CN117503912A - 一种含干细胞外泌体的组合物及其在制备具有治疗肺损伤作用的药物中的应用 - Google Patents

一种含干细胞外泌体的组合物及其在制备具有治疗肺损伤作用的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含干细胞外泌体的组合物及其在制备具有治疗肺损伤作用的药物中的应用，所述含干细胞外泌体的组合物按重量份计包括：0.25‑0.6份脐带间充质干细胞外泌体、4‑7份虫草提取物、0.01‑0.04份依克多因、0.15‑1.8份甘油、0.08‑0.2份蜂蜜、0.05‑0.3份复合维生素、0.03‑0.12份亮氨酸、0.03‑0.12份异亮氨酸、0.03‑0.12份缬氨酸、0.28‑0.7份甘露聚糖肽、0.15‑0.26份丙二醇海藻酸钠、0.05‑0.18份羧甲基纤维素钠、25‑35份去离子水。干细胞外泌体可以通过转移蛋白质、脂质及核酸来影响靶细胞的活动，同虫草提取物、聚糖肽甘露等起到抗炎、修复、保持肺细胞活力的作用，协同其他组分为肺部提供所需营养，有效治疗肺损伤。

Description

一种含干细胞外泌体的组合物及其在制备具有治疗肺损伤作 用的药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种含干细胞外泌体的组合物及其在制备具有治疗肺损伤作用的药物中的应用。
背景技术
肺是人体唯一的呼吸器官，人体通过肺与外界保持气体的流通和交换，以维持人体的基本生命，对人体体内的水分、温度、酸碱平衡也起到了维持稳定的作用。肺损伤是直接或间接的因素导致肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成的弥漫性肺间质及肺泡水肿，由于多发性损伤的总面积改变和激发反应性改变，可能会导致较严重、甚至危及生命的并发症。
干细胞外泌体是膜衍生的纳米级的囊泡，携带着来自间充质干细胞的某些蛋白质、脂质、DNA及RNA等生物活性物质，可以通过抗炎、抗细胞凋亡、促进细胞再生等共同机制对肺损伤发挥作用。
研究表明，间充质干细胞外泌体在急性肺损伤中具有保护作用，通过旁分泌多种细胞因子和生长因子来促进受损肺组织的修复，治疗效果良好，基于此，如何制备一种含干细胞外泌体组合物的药物用于治疗肺损伤成为目前研究的一个方向。
发明内容
本发明首先提供一种含干细胞外泌体的组合物及其在制备具有治疗肺损伤作用的药物中的应用，所述组合物能够协同为肺提供所需营养，促进肺部细胞再生，有效治疗肺损伤。
本发明解决技术问题采用如下技术方案：
本发明提供一种含干细胞外泌体的组合物，其特征在于，所述含干细胞外泌体的组合物按重量份计包括：0.25-0.6份脐带间充质干细胞外泌体、4-7份虫草提取物、0.01-0.04份依克多因、0.15-1.8份甘油、0.08-0.2份蜂蜜、0.05-0.3份复合维生素、0.03-0.12份亮氨酸、0.03-0.12份异亮氨酸、0.03-0.12份缬氨酸、0.28-0.7份甘露聚糖肽、0.15-0.26份丙二醇海藻酸钠、0.05-0.18份羧甲基纤维素钠、25-35份去离子水。
优选地，所述含干细胞外泌体的组合物按重量份计包括：0.4-0.45份脐带间充质干细胞外泌体、5-6份虫草提取物、0.02-0.03份依克多因、0.9-1.1份甘油、0.14-0.16份蜂蜜、0.15-0.2份复合维生素、0.05-0.1份亮氨酸、0.05-0.1份异亮氨酸、0.05-0.1份缬氨酸、0.45-0.55份甘露聚糖肽、0.18-0.23份丙二醇海藻酸钠、0.09-0.14份羧甲基纤维素钠、28-32份去离子水。
优选地，所述含干细胞外泌体的组合物按重量份计包括：0.42份脐带间充质干细胞外泌体、5.5份虫草提取物、0.025份依克多因、1份甘油、0.15份蜂蜜、0.18份复合维生素、0.08份亮氨酸、0.08份异亮氨酸、0.08份缬氨酸、0.5份甘露聚糖肽、0.2份丙二醇海藻酸钠、0.12份羧甲基纤维素钠、30份去离子水。
优选地，所述脐带间充质干细胞外泌体的制备方法为：
