CN117517546A - 一种2-溴吡啶有关物质分析方法 - Google Patents

一种2-溴吡啶有关物质分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种2‑溴吡啶有关物质分析方法。本方法采用反相液相色谱法实现了2‑溴吡啶、3‑溴吡啶、4‑溴吡啶三种位置异构体的有效分离，相比较于异构体分离通常采用的正相液相色谱法，本发明提供的方法更快速、简便，能将多个异构体杂质进行有效的分离，并准确定量它们的含量，使产品的质量得到有效的控制。

Description

一种2-溴吡啶有关物质分析方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种2-溴吡啶有关物质分析方法。
背景技术
2-溴吡啶，浅黄色油状液体，英文名称为2-Bromopyridine，化学名称为α-溴氮杂苯，分子式：C5H4BrN，分子量：158.00，结构式如式Ⅰ所示。
2-溴吡啶主要用于有机合成，是重要的甲基化剂，广泛作为化工、医药、农药、军工、染料、香料、橡胶等行业领域的重要中间体。在医药工业领域，其主要用于合成心脏病类药双异丙吡胺(磷酸丙吡胺)等。2-溴吡啶是我司生产上市售卖的马来酸氯苯那敏原料药的主要原料之一；在目前药品的注册审评形式下，国家对于药品监管的力度日益强化，药品质量的源头控制及过程控制引起了更为广泛的关注，故2-溴吡啶作为马来酸氯苯那敏原料药的源头，其质量的优劣对于提高马来酸氯苯那敏原料药的质量起着关键的作用。
2-溴吡啶的合成工艺如下：以2-氨基吡啶为原料，与亚硝酸钠、溴素、氢溴酸经过重氮化反应，得到2-溴吡啶氢溴酸盐，经氢氧化钠中和，用乙酸乙酯萃取，最后经蒸馏得到。
根据上述合成工艺，2-溴吡啶是由2-氨基吡啶经桑德迈尔溴代反应制得，但在实际反应过程中，可能会发生副反应，导致生成2-溴吡啶的取代基位置异构体杂质，即3-溴吡啶、4-溴吡啶，如以下合成路线所示。
故对2-溴吡啶生产过程中可能产生的取代基位置异构体杂质进行定量控制，进而对马来酸氯苯那敏原料药的质量起着关键的作用。
目前，国内外关于2-溴吡啶的研究主要多集中在其化学合成方法的研究方面，而其杂质的定量质量控制的研究鲜有报道，本发明旨在提供一种2-溴吡啶位置异构体的高效液相色谱检测方法，对2-溴吡啶中位置异构体杂质的含量进行定量控制，降低其被带入马来酸氯苯那敏原料药的风险，从而在源头上就为保障人民群众的用药安全提供更可靠的保障。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种2-溴吡啶有关物质分析方法。
本发明的技术方案如下：一种2-溴吡啶有关物质分析方法，采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以乙腈为流动相B，流动相A与流动相B的比例为86:14～90:10，其中流动相A的配置方法为：取磷酸二氢铵1.15g，加水稀释至1000ml，加三乙胺10ml，用磷酸调节pH至2.8～3.2，本分析方法采用等度洗脱。
在一些实施方案中，所述流动相的流速为1ml～1.5ml/min，优选为1.2ml/min。
在一些实施方案中，所述色谱柱的柱温为20～40℃，柱温优选为30℃。
在一些实施方案中，所述方法采用紫外检测器，且其检测波长为210nm～280nm；优选为265nm
在一些实施方案中，所述进样体积为10μl。
在一些典型的实施方案中，本发明提供了一种2-溴吡啶有关物质分析方法，包括以下步骤：
系统适用性溶液：精密称取2-溴吡啶样品，置量瓶中，加溶剂适量溶解，加30％过氧化氢溶液，于80℃水浴2小时，取出放冷至室温，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。
混合对照溶液：精密称取2-溴吡啶对照品、3-溴吡啶对照品、4-溴吡啶对照品适量，加溶剂溶解并稀释制成混合对照溶液。
供试品溶液：取2-溴吡啶样品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成，作为供试品溶液。
对照溶液：精密量取供试品溶液适量，置量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
色谱分析：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以乙腈为流动相B，，其中流动相A的配置方法为：取磷酸二氢铵1.15g，加水稀释至1000ml，加三乙胺10ml，用磷酸调节pH至3.0，采用等度洗脱，流动相A与流动相B的比例为88:12，柱温为30℃，检测波长为265nm，进样体积为10μl，流速为1.2ml/min；精密量取供试品溶液与对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，采用外标法进行定量。
