CN109705105B - 一种检测氰化物的比率型近红外荧光探针的制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及荧光检测技术领域，尤其涉及一种用于检测食品中氰化物的比率型近红外荧光探针的制备方法及用途；制备步骤为：首先制备获得7‑（二乙氨基）香豆素和7‑（二乙氨基）香豆素醛；然后将7‑（二乙氨基）香豆素醛和(1,3‑二氧基氯‑2‑甲基)三苯基溴化膦加到二氯甲烷中溶解，滴加氢氧化钠溶液，加入盐酸中和，经萃取分液、柱层析纯化得到中间产物；将中间产物和苯乙酮加到二氯甲烷和甲醇混合溶剂中，再滴加四氢吡咯，加入氯化钠，搅拌、蒸馏、柱层析纯化得到检测氰化物的比率型近红外荧光探针；本发明开发出了一种新型高性能的比率型近红外荧光探针，合成方法简单，对氰化物有很好的选择性，并成功应用于检测食品的中的氰化物。

Description

一种检测氰化物的比率型近红外荧光探针的制备方法及用途

技术领域

本发明涉及荧光检测技术领域，尤其涉及一种用于检测氰化物的比率型近红外荧光探针的制备方法及用途。

背景技术

众所周知，氰化物(CN^-)是一种有毒试剂，非常小的剂量即可致人死亡。在生物体内，氰化物与细胞色素氧化酶紧密结合，从而抑制细胞呼吸。尽管氰化物具有很强的毒性，仍然被大量应用于各种工业生产过程，如冶金、金矿开采、电镀、塑料制造等。当工业废液不当处理时，工业废液中的氰化物就可能污染食品及水源，从而给人类的食品安全带来威胁。此外，生氰糖苷广泛分布于数千种植物中，其中包括高粱、杏仁、亚麻、竹笋、樱桃仁、土豆、木薯等多种粮食作物。植物细胞破裂后，通过酶的分解，氰化物可从生氰糖苷中释放出来；食用这些加工不当的粮食作物也会引起慢性或急性氰化物中毒，因而给消费者健康带来严重问题。因此，迫切需要开发出精确定量分析检测食品样品中氰化物含量的方法。

目前，已有多种检测氰化物的分析技术被报道，包括流动注射法、质谱法、电化学法、离子色谱法、拉曼光谱法、比色法和荧光探针法等。其中，荧光探针法具有方法简单、灵敏度高、选择性好、检测速度快、定量分析能力强等优点，因此非常适合精确检测食品样品中氰化物。到目前为止，已经有许多用于检测氰化物的荧光探针被报道。这些荧光探针的设计主要基于以下两种机理；一、利用氰化物与Co²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、Zn²⁺等金属离子的特有的配位作用，使金属离子从探针分子上移除，从而使探针分子产生荧光响应；二、利用氰化物内在的亲核性质与缺电子的共轭双键发生亲核加成反应，从而使探针分子的共轭发生变化，最终导致探针分子荧光性质的变化。

已报道的荧光探针在检测水样品和活细胞样品中的氰化物表现出良好的性能；然而，在食品样品中检测氰化物的荧光探针仍然很少；并且，这些检测食品样品中氰化物的探针由于其荧光发射波长主要在紫外和可见光谱区域，容易受到食品样品中生物分子背景荧光的影响，因此严重地干扰了分析检测的精确性。相比之下，生物分子在近红外光(NIR)区域(650-900nm)的背景荧光极小。因此，开发出荧光发射波长在近红外区域的荧光探针，能够极大地提高分析检测食物样品中氰化物浓度的精确性。此外，荧光探针在分析检测食品样品中氰化物时，探针在食品中的分布、探针的光漂白、以及仪器的效率等因素在分析检测时常常引起荧光信号假象，同样导致荧光分析检测精确度降低。为此，比率型荧光探针能够有效的消除上述荧光信号假象，从而可以进一步提高荧光分析检测的精确性。因此，非常有必要开发出一种新型的比率型近红外荧光探针，用来精确检测食物样品中氰化物。

