CN117618417A

CN117618417A - 包含木犀草素的药物组合物及其制备方法与制药用途

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Publication number: CN117618417A
Application number: CN202210951131.2A
Authority: CN
Inventors: 魏彦君; 吴祥根; 崔庆宸; 于林蓉; 邢艳平; 武海军
Original assignee: Shandong Viwit Baike Pharmaceutical Co ltd; Shandong Weizhi Zhongke Pharmaceutical Co ltd; Weizhi Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Shandong Viwit Baike Pharmaceutical Co ltd; Shandong Weizhi Zhongke Pharmaceutical Co ltd; Weizhi Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2022-08-09
Filing date: 2022-08-09
Publication date: 2024-03-01

Abstract

本发明公开了一种药物组合物，其包含黄酮类化合物和药学上可接受的辅料；其中，所述的黄酮类化合物为木犀草素或其药学上可接受的盐，所述的药学上可接受的辅料包含甘草酸盐。体外和/或体内的试验结果显示，本发明提供的药物组合物，对于预防和/或治疗药物性肝损伤具有较好的疗效，可以起到良好的保肝和护肝作用，能够有效降低因该病所引起的死亡率，延长其存活寿命；同时，还能够显著降低血清转氨酶水平，缓解肝脏和脾脏的水肿等症状，并对促炎性细胞因子等具有较好的抑制作用。试验结果还进一步表明，黄酮类化合物(木犀草素或其药学上可接受的盐)和甘草酸盐组合，提高了木犀草素的生物利用度，具有协同增效的作用，应用前景良好。

Description

包含木犀草素的药物组合物及其制备方法与制药用途

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种包含木犀草素的药物组合物及其制备方法与制药用途。

背景技术

因药物和/或其代谢产物造成的肝损伤称为药物性肝损伤(Drug-induced liverinjury)，通常，如果用药剂量过大或用药时间过长，就会对肝脏造成损害，造成部分肝细胞坏死，具体表现为血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)等肝功指标异常。

近年来，药物性肝损伤在临床上的发病率明显增加，尤其在欧美呈现愈发严重的趋势。其中，对乙酰氨基酚(又名扑热息痛，是一种最常见的解热镇痛药，主要用于普通感冒或流行性感冒引起的发热，也用于缓解轻至中度的疼痛)的过量使用和滥用，是诱发该类疾病的最主要原因之一。发病后，血清中的谷草转氨酶、谷丙转氨酶含量会升高，导致肝细胞坏死，进而引发肝硬化甚至死亡。

目前对于这种药物性肝损伤，主要是使用N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为治疗药物，虽然它是现阶段最有效的药物，但也存在一定的局限性和缺点(参见CN 112535694A)，尚无其他更好更有效的治疗药物可供选择。

木犀草素(luteolin)是一种天然黄酮类化合物，其结构式如下所示：

木犀草素具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒等药理活性，但因其结构中含有多个酚羟基，亲脂性较差，同时又因为酚羟基之间的分子间作用力使其晶格能较高，水溶性也较差，由此而导致木犀草素的生物利用度不高，其应用受到了很大限制(参见：王琪,李坤伟,周长征.木犀草素的药理作用及制剂研究进展[J].北京联合大学学报,2022,36(1):59-63)。

甘草酸二钾(DG)，为白色或类白色粉末，具有抗炎、抗过敏、保湿等功效，在医药行业主要用于镇咳祛痰、胃溃疡、急慢性胃炎、湿疹、皮肤瘙痒，以及用于治疗癌症和防治艾滋病等。

截止到目前为止，未检索到有将木犀草素和甘草酸二钾进行药物组合并将其用于预防、治疗和/或缓解药物性肝损伤的相关文献报道。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

针对现有技术存在的问题和/或不足，本发明的目的在于提供一种包含木犀草素的药物组合物及其制备方法与制药用途。该药物组合物，可用于制备预防和/或治疗药物性肝损伤的药物，或者降低血清转氨酶水平，或者用作促炎性细胞因子的抑制剂，或者用作蛋白抑制剂，具有比较良好的疗效。

本发明提供的一种药物组合物，其包含黄酮类化合物和药学上可接受的辅料；其中，所述的黄酮类化合物为木犀草素或其药学上可接受的盐，所述的药学上可接受的辅料包含甘草酸盐。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述黄酮类化合物和药学上可接受的辅料的重量比为1:5～50；

优选地，所述黄酮类化合物和药学上可接受的辅料的重量比为1:9～25；更优选地，所述黄酮类化合物和药学上可接受的辅料的重量比为1:13～20。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述的黄酮类化合物为木犀草素；和/或，所述的甘草酸盐选自甘草酸钠、甘草酸二钠、甘草酸钾、甘草酸二钾、甘草酸铵、甘草酸二铵中的一种或两种以上；

