CN117343914B - 经修饰的氨单加氧酶、载体、微生物以及用于氨氮降解的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种经修饰的氨单加氧酶、载体、微生物以及用于氨氮降解的方法，属于复合酶工程领域，原始amoA的修饰为如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第79位的M取代为I或V，和/或第83位的W取代为L，和/或第41位的H取代为P，和/或第103位的E取代为D，和/或第53位的F取代为L；原始amoB的修饰为如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第53位的K取代为T，和/或第67位的M取代为V或I，和/或第48位的Q取代为L，和/或第54位的W取代为L或G；原始amoC的修饰为如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列中第151位的S取代为G。提升氨单加氧酶的酶活性。
Description
技术领域
本发明涉及复合酶工程领域，具体涉及一种修饰的氨单加氧酶、表达构建体、载体、微生物以及用于氨氮降解的方法。
背景技术
随着工业的发展和城市人口的增加和城市化的不断扩大，城市用水量和废水排放量不断增加，水资源的短缺和枯竭、以及污水排放造成的环境污染，依然成为了严重影响经济发展和社会进步的关键原因了。污水处理最常见的工艺就是活性污泥法；除此之外的方法，还有添加能促进功能菌株形成优势、剩余污泥排放、加速氨氮降解等作用的生物菌剂至污水中。
硝化细菌为化能自养菌,包括氨氧化细菌(AOB，将NH4 +-N氧化为NO2 -—N)和亚硝酸盐氧化细菌(NOB，将NO2 -—N氧化为NO3 -—N)两个菌群。此过程共分为3步的生化反应，而氨单加氧酶催化氨氮为NH2OH的氧化反应，因转化率低、底物要求高、酶蛋白结构复杂等原因，是降氨氮生化过程中主要的限速步骤。因此提升氨氧化速率就能提升氨氮降解速率，最终实现污水处理应用中的氨氮排放达标。
硝化反应在温度低于15℃时会极大的降低氨氧化速率，最终由NH3到NO2 -的转化率出现减慢甚至停止。因此若能找到能够在低温条件下仍可保持高速反应的自养硝化细菌和酶基因。但目前市面在售上的低温硝化细菌产品，都未发现有明确的低温硝化细菌的分类学信息和反应温度曲线等数据，而在相关专利和文献中被报道并有实验数据的低温硝化细菌菌种又没有被发现被制备生产为生物菌剂产品。因此，若能在保留低温反应能力的基础上，通过一定的技术手段进一步提升这类低温硝化细菌的氨氧化速率，则能解决低温生物菌剂的一项最大短板，实现在水处理领域的特定场景应用。
氨单加氧酶是由硝化细菌中amo基因所编辑的，共分A、B、C三个亚基。其活性中心主要位于A亚基上，但也有了B亚基、C亚基的报道，经过分子对接等操作后可以确定活性中心上的数个关键氨基酸残基及底物结合口袋。而从反应过程来看，该反应除了底物氨氮外，还有氧气、氢供体等分子参与；从A亚基的底物结合口袋来看，空间位阻大而这些关键氨基酸残基难以与这些分子发生相应的作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有氨单加氧酶的空间位阻大，导致关键氨基酸残基难以与底物分子发生相应的作用，最终导致氨氮清除效果差。
本发明的第一目的在于提供经修饰的氨单加氧酶，在原始氨单加氧酶的基础上进行修饰所获得的；
原始氨单加氧酶由原始amoA、原始amoB以及原始amoC组成，原始amoA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，原始amoB的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，原始amoC的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；原始amoA、原始amoB以及原始amoC中至少一个的氨基酸序列被修饰；
其中，原始amoA进行如下之一的修饰，修饰后amoA的氨基酸序列如下所示：
SEQ ID NO.1上第79位的氨基酸M取代为I，记为SEQ ID NO.4；
SEQ ID NO.1上第83位的氨基酸W取代为L，记为SEQ ID NO.5；
SEQ ID NO.1上第41位的氨基酸H取代为P，记为SEQ ID NO.6；
SEQ ID NO.1上第103位的氨基酸E取代为D，记为SEQ ID NO.7；
SEQ ID NO.1上第53位的氨基酸F取代为L，记为SEQ ID NO.8；
SEQ ID NO.1上第79位的氨基酸M取代为V，记为SEQ ID NO.9；
SEQ ID NO.1上第79位的氨基酸M取代为I，且SEQ ID NO.1上第83位的氨基酸W取代为L，记为SEQ ID NO.10；
SEQ ID NO.1上第79位的氨基酸M取代为I，且SEQ ID NO.1上第41位的氨基酸H取代为P，记为SEQ ID NO.11；
SEQ ID NO.1上第79位的氨基酸M取代为I，且SEQ ID NO.1上第103位的氨基酸E取代为D，记为SEQ ID NO.12；
SEQ ID NO.1上第79位的氨基酸M取代为I，SEQ ID NO.1上第83位的氨基酸W取代为L，且SEQ ID NO.1上第41位的氨基酸H取代为P，记为SEQ ID NO.13；
SEQ ID NO.1上第79位的氨基酸M取代为I，SEQ ID NO.1上第83位的氨基酸W取代为L，且SEQ ID NO.1上第103位的氨基酸E取代为D，记为SEQ ID NO.14；
SEQ ID NO.1上第41位的氨基酸H取代为P，且SEQ ID NO.1上第53位的氨基酸F取代为L，记为SEQ ID NO.15；