发明内容

针对现有技术中的存在的不足，本发明旨在解决所述问题之一；本发明提供了一种用于检测氰化物的比率型近红外荧光探针及其制备方法，它不仅选择性好，灵敏度高，而且制备方法简单，可应用于食品中氰化物的检测。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明首先提供一种检测氰化物的比率型近红外荧光探针，其结构如下：

本发明还提供一种检测氰化物的比率型近红外荧光探针的制备方法，按照下述步骤进行：

(1)称取4-(二乙氨基)水杨醛溶于无水乙醇中，接着加入丙二酸二乙酯，搅拌均匀，再加入哌啶，得到混合液；将混合液进行第一次加热回流反应，反应结束后冷却至室温，通过减压蒸馏除去乙醇，然后在冰水浴条件下，加入乙酸和盐酸，进行第二次加热回流反应；反应结束后，在冰水浴条件下调节pH，然后通过减压抽滤得到滤饼，再用无水乙醇重结晶，得7-(二乙氨基)香豆素；

(2)首先用等体积的三氯氧磷和DMF配制威尔斯试剂，再用DMF将步骤1得到的7-(二乙氨基)香豆素完全溶解，然后滴加到制备好的威尔斯试剂中，得到混合液，进行加热回流反应；反应结束后，在冰水浴的条件下调节pH，将沉淀物减压抽滤得滤饼，再用无水乙醇重结晶，得7-(二乙氨基)香豆素醛；

(3)将(1，3-二氧戊环-2-甲基)三苯基溴化膦和步骤(2)得到的7-(二乙氨基)香豆素醛加到二氯甲烷中，常温搅拌，完全溶解后，滴加氢氧化钠溶液，在室温条件下进行反应，反应结束后调节pH，得到混合液；用蒸馏水和二氯甲烷进行萃取分液，将有机层回收，减压蒸馏除去二氯甲烷，通过柱层析纯化得到中间产物；

(4)将苯乙酮和步骤(3)得到的中间产物加入二氯甲烷和甲醇混合溶剂中，常温搅拌，完全溶解后，滴加四氢吡咯，再加入氯化钠，室温下搅拌进行反应，得到混合液，减压蒸馏除去二氯甲烷和甲醇，通过柱层析纯化得到检测氰化物的比率型近红外荧光探针。

优选的，步骤1中，所述4-(二乙氨基)水杨醛、无水乙醇、丙二酸二乙酯和哌啶的用量比为3g～4g：20mL～30mL：4mL～6mL：0.5mL～1mL；所述4-(二乙氨基)水杨醛、乙酸和盐酸的用量比为3g～4g：15mL～20mL：15mL～20mL。

优选的，步骤(1)中，所述第一次加热搅拌反应的温度为90～95℃，时间为6～7h，所述第二次加热搅拌反应的温度为100～105℃，时间为12～13h；所述调节pH是用氢氧化钠溶液调节pH至5；所述重结晶用的温度为90℃。

优选的，步骤(2)中，所述DMF和7-(二乙氨基)香豆素的用量比为3.5mL：2g～3g。

优选的，步骤(2)中，所述加热搅拌反应的温度为60～65℃，时间为13～14h；所述调节pH是用氢氧化钠溶液调节pH至5；所述重结晶用的温度为90℃。

优选的，步骤(3)中，所述7-(二乙氨基)香豆素醛、(1，3-二氧戊环-2-甲基)三苯基溴化膦、二氯甲烷和氢氧化钠溶液的用量比为0.4g～0.5g：0.6g～0.8g：5mL～6mL：0.5mL～1mL。