优选地，所述的甘草酸盐为甘草酸二钾或甘草酸二钠。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述的药学上可接受的辅料包覆所述的黄酮类化合物；优选地，所述的药学上可接受的辅料包覆所述的黄酮类化合物形成纳米颗粒；更优选地，所述纳米颗粒的平均粒径为1～50nm，例如为20～40nm，又例如为25～35nm。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述的黄酮类化合物以非晶态形式存在于所述的药物组合物中，例如，存在于所述的纳米颗粒中。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述的药物组合物可以是微球、纳米粒、脂质体等载体包裹后的药物；优选为纳米粒包裹后的药物。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述的药物组合物可以是载体纳米粒、载体脂质体等；优选为载体纳米粒。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述黄酮类化合物的包封率至少为80％；优选地，所述黄酮类化合物的包封率≥90％或≥95％。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述的药物组合物为固体制剂或液体制剂；和/或，所述药物组合物中的黄酮类化合物为治疗有效量的；

优选地，所述的药物组合物为液体制剂，所述液体制剂的溶剂选自药学上可接受的水、羧甲基纤维素钠水溶液或PBS缓冲液。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，当所述液体制剂中黄酮类化合物的浓度为1mg/ml时，所述的液体制剂满足下述条件①～③中的一项或两项以上：

①、所述液体制剂的平均胶束粒径为1～50nm；优选为20～40nm；

②、所述液体制剂的多分散系数为≤0.5；优选为≤0.4；

③、所述液体制剂的Zeta电位为-40～0mV；优选为-30～-20mV；

优选地，当所述液体制剂中黄酮类化合物的浓度为1mg/ml时，所述的液体制剂同时满足所述条件①～③。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述的药物组合物是由包括以下步骤的方法制成：将黄酮类化合物和药学上可接受的辅料分散或溶解于有机溶剂中，混匀，然后除去有机溶剂(例如，通过35～45℃旋转蒸发除去有机溶剂)，即得；

优选地，所述的有机溶剂为醇类溶剂；和/或，每毫克所述黄酮类化合物对应的所述有机溶剂用量为0.5～20mL；

更优选地，所述的醇类溶剂为甲醇和/或乙醇；和/或，每毫克所述黄酮类化合物对应的所述有机溶剂用量为1～2.5mL。

在上述任一技术方案(所述的药物组合物)中，所述的药物组合物是用于预防和/或治疗药物性肝损伤的药物组合物；例如，所述的药物性肝损伤为对乙酰氨基酚所导致的药物性肝损伤；

或者，所述的药物组合物是用于降低血清转氨酶水平的药物组合物；例如，所述的转氨酶为谷丙转氨酶和/或谷草转氨酶；

或者，所述的药物组合物为促炎性细胞因子抑制剂；例如，IL-6抑制剂、NF-κB抑制剂或TNF-α抑制剂；

或者，所述的药物组合物为蛋白抑制剂；例如，HMGB1抑制剂或RAGE抑制剂。

本发明的一个或多个实施方式还提供了前述任意一项所述的药物组合物的制备方法，包括以下步骤：将黄酮类化合物和药学上可接受的辅料一起分散或溶解于有机溶剂中，混匀，然后除去有机溶剂(例如，通过35～45℃旋转蒸发除去有机溶剂)，即得；

本发明的一个或多个实施方式还提供了前述任意一项所述的药物组合物在制备预防和/或治疗药物性肝损伤的药物中的用途；例如，所述的药物性肝损伤为对乙酰氨基酚所导致的药物性肝损伤。

本发明的一个或多个实施方式还提供了前述任意一项所述的药物组合物在制备降低血清转氨酶水平的药物中的用途；例如，所述的转氨酶为谷丙转氨酶和/或谷草转氨酶。

本发明的一个或多个实施方式还提供了前述任意一项所述的药物组合物在制备促炎性细胞因子抑制剂中的用途；例如，所述的促炎性细胞因子抑制剂为IL-6抑制剂、NF-κB抑制剂或TNF-α抑制剂。

本发明的一个或多个实施方式还提供了前述任意一项所述的药物组合物在制备预防和/或治疗由细胞因子IL-6、NF-κB、TNF-α中的一种或多种介导的疾病(例如炎症疾病)的药物中的用途。

本发明的一个或多个实施方式还提供了前述任意一项所述的药物组合物在制备蛋白抑制剂中的用途；例如，所述的蛋白抑制剂为HMGB1抑制剂或RAGE抑制剂。

本发明的一个或多个实施方式还提供了前述任意一项所述的药物组合物在制备预防和/或治疗由HMGB1和/或RAGE介导的疾病的药物中的用途。

关于使用术语的定义，除非另有说明，本文中术语提供的初始定义适用于全文中的该术语；对于本文没有具体定义的术语，应当根据公开内容和/或上下文以及本领域的常识，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。

