CN115721657A

CN115721657A - 一种包含非瑟酮的药物组合物、其制备方法及用途

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Publication number: CN115721657A
Application number: CN202111006784.5A
Authority: CN
Inventors: 魏彦君; 杨慧; 吴祥根; 刘希望; 邢艳平; 徐青景
Original assignee: Shandong Weizhi Zhongke Pharmaceutical Co ltd; Weizhi Pharmaceutical Co ltd; Shandong Viwit Baike Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Shandong Weizhi Zhongke Pharmaceutical Co ltd; Weizhi Pharmaceutical Co ltd; Shandong Viwit Baike Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-08-30
Filing date: 2021-08-30
Publication date: 2023-03-03

Abstract

本发明公开了一种包含非瑟酮的药物组合物、其制备方法及用途。本发明提供了一种药物组合物，其包含：黄酮类化合物和药学上可接受的甘草酸盐；其中，所述的黄酮类化合物为非瑟酮或其药学上可接受的盐。该药物组合物能够用于制备预防、治疗和/或缓解肝损伤的药物，或者用于制备降低血清转氨酶水平的药物，具有良好的疗效，能够有效降低因该病所引起的死亡率，延长其存活寿命；同时，也能够显著降低血清转氨酶水平。

Description

一种包含非瑟酮的药物组合物、其制备方法及用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种包含非瑟酮的药物组合物、其制备方法及用途。

背景技术

对乙酰氨基酚，又名扑热息痛，是一种最常见的解热镇痛药，主要用于普通感冒或流行性感冒引起的发热，也用于缓解轻至中度的疼痛，例如：头痛、关节痛、偏头痛、牙痛、肌肉痛、神经痛、痛经等，应用非常广泛。

然而，如果用药剂量过大或用药时间过长，就会对肝脏造成损害，造成部分肝细胞坏死，表现为血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)等肝功指标异常。通常，将因药物和/或其代谢产物造成的肝损伤(包括但不限于：水肿、氧化应激反应、炎症反应、肝细胞坏死等)称为药物性肝损伤(Drug-induced liver injury)。

近年来，药物性肝损伤在临床上的发病率明显增加，尤其在欧美呈现愈发严重的趋势。其中，对乙酰氨基酚的过量使用和滥用，是诱发该类疾病的最主要原因之一。发病后，血清中的谷草转氨酶、谷丙转氨酶含量会升高，导致肝细胞坏死，进而引发肝硬化甚至死亡。对乙酰氨基酚造成急性肝损伤，是因为对乙酰氨基酚在肝脏代谢后产生乙酰苯醌亚胺，它会耗尽肝脏中的谷胱甘肽，而且，剩余的乙酰苯醌亚胺还会对线粒体造成氧化应激，最终造成肝细胞坏死和损伤。

目前对于这种药物性肝损伤，主要是使用N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为治疗药物，虽然它是现阶段最有效的药物，但也存在一定的局限性和缺点(参见：CN 112535694 A)，尚无其他更好更有效的治疗药物可供选择。

甘草酸二钾，为白色或类白色粉末，具有抗炎、抗过敏、保湿等功效，在医药行业主要用于镇咳祛痰、胃溃疡、急慢性胃炎、湿疹、皮肤瘙痒、肝炎、高血脂症、结膜炎，以及用于治疗癌症和防治艾滋病等。

非瑟酮，又称漆黄素，黄色针状结晶，几乎不溶于水，可用于防治尿酸性肾病(CN112755018A)、抗辐射损伤(CN111700888A)、抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染(CN111617069A)、二肽基肽酶-IV抑制剂(CN107496411A)、抑制Tau蛋白异常聚集(CN108272791A)、抗李斯特菌感染(CN103191099A)等。

截止到目前为止，未检索到有将甘草酸二钾和非瑟酮组合用于预防、治疗和/或缓解肝损伤的相关文献报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题和/或不足，本发明的目的在于提供一种包含非瑟酮的药物组合物、其制备方法及用途。该药物组合物能够用于制备预防、治疗和/或缓解肝损伤的药物，或者用于制备降低血清转氨酶水平的药物，具有良好的疗效。

本发明提供了一种药物组合物，其包含：黄酮类化合物和药学上可接受的甘草酸盐；其中，所述的黄酮类化合物为非瑟酮或其药学上可接受的盐。

进一步的，

在上述任一技术方案(药物组合物)中，所述的黄酮类化合物与所述的甘草酸盐的重量比为1:2～50(例如，1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:15、1:16、1:18、1:20、1:22、1:25、1:30、1:35或1:45)；优选的，所述的黄酮类化合物与所述的甘草酸盐的重量比为1:5～20(例如，1:6、1:9、1:12、1:15或1:18)；更优选的，所述的黄酮类化合物与所述的甘草酸盐的重量比为1:15～18。

