CN117310041A - 一种宽体金线蛭药材、饮片及中成药中掺伪菲牛蛭的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种宽体金线蛭药材、饮片及中成药中掺伪菲牛蛭的检测方法。以伪品菲牛蛭的特征化学成分Bdelline B为指标，通过液质联用技术快速准确地检测宽体金线蛭药材、饮片及其中成药中是否掺杂菲牛蛭。该方法操作简便，检测速度快，专属性好，不受样品复杂工艺的影响，有效填补了DNA条形码无法检测中成药的技术空白，是一种基于化学成分检测宽体金线蛭掺伪菲牛蛭的技术，为水蛭的质量控制提供了新方法。
Description
技术领域
本发明属于中药掺伪检测及中药质量控制技术领域，具体涉及一种宽体金线蛭药材、饮片及中成药中掺伪菲牛蛭的检测方法。
背景技术
2020版《中国药典》一部收载水蛭科动物蚂蟥Whitmaniapigra Whitman(以下称宽体金线蛭)、水蛭Hirudo niponica Whitman(以下称日本医蛭)或柳叶蚂蟥Whitmaniaacranulata Whitman(以下称尖细金叶蛭)的干燥全体为药用。近年来，水蛭野生资源日益紧缺，目前市场上多为人工养殖，主要流通的品种为宽体金线蛭，另有少量的日本医蛭，而尖细金叶蛭极为罕见。随着水蛭的市场需求量增加，正品水蛭与混伪品混淆用药的情况极为普遍，其中以伪品菲牛蛭入药为主。
菲牛蛭目前仅被云南省地方标准和广西壮族自治区地方标准收录，而2020版《中国药典》中尚未收载。由于水蛭本身经济价值较高，并且其抗凝血活性明显低于菲牛蛭，常以菲牛蛭掺入宽体金线蛭入药提高其活性，并在一定程度上可以缓解水蛭资源紧缺问题。水蛭具有的活血化瘀功效较强，临床应用也较为广泛，市场上含水蛭的处方药如活血通脉胶囊、通心络胶囊、脑血康胶囊等的使用也较多、需求量大。研究表明，菲牛蛭和宽体金线蛭的抗凝血途径以及发挥抗凝血活性时对凝血酶的作用机制有一定区别，故水蛭基原的混乱对于其临床用药的安全性和有效性，以及对含水蛭中成药的质量控制存在巨大的问题，因此对药用水蛭基原的确定显得尤为必要。
CN108866205A公开了基于DNA条形码法鉴别菲牛蛭的特异性引物，其中上游引物为：5'-TCTGGCTCTTAGGCTTCG-3'，下游引物为：5'-GTTGTCTTCCTGGCTG TT-3'。丁月珠采用SDS-PAGE法检测蚂蟥水吊干品、干品菲牛蛭和鲜品菲牛蛭对纤维蛋白原的作用，结果显示蚂蟥具有水解纤维蛋白原的作用，对其α链和β链均有影响，而菲牛蛭则对纤维蛋白原无水解作用，通过该蛋白条带差异可以鉴别蚂蟥和菲牛蛭药材。CN102914612A提供了一种菲牛蛭药材指纹图谱的检测方法，该图谱含共有峰23个，可用于菲牛蛭药材的质量控制。目前，水蛭的真伪鉴定以分子鉴定技术应用最为广泛，但该技术仅可用于原药材及饮片的快速准确鉴别。在中成药中，由于复杂的制备工艺会导致水蛭核酸和蛋白的降解，无法通过该技术对其进行鉴别。除此之外，部分研究从化学成分差异的角度来区分菲牛蛭和宽体金线蛭，主要集中在蛋白多肽、氨基酸和核苷类成分，然而目前明确的成分缺乏专属性，仅通过含量差异进行质量控制。因此，为了保证水蛭的质量和药效，亟需找到一种新的特征性成分并建立方法鉴别宽体金线蛭及其伪品菲牛蛭。
发明内容
为了克服现有技术的不足，发明人基于课题组前期通过配体-垂钓技术以凝血酶为配基对菲牛蛭进行亲和超滤筛选出的蝶啶类成分Bdelline B，通过液质联用技术验证其是否为菲牛蛭和宽体金线蛭的差异性成分并建立了该成分的检测方法，有效鉴别宽体金线蛭药材、饮片及其中成药中掺伪菲牛蛭的情况。
本发明的目的在于提供一种宽体金线蛭药材、饮片及其中成药中掺伪菲牛蛭的检测方法，以保证原药材和中成药的质量。本发明的检测方法是基于伪品菲牛蛭的特征化学成分Bdelline B为指标，通过液质联用技术快速准确地检测宽体金线蛭药材、饮片及其中成药中是否掺杂菲牛蛭。
所述Bdelline B其结构式如下所示：
本发明所提供的宽体金线蛭药材、饮片及其中成药中掺伪菲牛蛭的检测方法，包括如下步骤：
1)对照品溶液的制备
