JP2009118806A - １−プロパノールの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】微生物を用いる１−プロパノールの効率のよい製造方法および該製造に用いうる微生物を提供する。
【解決手段】糖類から１，２−プロパンジオールを経て１−プロパノールを生合成する能力を有する微生物。好ましくは、宿主微生物に、ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールを生合成する経路に関与する酵素をコードする遺伝子を組み込んで得られる微生物。より好ましくは、さらにグリセロールから１，３−プロパンジオールを生合成する経路に関与する遺伝子を組み込んで得られる微生物。また、これらの微生物を培地に培養し、培養物中に１−プロパノールを生成、蓄積させ、該培養物から１−プロパノールを採取する、１−プロパノールの製造方法。
【選択図】なし
【解決手段】糖類から１，２−プロパンジオールを経て１−プロパノールを生合成する能力を有する微生物。好ましくは、宿主微生物に、ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールを生合成する経路に関与する酵素をコードする遺伝子を組み込んで得られる微生物。より好ましくは、さらにグリセロールから１，３−プロパンジオールを生合成する経路に関与する遺伝子を組み込んで得られる微生物。また、これらの微生物を培地に培養し、培養物中に１−プロパノールを生成、蓄積させ、該培養物から１−プロパノールを採取する、１−プロパノールの製造方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、１−プロパノールの製造方法および該製造に用い得る微生物に関する。
１−プロパノールは、多目的溶剤として、印刷用インク、化粧品、乳液、窓清掃剤、研磨剤、防腐剤、各種の化合物の製造における中間物質等に使用されることが多い。
１−プロパノールの化学的合成方法として、エチレンと一酸化炭素および水素との反応からプロピオンアルデヒドを生じさせ、水素添加して製造する方法が知られている。
１−プロパノールの化学的合成方法として、エチレンと一酸化炭素および水素との反応からプロピオンアルデヒドを生じさせ、水素添加して製造する方法が知られている。
一方、生物を用いる１−プロパノールの製造方法としては、１−プロパノールがエタノール発酵などの副生物として発酵生産されることを利用した方法があげられるが、主生成物たるエタノールとの分離が容易ではないため、工業的な製造方法としては適していない。
土壌から分離された微生物であるジオバシラス（Geobcillus） BS-001株を用いる製造方法（特許文献１参照）も知られているが、生産性が低いという問題がある。
土壌から分離された微生物であるジオバシラス（Geobcillus） BS-001株を用いる製造方法（特許文献１参照）も知られているが、生産性が低いという問題がある。
グルコースから１，２−プロパンジオールが生合成されること（非特許文献１参照）、および１，２−プロパンジオールから１−プロパノールが生合成されること（非特許文献２参照）は知られているが、グルコース等の糖類から１−プロパノールを効率よく生成する微生物、製造方法等は知られておらず、開発が望まれている。
本発明の目的は、微生物を用いる１−プロパノールの効率のよい製造方法および該製造に用い得る微生物を提供することにある。
本発明は、以下の（１）〜（１１）に関する。
（１） 糖類から１，２−プロパンジオールを経て１−プロパノールを生合成する能力を有する微生物。
（２） 糖類からジヒドロキシアセトンリン酸を経て１，２−プロパンジオールを生合成する、上記（１）の微生物。
（３） 糖類が、グルコースまたはグリセロールである、上記（１）又は（２）の微生物。
（４） 宿主微生物に、ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールを生合成する経路に関与する酵素をコードする遺伝子を組み込んで得られる、上記（１）から（３）のいずれか一つの微生物。
（５） ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールを生合成する経路に関与する酵素をコードする遺伝子が、メチルグリオキサール合成酵素遺伝子、メチルグリオキサール還元酵素遺伝子およびヒドロキシアセトン還元酵素遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子である、上記（４）の微生物。
（６） さらに、グリセロールから１，３−プロパンジオールを生合成する経路に関与する遺伝子を組み込んで得られる、上記（１）〜（５）いずれか一つの微生物。
（７） グリセロールから１，３−プロパンジオールを生合成する経路に関与する遺伝子が、グリセロールデヒドラターゼ遺伝子、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再生酵素遺伝子、およびアデノシルトランスフェラーゼ遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子である、上記（６）の微生物。
（８） エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、クレブシエラ（Klebsiella）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、クロストリジウム（Clostridium）属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属、ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属およびトリコデルマ(Trichoderma)属に属する微生物からなる群より選ばれる、上記（１）〜（７）いずれか１つの微生物。
（９） エシェリヒア属に属する、上記（１）〜（７）いずれか１つの微生物。
（１０） エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）またはエシェリヒア・ブラッテ（Escherichia blattae）に属する、上記（１）〜（７）いずれか１つの微生物。
（１１） 上記（１）〜（１０）いずれか１つの微生物を培地に培養し、培養物中に１−プロパノールを生成、蓄積させ、該培養物から１−プロパノールを採取する、１−プロパノールの製造方法。
（１） 糖類から１，２−プロパンジオールを経て１−プロパノールを生合成する能力を有する微生物。
（２） 糖類からジヒドロキシアセトンリン酸を経て１，２−プロパンジオールを生合成する、上記（１）の微生物。
（３） 糖類が、グルコースまたはグリセロールである、上記（１）又は（２）の微生物。
（４） 宿主微生物に、ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールを生合成する経路に関与する酵素をコードする遺伝子を組み込んで得られる、上記（１）から（３）のいずれか一つの微生物。
（５） ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールを生合成する経路に関与する酵素をコードする遺伝子が、メチルグリオキサール合成酵素遺伝子、メチルグリオキサール還元酵素遺伝子およびヒドロキシアセトン還元酵素遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子である、上記（４）の微生物。
（６） さらに、グリセロールから１，３−プロパンジオールを生合成する経路に関与する遺伝子を組み込んで得られる、上記（１）〜（５）いずれか一つの微生物。
（７） グリセロールから１，３−プロパンジオールを生合成する経路に関与する遺伝子が、グリセロールデヒドラターゼ遺伝子、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再生酵素遺伝子、およびアデノシルトランスフェラーゼ遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子である、上記（６）の微生物。
（８） エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、クレブシエラ（Klebsiella）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、クロストリジウム（Clostridium）属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属、ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属およびトリコデルマ(Trichoderma)属に属する微生物からなる群より選ばれる、上記（１）〜（７）いずれか１つの微生物。