术语“药学上可接受的”，是指通常在化学或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。

术语“辅料”，是指除活性成分以外包含在剂型中的物质。

术语“治疗有效量”，是指给予患者的、足以有效治疗疾病的药物化合物的量。治疗有效量将根据药物化合物、疾病种类、疾病的严重度、患者的年龄等变化，可由本领域技术人员视情况进行常规调整。

本发明的药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括但并不限于：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂等。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂；(b)增粘剂，例如：羧甲基纤维素及其盐；(c)保湿剂；(d)崩解剂；(e)缓溶剂；(f)吸收加速剂；(g)润湿剂；(h)吸附剂；以及(i)润滑剂等。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型还可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂，可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种剂型中活性化合物的释放可以以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括：药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，以及增溶剂和乳化剂等。除了这些惰性稀释剂外，药物中也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂。

用于肠胃外注射的药物，可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂等。

用于局部给药的药物剂型，包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明的有益效果，主要包括以下方面：

(1)体外和/或体内的试验结果显示，本发明提供的药物组合物(包含黄酮类化合物和药学上可接受的辅料)，对于预防和/或治疗药物性肝损伤具有较好的疗效，可以起到良好的保肝和护肝作用，能够有效降低因该病所引起的死亡率，延长其存活寿命；同时，还能够显著降低血清转氨酶水平，缓解肝脏和脾脏的水肿等症状，并对促炎性细胞因子等具有较好的抑制作用；

(2)试验结果还进一步表明，黄酮类化合物(木犀草素或其药学上可接受的盐)和甘草酸盐组合，安全性好，且易于溶解、释放和/或吸收等，提高了木犀草素的生物利用度，具有协同增效的作用，取得了比任意单一组分更优越的治疗效果。

附图说明

图1为实施例1所制得的Lut-DG(重量配比Lut:DG＝1:13)的外观形态图。

图2为实施例1所制得的Lut-DG(重量配比Lut:DG＝1:13)的微观形态图(SEM电镜图)。

图3为实施例1中Lut、DG、Lut&DG、Lut-DG的FT-IR对比图谱。

图4为实施例1中Lut、DG、Lut&DG、Lut-DG的DSC对比图谱。

图5为实施例1中Lut、DG、Lut&DG、Lut-DG的XRD对比图谱。

图6为实施例2中Lut-DG在不同的Lut和DG配比下的包封率图表。

图7为实施例2中Lut-DG在不同溶液中的溶解度图表。

图8为实施例2中Lut-DG的储存稳定性评价图表。

图9为实施例3中Lut和Lut-DG在PBS中的体外释放曲线对比图表。

图10为实施例4中Lut、DG和Lut-DG的抗氧化活性对比图表(FRAP法，固定浓度下的不同培养时间)。

图11为实施例4中Lut、DG和Lut-DG的抗氧化活性对比图表(FRAP法，固定培养时间下的不同浓度)。

图12为实施例5中Lut、DG、Lut&DG、Lut-DG接触鸡胚尿囊膜(CAM)前后的血管对比图。

图13为实施例5中Lut、DG、Lut&DG、Lut-DG接触鸡胚尿囊膜(CAM)后的台盼蓝吸收量对比图表。

图14为实施例6中Lut和Lut-DG口服给药后血浆中Lut浓度-时间曲线图表。

图15为实施例6中Lut和Lut-DG给药0.5h后各器官中的Lut含量图表。

图16为实施例6中Lut和Lut-DG给药0.5h后各胃肠组织中的Lut含量图表。

图17为实施例6中Lut和Lut-DG给药8h后各器官中的Lut含量图表。

图18为实施例6中Lut和Lut-DG给药8h后各胃肠组织中的Lut含量图表。

图19为实施例7中注射对乙酰氨基酚后各组小鼠肝组织与体重的比值图表。

图20为实施例7中注射对乙酰氨基酚后各组小鼠脾组织与体重的比值图表。

图21为实施例7中注射对乙酰氨基酚后各组小鼠血清中谷草转氨酶(AST)的测试结果图表。

图22为实施例7中注射对乙酰氨基酚后各组小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)的测试结果图表。

