CN117288700A - 一种基于HDES的ETA-LPME-micro UV-Vis检测植物中Co含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于HDES的ETA‑LPME‑micro UV‑Vis检测植物中Co含量的方法，包括步骤：(1)将待测植物样品进行干燥、消解、赶酸处理后，定容得到待测植物样品溶液；(2)利用甲基三辛基氯化铵和1‑辛醇合成HDES；(3)将NaHCO3、HDES和丙二酸研磨均匀，压成泡腾片；(4)在待测植物样品溶液中加入络合剂PAN，然后加入泡腾片进行反应，反应结束后离心得到有机相；(5)将有机相稀释后，测定待测植物样品中的Co含量。本发明所述的检测方法绿色、简单、快速、高效，不仅提高了仪器的灵敏度，扩大了它的应用范围，还有利于植物中Co含量的检测。
Description
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种基于HDES的ETA-LPME-micro UV-Vis检测植物中Co含量的方法。
背景技术
天麻为兰科(Orchidaceae)植物天麻(Gastrodia elata Bl.)的干燥块茎，始载于《神农本草经》，被列为我国四大名贵中药材之一。它含有多种化学成分，包括芳香化合物、有机酸酯类、类固醇、糖类及其苷类等，同时具有药用和食用的价值，广泛用于小儿惊厥、癫痫、破伤风、头痛、头晕、四肢麻木、风湿病和关节痛等多种疾病。近年来，由于药材种植、加工等不规范，生产出的药材产品质量不稳定。亟需对药材质量进行科学合理的评价。
药材中的重金属含量是其质量评价中的一项重要指标，钴(Co)元素属于重金属中的一种，也是维生素B12的主要成分，在血红蛋白的合成和铁的代谢中具有显著的作用。Co的建议日摄入量为50～200μg。有研究表明，体内Co过量会导致皮炎、心血管疾病、哮喘、鼻炎、中毒、DNA修复过程受阻以及呼吸系统等问题。因此，建立一种准确、灵敏、快速、易于应用的分析方法测定微量Co是有必要的。
微量紫外-可见分光光度法具有经济、操作方便、所需样品量和有机溶剂使用量少等优点，非常适合和有效的样品前处理方法相结合应用于植物中微量元素的检测。因此，建立了一种简单、快速、高效的天麻样品中Co的分析方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于HDES的ETA-LPME-micro UV-Vis检测植物中Co含量的方法，该方法具有绿色、简单、快速、高效的优点。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供一种基于HDES的ETA-LPME-micro UV-Vis检测植物中Co含量的方法，其包括如下步骤：
(1)将待测植物样品进行干燥、消解、赶酸处理后，定容得到待测植物样品溶液；
(2)利用甲基三辛基氯化铵和1-辛醇合成HDES；
(3)将NaHCO3、所述步骤(2)的HDES和质子供体剂研磨均匀，压成泡腾片；
(4)在所述步骤(1)的待测植物样品溶液中加入络合剂PAN，然后加入所述步骤(3)的泡腾片进行反应，反应结束后离心得到有机相；
(5)将所述步骤(4)的有机相稀释后，测定待测植物样品中的Co含量。
进一步的，所述步骤(2)中甲基三辛基氯化铵和1-辛醇的摩尔比为1:1-5。
优选的，所述步骤(2)中甲基三辛基氯化铵和1-辛醇的摩尔比为1:2。
进一步的，所述步骤(2)中HDES的合成温度为油浴60℃-80℃，时间为30min-40min。
进一步的，所述步骤(2)中HDES的合成步骤具体为：将甲基三辛基氯化铵和1-辛醇以1:2的摩尔比混合在圆底烧瓶中，然后将混合物在60℃的油浴中搅拌30min，得到均匀透明的液体HDES。
进一步的，所述步骤(3)中HDES的体积为0.0μL-275.0μL。
优选的，所述步骤(3)中HDES的体积为200.0μL。
进一步的，所述步骤(3)中NaHCO3的用量为200mg-1200mg。