（９） エシェリヒア属に属する、上記（１）〜（７）いずれか１つの微生物。
（１０） エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）またはエシェリヒア・ブラッテ（Escherichia blattae）に属する、上記（１）〜（７）いずれか１つの微生物。
（１１） 上記（１）〜（１０）いずれか１つの微生物を培地に培養し、培養物中に１−プロパノールを生成、蓄積させ、該培養物から１−プロパノールを採取する、１−プロパノールの製造方法。
本発明により、糖類を用いた微生物による１−プロパノールの効率のよい製造方法および該製造方法に用い得る微生物を提供することができる。
本発明の微生物は、グルコース、グリセロール、キシロース等の糖類、好ましくはグルコースから１，２−プロパンジオールを経て１−プロパノールを生合成する能力を有する微生物であればいずれの微生物も用いられる。
本発明の微生物は、宿主微生物に、ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールを生合成する経路に関与する酵素をコードする遺伝子、および必要に応じてグリセロールから１，３−プロパンジオールを生合成する経路に関与する遺伝子を組み込むことにより得ることができる。
本発明の微生物は、宿主微生物に、ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールを生合成する経路に関与する酵素をコードする遺伝子、および必要に応じてグリセロールから１，３−プロパンジオールを生合成する経路に関与する遺伝子を組み込むことにより得ることができる。
ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールを生合成する経路に関与する酵素をコードする遺伝子としては、メチルグリオキサール合成酵素遺伝子（以下、mgs遺伝子ということもある）、メチルグリオキサール還元酵素遺伝子（以下、arII遺伝子ということもある）およびヒドロキシアセトン還元酵素遺伝子（以下、gldA遺伝子ということもある）、からなる群から選ばれる遺伝子があげられる。
これらの遺伝子は、少なくとも一つを用いればよいが、好ましくは２つ、より好ましくは３つ全てを用いることが望ましい。
これらの遺伝子は、少なくとも一つを用いればよいが、好ましくは２つ、より好ましくは３つ全てを用いることが望ましい。
メチルグリオキサール合成酵素遺伝子は、公知の遺伝子であって、そのいずれの遺伝子を用いてもよい。例えば、配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。
また、配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつメチルグリオキサール合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡもメチルグリオキサール合成酵素遺伝子として用いることができる。
また、配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつメチルグリオキサール合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡもメチルグリオキサール合成酵素遺伝子として用いることができる。
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１００塩基以上、さらに好ましくは２００塩基以上、特に好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができ、プライマーとして用いるＤＮＡとしては、１７塩基以上、好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２５塩基以上のＤＮＡをあげることができる。
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750ｍMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベ
ートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができる。ストリンジェントな条件は、プローブＤＮＡの鎖長やＧＣ含量に応じて調整が可能であり、モレキュラー・クローニング第３版等に記載の方法により設定することができる。また、より低いストリンジェント条件を用いることもできるが、ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件においてハイブリダイゼーションを行った後、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。
ートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができる。ストリンジェントな条件は、プローブＤＮＡの鎖長やＧＣ含量に応じて調整が可能であり、モレキュラー・クローニング第３版等に記載の方法により設定することができる。また、より低いストリンジェント条件を用いることもできるが、ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件においてハイブリダイゼーションを行った後、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばBLAST、FASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号６で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばBLAST、FASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号６で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
塩基配列の相同性は、BLAST、FASTA等のプログラムを用いて決定することができる。
ここで、BLASTおよびFASTA とは、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]、FASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]ををいう。例えば、アルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）。
ここで、BLASTおよびFASTA とは、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]、FASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]ををいう。例えば、アルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）。
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、メチルグリオキサール合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることは、該ＤＮＡを発現する組換え体ＤＮＡを作製し、該組み換え体ＤＮＡを宿主微生物に導入して得られる微生物を培養して得られる培養物からタンパク質を精製し、該精製タンパク質を酵素源として用いて、Cooperらの方法に供して生成するメチルグリオキサールを定量することによって確認することができる。
メチルグリオキサール還元酵素遺伝子は、公知の遺伝子であって、そのいずれの遺伝子を用いてもよい。例えば、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。
また、配列番号６記載の塩基配列で表されるＤＮＡの場合と同様に、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつメチルグリオキサール還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡもメチルグリオキサール還元酵素遺伝子として用いることができる。
また、配列番号６記載の塩基配列で表されるＤＮＡの場合と同様に、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつメチルグリオキサール還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡもメチルグリオキサール還元酵素遺伝子として用いることができる。
上記ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、メチルグリオキサール還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることは、該ＤＮＡを発現する組換え体ＤＮＡを作製し、該組み換え体ＤＮＡを宿主微生物に導入して得られる微生物を培養して得られる培養物からタンパク質を精製し、該精製タンパク質を酵素源として、メチルグリオキサールを基質として用いた際に変化するNADPHの吸光度を測定して確認することができる。