SEQ ID NO.1上第41位的氨基酸H取代为P，SEQ ID NO.1上第83位的氨基酸W取代为L，且SEQ ID NO.1上第53位的氨基酸F取代为L，记为SEQ ID NO.16；
原始amoB进行如下之一的修饰，修饰后amoB的氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.2上第53位的氨基酸K取代为T，记为SEQ ID NO.17；
SEQ ID NO.2上第67位的氨基酸M取代为V，记为SEQ ID NO.18；
SEQ ID NO.2上第48位的氨基酸Q取代为L，记为SEQ ID NO.19；
SEQ ID NO.2上第54位的氨基酸W取代为L，记为SEQ ID NO.20；
SEQ ID NO.2上第67位的氨基酸M取代为I，记为SEQ ID NO.21；
SEQ ID NO.2上第54位的氨基酸W取代为G，记为SEQ ID NO.22；
SEQ ID NO.2上第53位的氨基酸K取代为T，且SEQ ID NO.2上第67位的氨基酸M取代为V，记为SEQ ID NO.23；
SEQ ID NO.2上第53位的氨基酸K取代为T，且SEQ ID NO.2上第48位的氨基酸Q取代为L，记为SEQ ID NO.24；
SEQ ID NO.2上第53位的氨基酸K取代为T，且SEQ ID NO.2上第54位的氨基酸W取代为L，记为SEQ ID NO.25；
SEQ ID NO.2上第53位的氨基酸K取代为T，SEQ ID NO.2上第67位的氨基酸M取代为V，且SEQ ID NO.2上第48位的氨基酸Q取代为L，记为SEQ ID NO.26；
SEQ ID NO.2上第53位的氨基酸K取代为T，SEQ ID NO.2上第67位的氨基酸M取代为V，且SEQ ID NO.2上第54位的氨基酸W取代为L，记为SEQ ID NO.27；
原始amoC进行如下的修饰，修饰后amoC的氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.3上第151位的氨基酸S取代为G，记为SEQ ID NO.28。
本发明的第二目的在于提供编码根据修饰的氨单加氧酶中的任一种的核酸序列及其互补核酸序列。
本发明的第三目的在于公开了一种表达构建体，其包含在调节核酸序列的遗传控制下的前述核酸序列。
本发明的第四目的在于公开了一种载体，其包含前述核酸序列或前述表达构建体。
本发明的第五目的在于公开了一种微生物，其包含前述核酸序列或前述表达构建体或根据前述的载体；所述微生物属于大肠杆菌(Escherichi)BL21(DE3)、w3110；亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)；亚硝化螺菌(Nitrosospira)；枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)；毕赤酵母(Pichiapastoris)；马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)以及假单胞菌(Pseudomonas)中的一种。
本发明的第六目的在于公开了用于制备前述修饰的氨单加氧酶的方法，其包括在适于氨单加氧酶表达的条件下培养根据微生物的步骤。
本发明的第七目的在于公开了用于氨氮降解的方法，其包括以下步骤，
a1)使修饰的氨单加氧酶与氨氮混合并反应，并使氨氮由此转换成NH2OH；或
a2)使微生物与氨氮混合并反应。
本发明的有益效果为：
本发明针对氨单加氧酶的底物结合口袋中一些氨基酸残基做替换改造成小分子氨基酸，最终扩大口袋以提升底物和酶蛋白间的相互作用，提升酶促反应效率，最终从根源上提升氨氧化速度，可应用于任何需要消除氨氮的场景中，例如污水处理、湖泊治理等领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。在附图中：
图1为本发明实施例1中SEQ ID NO.4所示的氨单加氧酶的电泳结果图，其中：A泳道对应的是含有amoB上位点K53I和M67V改变后基因的质粒，B泳道对应的是amoB上位点K53I和M67V改变后的基因，C泳道为DNA Marker；
图2为本发明实施例1中SEQ ID NO.17所示的氨单加氧酶的电泳结果图，其中：A泳道对应的是含有amoA上位点M79I改变后基因的质粒，B泳道对应的是amoA上位点M79I改变后的基因，C泳道为DNA Marker；
图3为本发明实施例1中SEQ ID NO.38所示的氨单加氧酶的电泳结果图；A泳道对应的是含有amoC上位点S151G改变后基因的质粒，B泳道对应的是amoC上位点S151G改变后的基因，C泳道为DNA Marker；
图4为本发明实施例1中SEQ ID NO.4所示的氨单加氧酶的图谱；
图5为本发明实施例1中SEQ ID NO.17所示的氨单加氧酶的图谱；
图6为本发明实施例1中SEQ ID NO.38所示的氨单加氧酶的图谱；
图7为本发明实施例1中原始菌株和m1-m33菌株的相对酶活性测定图；
图8为本发明实施例1中A亚基的关键残基图；
图9为本发明实施例1中A亚基的活性口袋图；
图10为本发明实施例1中B亚基的关键残基图；
图11为本发明实施例1中B亚基的活性口袋图；
图12为本发明实施例1中C亚基的关键残基图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
如本文所述，术语“氨单加氧酶”和“amo”是指催化氨氮与氧气反应产生NH2OH的酶。本发明提供经修饰的amo酶蛋白，其具有提高的催化氨氮与氧气反应生NH2OH的活性和，或这具有改进的动力学性质，包括但不限于提高的酶活、相对酶活、提高Vmax、降低的Km和提高Kcat等。
如本文所述，术语“氨基酸”包括蛋白质中非天然氨基酸和天然存在的氨基酸。蛋白质中天然存在的氨基酸的单字母和三字母命名采用本领域惯用名，如表1所示。
