CN108165516A - 一种枯草芽孢杆菌发酵生产氨酸脱氢酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌发酵生产氨酸脱氢酶的方法，属于酶工程领域。本发明通过在目的基因N端加入不同信号肽的策略，构建重组分泌表达质粒,并在枯草芽孢杆菌表达系统中进行表达，筛选到PhoD信号肽效果最佳，提高了亮氨酸脱氢酶分泌表达水平，为对照菌的2.2倍。此方法中枯草芽孢杆菌为安全菌株，重组蛋白直接分泌到胞外，使后期分离操作简单，更加适合工业化应用，为亮氨酸脱氢酶在医疗诊断等领域的应用提供了方便。

Description

一种枯草芽孢杆菌发酵生产氨酸脱氢酶的方法
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌发酵生产氨酸脱氢酶的方法，属于酶工程领域。
背景技术
亮氨酸脱氢酶(Leucine Dehydrogenase；EC 1.4.1.9；LeuDH)属于氧化还原酶类，以NAD+为辅酶，能可逆的催化L-亮氨酸及一些支链氨基酸产生相应的酮酸及其类似物，也可以催化α-酮酸还原成手性氨基酸。目前在多种细菌中均发现亮氨酸脱氢酶的存在，研究较多的亮氨酸脱氢酶主要来源于芽孢杆菌，且多为6-8个亚基的同源多聚体。
亮氨酸脱氢酶在医药等行业有广泛应用，可用于医药中间体手性氨基酸的生物催化；临床生化诊断上，可偶联尿酶测定血清或尿液中尿素含量，UV-LED法不受内源氨干扰，可辅助检测肾脏疾病，还可以测定支链氨基酸及测定血清中亮氨酸氨肽酶活性等。现有报道亮氨酸脱氢酶的生产方法为构建表达亮氨酸脱氢酶的大肠杆菌基因工程菌，基于亮氨酸脱氢酶在医药行业等方面的应用，对酶的安全性要求更高，有必要选择安全性更高表达宿主。相比大肠杆菌，B.subtilis具有不易形成包涵体、表达产物直接分泌到胞外，后期分离纯化便利等优点，有较好的工业生产应用基础。B.subtilis具有不易形成包涵体、表达产物直接分泌到胞外，后期分离纯化便利等优点，并且能从上游保证该酶生产的安全性，有较好的工业生产应用基础，并且目前还没有相关报道将亮氨酸脱氢酶在枯草芽孢杆菌中进行表达，因此，构建一种能够增加亮氨酸脱氢酶胞外分泌的枯草芽孢杆菌基因工程菌是有待研究的课题。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种表达亮氨酸脱氢酶的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌是将亮氨酸脱氢酶基因连接到表达载体上，然后在表达载体自身启动子和亮氨酸脱氢酶基因间加入信号肽序列，将构建的重组表达载体转化到枯草芽孢杆菌中，得到枯草芽孢杆菌重组菌。
在本发明的一种实施方式中，所述亮氨酸脱氢酶基因来源于Bacillus cereus。
在本发明的一种实施方式中，所述亮氨酸脱氢酶核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述信号肽序列为AmyQ、SacB或PhoD。
在本发明的一种实施方式中，所述信号肽序列为AmyQ、SacB或PhoD，所述AmyQ的核苷酸序列SEQ ID NO.2，所述SacB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所述，所述PhoD的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pMA5。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168或Bacillus subtilis WB600。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的制备方法：将亮氨酸脱氢酶连接到表达载体上，然后在表达载体自身启动子和亮氨酸脱氢酶基因间加入信号肽序列。
一种分泌亮氨酸脱氢酶枯草芽孢杆菌重组菌的构建方法，所述构建方法是：
(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1的亮氨酸脱氢酶的基因与质粒pMA5进行连接，得到重组质粒pMA5-leudh；
(2)将信号肽序列与重组质粒pMA5-leudh通过酶切位点相连，得到重组质粒
pMA5-SPN-leudh；
(3)将重组质粒pMA5-SPN-leudh转化枯草芽孢杆菌，得到枯草芽孢杆菌重组菌。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168或Bacillus subtilis WB600。
在本发明的一种实施方式中，所述信号肽序列为AmyQ、SacB或PhoD。
在本发明的一种实施方式中，所述信号肽序列为AmyQ、SacB或PhoD，所述AmyQ的核苷酸序列SEQ ID NO.2，所述SacB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所述，所述PhoD的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述信号肽序列为PhoD，所述PhoD的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明的第二个目的是提供一种发酵生产亮氨酸脱氢酶的方法，所述方法的具体步骤如下：