在一些典型的实施方案中，所述混合对照溶液中每1ml中含2-溴吡啶1mg、3-溴吡啶3μg、4-溴吡啶3μg的溶液。
在一些典型的实施方案中，所述供试品溶液中每1ml中含1mg2-溴吡啶的溶液。
在一些典型的实施方案中，所述溶剂为流动相A：流动相B＝88:12。
本发明的有益效果：针对现有研究中的不足，本发明的目的是提供一种2-溴吡啶位置异构体的高效液相色谱检测方法，其优点是：采用反相液相色谱法即实现了2-溴吡啶、3-溴吡啶、4-溴吡啶三种位置异构体的有效分离，相比较于异构体分离通常采用的正相液相色谱法，本发明提供的方法更快速、简便，能将多个异构体杂质进行有效的分离，并准确定量它们的含量，使产品的质量得到有效的控制。
附图说明
图1：系统适用性溶液的典型色谱图
图2：混合对照溶液的典型色谱图
图3：供试品溶液的典型色谱图
图4：对照溶液的典型色谱图
图5：有关物质-2-溴吡啶和已知杂质紫外扫描图
图6：2-溴吡啶标准曲线图
图7：3-溴吡啶标准曲线图
图8：4-溴吡啶标准曲线图
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业的本领域技术人员更全面地理解本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1样品检测方法
A、高效液相色谱法分析
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB-C18100×4.6mm3.5μm或效能相当的色谱柱)；
流动相A：磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢铵1.15g，加水稀释至1000ml，加三乙胺10ml，用磷酸调节pH至3.0)，流动相B：乙腈，流动相A与流动相B的比例为88:12；
柱温：30℃；
检测波长：265nm；
进样体积：10μl；
流速：1.2ml/min；
溶剂：流动相A：流动相B＝88:12
B、系统适用性考察
系统适用性溶液：取2-溴吡啶样品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂适量溶解，加30％过氧化氢溶液2ml，于80℃水浴2小时，取出放冷至室温，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。
混合对照溶液：精密称取2-溴吡啶对照品、3-溴吡啶对照品、4-溴吡啶对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中含2-溴吡啶1mg、3-溴吡啶3μg、4-溴吡啶3μg的溶液，作为混合对照溶液。
系统适用性溶液和混合对照溶液色谱图中，2-溴吡啶峰与相邻杂质峰之间的分离度应不小于1.5，理论塔板数按2-溴吡啶峰计算应不低于5000。
C、样品检测的实施
供试品溶液：取2-溴吡啶样品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液，作为供试品溶液。
对照溶液：精密量取供试品溶液100μl，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
精密量取供试品溶液与对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
实施例2检测方法验证
对此方法检测2-溴吡啶位置异构体的效果进行验证，验证效果如下：
1.检测波长的选择
分别取2-溴吡啶对照品、3-溴吡啶对照品、4-溴吡啶对照品和2-溴吡啶样品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成适宜浓度的供试品溶液，照紫外-可见分光光度法，于190～400nm范围内进行紫外扫描，结果如下表1和图5：
表1：检测波长的选择试验结果
名称 最大吸收波长(nm)
2-溴吡啶 264.80、211.80、199.40
3-溴吡啶 268.40、191.80
4-溴吡啶 193.40、240.60、256.60
2-溴吡啶样品 264.80、212.00、199.40
结论：2-溴吡啶和其位置异构体杂质在265nm波长附近均有较大吸收，参照上述紫外扫描结果，选择265nm作为本品位置异构体杂质检测的检测波长。
2.专属性
3-溴吡啶母液(1mg/ml)：精密称取3-溴吡啶对照品约10mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
4-溴吡啶母液(1mg/ml)：精密称取4-溴吡啶对照品约10mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2-溴吡啶母液(1mg/ml)：精密称取2-溴吡啶对照品约10mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