进一步的，

在上述任一技术方案(药物组合物)中，所述的黄酮类化合物的包封率至少为80％(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)；优选的，所述的黄酮类化合物的包封率≥90％或≥95％。

进一步的，

在上述任一技术方案(药物组合物)中，所述的黄酮类化合物为非瑟酮。

进一步的，

在上述任一技术方案(药物组合物)中，所述的黄酮类化合物以非晶态形式存在于所述的药物组合物中。

进一步的，

在上述任一技术方案(药物组合物)中，所述的黄酮类化合物为非瑟酮；所述的黄酮类化合物以非晶态形式存在于所述的药物组合物中。

在上述任一技术方案(药物组合物)中，所述的黄酮类化合物为非瑟酮，所述的甘草酸盐为甘草酸二钾，所述的黄酮类化合物与所述的甘草酸盐的重量比为1:15。

进一步的，

在上述任一技术方案(药物组合物)中，所述的黄酮类化合物与所述的甘草酸盐的摩尔比可为1:0.6～15.9，又可为1:1.6～6.4(例如，1:1.9、1:2.9、1:3.8、1:4.8或1:5.7)，还可为1:4.8～5.7。

进一步的，

在上述任一技术方案(药物组合物)中，所述的药物组合物满足下述条件i～v中的一个或两个以上：

i、所述的黄酮类化合物为非瑟酮；

ii、所述的黄酮类化合物以非晶态形式存在于所述的药物组合物中；

iii、所述的甘草酸盐选自甘草酸钠、甘草酸二钠、甘草酸钾、甘草酸二钾、甘草酸铵、甘草酸二铵中的一种或两种以上；优选的，所述的甘草酸盐为甘草酸二钾或甘草酸二钠；

iv、所述的黄酮类化合物与所述的甘草酸盐的摩尔比为1:0.6～15.9，优选为1:1.6～6.4(例如，1:1.9、1:2.9、1:3.8、1:4.8或1:5.7)，更优选为1:4.8～5.7；

v、所述的黄酮类化合物与所述的甘草酸盐的重量比为1:15；

优选的，所述的药物组合物同时满足条件i～iv，或者，所述的药物组合物同时满足条件i～iii和v。

进一步的，

在上述任一技术方案(药物组合物)中，所述的药物组合物可以是核壳结构，所述的黄酮类化合物是核，所述的甘草酸盐是壳；或者是其他结构形式。

进一步的，

在上述任一技术方案(药物组合物)中，所述的药物组合物可以是用于预防、治疗和/或缓解肝损伤的药物组合物；优选的，所述的肝损伤为药物性肝损伤或急性肝损伤；更优选的，所述的药物性肝损伤是由对乙酰氨基酚所引起的肝损伤。

进一步的，

在上述任一技术方案(药物组合物)中，所述的药物组合物可以是用于降低血清转氨酶水平的药物组合物；优选的，所述的转氨酶为谷丙转氨酶和/或谷草转氨酶。

进一步的，

在上述任一技术方案(药物组合物)中，

所述的药物组合物的剂型可为口服给药制剂、注射制剂、舌下给药制剂、颊给药制剂或透皮吸收制剂(视情况，可根据常规技术加入药学上可接受的辅料和/或辅助性成分以便制成前述剂型)；

或者，

所述的药物组合物的剂型可为汤剂、丸剂、散剂、膏剂、糊剂、膜剂、贴剂、贴膏剂、丹剂、针剂、酒剂、冲剂、口服液剂、片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂、喷雾剂、凝胶剂、糖浆剂、涂剂、搽剂、涂膜剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、植入剂、洗剂、冲洗剂、灌肠剂、合剂、缓释制剂、控释制剂、迟释制剂、靶向制剂或前体药物制剂(视情况，可根据常规技术加入药学上可接受的辅料和/或辅助性成分以便制成前述剂型)。

进一步的，

在上述任一技术方案(药物组合物)中，所述的药物组合物为溶液剂，其溶剂选自水、PBS缓冲液或0.5wt％羧甲基纤维素钠水溶液。

进一步的，

在上述任一技术方案(药物组合物)中，所述药物组合物为包含所述的黄酮类化合物与所述的甘草酸盐的纳米胶束制剂，优选为包含所述的黄酮类化合物与所述的甘草酸盐的自组装纳米胶束制剂。