S1、取脐带组织，放入PBS缓冲液中清洗3次，每次10min，去除动静脉得到沃顿胶，将沃尔顿胶剪碎成3-5mm的组织块，用去离子水冲洗15min,再用PBS缓冲液清洗4次，每次5min，得到组织块；
S2、将组织块和复合酶溶液按照重量比1:（8-10）混合，反应30-60min，得到第一物料；
S3、将第一物料和胶原酶I溶液按照重量比1：（0.2-0.28）混合，反应15-30min，得到第二物料；
S4、将第二物料置于800-1200r/min条件下离心10-30min，过0.3μm无菌滤膜，得到细胞沉淀，用PBS缓冲液洗涤3次；
S5、用平衡盐缓冲溶液洗涤细胞沉淀3次，再用2倍体积的平衡盐缓冲液重悬细胞，利用密度梯度离心法纯化细胞悬液，得到脐带间充质元代干细胞；
S6、将脐带间充质元代干细胞以1×10个/ml的密度接种至培养基中，放置于培养箱中培养3-5d，传代次数控制在P10以内，待细胞融合率达到80-90%时，收集培养液上清液；
S7、将培养液上清液于4℃、1200r/min条件下离心10-30min，收集上清液，超滤浓缩去除小分子后，过0.25μm无菌滤膜过滤除菌，得到脐带间充质干细胞外泌体。
作为一种优选方案，所述的PBS缓冲液包含1-3wt%的青霉素和2-2.5wt%的硫酸链霉素；所述的复合酶溶液由弹性蛋白酶和中性蛋白酶按照重量比1：（0.25-0.3）组成；所述的培养基为含8-10wt%FBS的DMEM培养基；所述的培养箱培养条件为35-39℃、4.5-5.5%CO2饱和湿度。
优选地，所述虫草提取物的制备方法为：
S21、将虫草洗净，干燥，粉碎至50-100目，得到虫草粉末；
S22、将虫草粉末加入酶解液中，加热至40-50℃保持1-3h，得到混合液A；
S23、往混合液A中加无水乙醇，将混合液溶液配成70-90%乙醇溶液，100-300W、40-50℃超声处理10-30min，得到混合液B;
S24、将混合液B在45℃下回流提取1-3h，提取3次后合并提取液，在25℃、9000r/min下离心15min，取上清液，将上清液进行超滤得到滤液；
S25、将滤液通入填有大孔树脂的吸附柱中，洗脱速度为1.5-2.5BV/h，用2倍树脂柱体积的去离子水以1-3BV/h、1.5倍树脂柱体积的50wt%乙醇溶液以2-3BV/h的流速冲洗吸附柱，收集乙醇溶液，干燥，即得虫草提取物。
作为一种优选方案，所述的虫草粉末与酶解液的重量比为1：（7-12）；所述的酶解液由2-5份纤维素酶、0.8-2份果胶酶、0.5-1.5份十六烷基三甲基溴化铵、0.08-0.15份柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和15-30份去离子水组成；所述的超滤采用截留分子量为50-100KD的超滤膜；所述的大孔吸附树脂为HPD-100。
优选地，所述复合维生素由维生素A、维生素B、维生素C、维生素D按照重量比3:1:2:0.5组成。
优选地，所述含干细胞外泌体的组合物的制备方法为：
S31、将甘油、复合维生素、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘露聚糖肽、丙二醇海藻酸钠、羧甲基纤维素钠溶于去离子水后，45℃、120-240rmp下搅拌45-75min，使其完全溶解，得到混合物A;
S32、将脐带间充质干细胞外泌体、虫草提取物加入到混合物A中，40℃、80-150rmp搅拌10-30min，得到混合物B;
S33、将混合物B在37℃下回流1-2h，过滤后浓缩至相对密度为1.5-2.5，冻干得到含干细胞外泌体的组合物。
本发明还提供了一种含干细胞外泌体的组合物在制备具有治疗肺损伤作用的药物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明所述的一种含干细胞外泌体的组合物，包含复合维生素、氨基酸等组分，干细胞外泌体可以通过转移蛋白质、脂质及核酸来影响靶细胞的活动，同虫草提取物、聚糖肽甘露等起到抗炎、修复、保持肺细胞活力的作用，各组分协同增益，为肺部提供正常生理活动所需的物质和能量，有效治疗肺损伤。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1.