ヒドロキシアセトン還元酵素遺伝子は、公知の遺伝子であって、そのいずれの遺伝子を用いてもよい。例えば、配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。
また、配列番号６記載の塩基配列で表されるＤＮＡの場合と同様に、配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヒドロキシアセトン還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡもヒドロキシアセトン還元酵素遺伝子として用いることができる。
また、配列番号６記載の塩基配列で表されるＤＮＡの場合と同様に、配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヒドロキシアセトン還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡもヒドロキシアセトン還元酵素遺伝子として用いることができる。
上記ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、ヒドロキシアセトン還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることは、該ＤＮＡを発現する組換え体ＤＮＡを作製し、該組み換え体ＤＮＡを宿主微生物に導入して得られる微生物を培養して得られる培養物からタンパク質を精製し、該精製タンパク質を酵素源として用い、ヒドロキシアセトンを基質として用いた際に変化するNADHの吸光度を測定して確認することができる。
グリセロールから１，３−プロパンジオールを生合成する経路に関与する遺伝子としては、グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（以下、dhaT遺伝子ということもある）、グリセロールデヒドラターゼ再生酵素をコードする遺伝子、およびアデノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子があげられる。これらの中でも、グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子を用いることが好ましく、必要に応じて、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を用いることが好ましく、さらに好ましくはこれら４種の全ての遺伝子を用いることが好ましい。
エシェリヒア・ブラッテ（Escherichia blattae）に属する微生物のように宿主微生物が、グリセロールから１，３−プロパンジオールを生合成する活性を有している場合は、グリセロールから１，３−プロパンジオールを生合成する経路に関与する遺伝子は必ずしも用いなくてもよい。
グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子としては、グリセロールデヒドラターゼを構成するサブユニットとしてラージサブユニットをコードする遺伝子（以下、dhaB遺伝子ともいう）、ミディアムサブユニットをコードする遺伝子（以下、dhaC遺伝子ともいう）、およびスモールサブユニットをコードする遺伝子（以下、dhaE遺伝子ともいう）があげられる。グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子を用いる際には、これら３つの遺伝子はいずれも用いることが好ましい。
グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子としては、グリセロールデヒドラターゼを構成するサブユニットとしてラージサブユニットをコードする遺伝子（以下、dhaB遺伝子ともいう）、ミディアムサブユニットをコードする遺伝子（以下、dhaC遺伝子ともいう）、およびスモールサブユニットをコードする遺伝子（以下、dhaE遺伝子ともいう）があげられる。グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子を用いる際には、これら３つの遺伝子はいずれも用いることが好ましい。
dhaB遺伝子、dhaC遺伝子およびdhaE遺伝子の例としては、それぞれ配列番号２１、２２および２３で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
また、上記配列番号６記載の塩基配列で表されるＤＮＡの場合と同様に、これらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼの各サブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもグリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子として用いることができる。
また、上記配列番号６記載の塩基配列で表されるＤＮＡの場合と同様に、これらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼの各サブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもグリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子として用いることができる。
上記ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがグリセロールデヒドラターゼの各サブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることは、該ＤＮＡを発現する組換え体ＤＮＡを作製し、該組み換え体ＤＮＡを宿主微生物に導入して得られる微生物を培養して得られる培養物からタンパク質を精製し、各サブユニットからなるタンパク質を構成させ、該タンパク質を酵素源として用い、常法によりグリセロールデヒドラターゼ活性を測定して確認できる。
１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（dhaT遺伝子）の例としては、配列番号２６で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
また、上記配列番号６記載の塩基配列で表されるＤＮＡの場合と同様に、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子として用いることができる。
また、上記配列番号６記載の塩基配列で表されるＤＮＡの場合と同様に、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子として用いることができる。
上記ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることは、該ＤＮＡを発現する組換え体ＤＮＡを作製し、該組み換え体ＤＮＡを宿主微生物に導入して得られる微生物を培養して得られる培養物からタンパク質を精製し、該タンパク質を酵素源として用い、常法により１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ活性を測定して確認できる。
グリセロールデヒドラターゼ再生酵素をコードする遺伝子としては、グリセロールデヒドラターゼ再生酵素を構成するサブユニットとして、ラージサブユニットをコードする遺伝子（以下、dhaF遺伝子ともいう）、およびスモールサブユニットをコードする遺伝子（以下、dhaG遺伝子ともいう）があげられる。グリセロールデヒドラターゼ再生酵素をコードする遺伝子を用いる際には、これらの２つの遺伝子はいずれも用いることが好ましい。
dhaF遺伝子およびdhaG遺伝子の例としては、それぞれ配列番号２４および２７で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
また、上記配列番号６記載の塩基配列で表されるＤＮＡの場合と同様に、これらの遺伝子のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼ再生酵素の各サブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもグリセロールデヒドラターゼ再生酵素をコードする遺伝子として用いることができる。
また、上記配列番号６記載の塩基配列で表されるＤＮＡの場合と同様に、これらの遺伝子のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼ再生酵素の各サブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもグリセロールデヒドラターゼ再生酵素をコードする遺伝子として用いることができる。