3-溴吡啶定位溶液(3μg/ml)：精密量取3-溴吡啶母液0.3ml，加流动相稀释至100ml，摇匀，即得。
4-溴吡啶定位溶液(3μg/ml)：精密量取4-溴吡啶母液0.3ml，加流动相稀释至100ml，摇匀，即得。
混合对照溶液：精密称取2-溴吡啶对照品约10mg，置10ml量瓶中，加入3-溴吡啶母液、4-溴吡啶母液各30μl，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
系统适用性溶液：取本品约10mg，置10ml量瓶中，精密称定，加溶剂适量溶解，加入2ml 30％的过氧化氢溶液，于80℃水浴2小时，取出放冷至室温，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。氧化破坏空白溶液：取2ml 30％的过氧化氢溶液，置10ml量瓶中，加溶剂适量，于80℃水浴2小时，取出放冷至室温，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为氧化破坏空白溶液。
供试品溶液：精密称取本品10mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
对照溶液：精密量取供试品溶液100μl，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
分别精密量取上述定位溶液、混合对照溶液、系统适用性溶液、供试品溶液和对照溶液各10μl，照上述色谱条件操作，记录色谱图。结果如下表2：
表2：杂质定位及分离度试验结果
结论：各组分出峰顺序依次为4-溴吡啶、2-溴吡啶、3-溴吡啶；系统适用性溶液中，2-溴吡啶与相邻杂质之间的分离度大于1.5；混合对照溶液中4-溴吡啶、3-溴吡啶与主峰之间的分离度均大于1.5，主峰理论塔板数大于5000，符合要求；空白溶剂不影响样品有关物质的检测；在供试品溶液中，检出的杂质峰理论塔板数均较高，并具有较好的分离度，说明本法的专属性较好。
3.检测限、定量限
取2-溴吡啶与3-溴吡啶、4-溴吡啶对照品各适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成一定浓度的供试品溶液，并逐步稀释至信噪比(S/N)为10时，即为定量限；信噪比(S/N)为3时，即为检测限。平行配制六份定量限溶液，照上述色谱条件操作，记录色谱图。结果如下表3～5。
表3：定量限试验结果
名称 浓度μg/ml 检测限(ng) 相对于供试品溶液 峰面积 S/N
4-溴吡啶 0.1048 1.05 0.01 0.015 10.4
2-溴吡啶 0.1103 1.10 0.01 0.021 9.0
3-溴吡啶 0.2398 2.40 0.02 0.028 11.0
表4：检测限试验结果
名称 浓度μg/ml 检测限(ng) 相对于供试品溶液 峰面积 S/N
4-溴吡啶 0.05242 0.52 0.005 0.009 5.3
2-溴吡啶 0.05517 0.55 0.01 0.009 4.9
3-溴吡啶 0.1199 1.20 0.01 0.020 6.3
表5：定量限精密度试验结果
结论：2-溴吡啶、3-溴吡啶、4-溴吡啶定量限分别为1.10ng、2.40ng、1.05ng，浓度均低于供试品浓度(1mg/ml)的0.05％；检测限分别为0.55ng、1.20ng、0.52ng，浓度均低于供试品浓度(1mg/ml)的0.02％。说明本法选择的供试品浓度1mg/ml合适，6份定量限溶液中各组分峰面积RSD值均小于10％，符合验证要求。
4.线性与范围
线性母液：取2-溴吡啶母液、3-溴吡啶母液、4-溴吡啶母液，精密移取2-溴吡啶母液、3-溴吡啶母液、4-溴吡啶母液各3.0ml至50ml，用溶剂定容到刻度，摇匀，即得。
线性溶液1：精密量取线性母液200μl，置20ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
线性溶液2：精密量取线性母液500μl，置20ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
线性溶液3：精密量取线性母液800μl，置20ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
线性溶液4：精密量取线性母液1000μl，置20ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
线性溶液5：精密量取线性母液750μl，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