表1氨基酸及字母简写
| 氨基酸名称 | 单字母 | 多字母 |
| 丙氨酸 | A | Ala |
| 精氨酸 | R | Ara |
| 天冬酰胺 | N | Asn |
| 天冬氨酸 | D | Asp |
| 半胱氨酸 | C | Cys |
| 谷氨酰胺 | Q | Gln |
| 谷氨酸 | E | Glu |
| 甘氨酸 | G | Gly |
| 组氨酸 | H | His |
| 异亮氨酸 | I | Ile |
| 亮氨酸 | L | Leu |
| 赖氨酸 | K | Lys |
| 甲硫氨酸 | M | Met |
| 苯丙氨酸 | F | Phe |
| 脯氨酸 | K | Pro |
| 丝氨酸 | S | Ser |
| 苏氨酸 | T | Tir |
| 色氨酸 | W | Trp |
| 酪氨酸 | Y | Tyr |
| 缬氨酸 | V | Val |
如本文所述，术语“修饰”是指对由本发明的氨基酸序列的一切修饰，例如删除、取代、插入和/或添加一或多个氨基酸等方法。
本发明针对现有氨单加氧酶的空间位阻大，导致关键氨基酸残基难以与底物分子发生相应的作用，最终导致氨氮清除效果差的问题，从底物结合口袋着手，通过将底物结合口袋中的一些残基做替换改造成小分子氨基酸来扩大口袋，以提升底物和酶蛋白间的相互作用，提升酶促反应效率，最终从根源上提升氨氧化速度。
本发明公开一种经修饰的氨单加氧酶，原始氨单加氧酶由原始amoA、原始amoB以及原始amoC组成，原始amoA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，原始amoB的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，原始amoC的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；原始amoA、原始amoB以及原始amoC中至少一个的氨基酸序列被修饰；
需要说明的是：SEQ ID NO.1定义了原始衍生自硝化细菌的氨单加氧酶中amoA的氨基酸序列。同理，SEQ ID NO.2定义了原始衍生自硝化细菌的氨单加氧酶中amoB的氨基酸序列。SEQ ID NO.3定义了原始衍生自硝化细菌的氨单加氧酶中amoC的氨基酸序列。
“修饰的氨单加氧酶”具有与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3中定义的氨基酸序列相差至少一个不同的氨基酸，即amoA、amoB以及amoC中至少一个亚基被修饰，即既可以是amoA、amoB以及amoC中的任意一个被修饰，也是可以任意两个同时被修改，还可以三个同时被修改。其中每一个亚基上被修饰的氨基酸数量至少包括一个，即可以是1个，还可以是2个，也可以是两个以上的任意数值。此处的修饰可以是增加、减少以及替换中的至少一种方式。
修饰的氨单加氧酶和原始氨单加氧酶相比，两者均具有催化NH3氧化为NH2OH的活性，但是前者具有提高的催化氨氮、氧气与氢供体反应生成NH2OH的活性和/或具有改进的动力学性质(例如，提高酶活、提高相对酶活、提高的Kcat值、提高Vmax值、降低的Km值或增加的Vmax/Km)。
如本文所述，术语“Vmax”是指最大催化反应速度；定义为在一定酶浓度下，所能达到的催化反应的最大速度。具体而言，在酶浓度不变的条件下，当底物浓度在一定范围内时，反应速度通常会随着底物浓度的提升而提升；而当底物浓度达到一定值时，反应速度达到最大值(即Vmax)，不再随着底物浓度的提升而提升。
如本文所述，术语“Km”是指米氏常数；定义为在一定酶浓度下，当催化速度达到最大催化速度(即Vmax)的一半时的底物浓度。
如本文所述，术语“Kcat”是指催化常数；定义为在底物浓度处于饱和状态下，一个酶(或一个酶活性部位)催化一个反应有多快的测量；它等于最大反应速度除以总的酶浓度Vmax/[E]total)，或者是每摩尔酶活性部位每秒钟转化为产物的底物的摩尔数。
如本文所述，术语“酶活”是指酶促转化速率；定义为在一定条件下，它所催化的某一化学反应的转化速率来表示，可以用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。术语“相对酶活”是指突变后所得菌株的酶活与野生型菌株的酶活之间的比值。
酶活力的测定既可以通过定量测定酶反应的产物或底物数量随反应时间的变化，也可以通过定量测定酶反应底物中某一性质的变化，如黏度变化来测定。本文主要是用单位体积单位时间的底物NH3减少量或产物NH2OH增加量来表示。
在原始氨单加氧酶的氨基酸序列进行以下位置的替换得到新的目标氨基酸序列：
其中，原始amoA上进行修饰所得氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.1上第79位的氨基酸M取代为I，记为SEQ ID NO.4；
SEQ ID NO.1上第83位的氨基酸W取代为L，记为SEQ ID NO.5；
SEQ ID NO.1上第41位的氨基酸H取代为P，记为SEQ ID NO.6；
SEQ ID NO.1上第103位的氨基酸E取代为D，记为SEQ ID NO.7；
SEQ ID NO.1上第53位的氨基酸F取代为L，记为SEQ ID NO.8；
SEQ ID NO.1上第79位的氨基酸M取代为V，记为SEQ ID NO.9；
SEQ ID NO.1上第79位的氨基酸M取代为I，且SEQ ID NO.1上第83位的氨基酸W取代为L，记为SEQ ID NO.10；
SEQ ID NO.1上第79位的氨基酸M取代为I，且SEQ ID NO.1上第41位的氨基酸H取代为P，记为SEQ ID NO.11；
SEQ ID NO.1上第79位的氨基酸M取代为I，且SEQ ID NO.1上第103位的氨基酸E取代为D，记为SEQ ID NO.12；