优选的，步骤(3)中，所述氢氧化钠溶液的浓度是6.6mol/L。

优选的，步骤(3)中，所述调节pH具体是用盐酸调节pH至7。

优选的，步骤(3)中，所述室温条件下进行反应的时间为23～24h。

优选的，步骤(4)中，所述中间产物、苯乙酮、二氯甲烷和甲醇的用量比为0.1g～0.2g：90μL～100μL：2mL～4mL：2mL～4mL。

优选的，步骤(4)中，所述中间产物、四氢吡咯和氯化钠的用量比为0.1g～0.2g：370μL～400μL：0.1g～0.2g。

优选的，步骤(4)中，所述室温下搅拌进行反应的时间为1～1.5h。

优选的，步骤(1)、(3)和(4)中所述减压蒸馏除去溶剂所使用的仪器均为旋转蒸发仪。

本发明制备得到的比率型近红外荧光探针可用于检测食品中的氰化物。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明提供了一种全新的可用于氰化物分析检测的比率型近红外荧光探针，该荧光探针合成方法简单，对氰化物有很好的选择性，F^-，Cl^-，Br^-，I^-，NO₃ ^-，CH₃COO^-，H₂PO₄ ^-，HCO₃ ^-，SCN^-，ClO₄ ^-，SO₄ ^2-，HSO₃ ^-，Gly和Cys等相关干扰物对检测没有影响；探针的荧光发射峰(688nm)在近红外区域，有助于消除背景荧光的干扰，减小检测的误差，提高分析检测的精确度；探针溶液的荧光强度的比率值(I₅₁₉/I₆₈₈)与氰化物的浓度在0-80μM范围内呈线性关系，并且表现出极高的灵敏度(检测下限为0.075μM)。

(2)经过本发明的合成方法改进后，可以有效阻止副反应的发生，极大地减少反应过程中出现难以分离的杂质，从而可以得到高纯度的目标产物。

(3)本发明开发出了一种新型高性能的检测氰化物的比率型近红外荧光探针。首个应用到检测食品中的氰化物的近红外荧光探针，并且首次应用激光共聚焦荧光显微镜进行荧光成像来检测竹笋中内生的氰化物。更重要的是，通过制备探针试纸，实现发芽土豆中内生氰化物的现场检测。值得说明的是，探针试纸是一种简单、便于携带的工具，可以不需要依赖大型仪器设备，而实现发芽土豆的便捷、快速现场检测，因此具有革新性意义。

附图说明

图1为本发明检测氰化物的比率型近红外荧光探针的合成路线图。

图2为实施例1制备的比率型近红外荧光探针的选择性柱状图；横坐标为不同离子或分子添加情况，其中标号1：空白；2：CN^-；3：F^-；4：Cl^-；5：Br^-；6：I^-；7：NO₃ ^-；8：CH₃COO^-；9：H₂PO₄ ^-；10：HCO₃ ^-；11:SCN^-；12：ClO₄ ^-；13：SO₄ ^2-；14：HSO₃ ^-；15：Gly；16：Cys；纵坐标为荧光强度的比率值。

图3为实施例1制备的比率型近红外荧光探针的竞争性柱状图；横坐标为不同可能竞争离子或分子添加情况，其中标号1：空白；2:F^-；3:Cl^-；4:Br^-；5:I^-；6:NO₃ ^-；7:CH₃COO^-；8:H₂PO₄ ^-；9:HCO₃ ^-；10:SCN^-；11:ClO₄ ^-；12:SO₄ ^2-；13:HSO₃ ^-；14:Gly；15:Cys；纵坐标为荧光强度的比值。

图4为pH值对实施例1制备的比率型近红外荧光探针与氰化物反应前和反应后荧光强度比率值的影响；其中横坐标为pH，纵坐标为荧光强度的比率值。

图5为实施例1制备的比率型近红外荧光探针的动力学研究图。

图6为实施例1制备的比率型近红外荧光探针在紫外灯下检测樱桃果肉中不同浓度氰化物的溶液在石英比色皿中荧光成像图。

图7中A为实施例1制备的比率型近红外荧光探针检测苦杏仁和甜杏仁中氰化物的光谱数据图；B为检测一定浓度的氰化物(CN^-)的光谱数据来构建的荧光比率值(I₅₁₉/I₆₈₈)与氰化物(CN^-)浓度的线性关系图。

图8为实施例1制备的比率型近红外荧光探针检测发芽土豆中氰化物含量的试纸条成像图；其中a为探针试纸浸入不同浓度的氰化物溶液获得的比色卡，b为试纸条检测发芽土豆的成像图，c为试纸条检测未发芽土豆的成像图。