分别精密量取以上各线性溶液及定量限溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，做线性回归，结果见表6～表8。
表6：2-溴吡啶标准曲线
结论：2-溴吡啶准曲线方程为y＝0.1848x+0.0011，回归系数r＝0.9999，在0.1103μg/ml至4.965μg/ml浓度范围内线性关系良好。
表7：3-溴吡啶标准曲线
结论：3-溴吡啶标准曲线方程为y＝0.1326x-0.0004，回归系数r＝0.9999，在0.2398μg/ml至5.395μg/ml浓度范围内线性关系良好。
表8：4-溴吡啶标准曲线
结论：4-溴吡啶标准曲线方程为y＝0.1404x+0.0015，回归系数r＝0.9999，在0.1048μg/ml至4.718μg/ml浓度范围内线性关系良好。
5.校正因子
不同实验人员在不同实验时间条件下，配制线性溶液与定量限溶液，并在不同仪器上，进行校正因子考察。结合线性与范围试验结果见表9。
表9：杂质的校正因子
结论：3-溴吡啶、4-溴吡啶的校正因子均为1.3。
6.系统精密度
精密量取上述混合对照溶液10μl，照上述色谱条件操作，连续进样6次，记录色谱图，试验结果如下表10。
表10：系统精密度试验结果
结论：在混合对照溶液的色谱图中，连续进6针，2-溴吡啶与其位置异构体杂质保留时间的RSD值均小于1.0％，峰面积的RSD值均小于2.0％，说明系统精密度良好。
7.重复性
分别精密量取上述系统适用性溶液、混合对照溶液、供试品溶液和对照溶液各10μl，照上述色谱条件平行操作6次，记录色谱图，结果如下表11。
表11：重复性试验结果
结论：6份供试品溶液杂质个数和主峰纯度基本一致，2-溴吡啶与其位置异构体杂质、最大未知单杂和总杂含量无明显差异，说明本检测方法重复性良好。
8.中间精密度
由不同实验人员于不同实验时间，在不同实验仪器上，照上述色谱条件检测供试品溶液中杂质含量，并计算RSD值，应符合规定。结果见表12～13。
表12：中间精密度—混合对照试验结果
表13：中间精密度—供试品溶液试验结果
结论：不同人员于不同日期分别在两台HPLC仪器上检测的12份供试品中，主峰纯度及杂质个数基本一致，按本品拟定的定量方法计算杂质含量，2-溴吡啶与其位置异构体杂质、最大未知单杂和总杂含量无明显差异，说明本检测方法中间精密度良好。
9.准确度试验
杂质混合溶液：精密量取3-溴吡啶、4-溴吡啶母液各3ml，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质对照溶液：精密量取杂质混合溶液1ml，置20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，即得。
回收率溶液(10％)：取本品20mg，精密称定，置20ml量瓶中，加适量溶剂溶解，加入杂质混合溶液0.1ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。
回收率溶液(80％)：取本品20mg，精密称定，置20ml量瓶中，加适量溶剂溶解，加入杂质混合溶液0.8ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。
回收率溶液(100％)：取本品20mg，精密称定，置20ml量瓶中，加适量溶剂溶解，加入杂质混合溶液1.0ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。
回收率溶液(120％)：取本品10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加适量溶剂溶解，加入杂质混合溶液0.6ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。
供试品溶液：取本品10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
对照溶液：分别精密量取上述回收率溶液和供试品溶液各100μl，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
精密量取上述杂质对照溶液、回收率溶液、供试品溶液与对照溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按自身对照法，以峰面积计算回收率。试验结果见下表14～15。
表14：3-溴吡啶回收率试验结果
表15：4-溴吡啶回收率试验结果
10.方法耐用性
本发明的高效液相色谱条件如下：
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB-C18100×4.6mm3.5μm或效能相当的色谱柱)；