SEQ ID NO.1上第79位的氨基酸M取代为I，SEQ ID NO.1上第83位的氨基酸W取代为L，且SEQ ID NO.1上第41位的氨基酸H取代为P，记为SEQ ID NO.13；
SEQ ID NO.1上第79位的氨基酸M取代为I，SEQ ID NO.1上第83位的氨基酸W取代为L，且SEQ ID NO.1上第103位的氨基酸E取代为D，记为SEQ ID NO.14；
SEQ ID NO.1上第41位的氨基酸H取代为P，且SEQ ID NO.1上第53位的氨基酸F取代为L，记为SEQ ID NO.15；
SEQ ID NO.1上第41位的氨基酸H取代为P，SEQ ID NO.1上第83位的氨基酸W取代为L，且SEQ ID NO.1上第53位的氨基酸F取代为L，记为SEQ ID NO.16。
其中，原始amoB上进行修饰所得氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.2上第53位的氨基酸K取代为T，记为SEQ ID NO.17；
SEQ ID NO.2上第67位的氨基酸M取代为V，记为SEQ ID NO.18；
SEQ ID NO.2上第48位的氨基酸Q取代为L，记为SEQ ID NO.19；
SEQ ID NO.2上第54位的氨基酸W取代为L，记为SEQ ID NO.20；
SEQ ID NO.2上第67位的氨基酸M取代为I，记为SEQ ID NO.21；
SEQ ID NO.2上第54位的氨基酸W取代为G，记为SEQ ID NO.22；
SEQ ID NO.2上第53位的氨基酸K取代为T，且SEQ ID NO.2上第67位的氨基酸M取代为V，记为SEQ ID NO.23；
SEQ ID NO.2上第53位的氨基酸K取代为T，且SEQ ID NO.2上第48位的氨基酸Q取代为L，记为SEQ ID NO.24；
SEQ ID NO.2上第53位的氨基酸K取代为T，且SEQ ID NO.2上第54位的氨基酸W取代为L，记为SEQ ID NO.25；
SEQ ID NO.2上第53位的氨基酸K取代为T，SEQ ID NO.2上第67位的氨基酸M取代为V，且SEQ ID NO.2上第48位的氨基酸Q取代为L，记为SEQ ID NO.26；
SEQ ID NO.2上第53位的氨基酸K取代为T，SEQ ID NO.2上第67位的氨基酸M取代为V，且SEQ ID NO.2上第54位的氨基酸W取代为L，记为SEQ ID NO.27。
其中，原始amoC上进行修饰所得氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.3上第151位的氨基酸S取代为G，记为SEQ ID NO.28。
在一些实施方案中，原始amoA(如SEQ ID NO.1所示)、经修饰amoA(如SEQ IDNO.4-16所示)与amoB(如SEQ ID NO.2所示)、经修饰amoB(如SEQ ID NO.17-27所示)、原始amoC(如SEQ ID NO.3所示)、经修饰amoC(如SEQ ID NO.28所示)，经一定的分子克隆实验方法操作后，amoA、amoB、amoC三个亚基进行了不同的重组，然后制备成不相同的克隆子，并且表达重组氨单加氧酶。
在一些实施方案中，上述经修饰的amoA包含位置79、83、41、103、53的氨基酸取代，上述位置可按照SEQ ID NO.1来顺序排号。优选地，位置79的M取代为V、或更优选的I。优选地，位置83的W取代为L。优选地，位置41的H取代为P。优选地，位置103的E取代为D。优选地，位置53的F取代为L。
在一些实施方案中，上述经修饰的amoB包含位置53、67、48、54的氨基酸取代，所属位置可按照SEQ ID NO.2来顺序排号。优选地，位置53的K取代为T。优选地，位置67的M取代为I、或更优选的V。优选地，位置48的Q取代为L。优选地，位置54的W取代为G、或更优选的L。
在一些实施方案中，上述经修饰的amoC包含位置151的氨基酸取代，所属位置可按照SEQ ID NO.3来顺序排号。优选地，位置151的S取代为G。
在一些实施方案中，上述经修饰的amoA包含SEQ ID NO.4-16之一的氨基酸序列。
在一些实施方案中，上述经修饰的amoB包含SEQ ID NO.17-27之一的氨基酸序列。
在一些实施方案中，上述经修饰的amoC包含SEQ ID NO.28之一的氨基酸序列。
修饰的氨单加氧酶催化氨氮与氧气等反应生成羟胺的活性是SEQ ID NO:1-3组成的氨单加氧酶的催化此反应活性的至少100％、105％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％或更高。
如本文所述，术语“氨氮”是指还原态的含氮物质，包括氨气NH3和铵盐中铵根离子NH4 +。“氨氮”包括但不限于铵盐(例如NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2SO4、醋酸铵等)、及一些含有铵根离子的有机物。在一些实施方案中，上述氨氮是铵盐，例如NH4Cl和NH4CO3等；在一些实施方案中，上述氨氮是氨气，例如NH3。
为表达本发明的经修饰的氨单加氧酶，还提供包含本发明的多核苷酸的核酸构建体和载体，如表达载体。
如本文所述，术语“表达”包括多肽生产中包含的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因或者被修饰为含有天然不存在的核酸区段。当上述核酸构建体含有表达本发明编码序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