上記ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがグリセロールデヒドラターゼ再生酵素の各サブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることは、該ＤＮＡを発現する組換え体ＤＮＡを作製し、該組み換え体ＤＮＡを宿主微生物に導入して得られる微生物を培養して得られる培養物からタンパク質を精製し、各サブユニットからなるタンパク質を構成させ、該タンパク質を酵素源として用い、常法によりグリセロールデヒドラターゼ再生酵素活性を測定して確認できる。
アデノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子としては、アデノシルトランスフェラーゼを構成するサブユニットとして、ラージサブユニットをコードする遺伝子（以下、dhaI遺伝子ともいう）、およびスモールサブユニットをコードする遺伝子（以下、dhaH遺伝子ともいう）があげられる。アデノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を用いる際には、これらの２つの遺伝子はいずれも用いることが好ましい。
dhaI遺伝子およびdhaH遺伝子の例としては、それぞれ配列番号２５および２８で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
また、上記配列番号６記載の塩基配列で表されるＤＮＡの場合と同様に、これらの遺伝子のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、アデノシルトランスフェラーゼの各サブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもアデノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子として用いることができる。
また、上記配列番号６記載の塩基配列で表されるＤＮＡの場合と同様に、これらの遺伝子のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、アデノシルトランスフェラーゼの各サブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもアデノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子として用いることができる。
上記ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがアデノシルトランスフェラーゼの各サブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることは、該ＤＮＡを発現する組換え体ＤＮＡを作製し、該組み換え体ＤＮＡを宿主微生物に導入して得られる微生物を培養して得られる培養物からタンパク質を精製し、各サブユニットからなるタンパク質を構成させ、該タンパク質を酵素源として用い、常法によりアデノシルトランスフェラーゼ活性を測定して確認できる。
ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールを生合成する経路に関与する酵素をコードする遺伝子および必要に応じてグリセロールから１，３−プロパンジオールを生合成する経路に関与する遺伝子を組み込む宿主微生物としては、糖類からジヒドロキシアセトンリン酸を生合成することのできる微生物が好ましく用いられる。
例えば、エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属、クレブシエラ（Klebsiella）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、クロストリジウム（Clostridium）属等の細菌、ロドコッカス(Rhodococcus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属等の放線菌、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属等の酵母、ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、トリコデルマ(Trichoderma)属等の糸状菌があげられるが、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、アスペルギルス属、クレブシエラ属、ロドバクター属、ストレプトマイセス属に属する微生物が好ましく用いられ、特にエシェリヒア属に属する微生物が好ましく用いられる。
エシェリヒア属に属する微生物としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、エシェリヒア・ブラッテ（Escherichia blattae）等に属する微生物があげられる。
エシェリヒア属に属する微生物としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、エシェリヒア・ブラッテ（Escherichia blattae）等に属する微生物があげられる。
これらの遺伝子の公知の塩基配列情報に基づいて、PCRプライマーを設計、合成し、目的とする遺伝子を有する微生物の染色体を鋳型としてＰＣＲを行うことによって、目的遺伝子を増幅、単離したものを用いることができる。
なお、ＰＣＲに使用するプライマーの５'末端に適当な制限酵素サイトを付加しておくことにより、ベクターの適当な部位に連結させることができ、得られる組換えベクターを用いて宿主微生物に導入することができる。
なお、ＰＣＲに使用するプライマーの５'末端に適当な制限酵素サイトを付加しておくことにより、ベクターの適当な部位に連結させることができ、得られる組換えベクターを用いて宿主微生物に導入することができる。
取得した遺伝子の塩基配列は通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法、や塩基配列分析装置を用いて決定することができる。
取得した遺伝子の塩基配列を決定した結果、該ＤＮＡが部分配列であった場合、該部分配列をプローブとして用い、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長遺伝子を取得することができる。
遺伝子の塩基配列が決定された後は、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成することができる。
取得した遺伝子の塩基配列を決定した結果、該ＤＮＡが部分配列であった場合、該部分配列をプローブとして用い、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長遺伝子を取得することができる。
遺伝子の塩基配列が決定された後は、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成することができる。
宿主微生物に組み込む各遺伝子は、該遺伝子がコードする各酵素の機能を実質的に損なうことがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよく、または削除されていてもよく、あるいは新たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基配列の一部が転位されたものでもよい。
塩基配列の置換、削除、挿入、転移等の操作は、モレキュラー・クローニング第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)等に記載の方法の他、多数の他の標準的な教科書記載の方法に準じて行うことができる。
塩基配列の置換、削除、挿入、転移等の操作は、モレキュラー・クローニング第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)等に記載の方法の他、多数の他の標準的な教科書記載の方法に準じて行うことができる。
宿主微生物への遺伝子の組み込みは、該遺伝子を適当なベクターへ挿入して組み換え体ＤＮＡを調製し、該組み換え体DNAを用いて行うことができる。
具体的には、微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中に本発明に用いられる遺伝子を導入するか、もしくは、直接宿主ゲノム中に本発明に用いられる遺伝子を導入する。
具体的には、微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中に本発明に用いられる遺伝子を導入するか、もしくは、直接宿主ゲノム中に本発明に用いられる遺伝子を導入する。