本实施例的一种含干细胞外泌体的组合物，所述含干细胞外泌体的组合物按重量份计包括：0.25份脐带间充质干细胞外泌体、4份虫草提取物、0.01份依克多因、0.15份甘油、0.08份蜂蜜、0.05份复合维生素、0.03份亮氨酸、0.03份异亮氨酸、0.03份缬氨酸、0.28份甘露聚糖肽、0.15份丙二醇海藻酸钠、0.05份羧甲基纤维素钠、25份去离子水。
本实施例的脐带间充质干细胞外泌体的制备方法为：
S1、取脐带组织，放入PBS缓冲液中清洗3次，每次10min，去除动静脉得到沃顿胶，将沃尔顿胶剪碎成3mm的组织块，用去离子水冲洗15min,再用PBS缓冲液清洗4次，每次5min，得到组织块；
S2、将组织块和复合酶溶液按照重量比1:8混合，其中复合酶溶液由弹性蛋白酶和中性蛋白酶按照重量比1:0.25组成，反应30min，得到第一物料；
S3、将第一物料和胶原酶I溶液按照重量比1：0.2混合，反应15min，得到第二物料；
S4、将第二物料置于800r/min条件下离心10min，过0.3μm无菌滤膜，得到细胞沉淀，用PBS缓冲液洗涤3次；
S5、用平衡盐缓冲溶液洗涤细胞沉淀3次，再用2倍体积的平衡盐缓冲液重悬细胞，利用密度梯度离心法纯化细胞悬液，得到脐带间充质元代干细胞；
S6、将脐带间充质元代干细胞以1×10个/ml的密度接种至培养基中，放置于培养箱中，于35℃、4.5%CO2饱和湿度条件下培养3d，传代次数控制在P10以内，待细胞融合率达到80%时，收集培养液上清液；
S7、将培养液上清液于4℃、1200r/min条件下离心10min，收集上清液，超滤浓缩去除小分子后，过0.25μm无菌滤膜过滤除菌，得到脐带间充质干细胞外泌体。
本实施例的PBS缓冲液包含1wt%的青霉素和2wt%的硫酸链霉素；本实施例的培养基为含8wt%FBS的DMEM培养基。
本实施例的虫草提取物的制备方法为：
S21、将虫草洗净，干燥，粉碎至50目，得到虫草粉末；
S22、将虫草粉末加入酶解液中，加热至40℃保持1h，得到混合液A；
S23、往混合液A中加无水乙醇，将混合液溶液配成70%乙醇溶液，100W、40℃超声处理10min，得到混合液B;
S24、将混合液B在45℃下回流提取1h，提取3次后合并提取液，在25℃、9000r/min下离心15min，取上清液，将上清液经过截留分子量为50KD的超滤摸，得到滤液；
S25、将滤液通入填有大孔树脂的吸附柱中，洗脱速度为1.5BV/h，用2倍树脂柱体积的去离子水以1BV/h、1.5倍树脂柱体积的50wt%乙醇溶液以2BV/h的流速冲洗吸附柱，收集乙醇溶液，干燥，即得虫草提取物。
本实施例的虫草粉末与酶解液的重量比为1：7；所述的酶解液由2份纤维素酶、0.8份果胶酶、0.5份十六烷基三甲基溴化铵、0.08份柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和15份去离子水组成；本实施例的大孔吸附树脂为HPD-100。
本实施例的复合维生素由维生素A、维生素B、维生素C、维生素D按照重量比3:1:2:0.5组成。
本实施例的含干细胞外泌体的组合物的制备方法为：
S31、将甘油、复合维生素、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘露聚糖肽、丙二醇海藻酸钠、羧甲基纤维素钠溶于去离子水后，45℃、120rmp下搅拌45min，使其完全溶解，得到混合物A;