流动相A：磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢铵1.15g，加水稀释至1000ml，加三乙胺10ml，用磷酸调节pH至3.0)，流动相B：乙腈，流动相A与流动相B的比例为88:12；
柱温：30℃；
检测波长：265nm；
进样体积：10μl；
流速：1.2ml/min；
溶剂：流动相A：流动相B＝88:12
对上述色谱条件中的流速、有机相比例、缓冲液pH值等参数进行改变，考察这些色谱参数的改变对本发明所达到的色谱效果的影响，并根据考察效果在本发明中对色谱条件的耐用范围进行规定，色谱条件改变的考察范围见下表16。
表16：色谱条件参数改变范围
混合对照溶液：精密称取2-溴吡啶对照品约10mg，置10ml量瓶中，加入3-溴吡啶母液、4-溴吡啶母液各30μl，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
精密量取上述混合对照溶液10μl，照上述各色谱条件操作，记录色谱图。结果如下表17。
表17：混合对照溶液耐用性考察结果
结论：改变色谱条件中的流速±0.2ml/min、流动相比例中流动相A±2％、缓冲液pH值±0.2，混合对照溶液中，2-溴吡啶与其位置异构体杂质之间的分离度良好，理论板数符合要求；但改变色谱条件中的流速±0.5ml/min、流动相比例中流动相A±5％、缓冲液pH值±0.5，混合对照溶液中，2-溴吡啶与其位置异构体杂质之间的分离度均小于1.5，达不到基线分离，不满足2-溴吡啶与其位置异构体杂质的准确定量。

Claims (9)

1.一种2-溴吡啶有关物质分析方法，采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以乙腈为流动相B，流动相A与流动相B的比例为86:14～90:10，其中流动相A的配置方法为：取磷酸二氢铵1.15g，加水稀释至1000ml，加三乙胺10ml，用磷酸调节pH至2.8～3.2，本分析方法采用等度洗脱。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述流动相的流速为1ml～1.5ml/min，优选为1.0～1.2ml/min。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为20～40℃，柱温优选为30℃。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述方法采用紫外检测器，且其检测波长为210nm～280nm；优选为265nm。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述进样体积为10μl。
6.一种2-溴吡啶有关物质分析方法，包括以下步骤：
系统适用性溶液：精密称取2-溴吡啶样品，置量瓶中，加溶剂适量溶解，加30％过氧化氢溶液，于80℃水浴2小时，取出放冷至室温，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。
混合对照溶液：精密称取2-溴吡啶对照品、3-溴吡啶对照品、4-溴吡啶对照品适量，加溶剂溶解并稀释制成混合对照溶液。
供试品溶液：取2-溴吡啶样品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成，作为供试品溶液。
对照溶液：精密量取供试品溶液适量，置量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
色谱分析：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以乙腈为流动相B，，其中流动相A的配置方法为：取磷酸二氢铵1.15g，加水稀释至1000ml，加三乙胺10ml，用磷酸调节pH至3.0，采用等度洗脱，流动相A与流动相B的比例为88:12，柱温为30℃，检测波长为265nm，进样体积为10μl，流速为1.2ml/min；精密量取供试品溶液与对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，采用外标法进行定量。
7.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述混合对照溶液中每1ml中含2-溴吡啶1mg、3-溴吡啶3μg、4-溴吡啶3μg的溶液。
8.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述供试品溶液中每1ml中含1mg 2-溴吡啶的溶液。
9.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述溶剂为流动相A：流动相B＝88:12。
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