进一步的，

在上述任一技术方案(药物组合物)中，当所述的溶液剂中的黄酮类化合物浓度为1.0mg/mL时，所述溶液剂的胶束尺寸为50～150nm(例如，60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm或140nm)；优选70～90nm。

在上述任一技术方案(药物组合物)中，当所述的溶液剂中的黄酮类化合物浓度为1.0mg/mL时，所述的黄酮类化合物浓度为1.0mg/mL，所述溶液剂的多分散系数为≤0.7；优选≤0.5或0.4。

在上述任一技术方案(药物组合物)中，当所述的溶液剂中的黄酮类化合物浓度为1.0mg/mL时，所述溶液剂的zeta电位为-60mV～0mV(例如，-50mV、-40mV、-30mV、-20mV或-10mV)；优选-60mV～-40mV。

在上述任一技术方案(药物组合物)中，当所述的溶液剂中的黄酮类化合物浓度为1.0mg/mL时，

所述溶液剂的胶束尺寸为50～150nm(例如，60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm或140nm)；优选70～90nm；

所述的黄酮类化合物浓度为1.0mg/mL，所述溶液剂的多分散系数为≤0.7；优选≤0.5或0.4；

所述溶液剂的zeta电位为-60mV～0mV(例如，-50mV、-40mV、-30mV、-20mV或-10mV)；优选-60mV～-40mV。

进一步的，

在上述任一技术方案(药物组合物)中，所述的药物组合物是由包括以下步骤的方法制成：将所述的黄酮类化合物和所述的甘草酸盐一起分散或溶解于溶剂中，混匀，然后35～45℃旋转蒸发除去溶剂，即得；优选的，所述的溶剂为醇类溶剂，再优选为甲醇或乙醇。

本发明的另一目的在于提供上述药物组合物的制备方法。

具体的，

本发明还提供了一种上述药物组合物的制备方法，其包括以下步骤：将上述的黄酮类化合物和上述的甘草酸盐一起分散或溶解于溶剂中，混匀，然后35～45℃旋转蒸发除去溶剂，即得；优选的，所述的溶剂为醇类溶剂，再优选为甲醇或乙醇。

本发明的另一目的还在于提供上述药物组合物的药物用途。

具体的，

本发明还提供了一种上述药物组合物在制备预防、治疗和/或缓解肝损伤的药物中的用途；优选的，所述的肝损伤为药物性肝损伤或急性肝损伤；更优选的，所述的药物性肝损伤是由对乙酰氨基酚所引起的肝损伤。

或者，

本发明还提供了一种上述药物组合物在制备用于降低血清转氨酶水平的药物中的用途；优选的，所述的转氨酶为谷丙转氨酶和/或谷草转氨酶。

关于本发明中使用术语的定义，除非另有说明，本文中术语提供的初始定义适用于全文中的该术语；对于本文没有具体定义的术语，应当根据公开内容和/或上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。

本发明药物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括但并不限于：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂等。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂；(b)增粘剂，例如：羧甲基纤维素及其盐；(c)保湿剂；(d)崩解剂；(e)缓溶剂；(f)吸收加速剂；(g)润湿剂；(h)吸附剂；以及(i)润滑剂等。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型还可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂，可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种剂型中活性化合物的释放可以以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括：药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，以及增溶剂和乳化剂等。除了这些惰性稀释剂外，药物中也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂。

用于肠胃外注射的药物，可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂等。

用于局部给药的药物剂型，包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

体内试验结果显示，非瑟酮和甘草酸盐(例如：甘草酸二钾)组合对于预防、治疗和/或缓解肝损伤(尤其是药物性肝损伤)具有良好的疗效，能够有效降低因该病所引起的死亡率，延长其存活寿命；同时，也能够显著降低血清转氨酶水平。此外，试验结果还进一步表明，非瑟酮和甘草酸盐组合具有协同增效的作用，取得了比任意单一组分更优越的疗效。

