CN113755412A - 一种生产mk-7的基因工程菌及方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种生产MK‑7的基因工程菌以及利用该基因工程菌生产MK‑7的方法，公开了一种提高MK‑7发酵产量的方法，公开了该基因工程菌株的应用。将菌株基因组上的四异戊二烯基‑β‑姜黄烯合成酶基因缺失，或者四异戊二烯基‑β‑姜黄烯合成酶失活或者活力降低，可将MK‑7发酵产量提高10倍左右。

Description

一种生产MK-7的基因工程菌及方法、应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基因工程菌及其发酵生产MK-7的方法，一种提高MK-7发酵产量的方法，利用该基因工程菌在含有MK-7的饲料、食品、保健品或者药品中的应用。

背景技术

维生素K2是一种脂溶性维生素，具有叶绿醌生物活性的萘醌基团的衍生物，是人体中不可缺少的重要维生素之一，可预防骨质疏松症和心血管疾病。众所周知，补钙的关键是钙能否被骨骼吸收，如果骨骼不能吸收的话，补充的钙可能会造成血钙浓度提高，甚至引起血管钙化和动脉粥样硬化。维生素K2能够支持骨骼健康和心血管健康的原因是，可以促进血液中的钙，进入骨骼，一方面增加了骨骼钙化，另一方面降低了血液中的钙浓度；起到这一作用的机理是维生素K2可以活化骨钙素(OC)和基质γ-羧基谷氨酸蛋白(MGP)，使其形成“钙爪”，促进钙吸收入骨。中国国家卫计委已批准维生素K2为营养强化剂，这推动了维生素K2的市场化，目前除了保健食品以外，一些普通食品(如酸奶、牛奶等)、动物饲料等也选择强化维生素K2。

维生素K2的结构是一系列含有2-甲基-1,4-萘醌母核及C3位带有数目不等的异戊二烯结构单元的萜烯侧链。根据萜烯侧链上异戊二烯结构单元的数目，维生素K2可分为不同类型，目前已经商业化的维生素K2分别是含有4个异戊二烯结构单元的MK-4和7个异戊二烯结构单元的MK-7(Menaquinone-7)。无论从生物活性、生物利用度还是功效方面，MK-7都远超MK-4，具有更广阔的市场前景。

目前MK-7的生产主要通过化学合成和发酵，特别是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，如纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)。但化学合成收率低，污染严重；纳豆枯草芽孢杆菌在发酵罐中的MK-7发酵单位只有300mg/L，因此利用纳豆枯草芽孢杆菌生产大量MK-7也不现实；无论上面哪种方法生产MK-7，成本巨大。已有文献报道在芽孢杆菌中利用基因工程手段来提高MK-7的产量，文献Yang,et al.Modular pathwayengineering of Bacillus subtilis to promote de novo biosynthesis ofmenaquinone-7.ACS Synth.Biol.8(1),70-81,2019中，在Bacillus subtilis 168中敲除异分支酸酶(dhbB)，过表达1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因(dxs)、1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因(dxr)等用于MK-7的生产；文献Ma,et al.Metabolic Engineering of theMEP Pathway in Bacillus subtilis for Increased Biosynthesis of Menaquinone-7.ACS Synth.Biol.8(7),1620-1630,2019中，在B.subtilis 168中过表达dxs、dxr等用于MK-7的生产。目前尚无相关文献报道，敲除ytpB基因，可提高MK-7发酵产量。

发明内容

基于背景技术存在的技术现状，本发明公开了一种基因工程菌及其生产MK-7的方法，提高MK-7产量的方法，本发明将菌株中的四异戊二烯基-β-姜黄烯合成酶基因缺失，或者四异戊二烯基-β-姜黄烯合成酶失活或者活力降低，可以使得七异戊二烯焦磷酸(heptaprenyldiphosphate)到四异戊二烯基-β-姜黄烯的代谢流截断或者减弱。