組み換え体ＤＮＡの作製のための手順および宿主に適合した組み換え体DNAの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、モレキュラー・クローニング第３版等を参照）。
このとき、組み込む遺伝子の５’−側上流にプロモーターを組み込むことが好ましく、３’−側下流にターミネーターを組み込むことがより好ましい。
本発明で用いることができるプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主微生物中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されない。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーターおよびターミネーター等に関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488(1992)、等に詳細に記述されている。
このとき、組み込む遺伝子の５’−側上流にプロモーターを組み込むことが好ましく、３’−側下流にターミネーターを組み込むことがより好ましい。
本発明で用いることができるプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主微生物中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されない。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーターおよびターミネーター等に関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488(1992)、等に詳細に記述されている。
例えばエシェリヒア属、特にエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとしては、pBR、pUC系プラスミドが挙げられ、lac(β-ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、 trc (lac、trpの融合)、λファージ PＬ、PＲなどに由来するプロモーターなどがあげられる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどがあげられる。
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においては、ベクターとしては、pCS11(特開昭57-183799号公報)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミドベクターがあげられる。
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においては、ベクターとしては、pCS11(特開昭57-183799号公報)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミドベクターがあげられる。
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)においては、ベクターとしては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))などのプラスミドベクターをあげることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
バチルス属においては、ベクターとしては、pUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどをあげることができ、また、染色体に導入することもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーターなどが利用できる。
バチルス属においては、ベクターとしては、pUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどをあげることができ、また、染色体に導入することもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーターなどが利用できる。
シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)などで開発されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む)pKT240を挙げることができる。
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae) においては、ベクターとしては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドがあげられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae) においては、ベクターとしては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドがあげられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属においては、ベクターとしては、Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクターをあげることができる。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
アスペルギルス(Aspergillus)属においては、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) 、アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などが糸状菌の中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体への導入が可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)）。
また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が開発されており、それらを適宜使用することができる。
アスペルギルス(Aspergillus)属においては、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) 、アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などが糸状菌の中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体への導入が可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)）。
また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が開発されており、それらを適宜使用することができる。
組み換え体ＤＮＡの宿主微生物への導入方法としては、カルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法等上記宿主微生物へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。
組み換え体ＤＮＡを宿主微生物へ導入して得られた形質転換体は、本発明の微生物として、１−プロパノールの製造に用いることができる。
１−プロパノールの製造は、本発明の微生物を培地に培養して行う。
組み換え体ＤＮＡを宿主微生物へ導入して得られた形質転換体は、本発明の微生物として、１−プロパノールの製造に用いることができる。
１−プロパノールの製造は、本発明の微生物を培地に培養して行う。
培地は、本発明の微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、マンノース、キシロース、フルクトース、サッカロース、グリセロール、オリゴ糖、多糖類、これらを含有する糖蜜等があげられるが、グルコースまたはグリセロールが好ましく用いられ、グルコースがさらに好ましく用いられる。これらの炭素源は単独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。
炭素源としては微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、マンノース、キシロース、フルクトース、サッカロース、グリセロール、オリゴ糖、多糖類、これらを含有する糖蜜等があげられるが、グルコースまたはグリセロールが好ましく用いられ、グルコースがさらに好ましく用いられる。これらの炭素源は単独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸塩もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の願窒素化合物、ならびにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