优选的，所述步骤(3)中NaHCO3的用量为800mg。
进一步的，所述步骤(3)中质子供体剂为丙二酸、草酸、柠檬酸、衣康酸中的至少一种。
优选的，所述步骤(3)中质子供体剂为丙二酸。
进一步的，所述步骤(3)中丙二酸的用量为496mg。
进一步的，所述步骤(4)中络合剂PAN的浓度为3×10-6mol/L-18×10-6mol/L。
优选的，所述步骤(4)中络合剂PAN的浓度为12×10-6mol/L。
进一步的，所述步骤(5)中测定方法为微量紫外-可见分光光度法，采用的检测波长为464nm。
进一步的，所述方法检测植物样品中Co含量的检出限为0.05μg/L，定量限为0.18μg/L。
进一步的，所述方法的富集倍数为38倍，日内精密度为1.59％，日间精密度为1.62％。
进一步的，所述植物为天麻。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
1、本发明首次将基于HDES的ETA-LPME法与微量紫外-可见分光光度计联用检测药用植物中的微量Co，进而提高了常规紫外-可见分光光度法的灵敏度，扩大了其应用范围。
2、本发明的方法绿色、简单、快速、高效，且具有较低的检测限和定量限。
3、本发明基于HDES的ETA-LPME检测植物中Co含量的方法对其他重金属离子的抗干扰较强，更便于对天麻中Co含量的检测。
附图说明
图1为甲基三辛基氯化铵、1-辛醇、HDES的红外光谱图。
图2为未采用ETA-LPME和采用ETA-LPME的最大吸收波长扫描图。
图3为HDES的种类优化图。
图4为HDES的摩尔比优化图。
图5为HDES的体积优化图。
图6为NaHCO3的用量优化图。
图7为质子供体剂的种类优化图。
图8为PAN的浓度优化图。
图9为HDES-PAN、HDES-NaHCO3、NaHCO3-PAN的响应面曲线图。
具体实施方式
结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
实施例1
一、疏水深共晶溶剂(HDES)的制备与表征
以甲基三辛基氯化铵作为HBA，1-辛醇为HBD，将HBA和HBD以1:2的摩尔比混合在圆底烧瓶中，然后将混合物在60℃的油浴中搅拌30min，得到均匀透明的液体，即HDES。
为了确认氢键的形成，将纯1-辛醇、甲基三辛基氯化铵和HDES的FT-IR光谱对比。如图1所示，与1-辛醇的O-H拉伸振动峰(3325cm-1)相比，HDES的O-H拉伸振动峰(3314cm-1)向更低的波数偏移。因此，O-H的振动位移表明，当HDES形成完成时，1-辛醇与甲基三辛基氯化铵之间形成了氢键。1-辛醇和甲基三辛基氯化铵的特征峰均显示在HDES光谱图中。此外，将HDES的FT-IR光谱与其组分的FT-IR光谱进行比较，没有发现新的峰消失和出现，说明在HDES制备过程中没有发生反应。
二、配合物的吸收光谱的确定
将496mg丙二酸、800mg NaHCO3和200.0μL HDES放入研钵中研磨均匀，用手动冲孔机压成片剂，得到泡腾片。
采用基于疏水深共晶溶剂的泡腾片辅助液相微萃取(ETA-LPME)方法：将制备好的泡腾片放入含有Co-PAN络合物的溶液中，由于泡腾反应产生大量CO2气泡，萃取剂HDES通过CO2的释放有效且均匀地分布到样品溶液中，成功的将Co-PAN络合物萃取到溶液上层，提取速度快，一步完成。然后，用离心机以8000r/min的速度离心5min，用注射器除去下层水相，得到含有Co-PAN络合物的有机相。最后用少量甲醇将有机相稀释，并用甲醇定容至300μL。
对照为不采用ETA-LPME：在10mL含500μg/L的Co的分析液中加入12×10-6mol/L的PAN，混合均匀。