S32、将脐带间充质干细胞外泌体、虫草提取物加入到混合物A中，40℃、80rmp搅拌10min，得到混合物B;
S33、将混合物B在37℃下回流1h，过滤后浓缩至相对密度为1.5，冻干得到含干细胞外泌体的组合物。
实施例2.
本实施例的一种含干细胞外泌体的组合物，所述含干细胞外泌体的组合物按重量份计包括：0.6份脐带间充质干细胞外泌体、7份虫草提取物、0.04份依克多因、1.8份甘油、0.2份蜂蜜、0.3份复合维生素、0.12份亮氨酸、0.12份异亮氨酸、0.12份缬氨酸、0.7份甘露聚糖肽、0.26份丙二醇海藻酸钠、0.18份羧甲基纤维素钠、35份去离子水。
本实施例的脐带间充质干细胞外泌体的制备方法为：
S1、取脐带组织，放入PBS缓冲液中清洗3次，每次10min，去除动静脉得到沃顿胶，将沃尔顿胶剪碎成5mm的组织块，用去离子水冲洗15min,再用PBS缓冲液清洗4次，每次5min，得到组织块；
S2、将组织块和复合酶溶液按照重量比1:10混合，其中复合酶溶液由弹性蛋白酶和中性蛋白酶按照重量比1:0.3组成，反应60min，得到第一物料；
S3、将第一物料和胶原酶I溶液按照重量比1：0.28混合，反应30min，得到第二物料；
S4、将第二物料置于1200r/min条件下离心30min，过0.3μm无菌滤膜，得到细胞沉淀，用PBS缓冲液洗涤3次；
S5、用平衡盐缓冲溶液洗涤细胞沉淀3次，再用2倍体积的平衡盐缓冲液重悬细胞，利用密度梯度离心法纯化细胞悬液，得到脐带间充质元代干细胞；
S6、将脐带间充质元代干细胞以1×10个/ml的密度接种至培养基中，放置于培养箱中，于39℃、5.5%CO2饱和湿度条件下培养5d，传代次数控制在P10以内，待细胞融合率达到90%时，收集培养液上清液；
S7、将培养液上清液于4℃、1200r/min条件下离心10min，收集上清液，超滤浓缩去除小分子后，过0.25μm无菌滤膜过滤除菌，得到脐带间充质干细胞外泌体。
本实施例的PBS缓冲液包含3wt%的青霉素和2.5wt%的硫酸链霉素；本实施例的培养基为含10wt%FBS的DMEM培养基。
本实施例的虫草提取物的制备方法为：
S21、将虫草洗净，干燥，粉碎至100目，得到虫草粉末；
S22、将虫草粉末加入酶解液中，加热至50℃保持3h，得到混合液A；
S23、往混合液A中加无水乙醇，将混合液溶液配成90%乙醇溶液，300W、50℃超声处理30min，得到混合液B;
S24、将混合液B在45℃下回流提取3h，提取3次后合并提取液，在25℃、9000r/min下离心15min，取上清液，将上清液经过截留分子量为100KD的超滤摸，得到滤液；
S25、将滤液通入填有大孔树脂的吸附柱中，洗脱速度为2.5BV/h，用2倍树脂柱体积的去离子水以3BV/h、1.5倍树脂柱体积的50wt%乙醇溶液以3BV/h的流速冲洗吸附柱，收集乙醇溶液，干燥，即得虫草提取物。
本实施例的虫草粉末与酶解液的重量比为1：12；所述的酶解液由5份纤维素酶、2份果胶酶、1.5份十六烷基三甲基溴化铵、0.15份柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和30份去离子水组成；本实施例的大孔吸附树脂为HPD-100。
本实施例的复合维生素由维生素A、维生素B、维生素C、维生素D按照重量比3:1:2:0.5组成。
