CN117487839A - 一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌及构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种产吩嗪‑1‑羧酸的嗜甲烷工程菌及构建方法和应用，嗜甲烷工程菌通过基因组整合的方法将外源吩嗪‑1‑羧酸合成基因簇整合在嗜甲烷菌宿主基因组中，从而完成宿主异源吩嗪‑1‑羧酸合成模块的搭建；以一碳化合物为碳源，在嗜甲烷菌中合成吩嗪‑1‑羧酸，应用在微生物源吩嗪‑1‑羧酸及其衍生物的生产中；吩嗪‑1‑羧酸基于其农用和医用活性以及电子传递功能，通过电子传递过程强化促进甲烷氧化效率，从而提高吩嗪‑1‑羧酸的产量，实现甲烷高效生物转化。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌及构建方法和应用。
背景技术
吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylic acid,PCA)是一种重要的天然含氮杂环的芳香族化合物，因其具有显著的农用和医用活性以及电子传递功能，在农业和医药领域有广泛的应用。现有生物合成技术中，吩嗪-1-羧酸主要通过假单胞菌发酵来获得，由此合成的吩嗪-1-羧酸已被开发为我国自主研发的一种新型微生物源农药“申嗪霉素”，具有高效、安全、广谱等特点。
然而，假单胞菌在发酵中以葡萄糖或甘油为底物，通过发酵生产化学品(如天然产物)的成本通常取决于所使用的碳源。糖通常是成本较高的碳源，同时糖基原料的过度依赖存在“与人争粮，与粮争地”的问题。随着第三代生物炼制技术的发展，极具成本效益且资源丰富的可再生一碳资源甲烷(CH4)被认为是极具潜力的下一代生物制造原料。利用甲烷原料合成吩嗪-1-羧酸的技术路线是完全可行。迄今为止，虽然已构建多种转化甲烷合成化学品的工程菌株，但是这些产物多集中在有机酸、生物蛋白、萜类化合物等，由天然嗜甲烷菌转化甲烷合成生物农药，尤其是合成吩嗪-1-羧酸的方法尚未报道。嗜甲烷菌中特有的甲烷单加氧酶(particulate methane monooxygenase，pMMO)是甲烷利用关键酶，其可将甲烷氧化为甲醇加以利用。因该反应过程需要电子供给，电子传递效率是甲烷氧化的主要瓶颈之一。吩嗪-1-羧酸具有优良的电子传递特性，因此通过转化甲烷内源合成吩嗪-1-羧酸强化电子传递，在甲烷合成高值产物的同时，也能够促进pMMO酶活，从而提高嗜甲烷菌的甲烷利用效率，是一个亟待研究的方向。
发明内容
为了客服上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌及构建方法和应用，通过代谢路径设计，构建产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷菌工程菌，通过电子传递过程强化促进甲烷氧化效率，从而提高吩嗪-1-羧酸的产量，实现甲烷高效生物转化。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌，包括嗜甲烷菌宿主，以及嗜甲烷菌宿主中引入的外源吩嗪-1-羧酸合成的基因簇phzABCDEFG。
所述的嗜甲烷菌宿主选自甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基微菌(Methylomicrobium)、甲基球形属(Methylosphaera)、甲基热菌(Methylocaldum)、甲基八叠球菌属(Methylosarcina)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基细胞菌属(Methylocella)和甲基帽菌属(Methylocapsa)中的一种。
所述的甲基微菌是Methylotuvimicrobium buryatense或Methylotuvimicrobiumalcaliphilum；
Methylotuvimicrobium buryatense具体为Methylotuvimicrobium buryatense5GB1C；Methylotuvimicrobium alcaliphilum具体为Methylotuvimicrobiumalcaliphilum 20Z。
所述外源吩嗪-1-羧酸合成基因簇phzABCDEFG，来自铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa PAO1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌的构建方法，通过基因组整合的方法将外源吩嗪-1-羧酸合成基因簇整合在嗜甲烷菌宿主基因组中，从而完成宿主异源吩嗪-1-羧酸合成模块的搭建。
