CN117233292B - 一种九龙藤蜜的鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品检测技术领域，具体涉及一种九龙藤蜜的鉴别方法。本发明发现了4,7,8‑三甲基氧化二苯并呋喃‑3‑醇的含量在九龙藤蜜与其它蜂蜜中的差异特征，4,7,8‑三甲基氧化二苯并呋喃‑3‑醇在不同年份和来源的九龙藤蜜中稳定存在，而在其它蜂蜜中均无法检测到，可作为鉴别九龙藤蜜的特征性标志物。本发明提供的九龙藤蜜的鉴别方法具有准确性高、操作简单、高效等特点，适于在实践中用于九龙藤蜜的鉴定和品质控制。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，尤其涉及一种九龙藤蜜的鉴别方法。
背景技术
九龙藤是一种药性植物，具有促进血液循环和减轻疼痛的特殊功效，主要在传统医学中用于治疗类风湿关节炎、急性和慢性腰痛和腿痛以及上腹痛。许多研究表明，该植物含有丰富的活性化合物，具有抗癌、预防急性缺血损伤、调节细胞凋亡等作用。
九龙藤蜂蜜（以下简称九龙藤蜜）的产地是阳朔县，位于广西壮族自治区东北部，桂林市区南面，地处中亚热带季风性气候，热量丰富，雨量充沛，日照充足，温和湿润，四季分明，为高纯度、高品质九龙藤蜜的生产提供了绝佳条件。九龙藤蜜属于稀有蜜种，营养价值与功能活性相对较高，因此开发高效的九龙藤蜜鉴别方法对其品质控制具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种九龙藤蜜的鉴别方法，该方法以4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇作为特征性标志物。
本发明通过分别利用超高效液相串联四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）和超高效液相串联三重四级杆质谱（UPLC-QqQ/MS）对不同年份、不同来源的九龙藤蜜以及洋槐蜜、枣花蜜、荆条蜜等其它蜂蜜样品进行成分检测，发现了九龙藤蜜所特有的特征峰，且该特征峰在不同年份、不同来源的九龙藤蜜中稳定存在，而在其它蜂蜜中均无法检测到。经进一步比对分析，确定该特征峰对应的化合物为4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇。经验证，4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇适合作为九龙藤蜜的特征性标志物，用于九龙藤蜜的鉴别或真实性评价。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇作为九龙藤蜜特征性标志物的应用。
本发明中，4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的英文名为4,7,8-Trimethoxydibenzo[b,d]furan-3-ol，化学式为C15H14O5，化学结构如式（I）所示：
式（I）。
第二方面，本发明提供4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇在鉴别九龙藤蜜中的应用。
本发明中，所述鉴别九龙藤蜜是指将九龙藤蜜与其它蜂蜜进行区分鉴别。
第三方面，本发明提供4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇在检测九龙藤蜜的真实性中的应用。
以上所述的真实性检测是指区分真实九龙藤蜜和掺假九龙藤蜜，其中，掺假九龙藤蜜为在九龙藤蜜中掺入除九龙藤蜜、4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇以外的其它物质；掺假九龙藤蜜中4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的含量明显降低，因此，可通过检测4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的含量判断九龙藤蜜是否掺假，即进行九龙藤蜜的真实性检测。
第四方面，本发明提供一种九龙藤蜜的鉴别方法，所述方法以4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇作为特征性标志物检测蜂蜜样品，若所述蜂蜜样品中4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的含量不低于10μg/kg，则判断所述蜂蜜样品为九龙藤蜜；若所述蜂蜜样品中4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的含量小于10μg/kg，则判断所述蜂蜜样品为除九龙藤蜜以外的其它蜂蜜或为掺假九龙藤蜜。
优选地，若所述蜂蜜样品中4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的含量小于其检出限（LOD），则判断所述蜂蜜样品为除九龙藤蜜以外的其它蜂蜜或为掺假九龙藤蜜。
以上所述的除九龙藤蜜以外的其它蜂蜜包括但不限于洋槐蜜、枣花蜜、荆条蜜等。
以上所述的鉴别方法中，优选采用超高效液相串联三重四级杆质谱检测所述蜂蜜样品。