附图说明

图1为本发明DG-FIT粉末外观图。

图2为DG(图2-a)、FIT(图2-b)、DG&FIT物理共混物(图2-c)、DG-FIT(图2-d)的SEM图。

图3为DG(U-1)、FIT(U-2)、DG&FIT物理共混物(U-3)、DG-FIT(U-4)的UV图。

图4为DG(IR-1)、FIT(IR-2)、DG&FIT物理共混物(IR-3)、DG-FIT(IR-4)的IR图。

图5为DG(X-1)、FIT(X-2)、DG&FIT物理共混物(X-3)、DG-FIT(X-4)的XRD图。

图6为DG(D-1)、FIT(D-2)、DG&FIT物理共混物(D-3)、DG-FIT(D-4)的DSC图。

图7为FIT、DG&FIT物理共混物、DG-FIT分别在水中的溶解情况。

图8为FIT和DG-FIT在不同溶剂中的溶解度。

图9为不同药载比DG-FIT水溶液的胶束尺寸。

图10为不同药载比DG-FIT水溶液的多分散指数。

图11为不同药载比DG-FIT水溶液的zeta电位。

图12为不同药载比DG-FIT水溶液的包封率。

图13为DG-FIT储存1周～12周的胶束尺寸。

图14为DG-FIT储存1周～12周的多分散指数。

图15为储存1周～12周DG-FIT中剩余的FIT。

图16为FIT和DG-FIT的体外释放曲线对比(透析法)。

图17为FIT和DG-FIT的体外释放曲线对比(PAMPA法)。

图18为DG、FIT、DG&FIT物理共混物、DG-FIT的溶血率。

图19为DG、FIT、DG-FIT的抗氧化活性曲线。

图20为FIT、DG-FIT的体内肠道分布研究结果。

图21为肝损伤体内试验不同试验组的AST水平。

图22为肝损伤体内试验不同试验组的ALT水平。

图23为肝损伤体内试验不同试验组的肝重与体重的比值。

图24为肝损伤体内试验不同试验组的GSH水平。

图25为肝损伤体内试验不同试验组的SOD水平。

图26为肝损伤体内试验不同试验组的MDA水平。

图27为肝损伤体内试验不同试验组的IL-1β水平。

图28为肝损伤体内试验不同试验组的IL-6水平。

图29为肝损伤体内试验不同试验组的TNF-α水平。

图30为肝损伤体内试验不同试验组：胃肠组织和主要器官的组织病理学检查。

图31为肝损伤体内试验不同试验组：肝的组织病理学检查和细胞凋亡评价。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明进行清楚、完整的描述，本领域技术人员将会理解，下面所述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为对本发明保护范围的限制。

本发明中，未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

例如：

非瑟酮(Fisetin，缩写为FIT)：又称漆黄素，纯度≥95％，购自大连美仑生物技术有限公司。

甘草酸二钾(Dipotassium glycyrrhizinate，缩写为DG)：纯度≥98％，购自陕西富捷药业有限公司。

香豆素-6(Coumarin-6)：美国Sigma-Aldrich公司。

对乙酰氨基酚：又名扑热息痛，购自上海麦克林(Macklin)生化科技有限公司。

雄性SD大鼠(～200g)和雄性C57BL/6小鼠(8周龄)，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。所有动物均健康，无临床可观察到的身体异常。

本发明中，所有分析均采用spss11.5软件(spssinc，芝加哥)，P<0.05表示具有显著性。

实施例1

1制备DG-FIT

乙醇蒸发法：取50mg的非瑟酮(FIT)，分别按不同的药物载体比率(是指药物与载体之间的重量比，也可称为药载比)，与甘草酸二钾(DG)混合，共同溶于无水乙醇(30mL)中；然后，使用旋转蒸发器在40℃下减压蒸发完全除去乙醇，过80目筛，得到淡黄色粉末，即为DG-FIT(以DG为载体的FIT自组装纳米载药胶束)，见图1(药载比1:15)。

按照上述方法，用香豆素-6替换其中的500μg非瑟酮(FIT)，得到香豆素-6标记的DG-FIT，用于体内肠道吸收曲线观察。

1.1SEM测试

使用扫描电子显微镜(SEM，Hitachi S-4800，日本)观察DG-FIT粉末的形态。DG、FIT、DG&FIT物理共混物(FIT和DG的重量比为1:15)、DG-FIT(药载比1:15)的SEM图，依次见图2中的a、b、c和d。

SEM结果显示，DG呈球状或破坏的球状(图2-a)，FIT表现为粉末团簇(图2-b)，DG&FIT物理共混物呈现为粘附在球状体上的小团簇(图2-c)，DG-FIT表现出与DG&FIT物理共混物存在较大差异的微观形貌：DG的球形完全消失，呈现为团簇颗粒(图2-d)。

1.2UV测试

用多功能酶标仪(Molecular Devices SpectraMax i3，Tacan Austria GmbH,Grodig,Austria)，对DG、FIT、DG&FIT物理共混物(FIT和DG的重量比为1:15)、DG-FIT(药载比1:15)进行紫外-可见光谱分析，依次见图3中的U-1、U-2、U-3、U-4。

1.3红外测试

采用傅立叶变换红外光谱法研究DG-FIT中DG与FIT的分子间相互作用(FTIR，Nicolet iS10，ThermoFisher，Madison，WI，USA)。DG、FIT、DG&FIT物理共混物(FIT和DG的重量比为1:15)、DG-FIT(药载比1:15)的IR图，依次见图4中的IR-1、IR-2、IR-3、IR-4。