所述构建方法具体如下：
(1)、将外源吩嗪-1-羧酸合成基因簇phzABCDEFG与Ptac启动子串联得到Ptac-PHZ片段；将外源基因片段Ptac-PHZ、loxP位点与质粒pUC57相连构建重组质粒pUC57-Ptac-PHZ；
所述Ptac启动子核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；
(2)、克隆pUC57-Ptac-PHZ质粒中的线性化片段loxP-Ptac-PHZ-Gm-loxP，将该线性化片段电转至含有loxP整合位点的嗜甲烷菌宿主中，获得产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷菌工程菌；利用该策略同样获得由PmaxF驱动的吩嗪合成基因簇工程菌。
所述的Ptac启动子能够替换成PmaxF启动子，串联得到PmaxF-PHZ片段，与质粒pUC57相连构建重组质粒pUC57-PmaxF-PHZ；
所述PmaxF启动子核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌的应用，以一碳化合物为碳源，在嗜甲烷菌中合成吩嗪-1-羧酸，应用在微生物源吩嗪-1-羧酸及其衍生物的生产中。
所述的一碳化合物包括甲烷、甲醇或沼气。
所述的吩嗪-1-羧酸基于其农用和医用活性以及电子传递功能，应用在农业生物防治中或应用在生产甲烷减排中。
本发明有益效果体现在：
1、本发明提供一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷菌工程菌，通过引入异源吩嗪-1-羧酸合成基因簇phzABCDEFG，构建一条可以利用一碳化合物(甲烷、甲醇或沼气)为底物生成吩嗪-1-羧酸的代谢通路；通过吩嗪-1-羧酸合成强化电子传递效率，也能够促进甲烷碳转化率。
2、基于本发明所述的嗜甲烷菌工程菌，能够产吩嗪-1-羧酸，利用一碳化合物(甲烷、甲醇或沼气)为碳源，原料成本低廉，工艺操作简单，菌株可以重复使用，有助于农业生产中甲烷减排及病虫害生物防治；利用甲烷生产吩嗪-1-羧酸为商业化利用沼气生产吩嗪-1-羧酸及其衍生物提供借鉴。
附图说明
图1为本发明重组质粒pUC57-Ptac-PHZ的构建图谱。
图2为本发明pUC57-Ptac-PHZ成功构建的验证图。
图3为本发明吩嗪-1-羧酸合成基因簇phzABCDEFG在嗜甲烷菌基因组整合表达示意图。
图4为工程菌株Mbp01成功构建的测序验证图。
图5为申嗪霉素检测标准曲线图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例1
一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌，包括嗜甲烷菌宿主，以及嗜甲烷菌宿主中引入外源吩嗪-1-羧酸合成基因簇phzABCDEFG。
所述的嗜甲烷菌宿主选自甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基微菌(Methylomicrobium)、甲基球形属(Methylosphaera)、甲基热菌(Methylocaldum)、甲基八叠球菌属(Methylosarcina)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基细胞菌属(Methylocella)和甲基帽菌属(Methylocapsa)中的一种。
所述的甲基微菌是Methylotuvimicrobium buryatense或Methylotuvimicrobiumalcaliphilum；
Methylotuvimicrobium buryatense具体为Methylotuvimicrobium buryatense5GB1C；Methylotuvimicrobium alcaliphilum具体为Methylotuvimicrobiumalcaliphilum 20Z；
所述外源吩嗪-1-羧酸合成基因簇phzABCDEFG，来自铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa PAO1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
实施例2
重组质粒pUC57-Ptac-PHZ的构建，参照图1，具体步骤如下：
(1)、根据pUC57-Ptac-PHZ中PHZ基因序列设计一对引物，通过PCR方法以铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PAO1基因组为模板，获得PHZ基因簇，设计一对引物如下:
