2公开了一株高产核黄素的枯草芽孢杆菌突变株及其构建方法，其保藏编号为：CGMCC No.24396；该申请还公开了一株高产核黄素的枯草芽孢杆菌工程菌株及其构建方法。该申请还公开了枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素的方法，以及高产核黄素的枯草芽孢杆菌菌株在生产核黄素中的应用和高产核黄素的枯草芽孢杆菌菌株在饲料、医药、食品中的应用。
目前本领域需要更多基于基因工程的微生物生产核黄素的方法。
发明内容
发明人基于细胞内的核黄素达到一定量是否会限制核黄素的产量的考虑。通过表达枯草芽孢杆菌的膜蛋白，筛选出增加核黄素产量的膜蛋白。本发明先构建表达枯草芽孢杆菌膜蛋白的库，然后将构建的表达膜蛋白质粒转化到从野生型枯草芽孢杆菌经过基因工程改造获得一株产核黄素的菌株中，最后经过摇瓶筛选出能够增加核黄素的膜蛋白-LtaSA蛋白。
为了实现上述技术目的，本发明特此提出了以下技术方案：
在一个方面，本发明提供了LtaSA蛋白或其编码基因在核黄素生产中的应用。
在一些实施方式中，所述LtaSA蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述LtaSA蛋白的编码基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述编码基因包含于重组质粒。
在一些实施方式中，所述重组质粒包含于重组基因工程菌株。
在另一个方面，本发明提供了LtaSA蛋白或其编码基因在提高核黄素产量中的应用。
在一些实施方式中，所述LtaSA蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述LtaSA蛋白的编码基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述编码基因包含于重组质粒。
在一些实施方式中，所述重组质粒包含于重组基因工程菌株。
在又一个方面，本发明提供了一种基因工程菌株，所述基因工程菌株于2023年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.28715，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis。
在又一个方面，本发明提供了一种基因工程菌株在提高核黄素产量中的应用，所述基因工程菌株于2023年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.28715，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
在又一个方面，本发明提供了一种提高核黄素产量的方法，所述方法包括以下至少一种步骤：
(1)将包含LtaSA编码基因的质粒导入宿主菌株；
(2)培养产核黄素的基因工程菌株。
在一些实施方式中，所述基因工程菌株为CGMCC No.28715枯草芽孢杆菌。
在一些实施方式中，所述LtaSA编码基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO:1：
MKKLFSYKLSFFVLAVILFWAKTYLSYKTEFNLGVKGTTQEILLIFNPFSSAVFFLGLALLAKGRKSAIIMLIIDFLMTFVLYANILFYRFFDDFLTFPNIKQSGNVGNMGDGIFSIMAGHDIFYFLDIIILIAVLIWRPELKEYKMKKRFASLVILSGIALFFINLHYAEKDRPQLLTRTFDRNYIVKYLGLYNYTIYDGVQTAQTETQRAYASSDDLTSVENYTTSHYAKPNAEYFGSAKGKNIIKIHLESFQSFLIDYKLNGEEVTPFLNKLAHGGEDVTYFDNFFHQTGQGKTSDAELTMDNSIFGLPEGSAFVTKGENTYQSLPAILDQKEGYTSAVLHGDYKSFWNRDQIYKHIGYDKFFDASTYDMSDENVINMGLKDKPFFTESIPKLESLKQPFYAHLITLTNHYPFNLDEKDASLKKATTGDNTVDSYFQTARYLDEALEQFFKELKEAGLYDNSVIMIYGDHNGISENHNRAMKEILGKEITDYQNAQNQRVPLMIRVPGKKGGVNHTYGGEIDVMPTLLHLEGIDSQKYINFGTDLFSKDHDDTVAFRNGDFVTPKYTSVDNIIYDTKTGEKLKANEETKNLKTRVNQQLSLSDSVLYKDLLRFHKLNDFKAVDPSDYHYGKEKEIK。