本实施例的含干细胞外泌体的组合物的制备方法为：
S31、将甘油、复合维生素、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘露聚糖肽、丙二醇海藻酸钠、羧甲基纤维素钠溶于去离子水后，45℃、240rmp下搅拌75min，使其完全溶解，得到混合物A;
S32、将脐带间充质干细胞外泌体、虫草提取物加入到混合物A中，40℃、150rmp搅拌30min，得到混合物B;
S33、将混合物B在37℃下回流2h，过滤后浓缩至相对密度为2.5，冻干得到含干细胞外泌体的组合物。
实施例3.
本实施例的一种含干细胞外泌体的组合物，所述含干细胞外泌体的组合物按重量份计包括：0.42份脐带间充质干细胞外泌体、5.5份虫草提取物、0.025份依克多因、1份甘油、0.15份蜂蜜、0.18份复合维生素、0.08份亮氨酸、0.08份异亮氨酸、0.08份缬氨酸、0.5份甘露聚糖肽、0.2份丙二醇海藻酸钠、0.12份羧甲基纤维素钠、30份去离子水。
本实施例的脐带间充质干细胞外泌体的制备方法为：
S1、取脐带组织，放入PBS缓冲液中清洗3次，每次10min，去除动静脉得到沃顿胶，将沃尔顿胶剪碎成4mm的组织块，用去离子水冲洗15min,再用PBS缓冲液清洗4次，每次5min，得到组织块；
S2、将组织块和复合酶溶液按照重量比1:9混合，其中复合酶溶液由弹性蛋白酶和中性蛋白酶按照重量比1:0.27组成，反应45min，得到第一物料；
S3、将第一物料和胶原酶I溶液按照重量比1：0.24混合，反应30min，得到第二物料；
S4、将第二物料置于1000r/min条件下离心20min，过0.3μm无菌滤膜，得到细胞沉淀，用PBS缓冲液洗涤3次；
S5、用平衡盐缓冲溶液洗涤细胞沉淀3次，再用2倍体积的平衡盐缓冲液重悬细胞，利用密度梯度离心法纯化细胞悬液，得到脐带间充质元代干细胞；
S6、将脐带间充质元代干细胞以1×10个/ml的密度接种至培养基中，放置于培养箱中，于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养4d，传代次数控制在P10以内，待细胞融合率达到85%时，收集培养液上清液；
S7、将培养液上清液于4℃、1200r/min条件下离心20min，收集上清液，超滤浓缩去除小分子后，过0.25μm无菌滤膜过滤除菌，得到脐带间充质干细胞外泌体。
本实施例的PBS缓冲液包含2wt%的青霉素和2.2wt%的硫酸链霉素；本实施例的培养基为含9wt%FBS的DMEM培养基。
本实施例的虫草提取物的制备方法为：
S21、将虫草洗净，干燥，粉碎至70目，得到虫草粉末；
S22、将虫草粉末加入酶解液中，加热至45℃保持2h，得到混合液A；
S23、往混合液A中加无水乙醇，将混合液溶液配成80%乙醇溶液，200W、45℃超声处理20min，得到混合液B;
S24、将混合液B在45℃下回流提取2h，提取3次后合并提取液，在25℃、9000r/min下离心15min，取上清液，将上清液经过截留分子量为50KD的超滤摸，得到滤液；
S25、将滤液通入填有大孔树脂的吸附柱中，洗脱速度为2BV/h，用2倍树脂柱体积的去离子水以2BV/h、1.5倍树脂柱体积的50wt%乙醇溶液以2.5BV/h的流速冲洗吸附柱，收集乙醇溶液，干燥，即得虫草提取物。