图23为实施例7中注射对乙酰氨基酚后各组小鼠的肝组织外观图。

图24为实施例7中注射对乙酰氨基酚后各组小鼠的肝脏用苏木精-伊红染色后的显微图像。

图25为实施例7中注射对乙酰氨基酚后各组小鼠肝组织中的超氧化物歧化酶(SOD)水平图表。

图26为实施例7中注射对乙酰氨基酚后各组小鼠肝组织中的丙二醛(MDA)水平图表。

图27为实施例7中注射对乙酰氨基酚后各组小鼠肝组织中的IL-6水平图表。

图28为实施例7中注射对乙酰氨基酚后各组小鼠肝组织中的NF-κB水平图表。

图29为实施例7中注射对乙酰氨基酚后各组小鼠肝组织中的TNF-α水平图表。

图30为实施例7中注射对乙酰氨基酚后各组小鼠肝组织中的HMGB1表达水平图表。

图31为实施例7中注射对乙酰氨基酚后各组小鼠肝组织中的RAGE表达水平图表。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。

本发明的实施例中，未注明具体条件的试验，按照本领域常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂和仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

木犀草素(Luteolin，缩写为“Lut”)：购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

甘草酸二钾(Dipotassium glycyrrhizinate，缩写为“DG”)：纯度≥98％，购自陕西富捷药业有限公司。

台盼蓝(TB)和对乙酰氨基酚(APAP)：购自北京索莱宝科技有限公司。

雄性SD大鼠(约200g±20g)和雄性C57BL/6J小鼠(8周龄)：购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，所有动物均健康，无临床可观察到的身体异常。

本发明的实施例中，采用SPSS Statistics 24软件进行数据分析，P<0.05表示具有显著性。

本发明的实施例中，所使用的百分数如无特别说明均为质量百分数。

实施例1、Lut-DG的制备

采用乙醇蒸发法制备Lut-DG。

取50mg的木犀草素(Lut)，分别与350mg、450mg、550mg、650mg、750mg和850mg(重量配比分别为1:7、1:9、1:11、1:13、1:15、1:17)的甘草酸二钾(DG)一起溶解于50ml乙醇中，然后使用旋转蒸发器在40℃下减压蒸发完全除去乙醇，得到Lut-DG。

其中，重量配比Lut:DG＝1:13所得的Lut-DG，其外观形态如图1所示、微观形态如图2所示。

重量配比Lut:DG＝1:13所得的Lut-DG，其FT-IR、DSC和XRD图谱分别如图3-图5所示，木犀草素(Lut)、甘草酸二钾(DG)、木犀草素和甘草酸二钾的物理混合物(缩写为“Lut&DG”，Lut和DG的重量配比为1:13，直接将两种固体混合得到)作为对比。DSC和XRD图谱显示，Lut-DG中的Lut表现为非晶态形式。

实施例2、Lut-DG的性能测试

1.包封率

将实施例1所得的Lut-DG制成水溶液，过0.22μm滤膜，过滤分离未包封的Lut，分别用甲醇稀释Lut-DG过滤前和过滤后的溶液，破坏胶束。通过下述的HPLC法测定溶液中的Lut浓度并计算包封率，包封率为过滤后检测到的Lut浓度与过滤前检测到的Lut浓度的比值(％)。

高效液相色谱法(HPLC)：

色谱柱：安捷伦ZORBAX SB-C18(250mm×4.60mm，5μm)，柱温25℃；流动相：甲醇-0.1％磷酸水溶液(65:35，v/v)，流速1.0ml/min；检测波长350nm；进样体积20μl。

不同配比(实施例1所制得，重量配比Lut:DG＝1:7、1:9、1:11、1:13、1:15、1:17)所得Lut-DG的包封率如图6所示。结果显示，配比1:7、1:9、1:11、1:13时的包封率分别为28.55±0.52％、88.95±1.15％、90.88±0.66％、99.16±0.90％，配比1:15和1:17的包封率均在99％左右。

此外，通过肉眼观察，配比1:7、1:9和1:11所得的Lut-DG溶解在水中时表现为悬浮液，配比1:13、1:15和1:17所得的Lut-DG溶解在水中时表现为澄清溶液。

2.溶解度

分别将过量的Lut和实施例1所制得的Lut-DG(重量配比Lut:DG＝1:13)加入到1ml试验溶液中：水、磷酸盐缓冲液(武汉赛维尔生物科技有限公司市售PBS粉末，溶解于蒸馏水中，浓度0.01M，25℃时pH值7.2～7.4)(实测pH＝7.4)、模拟肠液SIF(pH＝6.8)、模拟胃液SGF(pH＝1.2)，在摇床37℃和100rpm的条件下培养4h或24h后，离心，0.22μm滤膜过滤，甲醇稀释，利用前述HPLC法测定Lut浓度并计算溶解度。

溶解度的测定结果如图7所示。结果显示，4h时和24h时Lut在水中的溶解度分别为2.98±0.03μg/ml、4.20±0.18μg/ml，而4h时和24h时Lut-DG中的Lut在水中的溶解度分别为33345.17±383.95μg/ml、51666.93±1552.70μg/ml。相对于Lut，Lut-DG中的Lut在其他试验溶液中的溶解度也都有非常大的提高。