1.4XRD测试

采用X射线衍射(XRD，D/max-2400，日本Rigaku)研究DG-FIT中FIT的结晶特性变化。DG、FIT、DG&FIT物理共混物(FIT和DG的重量比为1:15)、DG-FIT(药载比1:15)的XRD图，依次见图5中的X-1、X-2、X-3、X-4。

结果显示，FIT在2θ＝7.92、12.44、15.5、17.44、24.08、25.72、28.26度处有特征峰，而在DG-FIT中这些特征峰消失，表明DG-FIT中的FIT为非晶态。

1.5DSC测试

采用差示扫描量热法(TG-DSC STA 449F3

Netzsch,Germany)研究分析DG-FIT中DG与FIT之间的相互作用以及相变情况。DG、FIT、DG&FIT物理共混物(FIT和DG的重量比为1:15)、DG-FIT(药载比1:15)的DSC图，依次见图6中的D-1、D-2、D-3、D-4。

2水溶液中DG-FIT自胶束化特性

2.1溶解性

将过量的DG-FIT(药载比1:15)加入到1mL试验溶液(例如：水、磷酸盐缓冲液PBS、模拟肠液SIF、模拟胃液SGF等)中，25℃下置于摇床(100转/分钟)中，分别在4h、24h取样品，离心(10000转/分钟)10分钟，0.22μm滤膜过滤除去不溶物，再用高效液相色谱法(HPLC)测定滤液中的FIT浓度。

磷酸盐缓冲液(PBS)：pH＝7.4。

模拟肠液(SIF)：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄、0.24g KH₂PO₄、1000mL水，pH＝6.8，0.5％(w/v)吐温80。

模拟胃液(SGF)：0.15M的HCl，0.05M的KCl，pH＝1.2，0.5％(w/v)吐温80。

高效液相色谱法(HPLC)测定滤液中的FIT浓度：安捷伦1100色谱系统；G1314A紫外检测器(检测波长225nm)；G1367A进样器；反相色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18，250mm×4.6mm，5μm；流动相：甲醇-水(80:20，体积比)；流速：1.0mL/min；FIT的保留时间约为4.5min。

结果显示，

DG-FIT易溶于水，形成淡黄色的澄清溶液，而FIT、DG&FIT物理共混物在水中则都表现为淡黄色的悬浮液，见图7。

FIT、DG-FIT的溶解性测试结果，见图8。与FIT相比，DG-FIT摇床培养4小时(表观溶解度)在水、PBS、SIF、SGF中的溶解度分别高出1402倍、1406倍、1232倍和1337倍，摇床培养24小时(平衡溶解度)分别高出1804倍、1613倍、1546倍和1586倍。

2.2胶束尺寸、多分散指数和zeta电位

将DG-FIT水溶液中的FIT浓度调节至约1.0mg/mL，进行以下分析测试：用透射电子显微镜(TEM，JEM-1200EX，日本东京JEOL公司)对胶束进行显微观察，观察前用1.5％磷钨酸对样品进行染色；使用Zetasizer Nano ZS90(英国伍斯特郡Malvern Instruments)的动态光散射(DLS)方法测定胶束的流体动力学尺寸分布和zeta电位。

不同药载比(1:6、1:9、1:12、1:15、1:18)所得DG-FIT的胶束尺寸(micelle size)、多分散指数(polydispersity index，缩写为PDI)和zeta电位，分别见图9～11。

2.3包封率

将DG-FIT溶于水中，并将其FIT浓度调节至约1.0mg/mL，过0.22μm滤膜，过滤分离未负载的FIT。用甲醇稀释DG-FIT过滤前和过滤后的溶液，以破坏胶束。采用高效液相色谱法测定FIT浓度。包封率，为过滤后检测到的FIT浓度与过滤前检测到的FIT浓度之比。

不同药载比(1:6、1:9、1:12、1:15、1:18)所得DG-FIT的包封率，见图12。结果显示，药载比1:6的包封率约为80％，药载比1:15的包封率高达99.65％±0.78％，接近100％(通常，药学上要求包封率在80％以上)。

实施例2

储存稳定性：将DG-FIT(药载比1:15)置于10mL玻璃瓶中，密封并用铝箔包裹，分别在4℃、25℃下储存。在预先确定的时间点，随机抽取3瓶样品，并用水溶解DG-FIT(浓度约为1mg/mL)，测定溶液的胶束尺寸(图13)、PDI(图14)和包封率，DG-FIT中剩余的FIT＝不同时间点的包封率/初始(0天)的包封率，见图15。