本实施例的虫草粉末与酶解液的重量比为1：10；所述的酶解液由3份纤维素酶、1.4份果胶酶、1份十六烷基三甲基溴化铵、0.12份柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和22份去离子水组成；本实施例的大孔吸附树脂为HPD-100。
本实施例的复合维生素由维生素A、维生素B、维生素C、维生素D按照重量比3:1:2:0.5组成。
本实施例的含干细胞外泌体的组合物的制备方法为：
S31、将甘油、复合维生素、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘露聚糖肽、丙二醇海藻酸钠、羧甲基纤维素钠溶于去离子水后，45℃、180rmp下搅拌60min，使其完全溶解，得到混合物A;
S32、将脐带间充质干细胞外泌体、虫草提取物加入到混合物A中，40℃、120rmp搅拌20min，得到混合物B;
S33、将混合物B在37℃下回流1.5h，过滤后浓缩至相对密度为2，冻干得到含干细胞外泌体的组合物。
对比例1.
与实施例3不同的是不含脐带间充质干细胞外泌体。
对比例2.
与实施例3不同的是不含虫草提取物。
对比例3.
与实施例3不同的是虫草提取物的制备方法不同，为：
S21、将虫草洗净，干燥，粉碎至70目，得到虫草粉末；
S22、将虫草粉末与80%乙醇溶液按照重量比1:10混合后，200W、45℃超声处理20min，得到混合液B;
S24、将混合液B在45℃下回流提取2h，提取3次后合并提取液，在25℃、9000r/min下离心15min，取上清液，将上清液经过截留分子量为50KD的超滤摸，得到滤液；
S25、将滤液通入填有大孔树脂的吸附柱中，洗脱速度为2BV/h，用2倍树脂柱体积的去离子水以2BV/h、1.5倍树脂柱体积的50wt%乙醇溶液以2.5BV/h的流速冲洗吸附柱，收集乙醇溶液，干燥，即得虫草提取物。
对比例4.
与实施例3不同的是虫草提取物的制备方法不同，为：
S21、将虫草洗净，干燥，粉碎至70目，得到虫草粉末；
S22、将虫草粉末加入酶解液中，加热至45℃保持2h，得到混合液A；
S23、往混合液A中加无水乙醇，将混合液溶液配成80%乙醇溶液，200W、45℃超声处理20min，得到混合液B;
S24、将混合液B在45℃下回流提取2h，提取3次后合并提取液，在25℃、9000r/min下离心15min，取上清液，将上清液经过截留分子量为50KD的超滤摸，得到滤液；
S25、将滤液用旋转蒸发仪在45℃下旋蒸浓缩回收乙醇，将旋蒸产物用乙酸乙酯萃取，所得产物离心，再次旋蒸浓缩，冻干得到虫草提取物。
由于小鼠与人的肺损伤的致病机制及药物的作用靶点相近，许多药物的治疗效果相似，故以本发明药物在小鼠上的实验数据推导该药物对人的肺损伤的治疗效果，对实施例1-3、对比例1-4所得药物进行测试，具体试验操作如下：
1.选取体重为20±2g的C57BL/6雄性野生型小鼠，将博来霉素用PBS液配成1.25mg/mL溶液，按2.0μl/g分别向气管内滴注PBS或博来霉素溶液，分别制备对照组和博来霉素肺损伤组。
2.肺损伤模型造模后24小时，将本次实施例、对比例所的药物用PBS液配成0.2mg/mL溶液，按2.0μl/g分别向气管内滴注PBS或本发明药物治疗肺损伤，作为本试验的给药组。
3.给药24小时候，往小鼠腹腔内注射戊巴比妥钠麻醉后，放血致死，取部分肺组织，用4%福尔马林固定，行苏木素伊红HE染色，进行病理检查，对小鼠肺损伤程度由轻到重氛围1-4级，试验结果如下表所示：