术语“保守取代”也称为由“同源”氨基酸残基取代，是指其中氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基置换的取代，例如，非极性侧链氨基酸(例如脯氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、色氨酸、甲硫氨酸)、芳香侧链氨基酸(例如色氨酸、组氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)、非荷电极性侧链氨基酸(例如谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺)、β-分支的侧链氨基酸(例如异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸)、碱性侧链的氨基酸(例如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)及酸性侧链的氨基酸(例如谷氨酸、天冬氨酸)。
保守氨基酸取代一般对表达蛋白质活性的影响是最小的。这种取代在下文描述。保守取代是用芳香性、电荷、大小、空间特征、疏水性、空间特征、极性等相似的氨基酸置换一个氨基酸。当希望精细调节蛋白质的特性时，这种取代通常是保守的。如本文所述，“同源”氨基酸残基是指具有相似化学性质的氨基酸残基，上述化学性质涉及疏水性、电荷、极性、空间特征、芳香性特征等。彼此同源的氨基酸的例子包括正电荷的赖氨酸、精氨酸、组氨酸，负电荷的谷氨酸、天冬氨酸，疏水性的甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸，极性的丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺，芳香性的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸，化学相似侧链基团的丝氨酸与苏氨酸，或者谷氨酰胺和天冬酰胺，或者亮氨酸和异亮氨酸。
蛋白质中氨基酸保守取代的例子包括：Ile或Val取代Leu，Ser取代Ala，Asp取代Glu，Pr取代Gly，Lys取代Arg，Ser取代Thr，Gln或His取代Asn，Glu取代Asp，Trp或Phe取代Tyr，Asn取代Gln，Asn或Gln取代His，Leu或Val取代Ile，Leu或Ile取代Met，Met、Leu或Tyr取代Phe，Thr取代Ser，Arg或Gln取代Lys，Tyr取代Trp，Ser取代Cys及Ile或Leu取代Val。
术语“表达载体”在本文是指线性或环形DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，上述多核苷酸与为上述多核苷酸表达而提供的另外的核苷酸，例如，控制序列，可操纵地连接。上述表达载体包括病毒载体或质粒载体。
编码本发明氨基酸序列可以进行各种操作，以使得氨基酸序列表达。在将其插入载体之前，根据表达载体对氨基酸序列的操作是可取的或必需的。利用重组DNA方法修饰多氨基酸序列的技术为本领域熟知。
对于本发明，为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的相同性百分比，以最佳比较为目的比对序列(例如在第一个氨基酸或核酸序列中可导入缺口，以与第二个氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的位置在第二个序列中相应位置由相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则这些分子在这个位置是相同的。两个序列之间的相同性百分比是上述序列共有的相同位置的数量的函数(即相同性百分比＝相同位置的数量/位置(即重叠位置)的总数量×100)。优选地，这两个序列是相同长度的。
本领域技术人员知晓，可以使用一定的计算机程序确定两个序列之间的相同性。“氨基酸相同性百分比”或者“氨基酸序列相同性百分比”是指两个多肽在氨基酸上的比较，当最佳比对时，上述两个多肽具有大约指定的相同氨基酸百分比。例如，“95％的氨基酸相同性”是指两个多肽的氨基酸比较，当处于最佳比对时，上述两个多肽有95％的氨基酸相同。
为了鉴定和选择包含本发明的表达载体的宿主细胞，本发明的载体优选含有一或多个可选择标记，其使得可以对转化、转染、转导等的细胞进行简单的选择。可选择标记是一种基因，其产物提供生物杀灭剂或病毒抗性、重金属抗性、补充营养缺陷型等。例如，细菌的可选择标记是来大肠杆菌或硝化细菌的dal基因。
本发明的载体可整合进宿主细胞基因组中或者在细胞中不依赖于基因组而自主复制。为了整合进宿主细胞基因组中或者自主复制所需的元件是本领域已知的。
载体DNA可以通过常规转化或转染技术导入原核或真核细胞中。如本文所述，术语“转化”和“转染”是指将外源核酸(例如DNA)导入宿主细胞中的各种本领域公认的技术，可见于相关实验室手册。
本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的氨基酸，上述氨基酸有利地用于氨单加氧酶多肽的重组产生中。包含本发明氨基酸的载体被导入宿主细胞中，由此上述载体作为染色体整合体或作为自身复制染色体外载体被保留。本领域技术人员知晓表达蛋白质的常规载体和宿主细胞。
在一些实施方案中，上述表达载体是pEASY-Blunt、pET24a(+)、pET28b、pTrc99a、pET-30a(+)等质粒。
在一些实施方案中，本发明的宿主细胞或微生物是大肠杆菌(Escherichi)BL21(DE3)、w3110；亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)；亚硝化螺菌(Nitrosospira)；枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)；毕赤酵母(Pichiapastoris)；马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)；假单胞菌(Pseudomonas)等。