优选地，所述菌株为芽孢杆菌、类芽孢杆菌、短短芽孢杆菌、棒杆菌。

优选地，所述菌株为Bacillus subtilis 168trpC2ΔuppΔguaB△ydiO-ydjA::xylR-Pxyl-ComK，简写为BF3，其分类名为枯草芽孢杆菌，该菌株于2020年4月13日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.19574。

优选地，所述四异戊二烯基-β-姜黄烯合成酶基因为ytpB，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1或其突变体，其氨基酸序列是SEQ ID NO.2或同SEQ ID No.2具有75％以上的同源性。

本发明还公开了一种上述基因工程菌在生产MK-7中的应用。

本发明还公开了一种利用基因工程菌生产MK-7的方法，将枯草芽孢杆菌BF3中的四异戊二烯基-β-姜黄烯合成酶基因ytpB缺失，或者四异戊二烯基-β-姜黄烯合成酶失活或者活力降低，使得七异戊二烯焦磷酸到四异戊二烯基-β-姜黄烯的代谢流截断或者减弱，利用该基因工程菌以甘油或者葡萄糖为碳源发酵生产MK-7。

本发明还公开了上述基因工程菌在含有MK-7的饲料、食品、保健品或者药品中的应用。从上述的基因工程菌中提取得到MK-7，或者将所述MK-7的基因工程菌体或者基因工程菌体破碎混合物直接用于饲料、食品、保健品或者药品中。

有益效果：

1.本发明将菌株中的四异戊二烯基-β-姜黄烯合成酶基因ytpB缺失，或者四异戊二烯基-β-姜黄烯合成酶失活或者活力降低，使得七异戊二烯焦磷酸到四异戊二烯基-β-姜黄烯的代谢流截断或者减弱，可以极大地增加细胞内七异戊二烯焦磷酸的供应，进而提高MK-7的产量，将MK-7产量提高10倍左右。

2.本发明将菌株中的四异戊二烯基-β-姜黄烯合成酶基因ytpB缺失，对MK-7产量的贡献要优于过表达七异戊二烯焦磷酸上游的多个限速酶的基因的贡献。

3.本发明所述的MK-7的生产方法，发酵周期只有4天，比文献报道的5-7天的发酵周期短，发酵成本低。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌中MK-7的合成示意图，其中PEP为磷酸烯醇式丙酮酸，CHA为分支酸，DHNA-CoA为1,4-二羟基-2-萘甲酸-辅酶A，Fni为异戊二烯焦磷酸delta-异构酶，IspA为香叶基转移酶，HepST为七异戊二烯焦磷酸合成酶，YtpB为四异戊二烯基-β-姜黄烯合成酶，MenA为1,4-二羟基-2-萘甲酸酯八异戊二烯基转移酶，MenG为去甲基甲萘醌甲基转移酶；

图2为ytpB敲除菌株PCR验证的核酸胶图，其中M为Marker，line 1-5为ytpB敲除菌株的5个单菌落；

图3为MK-7的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。

本发明的技术方案可以应用芽孢杆菌属(Bacillus)，类芽孢杆菌属(Paenibacillus)，短短芽孢杆菌属(Brevibacillus)，棒杆菌属(Corynebacterium)，或者其他的微生物，下面以枯草芽孢杆菌为例，对技术方案进行进一步说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例中使用的试剂盒、试剂来源信息如下：GBclonart无缝克隆试剂盒(苏州神洲基因有限公司，货号GB2001-48)。

实施例1 BF3构建的目的和意义

为了便于进行基因工程的操作，在以下实施例中，首先以构建的BF3菌株作为出发菌株，进行MK-7相关基因工程工作。BF3基因型Bacillus subtilis 168 trpC2ΔuppΔguaB△ydiO-ydjA::xylR-Pxyl-comK，该菌株于2020年4月13日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19574。