ビタミン類としては、ビタミンB12等があげられる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
ビタミン類としては、ビタミンB12等があげられる。
培養は、静置培養、振とう培養、深部通気攪拌培養のいずれで行ってもよいが、静置培養が好ましく用いられる。また、窒素ガスや二酸化炭素等を供給して培養する嫌気的培養を行ってもよい。
培養温度は通常１５〜４０℃であり、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやカナマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養温度は通常１５〜４０℃であり、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやカナマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記した方法で製造した１−プロパノールは、必要に応じて、培養液から通常の分離、精製方法で分離、精製することができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１：
（１）ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールを生合成する経路に関与する酵素をコードする遺伝子を有するプラスミドの調製
スポロボロマイセス・サルモニコラ（Sporobolomyces salmonicolor）由来のメチルグリオキサール還元酵素をコードする配列番号３で表されるDNAを含むプラスミドpUCAR2（Kita et al., Appl. Environ. Microbiol., 65: 5207-5211 (1999)）を、EcoRIおよびHindIIIで制限酵素処理し、メチルグリオキサール還元酵素遺伝子を含むDNAを単離、精製し、同様にEcoRIおよびHindIIIで制限酵素処理し、精製したプラスミドpKK223-3 (ＧＥヘルスケア社製、以下同じ)と連結して、プラスミドpKKAR2を得た。このプラスミドを鋳型とし、配列番号１および２で表される塩基配列を有するDNAをプライマーとして用いてPCRを行った。ＰＣＲ法はPrimeSTAR HS DNA Polymerase (タカラバイオ社製)を用い、添付された説明書の記載に準じて行った。以下、PCR法は全て該説明書の記載に準じた。
（１）ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールを生合成する経路に関与する酵素をコードする遺伝子を有するプラスミドの調製
スポロボロマイセス・サルモニコラ（Sporobolomyces salmonicolor）由来のメチルグリオキサール還元酵素をコードする配列番号３で表されるDNAを含むプラスミドpUCAR2（Kita et al., Appl. Environ. Microbiol., 65: 5207-5211 (1999)）を、EcoRIおよびHindIIIで制限酵素処理し、メチルグリオキサール還元酵素遺伝子を含むDNAを単離、精製し、同様にEcoRIおよびHindIIIで制限酵素処理し、精製したプラスミドpKK223-3 (ＧＥヘルスケア社製、以下同じ)と連結して、プラスミドpKKAR2を得た。このプラスミドを鋳型とし、配列番号１および２で表される塩基配列を有するDNAをプライマーとして用いてPCRを行った。ＰＣＲ法はPrimeSTAR HS DNA Polymerase (タカラバイオ社製)を用い、添付された説明書の記載に準じて行った。以下、PCR法は全て該説明書の記載に準じた。
ＰＣＲ後に得られたDNA断片をEcoRIおよびHindIIIで制限酵素処理し、別途EcoRIおよびHindIIIでプラスミドpKK223-3を制限酵素処理して得られたDNA断片と常法に従って連結して、プラスミドpKKARII2を得た。挿入されたDNA断片の塩基配列を常法に準じて調べたところ、メチルグリオキサール還元酵素をコードする配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡを有していた。
一方、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K-12 NBRC3301株の染色体を常法により調製した。得られた染色体を鋳型とし、配列番号４および５で表される塩基配列を有するDNAをプライマーとして用いてPCRを行った。
ＰＣＲ後に得られたDNA断片をEcoRIおよびHindIIIで制限酵素処理し、別途EcoRIおよびHindIIIでプラスミドpKK223-3を制限酵素処理して得られたDNA断片と常法に従って連結し、プラスミドpKKEMGSを得た。挿入されたDNA断片の塩基配列を常法に準じて調べたところ、メチルグリオキサール合成酵素をコードする配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡを有していた。
ＰＣＲ後に得られたDNA断片をEcoRIおよびHindIIIで制限酵素処理し、別途EcoRIおよびHindIIIでプラスミドpKK223-3を制限酵素処理して得られたDNA断片と常法に従って連結し、プラスミドpKKEMGSを得た。挿入されたDNA断片の塩基配列を常法に準じて調べたところ、メチルグリオキサール合成酵素をコードする配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡを有していた。
同様に、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K-12 NBRC3301株の染色体を鋳型とし、配列番号７および８で表される塩基配列を有するDNAをプライマーとしてPCRを行った。
ＰＣＲ後に得られたＤＮＡ断片をEcoRIおよびPstIで制限酵素処理し、別途EcoRIおよびPstIでプラスミドpKK223-3を制限酵素処理して得られたDNA断片と常法に従って連結して、プラスミドpKKEcGLYDHを得た。挿入されたDNA断片の塩基配列を常法に準じて調べたところ、ヒドロキシアセトン還元酵素をコードする配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡを有していた。
ＰＣＲ後に得られたＤＮＡ断片をEcoRIおよびPstIで制限酵素処理し、別途EcoRIおよびPstIでプラスミドpKK223-3を制限酵素処理して得られたDNA断片と常法に従って連結して、プラスミドpKKEcGLYDHを得た。挿入されたDNA断片の塩基配列を常法に準じて調べたところ、ヒドロキシアセトン還元酵素をコードする配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡを有していた。
プラスミドpKKEMGSを鋳型とし、配列番号１０および１１で表される塩基配列を有するDNAをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。
得られたDNAをHpaIおよびXbaIで制限酵素処理し、別途PmaCIおよびXbaIでプラスミドpKKARII2を制限酵素処理して得られたＤＮＡ断片と常法に従って連結してプラスミドpKKArMeを得た。
得られたDNAをHpaIおよびXbaIで制限酵素処理し、別途PmaCIおよびXbaIでプラスミドpKKARII2を制限酵素処理して得られたＤＮＡ断片と常法に従って連結してプラスミドpKKArMeを得た。
また、プラスミドpKKEcGLYDHを鋳型とし、配列番号１０および１１で表される塩基配列を有するDNAをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲ後に得られたDNA断片をHpaIおよびXbaIで制限酵素処理し、別途PmaCIおよびXbaIでプラスミドpKKArMeを制限酵素処理して得られたDNA断片と常法に従って連結してプラスミドpKKArMeGeを得た。挿入されたDNA断片の塩基配列を常法に従って調べ、それぞれarII遺伝子、mgs遺伝子およびgldA遺伝子に該当する配列番号３、６および９で表される塩基配列を有するＤＮＡを有していることを確認した。
ＰＣＲ後に得られたDNA断片をHpaIおよびXbaIで制限酵素処理し、別途PmaCIおよびXbaIでプラスミドpKKArMeを制限酵素処理して得られたDNA断片と常法に従って連結してプラスミドpKKArMeGeを得た。挿入されたDNA断片の塩基配列を常法に従って調べ、それぞれarII遺伝子、mgs遺伝子およびgldA遺伝子に該当する配列番号３、６および９で表される塩基配列を有するＤＮＡを有していることを確認した。
（２）グリセロールから１，３−プロパンジオールを生合成する経路に関与する遺伝子を有するプラスミドの調製