图9中A为实施例1制备的比率型近红外荧光探针检测竹笋中氰化物的光共聚焦荧光显微镜成像图，B为未做任何处理的竹笋切片的光共聚焦荧光显微镜成像图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明进行详细描述，但本发明不局限于此实施例。

实施例1：

(1)向150mL烧瓶中加入3g的4-(二乙氨基)水杨醛，用20mL无水乙醇溶解，接着加入4.7mL丙二酸二乙酯，搅拌均匀，再加入0.83mL哌啶，得到混合液A，将混合液在90℃加热回流搅拌反应7h；反应结束后冷却至室温，用旋转蒸发仪除去多余的溶剂，在冰水浴条件下，依次加入20mL等量的乙酸和盐酸，接着100℃加热回流进行反应12h；反应结束后，在冰水浴下用氢氧化钠溶液调节pH至5，将沉淀物减压抽滤得滤饼，再用无水乙醇在90℃重结晶，真空干燥，得7-(二乙氨基)香豆素土黄色固体；

(2)首先用5mL三氯氧磷和等体积的DMF制备威尔斯试剂，再用3.5mL DMF将步骤1得到的2g 7-(二乙氨基)香豆素完全溶解，再滴加到制备好的威尔斯试剂中，得到混合液B，65℃加热反应13h；反应结束后，在冰水浴的条件下，用氢氧化钠溶液调节pH至5,将沉淀物减压抽滤得滤饼，再用无水乙醇90℃重结晶，得7-(二乙氨基)香豆素醛；

(3)称取0.4g步骤2得到的7-(二乙氨基)香豆素醛和0.6g(1，3-二氧戊环-2-甲基)三苯基溴化膦加到6mL二氯甲烷中，常温搅拌，待完全溶解后，滴加0.5mL氢氧化钠溶液，室温反应24h；加入盐酸中和使得pH至7，得到混合液C，用蒸馏水和二氯甲烷进行萃取分液，将有机层回收，减压蒸馏除去多余的溶剂(二氯甲烷)，通过柱层析纯化(石油醚/二氯甲烷＝5:1,v/v)即可得到中间产物；

(4)分别取2mL二氯甲烷和甲醇混合，然后加入95μL苯乙酮和0.1g步骤3得到的中间产物，常温搅拌，待完全溶解后，滴加370μL四氢吡咯，再加入0.1g氯化钠，室温下搅拌进行反应1h，得到混合液D，用旋转蒸发仪除去多余的溶剂(二氯甲烷和甲醇)，通过柱层析纯化(甲醇/二氯甲烷＝1：15，v/v)即可得到检测氰化物的比率型近红外荧光探针。

实施例2：

(1)向150mL烧瓶中加入4g的4-(二乙氨基)水杨醛，用25mL无水乙醇溶解，接着加入4mL丙二酸二乙酯，搅拌均匀，再加入0.5mL哌啶，得到混合液A，将混合液在90℃加热回流搅拌反应7h；反应结束后冷却至室温，用旋转蒸发仪除去多余的溶剂，在冰水浴条件下，依次加入15mL等量的乙酸和盐酸，接着105℃加热回流进行反应12h；反应结束后，在冰水浴下用氢氧化钠溶液调节pH至5，将沉淀物减压抽滤得滤饼，再用无水乙醇在90℃重结晶，真空干燥，得7-(二乙氨基)香豆素土黄色固体；

(2)首先用5mL三氯氧磷和等体积的DMF制备威尔斯试剂，再用3.5mL DMF将步骤1得到的2g 7-(二乙氨基)香豆素完全溶解，再滴加到制备好的威尔斯试剂中，得到混合液B，65℃加热反应13h；反应结束后，在冰水浴的条件下，用氢氧化钠溶液调节pH至5，将沉淀物减压抽滤得滤饼，再用无水乙醇90℃重结晶，得7-(二乙氨基)香豆素醛；