对使用ETA-LPME法和未使用ETA-LPME法得到的Co-PAN配合物在300-750nm波长范围内进行扫描，结果如图2所示。在测定前，对所有试剂空白的吸光度进行校正。对于没有使用ETA-LPME法的Co-PAN配合物，Co浓度为500μg/L，λmax为575nm。使用ETA-LPME法的Co-PAN配合物，Co浓度为20μg/L，λmax为464nm。从图2中可以看出，萃取后的灵敏度有了明显的提高，由于萃取剂和稀释剂的影响，萃取后的最佳吸收波长向短波方向偏移。采用ETA-LPME和未采用ETA-LPME的样品分别选择464nm和575nm波长进行定量分析。
三、单因素考察
1、HDES的种类优化
本研究合成了多种疏水DESs，以寻找具有高萃取能力的最佳萃取溶剂。在此基础上，成功合成了5种HDESs，并对其吸光度进行了比较，其中(1)HDES-1：L-薄荷醇-己酸(3:1)；(2)HDES-2：甲基三辛基氯化铵-1-辛醇(1:2)；(3)HDES-3：四丁基溴化铵-1-辛醇(1:2)；(4)HDES-4：L-薄荷醇-庚酸(3:1)；(5)HDES-5：甲基三辛基氯化铵-壬酸(1:2)。
结果如图3所示，与HDES-1、3、4、5相比，HDES-2的吸光度最大。因此，选择HDES-2作为萃取溶剂进行优化。
2、HDES的摩尔比优化
在本研究中，HDES由甲基三辛基氯化铵和1-辛醇组成。不同的摩尔比对萃取效率有显著的影响。因此，以甲基三辛基氯化铵为HBA，1-辛醇为HBD，按照1:1、1:2、1:3、1:4和1:5的摩尔比制备了5种HDESs。
结果如图4所示，当摩尔比为1:2时，吸光度最大。因此，选择该比例用于后续实验。
3、HDES的体积
采用不同体积的HDES(0.0μL-275.0μL)进行萃取实验，考察HDES体积对提取效率的影响。从图5可以看出，从0.0μL到200.0μL，吸光度随着体积的增加而增大，在200.0μL时达到最大值。但随着HDES体积进一步增大(225.0μL-275.0μL)，萃取效率趋于饱和。此外，当HDES的体积大于200.0μL时，由于HDES体积过大，在压片过程中会造成HDES的直接损失。相反，如果HDES的体积太小，则很难均匀地压入片剂中。
结果如图5所示，吸光度在200.0μL时达到最大值。因此，选择200.0μL作为HDES的最佳体积。
4、NaHCO3的用量
泡腾片在本研究中具有重要作用，它产生CO2气泡，使萃取剂均匀地分散到样品溶液中。本发明中，泡腾片主要由HDES(萃取剂)、NaHCO3(泡腾剂)和丙二酸(质子供体剂)组成。泡腾剂的用量对泡腾片的提取效率有重要影响。随着泡腾剂的量增加，会产生更多的气泡，加速萃取剂在样品溶液中的分散，但由于样品溶液的粘度和离子强度的增加，也会降低萃取效率。因此，研究了泡腾剂用量在200-1200mg范围内其对萃取效率的影响。
从图6中可以看出，当泡腾剂用量在200mg-800mg范围内时，吸光度随着泡腾剂用量的增加而增大，在800mg时达到最大值。但当继续加大泡腾剂的用量后，吸光度减小。因此选择NaHCO3的量为800mg进行后续实验。
5、质子供体剂的种类
质子供体剂是泡腾片的组分之一，在实验中与NaHCO3反应，产生CO2气泡，加速萃取过程，提高萃取效率。不同的质子供体剂对ETA-LPME的萃取效率产生不同的影响。本研究比较了丙二酸、草酸、柠檬酸、衣康酸对ETA-LPME萃取效率的影响。
从图7中可以看出，丙二酸和柠檬酸的萃取效果差别不大，但柠檬酸的吸湿性比丙二酸强，在实验过程中使用丙二酸更方便，且丙二酸的萃取效果最好。因此，选择丙二酸作为泡腾片的质子供体剂。
6、PAN的浓度
选择PAN作为Co的络合剂，PAN的浓度是影响萃取效果的重要因素之一。因此考察了PAN浓度在3×10-6mol/L-18×10-6mol/L范围内对萃取效率的影响。
结果如图8所示，在3×10-6mol/L-12×10-6mol/L范围内，吸光度随着PAN浓度的增加而增大，在12×10-6mol/L-18×10-6mol/L浓度范围内，吸光度随着PAN浓度的增加而减小。可能是因为过量的PAN被共萃取到有机相中，降低了Co的萃取效率。因此，PAN的最佳浓度为12×10-6mol/L。
实施例2
1、响应面实验设计