3.胶束尺寸、多分散指数和Zeta电位

将实施例1所得的Lut-DG(重量配比Lut:DG＝1:13)制成水溶液(Lut浓度为1.0mg/ml)，使用Zetasizer Nano ZS90(动态光散射法，DLS)在25℃下测定Zeta电位、胶束尺寸和多分散指数(Polydispersity Index，缩写为PDI)。

结果显示，Lut-DG水溶液的Zeta电位为-27.0±0.5mV，平均胶束粒径为30.32±0.12nm，粒径分布窄(PDI＝0.138±0.024)。

4.储存稳定性

将实施例1所制得的Lut-DG(重量配比Lut:DG＝1:13)密封在玻璃瓶中，分别在4℃和25℃下避光储存6个月，每个月取1次样品按照前述的HPLC法检测包封率，按照下式计算Lut的保留率：Lut的保留率＝每个月的包封率检测数据/初始的包封率数据，初始的包封率为99.16±0.90％。

如图8所示，结果表明：在4℃和25℃下避光储存6个月，Lut-DG的包封率仍然在90％以上，两种储存条件下均表现出了良好的储存稳定性。

实施例3体外释放试验

采用透析法分析评估Lut-DG的体外释放特性。

测试溶液：

(1)Lut-DG(实施例1所制得，重量配比Lut:DG＝1:13)水溶液，Lut的含量为1mg/ml；

(2)Lut悬液：Lut分散在水中，Lut的含量为1mg/ml。

分别将1ml上述测试溶液置于透析袋中(截留分子量[MWCO]＝3500Da)，再浸入100ml磷酸盐缓冲液(pH＝7.4，含0.5％吐温80)中，在37℃下以100rpm摇床培养，在设定的时间点分别取1ml透析液(同时补充1ml磷酸盐缓冲液)，过0.22μm滤膜，用HPLC法进行检测，体外释放曲线如图9所示。

结果显示，Lut在PBS(pH＝7.4)中24小时的累计释放量为14.83±0.81％，而Lut-DG中Lut在PBS(pH＝7.4)中24小时的累计释放量高达79.75±8.38％，Lut-DG相比Lut表现出了更快的体外释放速率。

实施例4体外抗氧化活性试验

通过铁离子还原/抗氧化能力法(FRAP法)检测Lut、DG、Lut-DG(实施例1所制得，重量配比Lut:DG＝1:13)的抗氧化活性。检测结果如图10(固定浓度下的不同培养时间)和图11(固定培养时间下的不同浓度)所示。

图10和图11结果显示，Lut-DG表现出了比Lut更强的抗氧化活性。

实施例5生物相容性和安全性试验

1.溶血试验

采用生理盐水作为阴性对照(0％溶血)、0.1％Triton X-100作为阳性对照(100％溶血)进行溶血试验。

结果显示，Lut-DG(实施例1所制得，重量配比Lut:DG＝1:13)水溶液中Lut的浓度为0.1～0.5mg/ml时的溶血率小于0.5％，水溶液中Lut的浓度为1mg/ml和2mg/ml时的溶血率小于2％，均低于5％的安全值，表明Lut-DG具有良好的血液生物相容性。

2.鸡胚绒毛尿囊膜(HET-CAM)-台盼蓝染色试验

将试验鸡胚随机分成以下6组，每组3只：

①、阴性对照：0.9％NaCl溶液(生理盐水)；

②、阳性对照：0.1M NaOH溶液；

③、Lut组：悬液，10mg/ml；

④、DG组：130mg/ml；

⑤、Lut&DG物理混合组(Lut和DG的重量配比为1:13)：Lut浓度为10mg/ml；

⑥、Lut-DG组(实施例1所制得，重量配比Lut:DG＝1:13)：水溶液，Lut浓度为10mg/ml。

前述样品溶液与鸡胚尿囊膜(CAM)接触5min后，CAM的血管情况如图12所示；然后用台盼蓝进行染色并测定台盼蓝吸收量，结果如图13所示(其中，“*”表示与阴性对照组(0.9％NaCl)相比，P＜0.05；“#”表示与阳性对照组(0.1M NaOH)相比，P＜0.05)。

结果显示，阳性对照组(0.1M NaOH)表现出了充血、血栓等症状以及较高的台盼蓝吸收量，表明其具有严重刺激性；而Lut-DG组与生理盐水组基本上类似，未表现出明显的刺激性，这从另一方面说明了Lut-DG具有良好的生物相容性和安全性。