(3)称取0.5g步骤2得到的7-(二乙氨基)香豆素醛和0.7g(1，3-二氧戊环-2-甲基)三苯基溴化膦加到5mL二氯甲烷中，常温搅拌，待完全溶解后，滴加0.8mL氢氧化钠溶液，室温反应23h；，加入盐酸中和使得pH至7，得到混合液C，用蒸馏水和二氯甲烷进行萃取分液，将有机层回收，减压蒸馏除去多余的溶剂(二氯甲烷)，通过柱层析纯化(石油醚/二氯甲烷＝5:1,v/v)即可得到中间产物；

(4)分别取3mL二氯甲烷和甲醇混合，然后加入90μL苯乙酮和0.2g步骤3得到的中间产物，常温搅拌，待完全溶解后，滴加370μL四氢吡咯，再加入0.1g氯化钠，室温下搅拌进行反应1h，得到混合液D，用旋转蒸发仪除去多余的溶剂(二氯甲烷和甲醇)，通过柱层析纯化(甲醇/二氯甲烷＝1:15,v/v)即可得到检测氰化物的比率型近红外荧光探针。

实施例3：

(1)向150mL烧瓶中加入3g的4-(二乙氨基)水杨醛，用30mL无水乙醇溶解，接着加入6mL丙二酸二乙酯，搅拌均匀，再加入1mL哌啶，得到混合液A，将混合液在95℃加热回流搅拌反应6h；反应结束后冷却至室温，用旋转蒸发仪除去多余的溶剂，在冰水浴条件下，依次加入10mL等量的乙酸和盐酸，接着100℃加热回流进行反应13h；反应结束后，在冰水浴下用氢氧化钠溶液调节pH至5，将沉淀物减压抽滤得滤饼，再用无水乙醇在90℃重结晶，真空干燥，得7-(二乙氨基)香豆素土黄色固体；

(2)首先用5mL三氯氧磷和等体积的DMF制备威尔斯试剂，再用3.5mL DMF将步骤1得到的3g 7-(二乙氨基)香豆素完全溶解，再滴加到制备好的威尔斯试剂中，得到混合液B，60℃加热反应14h；反应结束后，在冰水浴的条件下，用氢氧化钠溶液调节pH至5，将沉淀物减压抽滤得滤饼，再用无水乙醇90℃重结晶，得7-(二乙氨基)香豆素醛；

(3)称取0.5g步骤2得到的7-(二乙氨基)香豆素醛和0.8g(1，3-二氧戊环-2-甲基)三苯基溴化膦加到6mL二氯甲烷中，常温搅拌，待完全溶解后，滴加0.1mL氢氧化钠溶液，反应一段时间后，加入盐酸中和使得pH至7，得到混合液C，用蒸馏水和二氯甲烷进行萃取分液，将有机层回收，减压蒸馏除去多余的溶剂(二氯甲烷)，通过柱层析纯化(石油醚/二氯甲烷＝5:1,v/v)即可得到中间产物；

(4)分别取4mL二氯甲烷和甲醇混合，然后加入100μL苯乙酮和0.2g步骤3得到的中间产物，常温搅拌，待完全溶解后，滴加400μL四氢吡咯，再加入0.2g氯化钠，室温下搅拌进行反应1.5h，得到混合液D，用旋转蒸发仪除去多余的溶剂(二氯甲烷和甲醇)，通过柱层析纯化(甲醇/二氯甲烷＝1:15,v/v)即可得到检测氰化物的比率型近红外荧光探针。

性能测试：选择实施例1获得的荧光探针进行后续的性能测试。

一、测试方法：

图1为本发明检测食品中氰化物的比率型近红外荧光探针的合成路线图；其中2、3、4以及Hy分别指代对应合成的物质。

(1)荧光探针对氰化物荧光检测的选择性研究；

用20mM磷酸钾缓冲/DMF(1:1v/v,pH＝7.4)配制10μM的荧光探针测试溶液，备用。用去离子水配制各种被测物(1:空白；2：CN^-；3：F^-；4：Cl^-；5：Br^-；6：I^-；7：NO₃ ^-；8：CH₃COO^-；9：H₂PO₄ ^-；10：HCO₃ ^-；11:SCN^-；12：ClO₄ ^-；13：SO₄ ^2-,14：HSO₃ ^-；15：Gly；16：Cys)溶液的浓度为1×10^-3M。将含14当量的各种被测物的溶液加入到10μM荧光探针测试溶液中，以490nm为激发波长，测试荧光发射光谱，计算荧光比率值(I₅₁₉/I₆₈₈)，得到荧光探针对各被测物的比率荧光响应值，其测定结果如图2所示；