(1)将枯草芽孢杆菌重组菌在LB培养基中，35-39℃振荡培养10-16h，作为一级种子发酵液；
(2)将一级种子发酵液按照4-5％接种到发酵培养液，35-39℃振荡培养8-12h，作为二级种子发酵液；
(3)将二级种子发酵液全部加入有发酵培养液的发酵罐中，在35-39℃，溶氧控制在 25-35％条件下培养，全程用氨水以及磷酸进行pH值的调节，保持在6.8-7.2；待碳源耗尽，即DO值迅速上升时，进行补料。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基包括如下成分：葡萄糖8-10g/L，蛋白胨 10-12g/L，酵母粉22-24g/L，酵母浸膏8-10g/L，磷酸氢二钾11-12.54g/L，磷酸二氢钾2.00-2.31 g/L，微量元素2-3ml，加入卡纳至75-100mg/L。
在本发明的一种实施方式中，所述补料配方为葡萄糖450-500g/L，酵母提取物65-75g/L。本发明的有益效果
采用本发明的方法首次实现了亮氨酸脱氢酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达，构建的重组菌Bacillus subtilis 168/pMA5-SPN-leudh，通过信号肽的加入，促进了亮氨酸脱氢酶的分泌表达，提高了亮氨酸脱氢酶酶活。相比重组菌Bacillus subtilis 168/pMA5–leudh，胞外亮氨酸脱氢酶酶活提高了2.2倍，亮氨酸脱氢酶的酶活力可达252.92U/mL。本发明采用的B.subtilis表达体系，具有非密码子偏爱性，不易形成包涵体、表达产物直接分泌到胞外，后期分离纯化便利等优点，该体系在表达亮氨酸脱氢酶过程中，能够将酶直接分泌到胞外，减小纯化成本，为工业生产亮氨酸脱氢酶提供新的思路。
附图说明
图1分泌表达载体pMA5-SPN-leudh构建示意图；
图2含不同信号肽各重组菌SDS-PAGE
M:Protein Marker(Low)1:168/pMA5 2:168/pMALipB 3:168/pMANprE 4: 168/pMAAmyQ5:168/pMASacB 6:168/pMALipA 7:168/pMAYwbN 8:168/pMAPhoD；
图3重组菌B.subtilis 168/pMA5-SPPhoD-leudh 7.5L发酵罐酶活曲线图。
具体实施方式
单位酶活定义：每分钟生成1umol NADH所需的酶量为一个酶活单位。。
测定方法：反应体系3ml，在含20mM亮氨酸的0.2M甘氨酸-KCl-KOH(pH 10.5)缓冲液中加入12.5mM NAD+溶液，37℃平衡5min后加入酶液摇匀，不加酶液为对照，340nm波长测定3min内吸光值变化。
表1 引物
实施例1：含重组亮氨酸脱氢酶基因重组质粒的构建与表达
以全基因合成的leudh为模板，引物F1/R1(C端引入6×His)进行PCR，引入酶切位点BamH I/Mlu I。分别对PCR产物、质粒pMA5双酶切，跑胶回收片段用T4 DNA连接酶连接过夜，得到重组质粒pMA5-leudh。
实施例2：融合不同信号肽的分泌表达质粒pMA5-SPN-leudh的构建
提取B.subtilis 168基因组DNA，以该基因组DNA为模板，通过引物LipA-F/LipA-R进行PCR反应，扩增得到序列如SEQ ID NO.6的信号肽LipB，并在信号肽的N端和C端分别引入Nde I/BamH I位点，之后对信号肽片段以及质粒pMA5-leudh同时双酶切，酶切片段经纯化后通过T4 DNA连接酶连接，转化E.coli JM109。挑取重组菌进行培养，提质粒双酶切验证，由于信号肽片段较短，大小一般在100bp左右，因此提取的质粒采用Nde I和Mlu I进行双酶切验证，即将信号肽与目的基因视为完整片段进行酶切。其他6种信号肽的构建方法同上。
实施例3：枯草芽孢杆菌感受态的制备和转化
SPI-A：0.2g(NH4)2SO4，1.4g K2HPO4.3H2O，0.6g KH2PO4，0.1g Trisodium CitrateDihydrate，加水定容50ml，121℃灭菌20min。
SPI-B：0.02g MgSO4.7H2O，加水定容至50ml，121℃灭菌20min。
100×CAYE:2g Casamino acid，10gYeast Extract，121℃灭菌20min。
100×EGTA：10mmol/l EGTA溶液(加NaOH调pH8.0)，121℃灭菌20min。
50mM CaCI2：称取0.5549g CaCl2加水溶解定容至100ml，121℃灭菌20min。
250mM MgCI2·6H2O：称取2.38g MgCl2·6H2O加水溶解定容至100ml，121℃灭菌20min。
SPI Medium(20ml)：9.8ml SPI-A，9.8ml SPI-B，200ul(1％V)Glucose，200ul(1％V) 100×CAYE
SPII Medium(6ml)：5.88ml SPI Medium，60ul(1％V)50mM CaCl2，60ul(1％V)250mM MgCl2·6H2O
1)挑取B.subtilis 168/pMA5-leudh单菌落，接种至10ml LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜。