对照品溶液的制备：取对照品Bdelline B，加甲醇制成1mg/mL的储备液，精密吸取1μL储备液，加999μL甲醇，制备成Bdelline B浓度为1μg/mL的对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：将待测宽体金线蛭药材、饮片粉碎，过50目筛，或将待测中成药内容物取出，取药材粉末0.1g，加1mL 80％甲醇涡旋混匀，称重，超声1h后，加80％甲醇补足到原始重量，于4000r，15min离心，取上清，加入甲醇进行稀释，于14000r，10min离心，取上清；
3)将步骤1)所得对照品溶液注入超高效液相色谱-质谱联用仪，得到Bdelline B的离子流色谱图；
4)将步骤2)所得上清注入超高效液相色谱-质谱联用仪，得到供试品的离子流色谱图，并将其与步骤3)所得Bdelline B的离子流色谱图进行对比，若供试品的离子流色谱图中出现与Bdelline B对照品保留时间一致的色谱峰，说明供试品中掺入菲牛蛭；若未出现与Bdelline B对照品保留时间一致的色谱峰(S/N＜3)，说明供试品中未检出Bdelline B成分，认为未掺入菲牛蛭。
上述方法步骤3)、4)中，超高效液相色谱-质谱联用检测条件：
色谱条件：色谱柱为Waters公司的BEH C18柱(1.7μm,2.1mm ID×100mm)；
流动相A相：水(含0.1％(体积比)的甲酸)，B相：乙腈(0.1％(体积比)的甲酸)；
梯度洗脱(表1)：
表1梯度洗脱程序
流速：400μL/min；进样量：3μL；
质谱条件：采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾离子化源(ESI离子化源)，以正离子扫描的多反应监测(MRM)模式，具体的质谱工作参数见表2：
表2质谱工作参数
上述方法在宽体金线蛭药材、饮片及中成药质量控制中的应用也属于本发明的保护范围。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明建立的方法可以用于宽体金线蛭药材、饮片及中成药掺伪菲牛蛭的检测，该方法操作简便，检测速度快，专属性好，不受样品复杂工艺的影响，有效填补了DNA条形码无法检测中成药的技术空白，是一种基于化学成分检测宽体金线蛭掺伪菲牛蛭的技术，为水蛭的质量控制提供了新方法。
附图说明
图1为Bdelline B在m/z 523.1→435.9和m/z 523.1→320.9提取离子流色谱图。
图2为Bdelline B在正离子模式下的二级质谱图。
图3为菲牛蛭F1-F7在m/z 523.1→320.9提取离子流色谱图。
图4为宽体金线蛭K1-K7在m/z 523.1→320.9提取离子流色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、验证Bdelline B为菲牛蛭和宽体金线蛭的差异性成分
1.实验仪器与材料
1.1仪器
美国应用生物系统公司液相质谱联用系统API 6500Qtrap(含G4220A泵，G1316C柱温箱，G4226A进样器，G1330B恒温器，ESI和APCI离子源，Analyst 1.6.3质谱工作站软件)；KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，DV215CD型电子天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)；BY-R18型医用离心机(北京白洋医疗器械有限公司)。
1.2试剂
质谱级甲醇；质谱级乙腈；质谱级甲酸，均购自Fisher公司；屈臣氏纯净水；Bdelline B(委托宝鸡市辰光生物科技有限公司从菲牛蛭药材中分离得到，纯度98.42％)
Bdelline B的结构式如下所示：
1.3样品信息
表3菲牛蛭样品信息表
表4宽体金线蛭样品信息表
上述样品均经过DNA条形码鉴定，基原准确。
2.实验方法
2.1对照品溶液的制备：取对照品Bdelline B，加甲醇制成1mg/mL的储备液，精密吸取1μL储备液，加999μL甲醇，制备成Bdelline B浓度为1μg/mL的对照品溶液。