实施例6药效学试验

1.口服生物利用度试验

雄性SD大鼠随机分为两组，每组6只，试验前禁食12h。6只大鼠给予Lut悬液(0.5wt％羧甲基纤维素钠水溶液作为分散溶剂，Lut的浓度为10mg/ml，给药剂量为100mg/kg)；另6只大鼠给予Lut-DG溶液(实施例1所制得，重量配比Lut:DG＝1:13，0.5wt％羧甲基纤维素钠水溶液作为溶剂，按照Lut计算，Lut的浓度为10mg/ml，给药剂量为100mg/kg)。在给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12和24小时，从尾静脉抽取0.3ml血样，收集在抗凝管中，在4℃、3000rpm下离心10min，所得血浆样本在-80℃下储存，直到进行HPLC检测。

对于血浆样品分析，将100μl血浆与100μl的β-葡萄糖醛酸苷酶(10000单位/ml，在pH＝6.8的PBS中)混合，在37℃下培养2h，加入200μl芹菜素(内标物，2μg/ml)的乙腈溶液混匀，10000rpm离心10min，取上清液采用前述HPLC法进行检测。口服给药Lut和Lut-DG后血浆中Lut浓度-时间曲线如图14(其中，“*”表示与给药Lut组相比，P＜0.05)所示，药代动力学数据如表1所示。

表1.给药Lut和Lut-DG后Lut的药代动力学参数(n＝6)

参数	Lut	Lut-DG中的Lut
			C_max(μg/ml)	4.460±1.616	12.759±2.977
T_max(h)	4	0.25
			AUC_0→t(μg/ml·h)	64.244	112.326

其中，

达峰浓度(C_max)：药物的峰值浓度。药-时曲线上的最大血药浓度值，即用药后所能达到的最高血药浓度。

达峰时间(T_max)：药物作用的峰值时间。在给药后血浆药物浓度曲线上达到最高浓度(达峰浓度)所需的时间。

药时曲线下面积(AUC)：血药浓度曲线对时间轴所包围的面积；该参数代表药物的生物利用度(药物在人体中被吸收利用的程度)，AUC大则生物利用度高，反之则低。

结果显示，口服Lut后的T_max、C_max和AUC_0-24h分别为4h、4.460±1.616μg/ml和64.244μg/ml·h，而口服Lut-DG后的T_max、C_max和AUC_0-24h分别为0.25h、12.759±2.977μg/ml和112.326μg/ml·h。这些数据表明，与Lut相比，Lut-DG提高了Lut的释放速率，改善了Lut在体内的吸收，具有更好的生物利用度。

2.体内组织分布评价试验

SD大鼠随机分为两组，每组12只，评估Lut、Lut-DG中的Lut在主要器官以及胃肠组织中的分布，给药程序、剂量等与第1项口服生物利用度试验相同。在给药后的0.5h和8h，每组随机处死6只大鼠(0.5h和8h各6只)，切除其器官(包括心、肝、脾、肺、肾和脑)和胃肠组织(包括胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠)，称重，-80℃下保存，之后用于进一步检测。

对于Lut含量分析，将器官或胃肠组织用乙腈匀浆(芹菜素作为内标物，2μg/ml)，之后离心，取上清液采用前述HPLC法进行检测。

给药0.5h，心、肝、脾、肺、肾、脑等器官中的Lut含量如图15所示，胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠等胃肠组织中的Lut含量如图16所示；给药8h，心、肝、脾、肺、肾、脑等器官中的Lut含量如图17所示，胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠等胃肠组织中的Lut含量如图18所示(其中，“*”表示与给药Lut组相比，P＜0.05)。

结果表明，与单独的Lut相比，Lut-DG中的Lut能够更好地被胃肠组织所吸收利用，并能够更容易地进入肝、脾等器官，可以充分发挥Lut的药效作用，尤其是对肝脏的防护和/或治疗等作用。

实施例7药理活性试验

将健康的雄性C57BL/6J小鼠随机分为以下9组，每组16只：

①健康对照组；

②PBS治疗组；

③阳性(NAC：N-乙酰半胱氨酸)治疗组(NAC组)：给药剂量为200mg/kg；

④Lut治疗组：给药剂量为100mg/kg；

⑤DG治疗组：给药剂量为1300mg/kg；

⑥Lut&DG治疗组：给药剂量为100mg/kg的Lut和1300mg/kg的DG；

⑦Lut-DG(实施例1所制得，重量配比Lut:DG＝1:13)低剂量治疗组：给药剂量为5mg/kg Lut；

⑧Lut-DG(实施例1所制得，重量配比Lut:DG＝1:13)中剂量治疗组：给药剂量为50mg/kg Lut；

⑨Lut-DG(实施例1所制得，重量配比Lut:DG＝1:13)高剂量治疗组：给药剂量为100mg/kg Lut。

以上小鼠连续给药7天(健康对照组小鼠喂给等量PBS)，第7天给药之前12h禁食，第7天给药后1h注射对乙酰氨基酚(剂量为400mg/kg)，健康对照组小鼠注射等量PBS。