从图2的结果中可以发现，只有CN^-可使荧光探针的比率荧光值显著增强，而加入其它离子或分子诸如3：F^-；4：Cl^-；5：Br^-；6：I^-；7：NO₃ ^-；8：CH₃COO^-；9：H₂PO₄ ^-；10：HCO₃ ^-；11:SCN^-；12：ClO₄ ^-；13：SO₄ ^2-,14：HSO₃ ^-；15：Gly；16：Cys则没有响应。从荧光照片来看，第二个加入氰化物的探针溶液发出强烈的绿色荧光，而其左边第一个空白样以及加入其它被测物样品则为红色荧光。该结果表明：该荧光探针对氰化物具有很好的选择性。

(2)其它常见离子或分子对实施例获得的荧光探针检测氰化物的干扰实验；

按照1配制荧光探针测试溶液，先分别加入14当量的其它可能干扰物到10μM的荧光探针分子测试溶液中，包括1:空白；2:F^-；3:Cl^-；4:Br^-；5:I^-；6:NO₃ ^-；7:CH₃COO^-；8:H₂PO₄ ^-；9:HCO₃ ^-；10:SCN^-；11:ClO₄ ^-；12:SO₄ ^2-,13:HSO₃ ^-；14:Gly；15:Cys再往这些溶液中分别加入14当量的氰化物(CN^-)。混合2分钟后，在同样条件下以490nm为激发，进行荧光光谱测试，得到各组溶液的荧光光谱。

从图3的结果中可以发现，当体系加入F^-,Cl^-,Br^-,I^-,NO₃ ^-,CH₃COO^-,H₂PO₄ ^-,HCO₃ ^-,SCN^-,ClO₄ ^-,SO₄ ^2-,HSO₃ ^-,Gly和Cys等可能干扰物后，各组的荧光强度与只加氰化物的空白溶液的荧光强度没有明显差异。该结果表明：该发明的荧光探针对氰化物有很高的选择性，不受其它共存离子或分子的干扰。

(3)pH对实施例1获得的荧光探针检测氰化物的影响；

为检测探针分子在不同pH条件下对氰化物的响应，分别配制了不同pH(2.3-10.5)的磷酸缓冲液。依次测定pH从2.3-10.5体系下实施例获得的荧光探针的荧光光谱，如图4，从图中可以看到荧光探针自身在不同pH下均表现出几乎可以忽略的荧光比率值的变化，此结果表明该发明的荧光探针在不同pH下是可以稳定存在的；加入14当量的氰化物后，当溶液的pH值大于6.0时，荧光比率值明显增大，说明该荧光探针能够在pH大于6.0的溶液中对氰化物进行检测。

(4)荧光探针的动力学研究；

荧光探针检测氰化物的动力学研究是以490nm为激发波长，监测荧光发射波长为519nm的荧光强度。如图5所示，没有加入氰化物时，荧光探针测试溶液在519nm的荧光强度几乎不变。加入氰化物后，探针溶液在519nm的荧光强度急剧增强，并且在5s内达到平稳，说明探针对氰化物能够快速响应，从而能够实时检测氰化物。

二、实际应用检测

(1)利用实施例1获得的荧光探针检测樱桃果肉中的氰化物；

将10g的樱桃果肉洗净捣碎，存储在一个密封的容量瓶中在室温下释放氰化物60分钟。接着加入10mL水和50mg氢氧化钠，将得到的混合物剧烈搅拌5min，然后离心20min，取上清液作为提取样品进行进一步分析。移取0.05mL荧光探针母液(1×10^-3M)和2.45mL DMF于5mL容量瓶中，分别加入樱桃果肉提取液样品上清液50μL和不同浓度氰化物(0μM,50μM,100μM,300μM,500μM)，然后分别用20mM的磷酸盐缓冲剂(pH＝7.4)定容到5mL，摇匀，室温放置2min后，然后将混合溶液移入石英比色皿中，在365nm紫外光照射下拍照。