PHZ-F:
5’-ctcgtataatgtgtggaggtattcacacaggaaacagctATGAACGGTCAGCGGTACAG-3’
PHZ-R:
5’-CCGAACAGGCTTATGTCAATCACGGTTGCAGGTAGCG-3’
(2)、根据以pUC57-Ptac-loxP中带有loxP整合位点的线性化质粒的基因序列设计一对引物，以pUC57-Ptac-loxP通过PCR方法获得线性化质粒基因片段，设计一对引物如下:
loxP-F:5’-CCACACATTATACGAGCCGATG-3’
loxP-R:5’-TACCGCCACCTAACAATTCGT-3’
(3)、根据pUC57-Ptac-loxP质粒中抗性基因Gm序列设计一对引物，通过PCR方法获得Gm基因，设计一对引物如下：
Gm-F:5’-TTGACATAAGCCTGTTCGGT-3’
Gm-R:
5’-AATTGTTAGGTGGCGGTACTTGGGTCGATATCAAAGTGCATC-3’
(4)、采用高保真聚合酶2×PhantaMax MasterMix获得相应的PHZ、Gm目的片段，纯化回收后保存于-20℃冰箱。纯化回收后pUC57-Ptac-loxP使用限制性内切酶DPNI于37℃恒温酶切2h，80℃加热20分钟使DPNI酶失活，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后按照目的片段与载体片段摩尔比2:1的比例混合，使用C115连接酶50℃连接15分钟；将连接后质粒通过热转化方法转化到DH5α中。37℃复苏40分钟后的菌液涂布于庆大霉素LB平板，37℃倒置培养12h后挑单菌落进行菌落PCR验证。将验证正确的阳性克隆转接摇瓶37℃，200rpm培养12h后保藏菌种并提取质粒进行测序验证，如图2所示。
实施例3
吩嗪-1-羧酸合成基因簇phzABCDEFG在嗜甲烷菌基因组表达工程菌株的构建，参照图3，包括以下步骤：
(1)电转复合体loxP-PHZ-Gm-loxP片段的构建：
以pUC57-Ptac-PHZ质粒为模板，使用引物loxP-F：gaattgacgcgtattgggat及loxP-R：gaaacagctatgaccatgctc扩增线性化片段loxP-PHZ-Gm-loxP；经琼脂糖凝胶电泳验证条带大小，电转复合体片段构建鉴定结果，电泳条带与设计大小一致，证明敲除片段构建成功；
(2)电转复合体片段导入Methylotuvimicrobium buryatense5GB1C::Cre；
(3)验证大小正确的电转复合体片段经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后通过电转化进入Methylotuvimicrobium buryatense 5GB1C::Cre(Cre蛋白整合M.buryatense 5GB1C基因组中性位点，在四环素诱导Cre酶表达，发生位点特异性重组)电转感受态中，30℃，200rpm复苏20h后全部涂布在含有庆大霉素抗性的NMS平板培养基上，30℃倒置培养4天。挑选抗性平板上的单菌落进行菌落PCR验证，通过所得条带大小可以判断电转复合体片段成功整合到基因组上。将筛选的阳性克隆扩大培养后转到摇瓶保存，在对数生长期时保存种子液，得到吩嗪-1-羧酸合成基因簇phzABCDEFG在嗜甲烷菌基因组表达工程菌株Mbp01，并进行基因测序验证，如图4所示。
实施例4
工程菌株Mbp01中吩嗪-1-羧酸的检测
活化嗜甲烷菌工程菌Mbp01，经平板活化、培养；将培养获得的嗜甲烷菌Mbp01种子液按10％接种量接种至新的已灭菌的250mL摇瓶中培养，摇瓶中含有50mL新鲜无菌的NMS培养基，所述NMS液体培养基，包括：0.2～1g/L MgSO4·7H2O、0.01～0.02g/L CaCl2·6H2O、0.5～2g/L KNO3、8-12g/LNaCl以及20～60mL/L碳酸盐溶液、15～50m/L磷酸盐溶液和1～2mL/L微量元素溶液(Trace溶液)，余量为蒸馏水。
接种后于25～35℃、200～400rpm的条件下培养48～84h，培养过程中向培养体系内补充一碳化合物，所述一碳化合物的添加比例为培养体系气相或液相体积的0.120％～30％；观察到在30℃，200rpm的培养条件下生成吩嗪-1-羧酸，如图5所示，说明该嗜甲烷工程菌的应用，以一碳化合物为碳源，在嗜甲烷菌中合成了吩嗪-1-羧酸，能够应用在微生物源吩嗪-1-羧酸及其衍生物的生产中。
由于吩嗪-1-羧酸在农用和医用活性以及电子传递功能，因此本发明还可以应用在农业生物防治中或应用在生产甲烷减排中。