2)次日，从培养物中取100ul菌液，接种至含5ml SPI Medium的50ml离心管中，37℃，200rpm摇床培养，当菌体OD600>0.8即生长到对数末期时，取500ul接种到5ml SPIIMedium 中，于37℃，100rpm摇床培养1.5h；
3)加50ul 100×EGTA溶液，于37℃，100rpm摇床培养10min，用1.5ml离心管分装成500ul每管。
4)向管中加5-20ul的质粒，轻轻混匀于37℃，100rpm摇床培养30min。之后调整转速为250rpm，37℃培养1.5h。
5)4000rpm离心5min收集菌体，弃部分上清液，留100ul重悬菌体，涂布Kanr平板，37℃过夜培养。
实施例4：含不同信号肽重组菌的发酵培养
从枯草芽孢杆菌重组菌抗性平板上，挑取阳性克隆，接种于LB培养基中(含100ug/ml Kanr)，37℃，200r/min培养过夜，次日按5％接种量转接至50ml发酵培养基中(蛋白胨12g，酵母粉24g，甘油5g，K2HPO4.3H2O 16.43g，KH2PO42.3g，100ug/ml Kanr)培养48h，之后4℃， 8000r/min离心10min收集发酵上清液，测定发酵上清亮氨酸脱氢酶活性，结果如表2所示。结果表明：信号肽PhoD的效果最佳，亮氨酸脱氢酶的胞外活性为20.25U/ml。
采用与重组菌相同的载体和宿主表达亮氨酸脱氢酶基因(SEQ ID NO.1)，不融合信号肽，以该菌为对照菌，对照菌胞外酶活为9.04U/ml。
与对照菌相比，重组菌Bacillus subtilis 168/pMA5-SPN-leudh发酵时间48h酶活是对照菌的2.2倍。
表2 不同信号肽引导的LeuDH活性比较
实施例5：重组菌B.subtilis 168/pMA5-SPPhoD-leudh 7.5L发酵罐产酶研究
重组枯草芽孢杆菌重组菌发酵罐生产亮氨酸脱氢酶的方法在7.5L Eppendorf罐进行，过程分为三阶段进行：
第一阶段：接种实施例4中含有PhoD信号肽的阳性转化子单菌落至装有30ml LB培养基的150mL三角瓶中，200rpm，37℃振荡培养10-16h，作为一级种子发酵液；
第二阶段：取所述一级种子发酵液按照5％接种量接种于装有150mL发酵培养基的500mL三角瓶中，200rpm，37℃振荡培养12h，作为二级种子发酵液；
第三阶段：将150mL的种子发酵液接种到装有3L发酵培养基中的7.5L发酵罐中，在37℃，溶氧控制在30％左右条件下培养，全程用30％氨水以及20％磷酸进行pH值的调节，保持在7.0；待碳源耗尽，即DO值迅速上升时，进行补料；所述发酵培养基包括如下成分：葡萄糖10g/L，蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，酵母浸膏10g/L，磷酸氢二钾12.54g/L，磷酸二氢钾2.31g/L，微量元素3ml，加入卡纳至100mg/L；补料配方为葡萄糖500g/L，酵母提取物75g/L。
结果表明，重组菌B.subtilis 168/pMA5-SPPhoD-leudh在7.5L发酵罐中发酵，获得的亮氨酸脱氢酶的最佳酶活力为252.92U/mL(如图3)。
虽然本发明已较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 一种枯草芽孢杆菌发酵生产氨酸脱氢酶的方法
<120> 江南大
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaccctgg agatcttcga atacctggag aaatacgact atgagcaggt ggtgttctgc 60
caagataagg aaagcggtct gaaagcgatc attgcgatcc acgacaccac cctgggtccg 120
gcgctgggtg gcacccgtat gtggacctac gacagcgagg aagcggcgat tgaggatgcg 180
ctgcgtctgg cgaagggtat gacctataaa aacgcggcgg cgggtctgaa cctgggtggc 240
gcgaagaccg tgatcattgg tgacccgcgt aaggataaaa gcgaggcgat gttccgtgcg 300
ctgggccgtt acatccaggg tctgaacggc cgttatatta ccgcggaaga tgtgggtacc 360
accgttgacg atatggacat cattcacgag gaaaccgatt tcgttaccgg catcagcccg 420
agctttggta gcagcggtaa cccgagcccg gtgaccgcgt acggtgttta tcgtggcatg 480
aaggcggcgg cgaaagaggc gttcggtacc gacaacctgg aaggcaaagt gattgcggtt 540
cagggtgtgg gcaacgttgc gtaccacctg tgcaagcacc tgcacgcgga gggtgcgaaa 600
ctgatcgtga ccgatattaa caaggaagcg gtgcaacgtg cggttgagga atttggtgcg 660