本实施例以单因素优化的最佳值为中心点，以提取后Co-PAN的吸光度为响应值，利用Design-Expert 13软件对HDES体积、NaHCO3用量、PAN浓度进行响应面实验设计。试验因素及水平如表1所示。
表1 Co萃取效率的方差分析
利用Design-Expert 13软件，采用BBD法对实验进行优化。通过方差分析(ANOVA)对各目标对象进行多元线性回归和二项拟合分析。确定HDES的体积、PAN的浓度、NaHCO3的量与因变量吸光度之间的回归方程为：Y＝0.2208+0.0155A+0.0116B+0.0061C-0.0173AB-0.0048AC+0.0110BC-0.0097A2-0.0164B2-0.0149C2。
方差分析结果见表1，从表中可以看出，回归模型的拟合缺失显著(P<0.0001)，拟合缺失不显著(P>0.05)，表明优化模型显著。模型的拟合优度可用决定系数(R2)来检验。当R2接近1时，模型的预测能力增加。模型的R2值为0.9879，调整后的R2值为0.9723，表明实验结果与预测结果之间存在高度的一致性和相关性。因此，该模型可用于云南天麻中Co提取方法的优化和预测。
2、三维响应面分析
回归方程可以用三维响应面曲线图形化表示，三维响应面可以反映几个因素之间的相互作用对响应值的影响。图9展示了HDES-PAN，HDES-NaHCO3，PAN-NaHCO3的三维响应面曲线，可以看出HDES的影响最大，因为HDES的体积是影响萃取能力的关键因素，对萃取效率起决定性作用。如果HDES体积过小，就会导致萃取不完全，若HDES体积过大，就会稀释目标物的浓度，导致萃取效率变低。HDES与其他因素的相互作用如图9(a,c)所示，可以看出HDES-PAN，HDES-NaHCO3的相互作用都比较显著。根据响应面实验结果，所选因素对萃取效率的影响程度依次为A>B>C，两两交互作用显著性大小依次为AB>BC>AC。
3、最优条件确定
根据BBD实验结果，最佳实验条件为HDES的体积为203μL，PAN浓度为13.0×10- 6mol/L，NaHCO3的量为830mg，在此最佳萃取条件下重复实验三次，得到的吸光度分别为0.223、0.225、0.226，预测值为0.225，与预测值一致。结果表明，这些实验条件的参数是可靠的，因此选择这些条件作为后续实验的最佳萃取条件。
4、干扰离子的影响
由于实际样品基质的复杂性，一些共存离子可能与Co离子竞争，与PAN形成络合物。然后，与Co-PAN共萃取到有机相中，干扰已开发的方法的选择性，从而影响Co-PAN的萃取效率。本实验研究了药用植物中潜在的干扰离子的影响，考察了ETA-LPME的选择性和抗干扰能力。
结果如表2所示(容许极限值在相对误差±10％以内)，结果表明，一些常见的基体离子无明显干扰，其他重金属离子如Zn2+、Pb2+等会与Co-PAN发生共萃取，导致容许极限较低。
表2Co的测定中共存离子的容限(20.0μg/L)
5、分析性能评价
在最佳实验条件下，对提出的方法的分析性能进行了评价，结果如表3所示。相关系数R2为0.9991，显示出较好的线性关系。ETA-LPME的LOD和LOQ分别为0.05μg/L和0.18μg/L。与micro UV-Vis分光光度法直接检测结果相比，Co的EF为38。方法的日间和日内精密度分别为1.62％和1.59％。结果表明，所建立的方法具有良好的可行性，提高了仪器的灵敏度。
表3Co的分析性能测定
实施例3：天麻样品中Co的含量测定
1、样品采集和制备
从药材市场购买了云南昭通和香格里拉的天麻药材，经大理大学李海峰教授鉴定，为天麻药材的干燥块茎。将药材用超纯水冲洗干净，置于55℃烘箱中烘干至恒重，将药材粉碎后过120目筛。准确称取0.5000g药材粉末于消解罐中，加入8.0mL HNO3、2.0mL 30％H2O2、2.0mL H2O，放入消解仪中，按表4的消解程序进行消解，消解完全后放置于赶酸仪上，在130℃下赶酸约3.5h，待酸挥干到一定程度，冷却至室温，然后用超纯水将其转移至10.0mL容量瓶中，用超纯水定容至10.0mL，摇匀即可测定。