本发明的经修饰的氨单加氧酶可以与非-氨单加氧酶多肽(例如异源氨基酸序列)可操纵地连接，形成融合蛋白。例如，在一个实施方案中，上述融合蛋白是His-amo融合蛋白，其中amo序列与His序列的C-末端融合。这种融合蛋白可帮助重组氨单加氧酶的纯化。在另一实施方案中，上述融合蛋白是在其N末端含有异源信号序列的amo蛋白。在某些宿主细胞中(例如哺乳动物和酵母宿主细胞)，可以通过使用异源信号序列增加氨单加氧酶的表达和/或分泌。
本发明公开了一种用于氨氮降解的方法，转化为羟胺和继续反应生成亚硝酸盐，以实现硝化细菌高效降氨氮的方法，包括使本发明的经修饰的氨单加氧酶或宿主细胞与氨氮、氧气等接触。
在一些实施方案中，使用无细胞催化方法生产羟胺并进一步反应生成亚硝酸盐，在步骤(a1)中，提供本发明的经修饰的氨单加氧酶。
在一些实施方案中，可以使用游离或固定化的本发明的修饰的氨单加氧酶。
在一些实施方案中，上述氨氮是铵盐，例如NH4Cl、NH4HCO3。
在一些实施方案中，上述反应的温度在20～40℃，优选25～35℃，更优选28～35℃，例如30℃进行。
在一些实施方案中，上述反应过程中还添加有反应介质，反应介质包含缓冲液，例如PBS、Tris-HCl缓冲液。
在一个实施方案中，上述反应介质包含PBS，例如100mM的PBS。在一些实施方案中，上述反应介质的pH值为7.5-8。
在一些实施方案中，上述反应介质是部分或全部由细胞培养基组成的介质，本发明的经修饰的氨单加氧酶的活性由本发明的大肠杆菌、硝化细菌等宿主细胞提供，上述硝化细菌细胞在上述反应介质中培养。
在一些实施方案中，上述反应介质是部分或全部由细胞培养基组成的介质。
在一些实施方案中，将本发明的宿主细胞和/或上述第二宿主细胞在细胞培养基中培养并扩增，然后从细胞培养基分离经扩增的宿主细胞，使用缓冲液或水使生物量重悬浮。在加入上述经扩增的宿主细胞之前、期间或之后向上述缓冲液或水提供氨氮。
实施例1
1.材料和方法
如无特别说明，本发明中涉及到的实验方法均为常规方法，Sambrook et al.,1989是基因克隆操作具体主要的参考对象。
1)试剂：DNA聚合酶(PrimeSTAR Max DNA Polymerase)购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自碧云天公司。
2)载体和菌株：所使用的表达载体为pEASY-Blunt、pET24a(+)、pET28b、pTrc99a、pET-30a(+)等质粒，质粒购自碧云天等，所使用的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)、枯草芽孢杆菌或自培养硝化细菌Nitrosomonas、Nitrosospira等。
3)测序与引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司、擎科、赛默飞等公司完成。
4)全基因合成：
按照目标序列的基因，合成由一种或多种不同经修饰的amoA、amoB和amoC基因、或初始amoA、amoB和amoC基因组成的pEASY-Blunt、pET24a(+)、pET28a(+)、pET28b、pTrc99a、pET-30a(+)等质粒，即上述总计20种氨基酸序列分成三种不同亚基并在质粒中组合。收到质粒先PCR扩增并在凝胶成像系统上验证经修饰amoA、amoB、amoC基因长度是否正确，然后将其电转进入宿主细胞，涂布于LB琼脂培养基(含有50mg/L的抗生素，种类根据质粒抗性而定)、挑单菌落至LB液体培养基或硝化细菌富集培养基(含有50mg/L的抗生素)中培养，测序验证突变正确性。经验证的克隆置于-80℃保藏备用。若收到的是含表达质粒的甘油菌，则直接可以验证突变正确后保藏使用。
本实施例公开33种菌株，具体如下：
wt野生型菌株，其基因包括原始amoA、原始amoB以及原始amoC；
m1菌株，其基因包括SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3；
m2菌株，其基因包括SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3；
m3菌株，其基因包括SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3；
m4菌株，其基因包括SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3；
m5菌株，其基因包括SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3；
m6菌株，其基因包括SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3；
m7菌株，其基因包括SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3；
m8菌株，其基因包括SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3；
m9菌株，其基因包括SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3；
m10菌株，其基因包括SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3；
m11菌株，其基因包括SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3；