结果表明，DG-FIT具有良好的稳定性，在4℃或25℃下储存12周，其DG-FIT中剩余的FIT仍然保持在90％以上。

实施例3

测试溶液：

DG-FIT(药载比1:15)水溶液，1mg/mL；

FIT悬浮液：FIT分散在0.5％羧甲基纤维素钠水溶液中，1mg/mL。

(1)体外释放评价：采用透析法分析评估DG-FIT的体外释放特性。

分别将1mL上述测试溶液置于透析袋中(截留分子量[MWCO]＝3500Da)，再浸入100mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.4，0.5％吐温80)，在37℃下以100rpm摇床培养，在以下时间点(0.5、1、1.5、2、2.5、3、4和5h)，分别取1mL透析液(同时补充1mL磷酸盐缓冲液)，过0.22μm滤膜，用HPLC进行检测，体外释放曲线见图16。

结果显示，DG-FIT释放FIT的效果远远优于FIT(所有时间点的结果：P＜0.05，存在显著性差异)，例如：5h时，FIT的释放率仅有4.01±0.05％，而DG-FIT的释放率高达92.87±2.79％。

(2)平行人工膜渗透性试验(PAMPA，parallel artificial membranepermeability assay)

transwell供体侧的人工膜：聚碳酸酯膜，孔径0.4μm，内径12mm，面积1.12cm²(美国康宁公司)。在受体板的每个孔中加入1.5mL磷酸盐缓冲液(包含：5％v/v的二甲基亚砜)，供体侧加入0.5mL的DG-FIT水溶液(或FIT悬浮液)，盖上培养皿，在37℃下以200rpm摇床培养，分别在在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0和3.5h评估渗透性，见图17。

结果显示，与FIT相比，DG-FIT的渗透性显著增强(所有时间点的结果：P＜0.05，存在显著性差异)，例如：3.5h时，FIT的渗透量仅为12.59±0.93μg，而DG-FIT的渗透量高达267.30±14.53μg。

实施例4

血液相容性试验：

将小鼠红细胞悬浮到生理盐水中，得到2％v/v红细胞悬液。将100μL供试品溶液与900μL红细胞悬液混合，然后在37℃孵育1h，4000rpm离心15min，检测上清液在540nm处的吸光度。以水、生理盐水分别作为阳性对照和阴性对照。

使用以下公式计算溶血率，结果见图18：

溶血率(％)＝(OD_样品-OD_阴性对照)/(OD_阳性对照-OD_阴性对照)×100

结果显示，所有供试溶液(DG、FIT、DG&FIT物理共混物(FIT和DG的重量比为1:15)、DG-FIT(药载比1:15))的溶血率都低于安全值5％，说明它们均具有良好的血液生物相容性。

实施例5

抗氧化活性试验：

根据T-AOC检测试剂盒说明书(碧云天生物技术，中国上海)，通过铁离子(III)还原/抗氧化能力法(FRAP)评估DG、FIT、DG-FIT(药载比1:15)的抗氧化活性：浓度15.63、31.13、62.25、125、250μg/ml，时间15、30、60、90、120min，结果见图19。

结果显示，与DG、FIT相比，DG-FIT表现出更强的抗氧化活性；例如，浓度15.63μg/ml、时间15min之时，FIT的FRAP值仅为0.12％，而DG-FIT的FRAP值则为3.06％；浓度250μg/ml、时间120min之时，FIT的FRAP值为8.62％，而DG-FIT的FRAP值接近100％。

实施例6

体内肠道分布研究：

大鼠(禁食12h)随机分为两组，分别喂食1mL香豆素-6标记的DG-FIT(药载比1:15)水溶液、香豆素-6标记的FIT悬浮液。30min和3h时，每组随机处死3只大鼠，解剖后取十二指肠、空肠、回肠、结肠(约2cm)等肠组织，冷冻切片，制作样本，细胞核用4,‘6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)染成蓝色，肌动蛋白用罗丹明标记鬼笔环肽(rhodamine-phalloidin)染成红色；用荧光显微镜(BX53F2，日本东京奥林巴斯)观察染色组织切片，见图20。

结果显示，在这些肠组织中，DG-FIT显示出比FIT更强的绿色荧光，这表明DG-FIT能够更容易地穿过肠壁，迅速进入体循环，DG-FIT具有比FIT更好的口服生物利用度。