プラスミドpRSFDuet-1 (ノバジェン社製)を鋳型とし、配列番号１２および１３で表される塩基配列を有するDNAをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、RSF oriおよびカナマイシン耐性遺伝子を含む約1800 bpのDNA断片を得た。
また、同様にプラスミドpKK223-3を鋳型とし、配列番号１４および１５で表される塩基配列を有するDNAをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、Ptac、MCS、転写ターミネーターを含む約800 bpのDNA断片を得た。得られた両DNA断片をPvuIIおよびXbaIで制限酵素処理し、常法に従ってこの両DNA断片を連結してプラスミドpRSFAK30を得た。
プラスミドpRSFDuet-1 (ノバジェン社製)を鋳型とし、配列番号１２および１３で表される塩基配列を有するDNAをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、RSF oriおよびカナマイシン耐性遺伝子を含む約1800 bpのDNA断片を得た。
また、同様にプラスミドpKK223-3を鋳型とし、配列番号１４および１５で表される塩基配列を有するDNAをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、Ptac、MCS、転写ターミネーターを含む約800 bpのDNA断片を得た。得られた両DNA断片をPvuIIおよびXbaIで制限酵素処理し、常法に従ってこの両DNA断片を連結してプラスミドpRSFAK30を得た。
エシェリヒア・ブラッテ（Escherichia blattae）ATCC33430の染色体を、ウルトラクリーン・マイクロバイアルDNAキット（エムオー・バイオ・ラボラトリー社製）を用いて、添付の説明書に記載された方法に準じて調製した。
得られた染色体を鋳型とし、配列番号１６および１７で表される塩基配列を有するDNAをプライマーとして用いて、PCRを行い、dhaB、dhaC、dhaEおよびdhaF遺伝子の４つの遺伝子を含む 約4500 bpのDNA断片を得た。
得られた染色体を鋳型とし、配列番号１６および１７で表される塩基配列を有するDNAをプライマーとして用いて、PCRを行い、dhaB、dhaC、dhaEおよびdhaF遺伝子の４つの遺伝子を含む 約4500 bpのDNA断片を得た。
該４つの遺伝子を含むDNA断片をEcoRIおよびHindIIIで制限酵素処理した後、アガロースゲル電気泳動を行い、約4.5 kbのDNA断片を常法に従って精製し、上記４つの遺伝子を含むDNA断片を取得した。
また、プラスミドpRSFAK30を、EcoRIおよびHindIIIで制限酵素処理した後、アガロースゲル電気泳動を行い、約2.6 kbのDNA断片を常法に従って精製した。
取得された両DNA断片を常法に従って連結して、プラスミドpRSF_EbDhaBCEFを得た。挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を常法によって調べ、dhaB、dhaC、dhaEおよびdhaF遺伝子に該当する配列番号２１〜２４で表される塩基配列を有するＤＮＡが含まれていることを確認した。
また、プラスミドpRSFAK30を、EcoRIおよびHindIIIで制限酵素処理した後、アガロースゲル電気泳動を行い、約2.6 kbのDNA断片を常法に従って精製した。
取得された両DNA断片を常法に従って連結して、プラスミドpRSF_EbDhaBCEFを得た。挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を常法によって調べ、dhaB、dhaC、dhaEおよびdhaF遺伝子に該当する配列番号２１〜２４で表される塩基配列を有するＤＮＡが含まれていることを確認した。
一方、エシェリヒア・ブラッテATCC33430の染色体を鋳型とし、配列番号１８および１９であらわされる塩基配列を有するDNAをプライマーとして用いて、dhaI、dhaT、dhaGおよびdhaHの４つの遺伝子を含む 約2600 bpのDNA断片を調製した。
プラスミドpCDFDuet-1 (ノバジェン社製)を鋳型とし、配列番号１２および２０で表される塩基配列を有するDNAをプライマーとして用いて、CDF ori、ストレプトマイシン耐性遺伝子を含む約1800 bpのDNA断片を得た。
また、プラスミドpKK223-3を鋳型とし、上記の配列番号１４および１５を有するDNAをプライマーとして用いて、Ptac、MCSおよび転写ターミネーターを含む約800 bpのDNA断片を調製した。
得られた両DNA断片をPvuIIおよびXbaIで制限酵素処理し、常法に従ってこの両DNA断片を連結して、プラスミドpCDFAK30を得た。
プラスミドpCDFDuet-1 (ノバジェン社製)を鋳型とし、配列番号１２および２０で表される塩基配列を有するDNAをプライマーとして用いて、CDF ori、ストレプトマイシン耐性遺伝子を含む約1800 bpのDNA断片を得た。
また、プラスミドpKK223-3を鋳型とし、上記の配列番号１４および１５を有するDNAをプライマーとして用いて、Ptac、MCSおよび転写ターミネーターを含む約800 bpのDNA断片を調製した。
得られた両DNA断片をPvuIIおよびXbaIで制限酵素処理し、常法に従ってこの両DNA断片を連結して、プラスミドpCDFAK30を得た。
PCRにより増幅された４遺伝子を含むDNA断片をEcoRIおよびHindIIIで制限酵素処理した後、アガロースゲル電気泳動を行い、約2.6 kbのDNA断片を常法に従って精製し、dhaI、dhaT、dhaGおよびdhaHの４つの遺伝子を含むDNA断片を調製した。また、プラスミドpCDFAK30 DNAを、EcoRIおよびHindIIIで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、約2.6 kbのDNA断片を常法に従って調製した。
取得した両DNA断片を混合して、常法に従って連結して、dhaI、dhaT、dhaGおよびdhaH遺伝子を含むプラスミドpCDF_EbDhaITGHを得た。挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を常法によって調べ、dhaI、dhaT、dhaGおよびdhaH遺伝子に該当する配列番号２５、２６、２７および２８で表される塩基配列を有するＤＮＡが含まれていることを確認した。
取得した両DNA断片を混合して、常法に従って連結して、dhaI、dhaT、dhaGおよびdhaH遺伝子を含むプラスミドpCDF_EbDhaITGHを得た。挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を常法によって調べ、dhaI、dhaT、dhaGおよびdhaH遺伝子に該当する配列番号２５、２６、２７および２８で表される塩基配列を有するＤＮＡが含まれていることを確認した。
（３）形質転換体を用いた１−プロパノールの製造
上記（１）および（２）で調製したプラスミドpKKArMeGe、pRSF_EbDhaBCEF、およびpCDF_EbDhaITGHを用いて、常法に従ってエシェリヒア・コリJM109株およびエシェリヒア・コリBW25113株を形質転換し、各プラスミドに対応する薬剤（アンピシリン50 μg/ml、カナマイシン25 μg/ml、ストレプトマイシン50 μg/ml）を含むLB寒天培地（10g/Lのトリプトン、5g/Lの酵母エキスおよび10g/Lの塩化ナトリウムおよび15g/Lの寒天を含有する培地）に塗布し、37℃で１日間培養して、第１表に記載した形質転換体を取得した。
上記（１）および（２）で調製したプラスミドpKKArMeGe、pRSF_EbDhaBCEF、およびpCDF_EbDhaITGHを用いて、常法に従ってエシェリヒア・コリJM109株およびエシェリヒア・コリBW25113株を形質転換し、各プラスミドに対応する薬剤（アンピシリン50 μg/ml、カナマイシン25 μg/ml、ストレプトマイシン50 μg/ml）を含むLB寒天培地（10g/Lのトリプトン、5g/Lの酵母エキスおよび10g/Lの塩化ナトリウムおよび15g/Lの寒天を含有する培地）に塗布し、37℃で１日間培養して、第１表に記載した形質転換体を取得した。
得られた形質転換株を、各プラスミドに対応する薬剤（アンピシリン50 μg/ml、カナマイシン25 μg/ml、ストレプトマイシン50 μg/ml）を含むLB寒天培地に塗布し、37℃で１日間培養した。生育した菌体１コロニーを爪楊枝でLB液体培地5 mlに植菌し、37℃で16時間（一晩）培養し、これを前培養溶液とした。得られた前培養溶液を、10 mlネジ口試験管中の10 mlの生産培地（36g/Lのグルコース、5g/Lの酵母エキス、6g/Ｌのリン酸水素二ナトリウム、3g/Lのリン酸二水素カリウム、1g/Lの塩化アンモニウム、0.5g/Lの塩化ナトリウム、2mmol/Lの硫酸マグネシウム、5g/Lの炭酸カルシウム、100μmol/Lのイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド、50mg/Lのアンピシリン、50mg/Lのストレプトマイシン、25mg/Lのカナマイシンおよび0.1μg/LのビタミンB12を含有する培地）に懸濁し、37℃で静置培養した。１２０時間後の培養上清中のグルコース、１，２−プロパンジオール、および１−プロパノールの含有量を、以下の条件で、液体クロマトグラフィーを用いて定量した。