因为BF3中的guaB基因已敲除，所以在培养过程中要添加部分黄嘌呤，防止BF3生长过慢。

此外，upp基因敲除的目的：枯草芽孢杆菌中的upp基因表达产物尿嘧啶磷酸核糖转移酶，可以将5-氟尿嘧啶转化为5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸(5F-dUMP)，5F-dUMP抑制脱氧胸苷酸合成酶，阻止脱氧尿苷酸(dUMP)甲基化为脱氧胸苷酸(dTMP)，从而影响DNA的合成。因此BF3菌株中的upp基因敲除，该菌株对5-氟尿嘧啶敏感；在BF3中放入upp operon后，菌株对5-氟尿嘧啶不敏感，利用uppoperon和5-氟尿嘧啶的关系，可用于BF3菌株的特定基因敲除时单交换和双交换的筛选。

另，整合comK基因的目的：过表达comK基因可以增加芽孢杆菌的转化效率。构建comK到木糖诱导型启动子Pxyl(该启动子由xylR编码的阻遏蛋白严格控制表达)后，构建xylR-Pxyl-comK表达框，并将该表达框整合至基因组的ydiO-ydjA位点。

实施例2 ytpB基因的敲除

1 ytpB敲除质粒的构建

1.1以Bacilllus subtilis 168基因组为模板，以引物对pSA01-homL-1和pSA01-homL-2PCR得到940bp的ytpB-homL上游同源臂。

1.2以Bacilllus subtilis 168基因组为模板，以引物对pSA01-homR-1和pSA01-homR-2PCR得到1120bp的ytpB-homR下游同源臂。

表1 1.1和1.2中所用引物的序列

1.3将以上得到的ytpB-homL上游同源臂和ytpB-homR下游同源臂通过无缝克隆方式重组到含有大肠杆菌ori、kan operon、upp operon以及Kan(Bacillus)组件的载体上，得到ytpB敲除质粒pSA01，酶切验证质粒正确，pSA01的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2 ytpB基因的敲除

2.1 BF3感受态的制备：利用改进的Spizizen法制备BF3感受态。

2.2取500～1000ng pSA01质粒添加至500μL BF3感受态中，于37℃，200rpm摇床温育培养1.5小时，7000rpm离心，去除部分上清后，将菌体重悬并涂布于12.5μg/mL Kan的LB平板上，37℃培养过夜。

2.3挑取单菌落，接种LB试管中，于37℃培养传代3次后，稀释菌液，涂布含20μM 5-氟尿嘧啶和30mg/L黄嘌呤的MM平板上(MM培养基：葡萄糖10g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾4g/L，柠檬酸钠1g/L，七水硫酸镁0.2g/L，酪蛋白水解物1g/L，pH7.0)，37℃培养2天。(BF3菌株的guaB基因敲除，所以添加部分黄嘌呤，菌株生长不会太慢。BF3菌株的upp基因敲除，在5-氟尿嘧啶上可以生长；BF3/pSA01单交换，因pSA01含有upp operon，在5-氟尿嘧啶上不生长；BF3/pSA01双交换，因失去pSA01上的upp operon，在5-氟尿嘧啶上可以生长。)

2.4挑取单克隆，菌落PCR验证，验证引物为ytpB-200F和ytpB-100F，成功敲除ytpB后目的条带大小为2304bp，野生型条带为3215bp。由图2可知，4和5泳道的条带显示BF3菌株的ytpB基因敲除成功，正确敲除的菌株命名为MK01。

表2 ytpB-200F和ytpB-100R引物的序列

实施例3枯草芽孢杆菌摇瓶发酵生产MK-7

1枯草芽孢杆菌摇瓶发酵生产MK-7的方法

从MK01的LB平板上挑取单菌落接种2mL LB试管，37℃，250rpm活化过夜。第二天过夜试管菌液15％接种至2mL LB试管，37℃，250rpm活化4小时，活化液全部接种至含18mLSYG1-1培养基的250mL摇瓶中，37℃250rpm培养3.5小时；改发酵温度为40℃250rpm继续发酵96小时；