实施例7

将健康小鼠(C57BL/6)随机分为以下6组：

①PBS组；

②NAC(N-乙酰半胱氨酸)治疗组：200mg/kg；

③DG治疗组：750mg/kg；

④FIT治疗组：50mg/kg，用0.5wt％羧甲基纤维素钠水溶液作为分散溶剂；

⑤DG&FIT物理共混物治疗组：750mg/kg的DG和50mg/kg的FIT，用0.5wt％羧甲基纤维素钠水溶液作为分散溶剂；

⑥DG-FIT(药载比1:15)治疗组：50mg/kg(50mg是指DG-FIT中FIT的量)。

以上小鼠，每日定时(例如：8:00)灌胃给药以上药物(给另一组小鼠每日喂食生理盐水作为正常对照组)，连续给药7天(第7天给药之前12h禁食)。第7天给药后1h，腹腔注射对乙酰氨基酚(剂量400mg/kg，以生理盐水作为溶剂，浓度40mg/ml)。

(1)生化分析和水肿评价

注射对乙酰氨基酚后6h(开始有小鼠死亡)，从每组中随机选取12-16只小鼠处死，分离血清，测定谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)水平(AST和ALT是反映肝损伤严重程度的两个重要指标)，结果见图21和22。分离肝组织，用生理盐水冲洗，滤纸吸干多余水分，称重，测定肝重与体重的比值，用于评价肝脏的水肿程度，结果见图23。然后，每个肝组织被分成两部分：肝I和肝Ⅱ；其中，肝I一分为四，分别用于：谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和促炎性细胞因子水平(包括：白细胞介素IL-1β、白细胞介素IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α))的检测，肝Ⅱ用福尔马林固定。

结果显示，与正常对照组相比，PBS组的谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)水平猛增了数十倍(P<0.05)，同时表现为肝重与体重的比值升高；而DG-FIT治疗组(剂量：50mg/kg)的AST和ALT水平，远低于PBS组、DG治疗组、FIT治疗组、DG&FIT物理共混物治疗组的AST和ALT水平(P<0.05)，存在显著性差异，优于或基本相当于NAC治疗组(剂量：200mg/kg)、正常对照组的水平。

(2)组织氧化应激评价

检测谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)：

用试剂盒(碧云天生物技术，中国江苏)中提供的溶液均质，并根据试剂盒说明书测定GSH、SOD、MDA。GSH和SOD活性以U/mg(肝湿重)表示，MDA含量以nmol/mg(肝湿重)表示，结果见图24、图25和图26。

结果显示，与正常对照组相比，PBS组的GSH、SOD显著降低，同时MDA明显升高；而DG-FIT治疗组(剂量：50mg/kg)的GSH、SOD、MDA水平，与PBS组、DG治疗组、FIT治疗组、DG&FIT物理共混物治疗组的GSH、SOD、MDA水平相比，存在显著性差异(P<0.05)，优于或基本相当于NAC治疗组(剂量：200mg/kg)、正常对照组的水平。

(3)酶联免疫吸附试验

检测促炎性细胞因子水平：采用小鼠ELISA试剂盒(上海酶联生物技术有限公司)，结果见图27、图28和图29。

结果显示，与正常对照组相比，PBS组的IL-1β、IL-6、TNF-α水平有了较大幅度的升高；而DG-FIT治疗组(剂量：50mg/kg)的IL-1β、IL-6、TNF-α水平，与PBS组、DG治疗组、FIT治疗组、DG&FIT物理共混物治疗组的IL-1β、IL-6、TNF-α水平相比，存在显著性差异(P<0.05)，优于或基本相当于NAC治疗组(剂量：200mg/kg)、正常对照组的水平。

(4)组织学和细胞凋亡评价

注射对乙酰氨基酚后12h，从每组中随机选取6只处死，取胃、十二指肠、空肠、回肠等胃肠组织，以及心、肝、脾、肺、肾等器官，用福尔马林固定，作进一步组织学观察。福尔马林固定的组织器官切片，苏木精-伊红染色，进行组织病理学检查。采用免疫组织化学凋亡染色法(Tunel法，碧云天生物技术，中国江苏)，进行细胞凋亡评价，结果见图30和31。

结果显示，与正常对照组相比，PBS组的小鼠表现为肝水肿，肝脏结构明显紊乱，包括：出血、肝细胞坏死、大量炎性细胞浸润等，小叶中心严重坏死、出血，中央静脉周围凋亡细胞增多(图31)；而DG-FIT治疗组(剂量：50mg/kg)则没有明显的以上症状，未见有明显的炎症反应和细胞凋亡，这表明DG-FIT在对乙酰氨基酚过量致肝损伤的治疗评估中没有引起肠胃刺激和主要器官毒性。