m12菌株，其基因包括SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3；
m13菌株，其基因包括SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3；
m14菌株，其基因包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.17以及SEQ ID NO.3；
m15菌株，其基因包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.18以及SEQ ID NO.3
m16菌株，其基因包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.19以及SEQ ID NO.3
m17菌株，其基因包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.20以及SEQ ID NO.3
m18菌株，其基因包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.21以及SEQ ID NO.3
m19菌株，其基因包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.22以及SEQ ID NO.3
m20菌株，其基因包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.28
m21菌株，其基因包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.23以及SEQ ID NO.3
m22菌株，其基因包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.24以及SEQ ID NO.3
m23菌株，其基因包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.25以及SEQ ID NO.3
m24菌株，其基因包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.26以及SEQ ID NO.3
m25菌株，其基因包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.27以及SEQ ID NO.3
m26菌株，其基因包括SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.17以及SEQ ID NO.3；
m27菌株，其基因包括SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.19以及SEQ ID NO.3；
m28菌株，其基因包括SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.17以及SEQ ID NO.3；
m29菌株，其基因包括SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.21以及SEQ ID NO.3；
m30菌株，其基因包括SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.19以及SEQ ID NO.3；
m31菌株，其基因包括SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.19以及SEQ ID NO.3；
m32菌株，其基因包括SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.24以及SEQ ID NO.3；
m33菌株，其基因包括SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.17以及SEQ ID NO.3。
5)蛋白质表达及粗酶液的制备：
在LB琼脂培养基或硝化细菌富集培养基上将保藏的克隆活化。然后，将单菌落接种至LB液体培养基或硝化细菌富集培养基(含有50mg/L的抗生素)中，37℃振荡培养12h。将1mL培养物转接至50mL新鲜的LB液体培养基或硝化细菌富集培养基(含有50mg/L的抗生素)中，37℃振荡培养至OD600达到0.4-0.8左右，加入IPTG(终浓度为0.4mM)在25℃温育16h以诱导蛋白质表达。
温育后，将培养物以4000rpm在4℃离心10min，弃上清，收集大肠杆菌或硝化细菌细胞。将收集的大肠杆菌或硝化细菌细胞重悬于预冷的15mL pH 7.0的50mM PBS中，在4℃超声破碎大肠杆菌或硝化细菌细胞，或在冰水浴下使用均质机进行两次以上的破壁，或使用表面活性剂等化学方法直接溶胞。
细胞破碎液以6000g在4℃离心15min去除沉淀；然后将每一种亚基的制得的上清液进行等物质的量浓度的混合，即为含重组酶的粗酶液。将每种突变体的粗酶液进行编号，分类保藏于-20℃冰箱中。
6)酶活性测定
向PBS(100mM)溶液，中加入NH4Cl、NADH(也可以用NADPH、quinones醌类、FAD还原态、FMN还原态)，并用1moL/L氢氧化钠调节溶液pH值至8，溶液中羟胺的终浓度为100mM，NH4Cl的终浓度为50mM，而NADH的终浓度为0.2g/L(也可以是等物质的量浓度的NADPH、quinones醌类、FAD还原态、FMN还原态)。向上述溶液加入如5)中描述的方法制备的氨单加氧酶粗酶液，amo终浓度为0.02g/L，而氨单加氧酶的终浓度为0.2g/L。在30℃，于振荡器上持续振荡(400rpm)2小时，取样并用HJ535-2009纳氏试剂分光光度法检测氨氮降解量、用GB7493-87分光光度法检测亚硝态氮生成量、用HJ/T 346-2007紫外分光光度法检测硝态氮生成量，用高效液相色谱法检测羟胺生成量，从而测定催化反应初始速度。