サンプル：培養上清に等量の移動相溶液（5mmol/Lの硫酸溶液）を加えて遠心分離して得られる上清
カラム：Aminex HPX-87H (300 x 7.8 mm, バイオラッド社製)
移動相：5mmol/Lの硫酸溶液
流速 ：0.4 ml/分
カラム温度：35℃
検出 ：示差屈折率検出器
カラム：Aminex HPX-87H (300 x 7.8 mm, バイオラッド社製)
移動相：5mmol/Lの硫酸溶液
流速 ：0.4 ml/分
カラム温度：35℃
検出 ：示差屈折率検出器
結果を第１表に示す。なお、表中、プラスミドの欄の「なし」はプラスミドが導入されていないことを示す。また、「N.D.」は１，２−プロパンジオールまたは１−プロパノールが検出されなかったことを示す。
第１表に示すとおり、ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールを生合成する経路に関与する酵素をコードする遺伝子を導入して得られたエシェリヒア・コリでは、１，２−プロパンジオールの生成が認められ、さらにグリセロールから１，３−プロパンジオールを生合成する経路に関与する遺伝子を組み込んで得られたエシェリヒア・コリを用いることにより１−プロパノールを製造することができた。
実施例２：エシェリヒア・ブラッテを用いた１−プロパノールの製造
プラスミドpKKEMGSを鋳型とし、配列番号１０および１１で表される塩基配列を有するDNAをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲ後に得られたDNA断片をHpaIおよびXbaIで制限酵素処理し、別途PmaCIおよびXbaIでプラスミドpKKEcGLYDHを制限酵素処理して得られたＤＮＡ断片と常法に従って連結し、プラスミドpKKGeMeを得た。
プラスミドpKKEMGSを鋳型とし、配列番号１０および１１で表される塩基配列を有するDNAをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲ後に得られたDNA断片をHpaIおよびXbaIで制限酵素処理し、別途PmaCIおよびXbaIでプラスミドpKKEcGLYDHを制限酵素処理して得られたＤＮＡ断片と常法に従って連結し、プラスミドpKKGeMeを得た。
また、別に、プラスミドpKKARII2を鋳型とし、配列番号１０および１１で表される塩基配列を有するDNAをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲ後に得られたDNA断片をHpaIおよびXbaIで制限酵素処理し、別途PmaCIおよびXbaIでプラスミドpKKGeMeを制限酵素処理して得られたDNA断片と常法に従って連結して、プラスミドpKKGeMeArを得た。挿入されたDNA断片の塩基配列を常法に従って調べ、該プラスミドが配列番号３、６、９で表される塩基配列で表されるＤＮＡを有していることを確認した。
ＰＣＲ後に得られたDNA断片をHpaIおよびXbaIで制限酵素処理し、別途PmaCIおよびXbaIでプラスミドpKKGeMeを制限酵素処理して得られたDNA断片と常法に従って連結して、プラスミドpKKGeMeArを得た。挿入されたDNA断片の塩基配列を常法に従って調べ、該プラスミドが配列番号３、６、９で表される塩基配列で表されるＤＮＡを有していることを確認した。
エシェリヒア・ブラッテATCC33430株をLB培地に植菌し、OD660が0.5程度になるまで培養した後、プラスミドpKKGeMeArをバイオラッド社製のGene Pulserを用いてエレクトロポレーション法（電圧2.5 kV、25 μFDのキャパシター、400 Ωの抵抗値）により導入し、プラスミドpKKGeMeArを有するエシェリヒア・ブラッテATCC33430株を得た。
得られた形質転換体を、アンピシリン50 μg/mlを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で１日間培養した。生育した菌体１コロニーを爪楊枝でアンピシリン50 μg/ml を含むLB液体培地（LB寒天培地から寒天を除く組成を有する培地）5mlに植菌し、37℃で16時間（一晩）培養し、これを前培養溶液とした。得られた前培養溶液を、10 mlネジ口試験管中の10 mlの生産培地（18g/Lのグルコース、9.2g/Lのグリセロール、5g/Lの酵母エキス、6g/Lのリン酸二水素ナトリウム、3g/Lのリン酸二水素カリウム、1g/Lの塩化アンモニウム、0.5g/Lの塩化ナトリウム、13.3g/Lの炭酸水素ナトリウム、240mg/Lの硫酸マグネシウム、24mgのイソプロピル-β-チオガラクトピラノシドおよび50mg/Lのアンピシリンを含有する培地）に懸濁し、37℃で静置培養した。４８時間後の培養上清中の１−プロパノールの含有量を実施例１（３）記載の方法に準じて定量したところ、2.7mmol/Lの１−プロパノールが生成されていた。
本発明により、糖類を用いた微生物による１−プロパノールの効率のよい製造方法および該製造方法に用い得る微生物を提供することができる。
配列番号１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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Claims (11)
- 糖類から１，２−プロパンジオールを経て１−プロパノールを生合成する能力を有する微生物。
- 糖類からジヒドロキシアセトンリン酸を経て１，２−プロパンジオールを生合成する、請求項１記載の微生物。
- 糖類が、グルコースまたはグリセロールである、請求項１又は２記載の微生物。
- 宿主微生物に、ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールを生合成する経路に関与する酵素をコードする遺伝子を組み込んで得られる、請求項１〜３の何れか１項に記載の微生物。
- ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールを生合成する経路に関与する酵素をコードする遺伝子が、メチルグリオキサール合成酵素遺伝子、メチルグリオキサール還元酵素遺伝子およびヒドロキシアセトン還元酵素遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子である、請求項４記載の微生物。
- グリセロールから１，３−プロパンジオールを生合成する経路に関与する遺伝子を組み込んで得られる、請求項１〜５いずれか１項に記載の微生物。
- グリセロールから１，３−プロパンジオールを生合成する経路に関与する遺伝子が、グリセロールデヒドラターゼ遺伝子、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再生酵素遺伝子、およびアデノシルトランスフェラーゼ遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子である、請求項６記載の微生物。
- エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属、クレブシエラ（Klebsiella）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、クロストリジウム（Clostridium）属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属、ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属およびトリコデルマ(Trichoderma)属に属する微生物からなる群より選ばれる、請求項１〜７いずれか１項に記載の微生物。
- エシェリヒア属に属する、請求項１〜７いずれか１項に記載の微生物。
- エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）またはエシェリヒア・ブラッテ（Escherichia blattae）に属する、請求項１〜７いずれか１項に記載の微生物。
- 請求項１〜１０いずれか１項に記載の微生物を培地に培養し、培養物中に１−プロパノールを生成、蓄積させ、該培養物から１−プロパノールを採取する、１−プロパノールの製造方法。
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