其中，SYG1-1培养基成分为：50g/L甘油、20g/L酵母粉、50g/L蛋白胨、3.86g/L磷酸氢二钾、1.62g/L磷酸二氢钾、2mL/L trace element solution，pH 7.2-7.3。traceelement solution成分为：6.37g/L Na₂EDTA*2H₂O、1g/L七水硫酸锌、0.5g/L二水氯化钙、2.5g/L七水硫酸亚铁、0.51g/L四水钼酸铵、0.1g/L五水硫酸铜、0.2g/L六水氯化钴、0.52g/L一水硫酸锰、60g/L七水硫酸镁。

2 MK-7的提取

取5mL发酵液，添加20mL萃取剂(正己烷:异丙醇＝2:1)，用封口膜封住摇瓶塞子的透气孔，于37℃，250rpm摇床萃取30min，7830rpm离心5min，取上层有机相至旋蒸瓶中，蒸干有机相，用0.8mL乙腈溶解旋蒸瓶中的样品，12000rpm离心1min，上清用0.22μm的有机膜过滤后，HPLC检测。

3 HPLC检测

色谱柱为Agilent SB Aq(4.6*150mm，5μm)，紫外检测器检测，波长为254nm，流速1.0mL/min，柱温30℃，进样量5μL，流动相为水和乙腈，等度洗脱，洗脱比例为水:乙腈＝5:95，洗脱时间9min。如图3所示，MK-7的保留时间为6.918min。

实施例4 BF3 vs B.subtilis168摇瓶发酵的MK-7产量

按照实施例3中的摇瓶发酵方法，BF3和B.subtilis 168摇瓶发酵得到的MK-7产量分别为4.7mg/L和4.4mg/L，BF3和B.subtilis 168的MK-7产量相差不大，即在B.subtilis168基础上，通过基因工程手段得到的BF3菌株的过程，并没有对MK-7产量造成影响。

实施例5 MK01 vs BF3摇瓶发酵的MK-7产量

按照实施例3中的摇瓶发酵方法，BF3发酵的MK-7产量为4.7mg/L，MK01发酵的MK-7产量为46.7mg/L，可见ytpB敲除后，MK-7产量提高将近10倍。推测MK01发酵罐发酵MK-7的产量在450mg/L以上，高于目前市场上MK-7的产量水平，有明显的产量优势和市场优势。

实施例6过表达dxs、dxr、EcispA(大肠杆菌来源的ispA)、hepST

为了进一步提高MK-7的产量，我们按照现有技术的报道，进一步将枯草芽孢杆菌的dxs、dxr、hepST和大肠杆菌来源的ispA基因连接到枯草芽孢杆菌的表达载体pBG102(来源于pHT43，将pHT43的启动子替换为grac100启动子)上，在MK01菌株中进行过表达，按照实施例3中所述的摇瓶发酵方法，得到如表3所示的结果。令人意外的是，在MK01中过表达dxs、dxr、hepST、EcispA后，MK-7产量反而下降，不利于MK-7的生产，说明MK01中七异戊二烯焦磷酸的供应充足，不足的可能是DHNA的供应，或者MenA和MenG酶的供应，因此在MK01中过表达七异戊二烯焦磷酸上游的基因，并不能够增加MK-7的产量，反而可能由于反馈抑制导致MK-7产量下降。

本发明在MK01中过表达dxs和dxr的结果与文献Yang 2019和Ma 2019的结果不一致，说明只敲除基因ytpB，就可以极大地提高细胞内七异戊二烯焦磷酸的供应，进而提高MK-7产量；且只敲除基因ytpB，提高细胞内七异戊二烯焦磷酸的量要比过表达七异戊二烯焦磷酸上游的多个限速酶的基因而提高的量多，即敲除基因ytpB，对MK-7产量贡献更大。