1.肝脏与体重的比值&脾脏与体重的比值测试

注射APAP(对乙酰氨基酚)或PBS六个小时后，处死各组小鼠，收集血清、肝脏和脾脏样本进行分析，称重，分别计算肝脏与体重的比值、脾脏与体重的比值，用于评价肝脏、脾脏的水肿程度，结果分别如图19和图20所示(其中，“*”表示与健康对照组相比，P＜0.05；“#”表示与PBS组相比，P＜0.05；“&”表示与NAC组相比，P＜0.05；“$”表示与DG组相比，P＜0.05；“@”表示与Lut组相比，P＜0.05；“％”表示与Lut&DG组相比，P＜0.05；“^”表示与Lut-DG低剂量组相比，P＜0.05；“+”表示与Lut-DG中剂量组相比，P＜0.05)。

图19和图20结果显示，Lut-DG能够有效地缓解和/或防治过量的APAP所引起的肝脾水肿等症状。

2.血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)测试

采用市售试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定小鼠血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)水平(AST和ALT是反映肝损伤严重程度的两个重要指标)，结果分别如图21和图22所示(其中，“*”表示与健康对照组相比，P＜0.05；“#”表示与PBS组相比，P＜0.05；“&”表示与NAC组相比，P＜0.05；“$”表示与DG组相比，P＜0.05；“@”表示与Lut组相比，P＜0.05；“％”表示与Lut&DG组相比，P＜0.05)。

图21和图22结果显示，Lut-DG能够有效地抑制或避免过量的APAP所引起的血清中AST和ALT的骤然升高。Lut-DG高剂量治疗组(100mg/kg Lut)对应的AST和ALT分别为171.73±5.81％、254.53±12.41％，Lut-DG中剂量治疗组(50mg/kg Lut)对应的AST和ALT分别为225.87±23.91％、341.97±11.28％，可见Lut-DG具有良好的保肝和护肝作用。

3.组织学检查

将福尔马林固定的肝脏(如图23所示)用石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色，在显微镜下进行组织病理学评价(如图24所示)。

图23和图24结果显示，Lut-DG能够有效地抑制或避免过量的APAP所引起的出血、炎性细胞浸润、小叶中心坏死、空泡化等症状，具有良好的保肝和护肝作用。

4.超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)测试

肝组织用生理盐水均质，离心后的上清液采用市售试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测SOD和MDA水平，结果表示为U/mg蛋白，如图25和图26所示(其中，“*”表示与健康对照组相比，P＜0.05；“#”表示与PBS组相比，P＜0.05；“&”表示与NAC组相比，P＜0.05；“$”表示与DG组相比，P＜0.05；“@”表示与Lut组相比，P＜0.05；“％”表示与Lut&DG组相比，P＜0.05；“^”表示与Lut-DG低剂量组相比，P＜0.05)。

图25和图26结果显示，Lut-DG能够有效地抑制或避免过量的APAP所引起的肝组织中SOD水平大幅度降低，同时也能够有效地抑制或避免过量的APAP所引起的肝组织中MDA水平大幅度升高，具有良好的保肝和护肝作用。

5.酶联免疫吸附试验

采用市售的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海酶联生物技术有限公司)，检测小鼠肝脏中不同细胞因子(例如，促炎性细胞因子等)水平：

白细胞介素IL-6：一种重要的炎症细胞因子，主要表达于炎症反应等；

核因子NF-κB：一种重要的转录激活因子，涉及到炎症和急性反应、细胞繁殖、细胞凋亡、病毒感染等多种病理过程；

肿瘤坏死因子TNF-α：一种促炎细胞因子，其功能失调被认为与许多疾病相关，有报道称，TNF-α抑制剂是自身免疫疾病(如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎及银屑病性关节炎等)的首选治疗药物。

结果如图27-图29所示(其中，“*”表示与健康对照组相比，P＜0.05；“#”表示与PBS组相比，P＜0.05；“&”表示与NAC组相比，P＜0.05；“$”表示与DG组相比，P＜0.05；“@”表示与Lut组相比，P＜0.05；“％”表示与Lut&DG组相比，P＜0.05；“^”表示与Lut-DG低剂量组相比，P＜0.05；“+”表示与Lut-DG中剂量组相比，P＜0.05)。

图27-图29结果显示，Lut-DG能够有效地抑制IL-6、NF-κB、TNF-α等细胞因子的表达，对其所引起的多种炎症具有良好的预防和/或治疗效果，可以作为潜在的IL-6、NF-κB或TNF-α抑制剂，为临床用药提供更多的选择。