由测定的酶活性可知，本发明公开修饰的氨单加氧酶与原始氨单加氧酶相比，具有更好的酶活性。
7)酶动力学测定
在96孔酶标板上制备和分装多个200μL反应体系，其中含100mMpH7.5PBS(用1moL/L氢氧化钠调pH)、0.15mM的NADH(等物质的量浓度的NADPH、quinones醌类、FAD还原态、FMN还原态)、50mM的NH4Cl，10％体积稀释后的粗酶液(稀释500倍)、不同浓度底物NH4Cl(5-100mM)，分别按HJ535-2009、GB7493-87和HJ/T 346-2007的方法依次添加纳氏试剂和酒石酸钾钠溶液、显色剂、氨基磺酸和稀盐酸，然后在30℃分别检测420nm、540nm、220nm和275nm吸光强度的变化，记录并计算吸收随时间的变化率mA/min。所得参数带入Michaelis-Menten方程等反应动力学数学模型，其中的反应速度用吸光度随时间变化率计。然后分别计算出氨氮、亚硝态氮、硝态氮的随时间变化曲线。
实验例
目标氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的氨单加氧酶(突变位点为SEQ ID NO.1中M79I)进行琼脂糖凝胶电泳实验，结果如图1所示，由举例的图1及更多其他突变株电泳图可知，经过突变后amoA基因的DNA序列都长度正确；图谱如图4所示。
目标氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示的氨单加氧酶(突变位点为SEQ ID NO.2中K53T+M67V)进行琼脂糖凝胶电泳实验，结果如图2所示，由图2可知，由举例的图2及更多其他突变株电泳图可知，经过突变后amoB基因的DNA序列都长度正确，图谱如图5所示。
目标氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示的氨单加氧酶(突变位点为SEQ ID NO.3中S151G)进行琼脂糖凝胶电泳实验，结果如图3所示，由图3可知，由举例的图3及更多其他突变株电泳图可知，经过突变后amoC基因的DNA序列都长度正确，图谱如图6所示。
对本实施例所得到的wt菌株～m33菌株进行相对酶活测定，结果如图7所示，需要说明的是：相对酶活有四种情况：1、活性被改没了，图中会直接变成0％，这种是改到了结构域或活性中心了，负突变之一；2、活性减少，图中会变成0～100％间，这种属于把底物结合口袋缩小或提高了反应活化能，也是负突变；3、无变化，即100％，属于同义突变，证明此改动蛋白结构无任何变化，点位是无义氨基酸残基或相同三联密码子；4、活性增加，即超过100％，正向突变，就是我们要达到的理想效果，越高越好。
由图7可知，与野生型菌株wt相比，m1、m2、m3、m7、m8、m10、m14、m15、m16、m18、m20、m21、m22、m23、m25、m26、m27、m28、m30以及m33的活性增加，说明相应位置的突变是有益的，特别是m27和m33。
amoA的关键残基和底物活性口袋如图8和9所示。amoB的关键残基和底物活性口袋如图10和11所示。amoC的关键残基如图12所示。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.经修饰的氨单加氧酶，在原始氨单加氧酶的基础上进行修饰所获得的；
原始氨单加氧酶由原始amoA、原始amoB以及原始amoC组成，原始amoA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，原始amoB的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，原始amoC的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；其特征在于，原始amoA和原始amoB的氨基酸序列被修饰；
其中，修饰后amoA的氨基酸序列如下所示：
SEQ ID NO.1上第41位的氨基酸H取代为P，记为SEQ ID NO.6；
修饰后amoB的氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.2上第48位的氨基酸Q取代为L，记为SEQ ID NO.19。
2.编码根据权利要求1所述的修饰的氨单加氧酶中的任一种的核酸序列及其互补核酸序列。
3.表达构建体，其包含在调节核酸序列的遗传控制下的权利要求2的核酸序列。
4.载体，其包含权利要求2的核酸序列或权利要求3的表达构建体。
5.微生物，其包含权利要求2的核酸序列或权利要求3的表达构建体或根据权利要求4所述的载体；所述微生物属于大肠杆菌(Escherichi) BL21(DE3)、w3110；亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)；亚硝化螺菌(Nitrosospira)；枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)；毕赤酵母(Pichiapastoris)；马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)以及假单胞菌(Pseudomonas)中的一种。
6.用于制备权利要求1修饰的氨单加氧酶的方法，其包括在适于氨单加氧酶表达的条件下培养根据权利要求5所述微生物的步骤。
7.用于氨氮降解的方法，其包括以下步骤，
a1)使根据权利要求1所述修饰的氨单加氧酶与氨氮混合并反应，并使氨氮由此转换成NH2OH；或
a2)使根据权利要求5所述微生物与氨氮混合并反应。
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