如图6所示，从左至右可以看出，图b中加50μL樱桃果肉提取液样本上清液的荧光强度几乎和空白样品图a相同，说明樱桃果肉中氰化物含量极低，可以忽略不计。相比之下，从图c、d、e、f中看到，当分别加入不同浓度(50μM,100μM,300μM,500μM)的氰化物，荧光逐渐从红色变成绿色。以上结果表明，该发明的荧光探针可以检测樱桃果肉中的氰化物。

(2)实施例1获得的荧光探针检测杏仁中的氰化物；

取数个5mL容量瓶，每个都加入0.05mL荧光探针分子母液(1×10^-3M)和2.45mLDMF，再分别加入4μL苦杏仁提取液和4μL甜杏仁提取液,然后分别用20mM的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)定容到5mL，摇匀，室温放置2min后，以490nm为激发波长进行测试，得到相应的荧光光谱，并且在365nm紫外光照射下拍照。

如图7中图A所示，采用荧光发射光谱法对甜杏仁和苦杏仁中氰化物浓度分别进行了检测。加入甜杏仁提取液(4μL)的测试液的荧光光谱没有发生变化,插图中荧光的颜色也未发生变化，表明甜杏仁中没有检测到氰化物的存在。相比之下，加入苦杏仁提取液(4μL)时，在688nm的荧光强度降低，同时一个新的荧光在519nm急剧增强，相应地插图中荧光的颜色从红色变成绿色，这些结果推断苦杏仁中含有氰化物。如图7B所示，将探针(10μM)与不同浓度氰化物作用后，其荧光比率值(I₅₁₉/I₆₈₈)与氰化物的浓度在0-80μM的范围内呈线性关系。根据荧光探针与苦杏仁提取液作用后的荧光比率值(I₅₁₉/I₆₈₈)和图B所示的方程，确定苦杏仁中氰化物浓度为2.12mg/g，以上结果表明，该发明的荧光探针可以用来定量检测杏仁样品中的氰化物。

(3)实施例1获得的荧光探针检测发芽土豆中氰化物；

将滤纸剪成小条，浸没入0.1M的荧光探针溶液15min，取出自然晾干制作成为试纸条，备用。另外，将试纸条浸入一定浓度的氰化物后，记录其荧光颜色，制成比色卡(图8a)。经土豆提取液处理后，试纸条的荧光颜色由红色变为橙色(图8b)。通过与比色卡的颜色进行比较，表明土豆提取液中含有氰化物。此外，用未发芽的土豆提取液处理后，试纸条的荧光颜色几乎没有变化(图8c)。因此，在未发芽的土豆中没有发现氰化物。这些结果说明，探针试纸条可以作为一种简单、便携的食品样品氰化物现场检测工具，不需要复杂的大型仪器。

综上可见，本发明实施例不仅选择性好，灵敏度高，受其它相关试剂干扰小，而且合成方法简单。更重要的是，通过制备探针试纸，作为一种简单、便于携带的工具，可以不需要依赖大型仪器设备，实现食品样品中氰化物的便捷、快速现场检测，因此具有革新性意义。

(4)实施例1获得的荧光探针检测竹笋的氰化物；

将竹笋切成大约0.5毫米的薄片，备用。将竹笋片放置在含有探针(10μM)的20mM磷酸钾缓冲液/DMF(1:1v/v,pH 7.4)中浸泡30min后，在激光共聚焦荧光显微镜上进行荧光成像。如图9A(c)所示，近红外通道中观察到明显的荧光，说明探针能够渗透到竹笋组织中。此外，如图9A(b)所示，绿色通道中也出现了一定强度的荧光。因为在没有探针的竹笋切片中没有发现绿色荧光(图9B)，所以图9A(b)中的绿色荧光明显来源于探针与竹笋内源性氰化物反应后生成物所激发的荧光。另外，竹笋切片经过氰化物溶液(200μM)浸泡处理，然后竹笋切片进一步与探针溶液作用。通过激光共聚焦荧光成像，在绿色通道中可以检测到强烈的荧光(9A(e)),而在近红外通道几乎没有发现荧光(9A(f))。因此推断，探针在含有高浓度氰化物的竹笋切片中几乎被完全反应。为了进一步确认竹笋切片的荧光的变化是氰化物造成的，将竹笋切片先用50μM硝酸银(氰化物消除剂)浸泡处理,接着竹笋切片进一步在探针溶液中浸泡。如图9A(i)所示，在近红外通道具有强烈的荧光，而在绿色荧光通道几乎没有荧光9A(h)。因此，近红外通道荧光减弱和绿色通道荧光增强确实是探针检测氰化物的结果。