上述参照具体实施方式对该一株产吩嗪-1-羧酸的工程菌进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌，其特征在于，包括嗜甲烷菌宿主，以及嗜甲烷菌宿主中引入的外源吩嗪-1-羧酸合成的基因簇phzABCDEFG。
2.根据权利要求1所述的一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌，其特征在于，所述的嗜甲烷菌宿主选自甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基微菌(Methylomicrobium)、甲基球形属(Methylosphaera)、甲基热菌(Methylocaldum)、甲基八叠球菌属(Methylosarcina)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基细胞菌属(Methylocella)和甲基帽菌属(Methylocapsa)中的一种。
3.根据权利要求2所述的一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌，其特征在于，所述的甲基微菌是Methylotuvimicrobium buryatense或Methylotuvimicrobium alcaliphilum；
Methylotuvimicrobium buryatense具体为Methylotuvimicrobium buryatense5GB1C；Methylotuvimicrobium alcaliphilum具体为Methylotuvimicrobiumalcaliphilum 20Z。
4.根据权利要求1所述的一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌，其特征在于，所述外源吩嗪-1-羧酸合成基因簇phzABCDEFG，来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PAO1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌的构建方法，其特征在于，通过基因组整合的方法将外源吩嗪-1-羧酸合成基因簇整合在嗜甲烷菌宿主基因组中，从而完成宿主异源吩嗪-1-羧酸合成模块的搭建。
6.根据权利要求5所述的一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体如下：
(1)、将外源吩嗪-1-羧酸合成基因簇phzABCDEFG与Ptac启动子串联得到Ptac-PHZ片段；将外源基因片段Ptac-PHZ、loxP位点与质粒pUC57相连构建重组质粒pUC57-Ptac-PHZ；
所述Ptac启动子核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；
(2)、克隆pUC57-Ptac-PHZ质粒中的线性化片段loxP-Ptac-PHZ-Gm-loxP，将该线性化片段电转至含有loxP整合位点的嗜甲烷菌宿主中，获得产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷菌工程菌；利用该策略同样获得由PmaxF驱动的吩嗪合成基因簇工程菌。
7.根据权利要求6所述的一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌的构建方法，其特征在于，所述的Ptac启动子能够替换成PmaxF启动子，串联得到PmaxF-PHZ片段，与质粒pUC57相连构建重组质粒pUC57-PmaxF-PHZ；
所述PmaxF启动子核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
8.一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌的应用，其特征在于，以一碳化合物为碳源，在嗜甲烷菌中合成吩嗪-1-羧酸，应用在微生物源吩嗪-1-羧酸及其衍生物的生产中。
9.根据权利要求8所述的一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌的应用，其特征在于，所述的一碳化合物包括甲烷、甲醇或沼气。
10.根据权利要求8所述的一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌的应用，其特征在于，所述的吩嗪-1-羧酸基于其农用和医用活性以及电子传递功能，应用在农业生物防治中或应用在生产甲烷减排中。
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