另外，本发明中摇瓶发酵周期为4天，比文献报道的5-7天的发酵周期短，提高了生产效率，并且发酵成本低。

表3在MK01菌株中过表达不同基因的MK-7产量

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 苏州华赛生物工程技术有限公司

<120> 一种生产MK-7的基因工程菌及方法、应用

<130> 20200517

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> pSA01-homL-1

<400> 1

gattcattaa tgcagctggc acgtataaag gctgttgggt ggatatctgg 50

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> pSA01-homL-2

<400> 2

aaacgccaag caagccacat gcacccccta ctagttc 37

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> pSA01-homR-1

<400> 3

tagggggtgc atgtggcttg cttggcgttt atttgtcag 39

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> pSA01-homR-2

<400> 4

tgtcaaaacg cataccattt tgagatttgg atgtccaggg cat 43

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> ytpB-200F

<400> 5

gtgtaacctg atggcctatc gtg 23

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> ytpB-100R

<400> 6

gctatgtgga aggcgtcaat aaattaagaa aac 33

<210> 7

<211> 1104

<212> DNA

<213> SEQ ID No.1

<400> 7

ttgacagtac cggaacatcc ttttggattg atggcaaagg tatatcgaga tatttttccg 60

ctcgttcatc aagagctgga catatggaag caaaaatcag aatcgattca taacagtgaa 120

ttgaaagcac aggcaaccgc aagtattcgg gacaaaacgt ttcactgtga aggcggcggc 180

atactggcct tattgtcagg cagccaaaag cagaaatgtg tcgagtttat catcgcgtat 240

caaacgatta gtgattattt ggacaatctg tgtgaccgca gcacctcgct ggacccgcag 300

gattttcgga tgctccatgc ctcaatgcag gacgcactga cagttggggc ggaactgcaa 360

aactattatc aattcaggga agaacaggat gacagcggat atttgcatga actggttaaa 420

acgtgccagc gtgttctcgg ctccattgag cactatgaca tgattaaacc ttatctgctt 480

gaactgtgcg gctattattg cgatttgcag gtgcataagc acgttattga gcatgagcgt 540

gttccgcggc ttgaaaagtg gtttactcaa tatgaatcag agctgcctga gatggaatgg 600

tatgaatttt cagcctgtgc aggctcaacg ttaggcattt tctgtctggt tgcgtattcg 660

ttccagcctg atttcacaga aagcaccgct aaaaaaatcc gagacagtta ttttccttac 720

atacagggtc ttcatattct tcttgattat ttgattgatc aagaggagga cttgctggaa 780

ggagacttga atttctgctc gtattatcag tctcatgaag agatgatgga ccggcttgaa 840

cactttatcc ataaagccga cgagcattta caaggcattc cgcatgaaaa cttccatcgt 900

ttaatcaatc gcggcttgct tggcgtttat ttgtcagatg ataaagtggc aggccaaaag 960

gaaatgggcc ggctcgcaaa gaagctgatc aaagccagcg gaaaaacctc ccttttcttt 1020

tatatcaacg gcagagccta ccggaaattt caaaaaatgt cctggatgaa aaattcaaag 1080

aaaaaagctc aaatcatttg ctga 1104

<210> 8

<211> 367

<212> PRT

<213> SEQ ID No.2

<400> 8

Met Thr Val Pro Glu His Pro Phe Gly Leu Met Ala Lys Val Tyr Arg

1 5 10 15

Asp Ile Phe Pro Leu Val His Gln Glu Leu Asp Ile Trp Lys Gln Lys

20 25 30

Ser Glu Ser Ile His Asn Ser Glu Leu Lys Ala Gln Ala Thr Ala Ser

35 40 45

Ile Arg Asp Lys Thr Phe His Cys Glu Gly Gly Gly Ile Leu Ala Leu

50 55 60

Leu Ser Gly Ser Gln Lys Gln Lys Cys Val Glu Phe Ile Ile Ala Tyr

65 70 75 80

Gln Thr Ile Ser Asp Tyr Leu Asp Asn Leu Cys Asp Arg Ser Thr Ser

85 90 95

Leu Asp Pro Gln Asp Phe Arg Met Leu His Ala Ser Met Gln Asp Ala

100 105 110

Leu Thr Val Gly Ala Glu Leu Gln Asn Tyr Tyr Gln Phe Arg Glu Glu

115 120 125

Gln Asp Asp Ser Gly Tyr Leu His Glu Leu Val Lys Thr Cys Gln Arg

130 135 140

Val Leu Gly Ser Ile Glu His Tyr Asp Met Ile Lys Pro Tyr Leu Leu

145 150 155 160

Glu Leu Cys Gly Tyr Tyr Cys Asp Leu Gln Val His Lys His Val Ile