(5)死亡率

每组的其他小鼠(12只)注射对乙酰氨基酚后，自由进食，将注射对乙酰氨基酚的时间记为0h，每12h记录一次小鼠的死亡率，持续72h，结果见表1。

表1注射对乙酰氨基酚72小时各实验组小鼠的存活率情况

结果显示，与PBS组、DG治疗组、FIT治疗组、DG&FIT物理共混物治疗组相比，DG-FIT组和NAC组的小鼠存活率都得到了显著提升。

当然，本发明还可以有其它多种实施方式，在不违背本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可以根据本发明作出各种相应的改变和/或变形，这些相应的改变和/或变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims

1.一种药物组合物，其特征在于，其包含：黄酮类化合物和药学上可接受的甘草酸盐；其中，所述的黄酮类化合物为非瑟酮或其药学上可接受的盐。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的黄酮类化合物与所述的甘草酸盐的重量比为1:2～50；优选的，所述的黄酮类化合物与所述的甘草酸盐的重量比为1:5～20；更优选的，所述的黄酮类化合物与所述的甘草酸盐的重量比为1:15～18。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的黄酮类化合物的包封率至少为80％；优选的，所述的黄酮类化合物的包封率≥90％或≥95％。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物满足下述条件i～v中的一个或两个以上：

i、所述的黄酮类化合物为非瑟酮；

iv、所述的黄酮类化合物与所述的甘草酸盐的摩尔比为1:0.6～15.9，优选为1:1.6～6.4，更优选为1:4.8～5.7；

v、所述的黄酮类化合物与所述的甘草酸盐的重量比为1:15；

5.根据权利要求1～4任意一项所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物是由包括以下步骤的方法制成：将所述的黄酮类化合物和所述的甘草酸盐一起分散或溶解于溶剂中，混匀，然后35～45℃旋转蒸发除去溶剂，即得；优选的，所述的溶剂为醇类溶剂，再优选为甲醇或乙醇。

6.根据权利要求1～4任意一项所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物是用于预防、治疗和/或缓解肝损伤的药物组合物；优选的，所述的肝损伤为药物性肝损伤或急性肝损伤；更优选的，所述的药物性肝损伤是由对乙酰氨基酚所引起的肝损伤；

或者，所述的药物组合物是用于降低血清转氨酶水平的药物组合物；优选的，所述的转氨酶为谷丙转氨酶和/或谷草转氨酶。

7.根据权利要求1～4任意一项所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的剂型为口服给药制剂、注射制剂、舌下给药制剂、颊给药制剂或透皮吸收制剂；

或者，

所述的药物组合物的剂型为汤剂、丸剂、散剂、膏剂、糊剂、膜剂、贴剂、贴膏剂、丹剂、针剂、酒剂、冲剂、口服液剂、片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂、喷雾剂、凝胶剂、糖浆剂、涂剂、搽剂、涂膜剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、植入剂、洗剂、冲洗剂、灌肠剂、合剂、缓释制剂、控释制剂、迟释制剂、靶向制剂或前体药物制剂；

优选的，

所述的药物组合物为溶液剂，其溶剂选自水、PBS缓冲液或0.5wt％羧甲基纤维素钠水溶液；和/或，所述药物组合物为包含所述的黄酮类化合物与所述的甘草酸盐的纳米胶束制剂。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的剂型为溶液剂，当所述的溶液剂中的黄酮类化合物浓度为1.0mg/mL时，所述的溶液剂满足下述条件①～③中的一个或两个以上：

①、所述溶液剂的胶束尺寸为50～150nm；优选为70～90nm；

②、所述溶液剂的多分散系数为≤0.7；优选为≤0.5或0.4；

③、所述溶液剂的zeta电位为-60mV～0mV；优选为-60mV～-40mV；

优选的，所述的溶液剂同时满足条件①～③。

9.权利要求1～8任意一项所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：将所述的黄酮类化合物和所述的甘草酸盐一起分散或溶解于溶剂中，混匀，然后35～45℃旋转蒸发除去溶剂，即得；优选的，所述的溶剂为醇类溶剂，再优选为甲醇或乙醇。

10.权利要求1～8任意一项所述的药物组合物在制备药物中的用途；

其中，

所述的药物是用于预防、治疗和/或缓解肝损伤的药物，优选的，所述的肝损伤为药物性肝损伤或急性肝损伤；更优选的，所述的药物性肝损伤是由对乙酰氨基酚所引起的肝损伤；

或者，所述的药物是用于降低血清转氨酶水平的药物；优选的，所述的转氨酶为谷丙转氨酶和/或谷草转氨酶。