6.蛋白质印迹分析

采用Western Blot方法分析小鼠肝脏中高迁移率族蛋白B1(HMGB1)和糖基化终产物受体(RAGE)蛋白表达水平(参考文献：Qiqi Li,Meng Xin,Xianggen Wu,Bo Lei.A nano-phytochemical ophthalmic solution for marked improvement of corneal woundhealing in healthy or diabetic mice.Nanomedicine(London),2022(3):151-165)。

HMGB1(High Mobility Group Protein)：有研究表明，HMGB1是重要炎症介质，在脓毒症、肿瘤、关节炎等多种疾病的发生、发展过程中发挥着重要作用；

RAGE(Receptor for Advanced Glycation Endproducts)：糖基化终产物受体，是一种膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族。

结果如图30和图31所示(其中，“*”表示与健康对照组相比，P＜0.05；“#”表示与PBS组相比，P＜0.05；“&”表示与NAC组相比，P＜0.05；“$”表示与DG组相比，P＜0.05；“@”表示与Lut组相比，P＜0.05；“％”表示与Lut&DG组相比，P＜0.05；“^”表示与Lut-DG低剂量组相比，P＜0.05；“+”表示与Lut-DG中剂量组相比，P＜0.05)。

图30和图31结果显示，Lut-DG能够有效地抑制HMGB1、RAGE等蛋白的过度表达，可以作为潜在的HMGB1抑制剂或RAGE抑制剂，为临床用药提供更多的选择。

本发明所描述的实施方式仅出于示例性目的，并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可在本发明的范围内作出各种其他替换、改变和改进，因而，本发明并不局限于上述实施方式。

Claims

1.一种药物组合物，其包含黄酮类化合物和药学上可接受的辅料；其中，所述的黄酮类化合物为木犀草素或其药学上可接受的盐，所述的药学上可接受的辅料包含甘草酸盐。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述黄酮类化合物和药学上可接受的辅料的重量比为1:5～50；

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的黄酮类化合物为木犀草素；和/或，所述的甘草酸盐选自甘草酸钠、甘草酸二钠、甘草酸钾、甘草酸二钾、甘草酸铵、甘草酸二铵中的一种或两种以上；

优选地，所述的甘草酸盐为甘草酸二钾或甘草酸二钠。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物中，所述的药学上可接受的辅料包覆所述的黄酮类化合物；优选地，所述的药学上可接受的辅料包覆所述的黄酮类化合物形成纳米颗粒；更优选地，所述纳米颗粒的平均粒径为1～50nm，例如为20～40nm；

和/或，所述的黄酮类化合物以非晶态形式存在；

和/或，所述黄酮类化合物的包封率至少为80％；优选地，所述黄酮类化合物的包封率≥90％或≥95％。

5.根据权利要求1～3任意一项所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为固体制剂或液体制剂；和/或，所述药物组合物中的黄酮类化合物为治疗有效量的；

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，当所述液体制剂中黄酮类化合物的浓度为1mg/ml时，所述的液体制剂满足下述条件①～③中的一项或两项以上：

②、所述液体制剂的多分散系数为≤0.5；优选为≤0.4；

③、所述液体制剂的Zeta电位为-40～0mV；优选为-30～-20mV；

7.根据权利要求1～3任意一项所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物是由包括以下步骤的方法制成：将黄酮类化合物和药学上可接受的辅料分散或溶解于有机溶剂中，混匀，然后除去所述的有机溶剂，即得；

8.根据权利要求1～3任意一项所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物是用于预防和/或治疗药物性肝损伤的药物组合物；例如，所述的药物性肝损伤为对乙酰氨基酚所导致的药物性肝损伤；

9.权利要求1～6任意一项所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将黄酮类化合物和药学上可接受的辅料分散或溶解于有机溶剂中，混匀，然后除去所述的有机溶剂，即得；

10.权利要求1～7任意一项所述的药物组合物在制备预防和/或治疗药物性肝损伤的药物中的用途；例如，所述的药物性肝损伤为对乙酰氨基酚所导致的药物性肝损伤；

或者，权利要求1～7任意一项所述的药物组合物在制备降低血清转氨酶水平的药物中的用途；例如，所述的转氨酶为谷丙转氨酶和/或谷草转氨酶；

或者，权利要求1～7任意一项所述的药物组合物在制备促炎性细胞因子抑制剂中的用途；例如，所述的促炎性细胞因子抑制剂为IL-6抑制剂、NF-κB抑制剂或TNF-α抑制剂；

或者，权利要求1～7任意一项所述的药物组合物在制备蛋白抑制剂中的用途；例如，所述的蛋白抑制剂为HMGB1抑制剂或RAGE抑制剂。