2.2供试品溶液的制备：将宽体金线蛭、菲牛蛭药材粉碎，过50目筛，取药材粉末0.1g，加1mL80％甲醇涡旋混匀，称重，超声1h后，加80％甲醇补足到原始重量，于4000r，15min离心，取上清，加入适量甲醇进行稀释，于14000r，10min离心，取上清，注入液质联用仪。
2.3超高效液相色谱-质谱联用检测：
色谱条件：色谱柱为Waters公司的BEH C18柱(1.7μm,2.1mm ID×100mm)；流动相A相：水(含0.1％(体积比)的甲酸)，B相：乙腈(0.1％(体积比)的甲酸)；梯度洗脱程序：0-1min，25％B，1-2.5min，25％B-100％B，2.5min-4min，100％B，4-4.1min，100％B-25％B；流速400μL/min；进样量3μL。
质谱条件：采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾离子化源(ESI离子化源)，以正离子扫描的多反应监测(MRM)模式，具体的质谱工作参数见表2。
3.实验结果
图1为Bdelline B在m/z 523.1→435.9和m/z 523.1→320.9提取离子流色谱图。
图2为Bdelline B在正离子模式下的二级质谱图。
各批次菲牛蛭和宽体金线蛭中Bdelline B的测定结果见表5。
表5菲牛蛭和宽体金线蛭中Bdelline B测定结果
图3为菲牛蛭F1-F7在m/z 523.1→320.9提取离子流色谱图。
图4为宽体金线蛭K1-K7在m/z 523.1→320.9提取离子流色谱图。
由此可知：18批菲牛蛭在m/z 523.1→435.9和m/z 523.1→320.9提取的离子流色谱图中，均出现与Bdelline B对照品保留时间一致的色谱峰，而18批宽体金线蛭在m/z523.1→435.9和m/z 523.1→320.9提取离子流色谱图中其色谱峰的信噪比均小于3，即未出现与Bdelline B对照品保留时间一致的色谱峰，测定结果均为未检出，说明Bdelline B为菲牛蛭中的差异性成分，可以用来鉴别菲牛蛭和宽体金线蛭。
实施例2、方法学考察
2.1线性关系
取对照品Bdelline B适量，精密称定，加甲醇制成1mg/mL的母液，将母液进行梯度稀释，配制成1000ng/ml，500ng/ml，200ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，20ng/ml，10ng/ml，5ng/ml，2ng/ml，1ng/ml，0.5ng/ml的Bdelline B对照品溶液，按上述检测方法中的色谱和质谱条件进行测定，以Bdelline B m/z 523.1→320.9提取离子流色谱图中色谱峰的峰面积为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到Bdelline B的线性回归方程为Y＝632X-45.7，R＝0.9952，其线性良好。
2.2稳定性
取Bdelline B低、中、高3个浓度的质量控制(QC)，分别在制备后的0h、4h、8h、12h、24h按上述检测方法中的色谱和质谱条件，进行测定，将峰面积代入Bdelline B标准曲线中计算浓度的RSD分别为2.12％，2.78％，3.76％，表明该成分在24h内稳定性良好。
2.3精密度
取Bdelline B低、中、高3个浓度的质量控制(QC)样品各6份，在相同的色谱和质谱条件下重复进样分析，计算日内精密度RSD(n＝6)分别为2.83％，2.10％，1.89％；连续3天对3个浓度的6份质控样品进行分析，计算日间精密度RSD(n＝6)分别为1.59％，1.79％，1.87％，表明仪器精密度良好。
2.4检出限
取Bdelline B对照品溶液进行梯度稀释，以Bdelline B m/z 523.1→320.9提取离子流色谱图中色谱峰信噪比3:1计算Bdelline B化合物的检出限为0.5ng/mL。
2.5重复性