165 170 175

Glu His Glu Arg Val Pro Arg Leu Glu Lys Trp Phe Thr Gln Tyr Glu

180 185 190

Ser Glu Leu Pro Glu Met Glu Trp Tyr Glu Phe Ser Ala Cys Ala Gly

195 200 205

Ser Thr Leu Gly Ile Phe Cys Leu Val Ala Tyr Ser Phe Gln Pro Asp

210 215 220

Phe Thr Glu Ser Thr Ala Lys Lys Ile Arg Asp Ser Tyr Phe Pro Tyr

225 230 235 240

Ile Gln Gly Leu His Ile Leu Leu Asp Tyr Leu Ile Asp Gln Glu Glu

245 250 255

Asp Leu Leu Glu Gly Asp Leu Asn Phe Cys Ser Tyr Tyr Gln Ser His

260 265 270

Glu Glu Met Met Asp Arg Leu Glu His Phe Ile His Lys Ala Asp Glu

275 280 285

His Leu Gln Gly Ile Pro His Glu Asn Phe His Arg Leu Ile Asn Arg

290 295 300

Gly Leu Leu Gly Val Tyr Leu Ser Asp Asp Lys Val Ala Gly Gln Lys

305 310 315 320

Glu Met Gly Arg Leu Ala Lys Lys Leu Ile Lys Ala Ser Gly Lys Thr

325 330 335

Ser Leu Phe Phe Tyr Ile Asn Gly Arg Ala Tyr Arg Lys Phe Gln Lys

340 345 350

Met Ser Trp Met Lys Asn Ser Lys Lys Lys Ala Gln Ile Ile Cys

355 360 365

<210> 9

<211> 6011

<212> DNA

<213> SEQ ID No.3

<400> 9

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagccata ttcaacggga aacgtcttgc tctaggccgc 240

gattaaattc caacatggat gctgatttat atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg 300

ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc 360

tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc agactaaact 420

ggctgacgga atttatgcct cttccgacca tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg 480

catggttact caccactgcg atccctggga aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc 540

ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga 600

ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat 660

cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc 720

ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata aacttttgcc attctcaccg gattcagtcg 780

tcactcatgg tgatttctca cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt 840

gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc atcctatgga 900

actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg 960

ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt ttctaactgt 1020

cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa 1080

ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 1140

cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 1200

ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt 1260

tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga 1320

taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag 1380

caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 1440

agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 1500

gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 1560

gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 1620

ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 1680

acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt 1740

tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 1800

ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt 1860

ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga 1920

ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc 1980

tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacgt ataaaggctg ttgggtggat 2040