agcgcggtgg aaccgaacga gatctacggc gttgagtgcg acatttatgc gccgtgcgcg 720
ctgggtgcga ccgtgaacga tgaaaccatc ccgcagctga aggcgaaagt tattgcgggc 780
agcgcgaaca accaactgaa agaggaccgt cacggtgata tcattcacga aatgggcatc 840
gtgtacgcgc cggactatgt tatcaacgcg ggtggcgtga ttaacgttgc ggatgaactg 900
tacggttata accgtgagcg tgcgctgaaa cgtgtggaaa gcatctacga caccattgcg 960
aaggttatcg aaattagcaa acgtgacggc atcgcgacct atgttgcggc ggatcgtctg 1020
gcggaggaac gtattgcgag cctgaagaac agccgtagca cctatctgcg taacggtcac 1080
gatatcatta gccgtcgtta a 1101
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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<212> DNA
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cgcggatccg gcttttgctg acggctg 27

Claims (10)

1.一种表达亮氨酸脱氢酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌是将亮氨酸脱氢酶基因连接到表达载体上，然后在表达载体自身启动子和亮氨酸脱氢酶基因间加入信号肽序列，将构建的重组表达载体转化到宿主枯草芽孢杆菌中，得到枯草芽孢杆菌重组菌。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶基因来源于Bacilluscereus。
3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述信号肽序列为AmyQ、SacB或PhoD。
5.根据权利要求1或4所述的重组菌，其特征在于，所述信号肽序列为AmyQ、SacB和PhoD，所述AmyQ的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述SacB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述PhoD的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
6.根据权利要求1所述的的重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建方法如下：
(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1的亮氨酸脱氢酶的基因与质粒pMA5进行连接，得到重组质粒pMA5-leudh；
(2)将信号肽序列与重组质粒pMA5-leudh通过酶切位点相连，得到重组质粒pMA5-SPN-leudh；
(3)将重组质粒pMA5-SPN-leudh转化枯草芽孢杆菌，得到枯草芽孢杆菌重组菌。
7.根据权利要求1或6所述的的重组菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为Bacillussubtilis 168或Bacillus subtilis WB600。
8.根据权利要求1或6所述的的重组菌，其特征在于，所述信号肽序列为PhoD，所述PhoD的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
9.应用权利要求1-8任一所述重组菌发酵生产亮氨酸脱氢酶的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
(1)将菌枯草芽孢杆菌重组菌在LB培养基中，35-39℃振荡培养10-16h，作为一级种子发酵液；
(2)将一级种子发酵液按照4-5％接种到发酵培养液，35-39℃振荡培养8-12h，作为二级种子发酵液；
(3)将二级种子发酵液全部加入有发酵培养液的发酵罐中，在35-39℃，溶氧控制在25-35％条件下培养，全程用氨水以及磷酸进行pH值的调节，保持在6.8-7.2；待碳源耗尽，即DO值迅速上升时，进行补料。
10.根据权利要9所述方法，其特征在于，所述发酵培养基包括如下成分：葡萄糖8-10g/L，蛋白胨10-12g/L，酵母粉22-24g/L，酵母浸膏8-10g/L，磷酸氢二钾11-12.54g/L，磷酸二氢钾2.00-2.31g/L，微量元素2-3ml，加入卡纳至75-100mg/L；所述补料配方为葡萄糖450-500g/L，酵母提取物65-75g/L。
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