SEQ ID NO:2：
ATGAAGAAACTTTTTTCTTACAAACTTAGCTTTTTTGTGCTGGCTGTTATACTGTTTTGGGCAAAAACGTATTTATCCTACAAGACTGAGTTTAATCTTGGGGTAAAAGGCACAACTCAGGAGATCCTCCTGATATTTAACCCATTCTCAAGCGCCGTCTTCTTTTTAGGACTGGCTTTGCTGGCGAAAGGGCGTAAATCAGCCATTATTATGCTGATTATCGATTTCTTGATGACATTTGTGTTATATGCAAATATTTTATTCTATCGTTTCTTTGACGATTTCTTGACGTTCCCGAACATTAAACAGTCCGGAAACGTTGGAAACATGGGAGACGGGATTTTCAGTATCATGGCCGGTCATGATATTTTCTATTTCTTAGATATTATCATTTTGATTGCGGTATTGATCTGGAGACCTGAATTAAAAGAATACAAAATGAAAAAACGCTTTGCATCTTTAGTGATCCTTTCTGGGATCGCACTGTTTTTCATCAACCTGCACTATGCGGAAAAAGACCGTCCGCAACTGCTGACAAGAACGTTTGACCGCAATTATATTGTGAAATATTTAGGTTTATACAACTACACCATTTATGACGGTGTACAGACGGCTCAAACAGAGACGCAAAGAGCCTATGCAAGCAGCGATGATTTAACAAGTGTCGAGAATTACACGACGTCTCATTATGCGAAACCAAACGCCGAGTACTTCGGCTCTGCCAAAGGCAAAAATATCATTAAAATTCACCTCGAAAGCTTCCAGTCATTCCTGATTGACTACAAGCTAAACGGTGAAGAGGTGACGCCTTTCTTAAATAAACTTGCGCACGGCGGGGAAGATGTGACGTATTTTGATAACTTCTTCCATCAGACAGGCCAGGGAAAAACATCTGATGCCGAGCTGACAATGGATAACTCGATCTTCGGTCTTCCTGAAGGCTCCGCGTTTGTGACGAAAGGCGAAAACACCTACCAGTCGCTTCCTGCGATTTTAGACCAGAAGGAAGGCTATACAAGCGCCGTCCTGCATGGTGATTACAAATCGTTCTGGAACCGTGACCAGATTTACAAACATATCGGATATGACAAGTTCTTCGACGCAAGCACGTATGATATGTCAGATGAAAATGTGATTAATATGGGGCTTAAGGATAAGCCGTTCTTTACAGAATCGATTCCAAAGCTTGAATCTCTTAAACAGCCATTTTATGCGCATTTGATTACATTGACAAACCATTATCCGTTTAACCTTGATGAAAAAGACGCGTCTCTTAAAAAAGCGACAACAGGCGATAACACAGTTGACAGCTACTTCCAGACAGCGCGTTACCTTGACGAAGCGCTTGAGCAATTCTTCAAGGAGCTGAAGGAAGCCGGCCTGTATGACAACTCAGTCATCATGATTTACGGTGACCATAACGGTATTTCTGAAAACCATAACCGAGCGATGAAAGAGATTCTTGGAAAAGAGATCACAGATTATCAAAACGCACAGAACCAGCGTGTGCCGCTGATGATCCGCGTTCCTGGCAAAAAAGGCGGAGTGAACCATACGTATGGCGGCGAAATTGACGTCATGCCGACACTTCTGCACTTAGAAGGAATTGATTCTCAGAAATATATCAACTTTGGTACTGATTTATTCTCTAAAGACCACGACGATACGGTGGCATTCAGAAACGGAGACTTCGTAACGCCGAAGTACACATCAGTCGACAATATCATTTACGATACGAAGACAGGTGAAAAACTGAAAGCGAATGAAGAAACGAAGAATCTGAAAACAAGAGTGAACCAGCAGCTGAGCCTTTCAGACAGTGTCCTGTACAAAGACTTGCTGAGGTTCCATAAACTAAATGATTTCAAAGCCGTTGATCCGTCAGACTATCATTACGGCAAGGAGAAAGAAATCAAATAA。
本发明从250多个膜蛋白中筛选出了可以提高基因工程菌株核黄素产量的LtaSA蛋白，并构建了重组基因工程菌株，以用于工业化生产核黄素。本发明提供的包含LtaSA编码基因的重组基因工程菌株，可显著提高核黄素的产量，与对照菌株相比，核黄素产量提高了约54.3％。