取F14样品六份，按上述方法制备成供试品溶液，并在相同的色谱和质谱条件下检测，将峰面积代入Bdelline B标准曲线中计算含量的RSD(n＝6)为1.79％，表明该方法重复性良好。
2.6回收率
取已经含量的F14样品约0.1g，精密称定，分别精密加入Bdelline B化合物相应浓度的80％，100％，120％3个水平的对照品溶液适量，制备供试品溶液，测定该成分的含量，计算回收率分别为106.39％，98.44％，100.56％，其RSD分别为3.86％，2.07％，3.98％，表明该方法准确性良好。
实施例3、饮片和中成药检测
1.样品信息
本实施例中收集了水蛭配方颗粒和含水蛭的常用中成药，具体信息见表6。
表6中成药样品信息表
2.实验方法与实施例1相同
3.实验结果
表7中成药中Bdelline B测定结果
结果判定：活血通脉胶囊在m/z 523.1→435.9和m/z 523.1→320.9提取的离子流色谱图中，均出现与Bdelline B对照品保留时间一致的色谱峰，说明两种中成药中可能掺入了菲牛蛭。脑血康胶囊、大黄蛰虫丸及水蛭配方颗粒在m/z 523.1→435.9和m/z523.1→320.9提取离子流色谱图中其色谱峰的信噪比均小于3，即未出现与Bdelline B对照品保留时间一致的色谱峰，测定结果均为未掺伪。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (4)
1.一种宽体金线蛭药材、饮片及其中成药中掺伪菲牛蛭的检测方法，包括如下步骤：
1)对照品溶液的制备：取对照品Bdelline B，加甲醇制成1mg/mL的储备液，精密吸取1μL储备液，加999μL甲醇，制备成Bdelline B浓度为1μg/mL的对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：将待测宽体金线蛭药材、饮片粉碎，过50目筛或将待测中成药内容物取出，取药材粉末0.1g，加1mL 80％甲醇涡旋混匀，称重，超声1h后，加80％甲醇补足到原始重量，于4000r，15min离心，取上清，加入甲醇进行稀释，于14000r，10min离心，取上清；
3)将步骤1)所得对照品溶液注入超高效液相色谱-质谱联用仪，得到Bdelline B的离子流色谱图；
4)将步骤2)所得上清注入超高效液相色谱-质谱联用仪，得到供试品的离子流色谱图，并将其与步骤3)所得Bdelline B的离子流色谱图进行对比，若供试品的离子流色谱图中出现与Bdelline B对照品保留时间一致的色谱峰，说明供试品中掺入菲牛蛭；若未出现与Bdelline B对照品保留时间一致的色谱峰(S/N＜3)，说明供试品中未检出Bdelline B成分，认为未掺入菲牛蛭。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)、4)中，超高效液相色谱：
色谱条件：色谱柱为Waters公司的BEH C18柱(1.7μm,2.1mm ID×100mm)；
流动相A相：水(含0.1％(体积比)的甲酸)，B相：乙腈(0.1％(体积比)的甲酸)；
梯度洗脱：0-1min 25％B，1-2.5min 25％B-100％B，2.5min-4min 100％B，4-4.1min100％B-25％B；
流速：400μL/min；进样量：3μL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：质谱条件：采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾离子化源，以正离子扫描的多反应监测模式，质谱工作参数为：
Bdelline B母离子(m/z)523.1，子离子(m/z)435.9(定性)CE(eV)30；
母离子(m/z)523.1，子离子(m/z)320.9(定量)CE(eV)45。
4.权利要求1-3中任一项所述方法在宽体金线蛭药材、饮片及中成药质量控制中的应用。
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