从上表中可看出本发明的产品各组分协同增效，能够显著改善肺损伤程度。
从实施例1-3看出，本发明所述的一种含干细胞外泌体的组合物，其中的脐带间充质干细胞外泌体和虫草提取物互配，同依克多因、氨基酸、维生素等组分共同作用，能够促进肺细胞修复和增值，缓解炎症，治疗损伤。
对比实施例3与对比例1可知，不加脐带间充质干细胞外泌体，肺细胞的新陈代谢、调节信息无法得到充分表达，对肺损伤的治疗作用受到限制。
对比实施例3与对比例2、对比例3和对比例4可知，不添加虫草提取物，或者提取方法存在区别均没办法充分提取出虫草中的有效成分。本发明在酶提和乙醇浸提之后，通过一系列脱色除杂反应，借助大孔树脂洗脱分离，制备得到的虫草提取物可以有效治疗肺损伤。
以上述根据本发明的理想实施例为启示，应当指出，本发明的技术性范围不局限于说明书上的内容，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种含干细胞外泌体的组合物，其特征在于，所述含干细胞外泌体的组合物按重量份计包括：0.25-0.6份脐带间充质干细胞外泌体、4-7份虫草提取物、0.01-0.04份依克多因、0.15-1.8份甘油、0.08-0.2份蜂蜜、0.05-0.3份复合维生素、0.03-0.12份亮氨酸、0.03-0.12份异亮氨酸、0.03-0.12份缬氨酸、0.28-0.7份甘露聚糖肽、0.15-0.26份丙二醇海藻酸钠、0.05-0.18份羧甲基纤维素钠、25-35份去离子水。
2.根据权利要求1所述的一种含干细胞外泌体的组合物，其特征在于，所述含干细胞外泌体的组合物按重量份计包括：0.4-0.45份脐带间充质干细胞外泌体、5-6份虫草提取物、0.02-0.03份依克多因、0.9-1.1份甘油、0.14-0.16份蜂蜜、0.15-0.2份复合维生素、0.05-0.1份亮氨酸、0.05-0.1份异亮氨酸、0.05-0.1份缬氨酸、0.45-0.55份甘露聚糖肽、0.18-0.23份丙二醇海藻酸钠、0.09-0.14份羧甲基纤维素钠、28-32份去离子水。
3.根据权利要求1所述的一种含干细胞外泌体的组合物，其特征在于，所述含干细胞外泌体的组合物按重量份计包括：0.42份脐带间充质干细胞外泌体、5.5份虫草提取物、0.025份依克多因、1份甘油、0.15份蜂蜜、0.18份复合维生素、0.08份亮氨酸、0.08份异亮氨酸、0.08份缬氨酸、0.5份甘露聚糖肽、0.2份丙二醇海藻酸钠、0.12份羧甲基纤维素钠、30份去离子水。
4.根据权利要求1所述的一种含干细胞外泌体的组合物，其特征在于，所述脐带间充质干细胞外泌体的制备方法为：
S1、取脐带组织，放入PBS缓冲液中清洗3次，每次10min，去除动静脉得到沃顿胶，将沃尔顿胶剪碎成3-5mm的组织块，用去离子水冲洗15min,再用PBS缓冲液清洗4次，每次5min，得到组织块；
S2、将组织块和复合酶溶液按照重量比1:（8-10）混合，反应30-60min，得到第一物料；
S3、将第一物料和胶原酶I溶液按照重量比1：（0.2-0.28）混合，反应15-30min，得到第二物料；
S4、将第二物料置于800-1200r/min条件下离心10-30min，过0.3μm无菌滤膜，得到细胞沉淀，用PBS缓冲液洗涤3次；
S5、用平衡盐缓冲溶液洗涤细胞沉淀3次，再用2倍体积的平衡盐缓冲液重悬细胞，利用密度梯度离心法纯化细胞悬液，得到脐带间充质元代干细胞；