表4微波消解程序
2、疏水深共晶溶剂(HDES)的制备
以甲基三辛基氯化铵作为HBA，1-辛醇为HBD，将HBA和HBD以1:2的摩尔比混合在圆底烧瓶中，然后将混合物在60℃的油浴中搅拌30min，得到均匀透明的液体，为HDES。
3、萃取程序
将496mg丙二酸、800mg NaHCO3和200.0μL HDES放入研钵中研磨均匀，用手动冲孔机压成片剂，得到泡腾片。
将待测的天麻样品中加入浓度为12×10-6mol/L的络合剂PAN，得到含有Co-PAN络合物的溶液，将制备好的泡腾片放入含有Co-PAN络合物的溶液中，然后用离心机以8000r/min的速度离心5min，用注射器除去下层水相，得到含有Co-PAN络合物的有机相，最后用少量甲醇将有机相稀释，并用甲醇定容至300μL，用micro UV-Vis分光光度法在464nm波长下测定样品中的Co含量。
为了研究该方法的适用性，测定了云南天麻中的Co含量。从药材市场购买了天麻样品，经微波消解后，用所建立的方法萃取，最后，用micro UV-Vis分光光度法测定，并与ICP-OES测定结果进行比较。
结果如表5所示，云南天麻的测定结果与ICP-OES结果一致。样品的加标回收率在92.9-105％的可接受范围内，由此说明本发明的方法准确、可靠。
表5天麻样品中Co的分析结果
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种基于HDES的ETA-LPME-micro UV-Vis检测植物中Co含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将待测植物样品进行干燥、消解、赶酸处理后，定容得到待测植物样品溶液；
(2)利用甲基三辛基氯化铵和1-辛醇合成HDES；
(3)将NaHCO3、所述步骤(2)的HDES和质子供体剂研磨均匀，压成泡腾片；
(4)在所述步骤(1)的待测植物样品溶液中加入络合剂PAN，然后加入所述步骤(3)的泡腾片进行反应，反应结束后离心得到有机相；
(5)将所述步骤(4)的有机相稀释后，测定待测植物样品中的Co含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中甲基三辛基氯化铵和1-辛醇的摩尔比为1:1-5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其特征在于，所述步骤(2)中HDES的合成温度为油浴60℃-80℃，时间为30min-40min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中HDES的体积为0.0μL-275.0μL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中NaHCO3的用量为200mg-1200mg。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中质子供体剂为丙二酸、草酸、柠檬酸、衣康酸中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中络合剂PAN的浓度为3×10- 6mol/L-18×10-6mol/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中测定方法为微量紫外-可见分光光度法，采用的检测波长为464nm。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法检测植物样品中Co含量的检出限为0.05μg/L，定量限为0.18μg/L。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物为天麻。
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