综上所述，本发明设计合成了一种新型的比率型近红外荧光探针，用于检测各种食品样品中的氰化物。值得注意的是，通过测定探针溶液的荧光颜色变化，检测了樱桃果肉样品中氰化物。通过记录荧光发射光谱，定量检测了苦杏仁中的内源性氰化物。并且，荧光探针制备成试纸后，可以作为一种简便易行的工具，在不使用复杂大型设备的情况下，对发芽土豆内源性氰化物进行现场检测。与此同时，我们还利用激光共聚焦荧光显微镜对竹笋组织中的氰化物进行荧光成像，可以清晰地显示竹笋组织中的氰化物。因此，本发明设计的这种新型的比率型近红外荧光探针可以作为一种多用途的工具来精确监测各种食品样品中的氰化物含量。

说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (10)

1.一种检测氰化物的比率型近红外荧光探针，其特征在于，结构如下：

2.根据权利要求1所述的一种检测氰化物的比率型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)制备获得7-(二乙氨基)香豆素；

(2)制备获得7-(二乙氨基)香豆素醛；

(3)将(1，3-二氧戊环-2-甲基)三苯基溴化膦和步骤(2)得到的7-(二乙氨基)香豆素醛加到二氯甲烷中，常温搅拌，完全溶解后，滴加氢氧化钠溶液，在室温条件下进行反应，反应结束后调节pH，得到混合液；用蒸馏水和二氯甲烷进行萃取分液，将有机层回收，减压蒸馏除去二氯甲烷，通过柱层析纯化得到中间产物；

(4)将苯乙酮和步骤(3)得到的中间产物加入二氯甲烷和甲醇混合溶剂中，常温搅拌，完全溶解后，滴加四氢吡咯，再加入氯化钠，室温下搅拌进行反应，得到混合液，减压蒸馏除去二氯甲烷和甲醇，通过柱层析纯化得到检测氰化物的比率型近红外荧光探针。

3.根据权利要求2所述的一种检测氰化物的比率型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述氢氧化钠溶液的浓度是6.6mol/L；所述7-(二乙氨基)香豆素醛、(1，3-二氧戊环-2-甲基)三苯基溴化膦、二氯甲烷和氢氧化钠溶液的用量比为0.4g～0.5g：0.6g～0.8g：5mL～6mL：0.5mL～1mL。

4.根据权利要求2所述的一种检测氰化物的比率型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述调节pH具体是用盐酸调节pH至7。

5.根据权利要求2所述的一种检测氰化物的比率型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述在室温条件下进行反应的时间为23～24h。

6.根据权利要求2所述的一种检测氰化物的比率型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述中间产物、苯乙酮、二氯甲烷和甲醇的用量比为0.1g～0.2g：90μL～100μL：2mL～4mL：2mL～4mL。

7.根据权利要求2所述的一种检测氰化物的比率型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述中间产物、四氢吡咯和氯化钠的用量比为0.1g～0.2g：370μL～400μL：0.1g～0.2g。

8.根据权利要求2所述的一种检测氰化物的比率型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述室温下搅拌进行反应的时间为1～1.5h。

9.根据权利要求1所述的一种检测氰化物的比率型近红外荧光探针的用途，其特征在于，所述检测氰化物的比率型近红外荧光探针用于检测食品中的氰化物。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述食品为樱桃、苦杏仁、土豆或竹笋。

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