S6、将脐带间充质元代干细胞以1×10个/ml的密度接种至培养基中，放置于培养箱中培养3-5d，传代次数控制在P10以内，待细胞融合率达到80-90%时，收集培养液上清液；
S7、将培养液上清液于4℃、1200r/min条件下离心10-30min，收集上清液，超滤浓缩去除小分子后，过0.25μm无菌滤膜过滤除菌，得到脐带间充质干细胞外泌体。
5.根据权利要求4所述的一种含干细胞外泌体的组合物，其特征在于，所述的PBS缓冲液包含1-3wt%的青霉素和2-2.5wt%的硫酸链霉素；所述的复合酶溶液由弹性蛋白酶和中性蛋白酶按照重量比1：（0.25-0.3）组成；所述的培养基为含8-10wt%FBS的DMEM培养基；所述的培养箱培养条件为35-39℃、4.5-5.5%CO2饱和湿度。
6.根据权利要求1所述的一种含干细胞外泌体的组合物，其特征在于，所述的虫草提取物的制备方法为：
S21、将虫草洗净，干燥，粉碎至50-100目，得到虫草粉末；
S22、将虫草粉末加入酶解液中，加热至40-50℃保持1-3h，得到混合液A；
S23、往混合液A中加无水乙醇，将混合液溶液配成70-90%乙醇溶液，100-300W、40-50℃超声处理10-30min，得到混合液B;
S24、将混合液B在45℃下回流提取1-3h，提取3次后合并提取液，在25℃、9000r/min下离心15min，取上清液，将上清液进行超滤得到滤液；
S25、将滤液通入填有大孔树脂的吸附柱中，洗脱速度为1.5-2.5BV/h，用2倍树脂柱体积的去离子水以1-3BV/h、1.5倍树脂柱体积的50wt%乙醇溶液以2-3BV/h的流速冲洗吸附柱，收集乙醇溶液，干燥，即得虫草提取物。
7.根据权利要求6所述的一种含干细胞外泌体的组合物，所述的虫草粉末与酶解液的重量比为1：（7-12）；所述的酶解液由2-5份纤维素酶、0.8-2份果胶酶、0.5-1.5份十六烷基三甲基溴化铵、0.08-0.15份柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和15-30份去离子水组成；所述的超滤采用截留分子量为50-100KD的超滤膜；所述的大孔吸附树脂为HPD-100。
8.根据权利要求1所述的含干细胞外泌体的组合物，其特征在于，所述复合维生素由维生素A、维生素B、维生素C、维生素D按照重量比3:1:2:0.5组成。
9.根据权利要求1所述的含干细胞外泌体的组合物，其特征在于，所述含干细胞外泌体的组合物的制备方法为：
S31、将甘油、复合维生素、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘露聚糖肽、丙二醇海藻酸钠、羧甲基纤维素钠溶于去离子水后，45℃、120-240rmp下搅拌45-75min，使其完全溶解，得到混合物A;
S32、将脐带间充质干细胞外泌体、虫草提取物加入到混合物A中，40℃、80-150rmp搅拌10-30min，得到混合物B;
S33、将混合物B在37℃下回流1-2h，过滤后浓缩至相对密度为1.5-2.5，冻干得到含干细胞外泌体的组合物。
10.根据权利要求1-9任一项所述的一种含干细胞外泌体的组合物及其在制备具有治疗肺损伤作用的药物中的应用。
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