atctggcttg tgttccttat aagggtagat cataagattc atccttcttt ctctatttaa 2100

atttcgtatg aggtgaagat catgtggacc tggaaagcag acagacctgt tgccgtgatt 2160

gtaatcattc acggggcaag tgaatatcac ggacgatata aatggctgat tgaaatgtgg 2220

cggtcttcgg gttatcacgt tgtcatgggc gatttgcctg gacagggaac aacgacaaga 2280

gcgagagggc atattcgctc gtttcaagaa tacattgatg aagtagatgc ttggatagat 2340

aaagcgcgaa cctttgatct tccggttttt cttctaggtc acagcatggg cggtctggtc 2400

gcgattgaat gggttaaaca gcaaagaaat ccccggatta cgggaattat tttatcatca 2460

ccgtgtctcg gactgcaaat taaagtgaat aaagcgcttg atcttgcatc aaaaggcctg 2520

aatgtcatcg ctccgtcact taaggttgat tcgggattat caattgatat ggcgacgcgc 2580

aatgaggacg tcatcgaagc tgaccaaaat gattcgttat acgtcaggaa agtttctgtc 2640

agatggtaca gagagctttt aaagacaatt gaatcggcaa tggtgccgac agaggcattt 2700

ttgaaagttc cgcttcttgt gatgcaagcc ggtgatgaca agcttgttga caaaacgatg 2760

gtcatcaagt ggtttaatgg tgttgcttct cataataaag catacagaga gtgggaaggg 2820

ctttaccatg agatcttcaa tgaacccgag agagaagatg tttttaaagc agcaagagcg 2880

tttactgatc aatatatttg aactagtagg gggtgcatgt ggatccggct tgcttggcgt 2940

ttatttgtca gatgataaag tggcaggcca aaaggaaatg ggccggctcg caaagaagct 3000

gatcaaagcc agcggaaaaa cctccctttt cttttatatc aacggcagag cctaccggaa 3060

atttcaaaaa atgtcctgga tgaaaaattc aaagaaaaaa gctcaaatca tttgctgatc 3120

tgagcttttt tttcgatggc gacaataaat ggcgggtcat tttgctgatt gataaacccg 3180

tatgttaata cacgggctgt ttgctggtcc aagtcccggc aaaactcgag cacgtcgttt 3240

ttttcagctt tgccttccgg gtggccatga tagacgacga gaacaatcag accttcgtct 3300

ttcatgatgc tgagaagctg ttcaatggct ttgatcgtag aactgccgtt tgtcgtaatt 3360

gatttgtccc cgcccggcaa atagccgagg ttaaataccg cggccgccac tttgccatgt 3420

gtttcaggcg ggagggattc agcgatttta tcatggcttt tgtgaaataa cgttgttcgc 3480

gcttgataca tgtcaccgag ccgttccttt gtattggcca cggctgattc ttggatgtcg 3540

aatgcgtata catggccgtt ttcaccgaca agctccgcta aaaactgtgt atcatgtccg 3600

ttgcccattg tcgcatctac gacaatatct ccctctcccg cggccatttt cagcagttct 3660

ttgctgtaag gaagaatttt cttcaaaatc atagcgctga ttcctcctca agccgttgaa 3720

agaactttcc ttgatagctg cctcgatttt ctagctcttt attaatggcg ccaagcactt 3780

cccatttgtt gacgctccac attggcccga tcatcaactc aatcggtccg tcacctgtaa 3840

tgcggtggac gatcatttca ggcggaatga tctcaagctg atcgcagacg agctgcacat 3900

aatcatcttg agaaagaaat tccagcttgc ccttttcata ttgtttgacc atcggcgtgc 3960

ctttcagtag gtgaagcaga tggattttaa tgccctggac atccaaatct caaaatggta 4020

tgcgttttga cacatccact atatatccgt gtcgttctgt ccactcctga atcccattcc 4080

agaaattctc tagcgattcc agaagtttct cagagtcgga aagttgacca gacattacga 4140

actggcacag atggtcataa cctgaaggaa gatctgattg cttaactgct tcagttaaga 4200

ccgaagcgct cgtcgtataa cagatgcgat gatgcagacc aatcaacatg gcacctgcca 4260

ttgctacctg tacagtcaag gatggtagaa atgttgtcgg tccttgcaca cgaatattac 4320

gccatttgcc tgcatattca aacagctctt ctacgataag ggcacaaatc gcatcgtgga 4380

acgtttgggc ttctaccgat ttagcagttt gatacacttt ctctaagtat ccacctgaat 4440