保藏信息：
生物材料：SHB135
分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis
保藏编号：CGMCC No.28715
保藏时间：2023年10月23日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1为HPLC测定发酵液中的核黄素的实验结果。
图2和图3为LtaSA膜蛋白过表达菌株的两次发酵确认结果。其中图2为第一次发酵确认结果，图3为第二次发酵确认结果。
具体实施方式
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
本发明涉及的试剂和材料：
·LB培养基：每升培养基中含酵母粉5g，氯化钠10g，蛋白胨10g(著[美]J.莎姆布鲁克.黄培堂译,分子克隆指南2002,1595)。
·发酵培养基：每升培养基含葡萄糖60g，FM902酵母粉5g，玉米浆膏3g，味精2g，七水硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g，尿素2.3g，甜菜碱2g，溶解后使用氢氧化钠调pH 7.0。
上述溶液进行高压蒸汽灭菌，灭菌温度121℃，时间20-30min。
本发明的试验方法：
·摇瓶发酵：(1)接种重组菌株至含有抗生素的4mL的LB培养基中，置37℃摇床250rpm培养；(2)取培养16h后的种子液400μL转移至2mL含有抗生素的LB液体培养基，于37℃摇床250rpm培养4h；(3)将2.4mL二级种子全部转入装有18mL发酵培养基的摇瓶中，置40℃摇床中，250rpm培养4h；(4)添加IPTG使其终浓度0.1mM，继续培养48h左右。
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。这样的结构和技术在许多出版物，例如《分子克隆实验指南(第四版)》(冷泉港实验室科学出版社)、Ausubel，F.M等人，CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.和Wiley-lnterscience的出版中也进行了描述。
实施例1构建膜蛋白表达库
本发明先通过NCBI数据库搜索查询枯草芽孢杆菌相关的膜蛋白，筛选挑出250多个潜在的膜蛋白进行过表达。筛选出膜蛋白后，根据对应的基因序列分别设计引物进行扩增，然后通过无缝克隆构建到低拷贝载体pBG102(构建过程在专利ZL 202010498739.5中描述)质粒上，得到250多个膜蛋白表达质粒pHB412-pHB500和pHB700-pHB874。以pHB709质粒(即pBG102-ltaSA)构建为例：以枯草芽孢杆菌基因组为模板，利用引物YHG359-F/R对扩增LtaSA基因片段(引物对见表1)，得到大小为1971bp的片段且电泳无杂带，片段直接进行过柱回收纯化(捷瑞胶回收纯化试剂盒，上海捷瑞生物工程技术有限公司)，得到的片段以纳摩尔比1：2与BamHI酶切回收的pBG102载体片段进行EZ克隆构建(GBclonart无缝克隆试剂盒，苏州神洲基因有限公司)，重组克隆反应液于45℃水浴锅温浴30min，然后转移到冰上放置5min，加入TG1化转感受态细胞，混匀放置5min，42℃热击2min，冰浴2min后加入800μL复苏培养基LB，复苏培养1h后离心涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，次日挑取克隆培养过夜，提取质粒进行酶切验证，最终构建得到质粒pBG102-ltaSA，编号pHB709。
本发明以ZL202010498739.5专利中的BF3(保藏编号为CGMCC No.19574)菌株为出发菌株，通过基因工程方法对核黄素的降解基因进行弱化，然后整合解除反馈抑制的枯草芽孢杆菌核黄素合成操纵子ribDEAHT，整合枯草芽孢杆菌嘌呤途径合成基因purEKBCSQLFMNHD等代谢改造，获得产核黄素的基因工程菌株SHB135，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，该菌株已于2023年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.28715。
将上述构建得到的膜蛋白表达质粒以ZL202010498739.5专利中描述的转化方法，转化到产核黄素的宿主SHB135，分别得到表达不同膜蛋白的重组基因工程菌株，将这些重组基因工程菌株同对照菌株SHB135/pBG102(pBG102质粒为未连接表达蛋白的空质粒)一起进行摇瓶发酵，筛选有助于提高核黄素产量的膜蛋白。