cataaatcgg caaaatagag aaaaattgac catgtgtaag cggccaatct gattccacct 4500

gagatgcata atctagtaga atctcttcgc tatcaaaatt cacttccacc ttccactcac 4560

cggttgtcca ttcatggctg aactctgctt cctctgttga catgacacac atcatctcaa 4620

tatccgaata gggcccatca gtctgacgac caagagagcc ataaacacca atagccttaa 4680

catcatcccc atatttatcc aatattcgtt ccttaatttc atgaacaatc ttcattcttt 4740

cttctctagt cattattatt ggtccattca ctattctcat tcccttttca gataatttta 4800

gatttgcttt tctaaataag aatatttgga gagcaccgtt cttattcagc tattaataac 4860

tcgtcttcct aagcatcctt caatcctttt aataacaatt atagcatcta atcgaagaag 4920

caagacagcg tgtagctgct ctgactgata aatttccttt atataaagaa ttagattatt 4980

aagatcctaa aacccgcttg ggcttatgcc cggcgggttt tttgacgatg ttcttgaaac 5040

tcaatgtctt tttttgtaga atcaatagaa gtgtgtaatt gttgatggga caataaaaaa 5100

ggagctgaaa cacagtatgg gaaaggttta tgtatttgat catcctttaa ttcagcacaa 5160

gctgacatat atacggaatg aaaatacagg tacgaaggat tttagagagt tagtagatga 5220

agtggctaca ctcatggcat ttgaaattac ccgcgatctt cctctggaag aagtggatat 5280

caatacaccg gttcaggctg cgaaatcgaa agtcatctca gggaaaaaac tcggagtggt 5340

tcctatcctc agagcaggat tgggaatggt tgacggcatt ttaaagctga ttcctgcggc 5400

aaaagtggga catgtcggcc tttaccgtga tccagaaacc ttaaaacccg tggaatacta 5460

tgtcaagctt ccttctgatg tggaagagcg tgaattcatc gtggttgacc cgatgctcgc 5520

tacaggcggt tccgcagttg aagccattca cagccttaaa aaacgcggtg cgaaaaatat 5580

ccgtttcatg tgtcttgtag cagcgccgga gggtgtggaa gaattgcaga agcatcattc 5640

ggacgttgat atttacattg cggcgctaga tgaaaaatta aatgaaaaag gatatattgt 5700

tccaggtctc ggagatgcgg gtgaccgcat gtttggaaca aaataaaaaa tgaaatcccc 5760

aaaagggggt ttcatttttt tatccagttt tttgctattc ggtgaatctg tatacaatta 5820

taggtgaaaa tgtgaacatt ctgtggagac gtaaagtata aaaagttttt taactttaaa 5880

cagattgaca catgttaggg gctattgtat gctaaacgag ggtattatgg catccgctta 5940

cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc 6000

gaaacgcgcg a 6011

Claims (10)

1.一种生产MK-7的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中的四异戊二烯基-β-姜黄烯(tetraprenyl-beta-curcumene)合成酶基因缺失，或者四异戊二烯基-β-姜黄烯合成酶失活或者活力降低。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为芽孢杆菌(Bacillus)，类芽孢杆菌(Paenibacillus)，短短芽孢杆菌(Brevibacillus)，棒杆菌(Corynebacterium)。

3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为枯草芽孢杆菌，所述四异戊二烯基-β-姜黄烯合成酶基因为ytpB。

4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述四异戊二烯基-β-姜黄烯合成酶基因核苷酸序列是SEQ ID No.1或其突变体。

5.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述四异戊二烯基-β-姜黄烯合成酶的氨基酸序列是SEQ ID NO.2或同SEQ ID No.2具有75%以上的同源性。

6.一种如权利要求1-5任一项所述的基因工程菌在生产MK-7中的应用。

7.一种利用基因工程菌生产MK-7的方法，其特征在于，利用权利要求1-5任一项所述的基因工程菌以甘油或者葡萄糖为碳源发酵生产MK-7。

8.如权利要求1-5任一项所述的基因工程菌在含有MK-7的饲料、食品、保健品或者药品中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，从所述的基因工程菌中提取得到MK-7。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述MK-7的基因工程菌体或者基因工程菌体破碎混合物直接用于饲料、食品、保健品或者药品中。

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