表1pHB709质粒构建引物
实施例2膜蛋白表达库的筛选
2.1HPLC测定发酵液中的核黄素
发酵液处理后，用去离子水稀释至合适的倍数，离心，过0.22μm的滤膜，用高效液相色谱(HPLC)检测。HPLC的参数如下：
仪器条件色谱柱：Agilent SB C18，4.6×150×5μm；
流动相：A：甲醇，B：10mM乙酸铵pH 5.0，A：B＝35：65；
流动相比例参见表2：
表2流动相比例
| 时间(mins) | A相(％v/v) | B相(％v/v) |
| 0.01 | 35 | 65 |
| 6.00 | 35 | 65 |
柱流量：1.0mL/min；
检测波长：462nm；
柱温：30℃；
进样量：2μL；
时间：6min。
HPLC图谱如图1所示，出峰时间4.29min。
2.1对膜蛋白进行筛选
采用摇瓶发酵的方式进行筛选，将含不同的表达膜蛋白重组基因工程菌株及对照菌SHB135/pBG102分别接种到含5mg/L氯霉素的LB试管，取培养过夜的种子400μL转移至2mL含有抗生素的LB液体培养基，于37℃摇床250rpm培养4h后全部转入装有18mL发酵培养基的摇瓶中，置40℃摇床中，250rpm培养4h，加0.1mL的20mmol/L IPTG诱导40℃培养过夜，继续发酵48h左右。发酵结束后，向发酵摇瓶中添加与发酵液等体积的0.2mol/L氢氧化钠，充分混匀后，取0.1mL添加到0.9mL去离子水中混匀，12000rpm离心1min后取上清进行HPLC检测。
初步筛选结果显示大部分的膜蛋白过表达后核黄素的产量没增加，而LtaSA膜蛋白过表达后核黄素的产量提高较明显。
将初步筛出的核黄素产量提高较明显的重组基因工程菌株SHB135/pHB709(pBG102-LtaSA)，进行两次摇瓶发酵确认，两次发酵显示重组基因工程菌株SHB135/pHB709(pBG102-LtaSA)摇瓶发酵较稳定，核黄素产量提高较明显(图2和图3)，说明过表达LtaSA蛋白能提高核黄素的产量。本发明重组基因工程菌株的核黄素产量可达2.30g/L，相对于对照组的1.49g/L，提升了约54.3％。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.LtaSA蛋白或其编码基因在核黄素生产中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述LtaSA蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述编码基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
4.LtaSA蛋白或其编码基因在提高核黄素产量中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述LtaSA蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述LtaSA蛋白的编码基因具有如SEQID NO:2所示的核苷酸序列。
7.一种基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株于2023年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.28715，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
8.一种基因工程菌株在提高核黄素产量中的应用，其特征在于，所述基因工程菌株于2023年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.28715，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
9.一种提高核黄素产量的方法，其特征在于，所述方法包括以下至少一种步骤：
(1)将包含LtaSA编码基因的质粒导入宿主菌株；
(2)培养产核黄素的基因工程菌株；
所述基因工程菌株为CGMCC No.28715枯草芽孢杆菌。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述LtaSA编码基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
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