优选地，所述超高效液相串联三重四级杆质谱检测的液相条件如下：采用C18色谱柱，以0.1%甲酸水溶液为流动相A，以含0.1%甲酸的乙腈溶液为流动相B；采用梯度洗脱程序分离：0min，90%的流动相A；1min，90%的流动相A；2min，5%的流动相A；6min，5%的流动相A；6.1min，90%的流动相A；7min，90%的流动相A；后运行1 min，90%的流动相A。
进一步优选地，所述色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18 RRHD (2.1×50 mm,1.8 μm)。
所述超高效液相串联三重四级杆质谱检测的液相条件中，柱温为39~41℃（优选为40℃）；流动相的流速为0.25~0.35mL/min（优选为0.3 mL/min）。
所述超高效液相串联三重四级杆质谱检测的液相条件中，进样量优选为2μL。
优选地，所述超高效液相串联三重四级杆质谱检测的质谱条件如下：离子源模式：ESI，正离子MRM模式；干燥气温度：200℃；干燥气流速：15 L/min；鞘气温度：330℃；鞘气流速：12 L/min；雾化器压力：45 psi；毛细管电压：3500 V；碎裂电压：120 V。
采用上述超高效液相串联三重四级杆检测条件时，4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的保留时间为2.76 min，定量离子对m/z为243.0和275.0 m/z。
优选地，在超高效液相串联三重四级杆质谱检测前，还包括对所述蜂蜜样品进行预处理的步骤，所述预处理包括：将所述蜂蜜样品与水混合后再加入乙腈萃取，分离上清液，在35~40℃干燥，得到干燥的提取物，将干燥的提取物溶于甲醇。
在本发明的一些实施方式中，所述预处理包括：将所述蜂蜜样品与水以1g：1mL的配比混合，并搅拌溶解；加入2倍水体积用量的乙腈，混合，加入QuEChERs萃取袋（ENMethod5992-0650），搅拌，在4℃下离心分离上清液；将上清液在真空、温度35~40℃条件下蒸发，得到干燥的提取物，将干燥的提取物溶解在甲醇中，过滤后进行检测。
本发明中，所述九龙藤蜜为九龙藤单花蜂蜜。
本发明的有益效果至少包括：本发明首次发现了4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的含量在九龙藤蜜与其它蜂蜜中的差异特征，4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇在不同年份和产地来源的九龙藤蜜中稳定存在，而在其它蜂蜜中均无法检测到，可作为鉴别九龙藤蜜的特征性标志物。本发明提供的九龙藤蜜的鉴别方法具有准确性高、操作简单、高效等特点，适于在实践中用于九龙藤蜜的鉴定和品质控制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2中4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇标准品的UPLC-QqQ/MS分析特征离子多反应监测（MRM）相对丰度图。
图2为本发明实施例2中4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇标准品的UPLC-QqQ/MS分析特征离子多反应监测（MRM）响应强度图。
图3为本发明实施例2中九龙藤单花蜂蜜中4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的UPLC-QqQ/MS分析特征离子多反应监测（MRM）相对丰度图。
图4为本发明实施例2中九龙藤单花蜂蜜中4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的UPLC-QqQ/MS分析特征离子多反应监测（MRM）响应强度图。
图5为本发明实施例2中九龙藤植物甲醇提取液中4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的UPLC-QqQ/MS分析特征离子多反应监测（MRM）相对丰度图。
图6为本发明实施例2中九龙藤植物甲醇提取液中4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的UPLC-QqQ/MS分析特征离子多反应监测（MRM）响应强度图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种利用4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇作为特征性标志物鉴别蜂蜜样品是否为九龙藤蜜的方法，该方法采用UPLC-Q-TOF/MS（超高效液相串联四级杆-飞行时间质谱）和UPLC-QqQ/MS（超高效液相串联三重四级杆质谱）分别用于定性和定量检测蜂蜜样品，所得谱图中含有4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇对应的特征峰，且4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的含量≥10μg/kg时，则判断蜂蜜样品为九龙藤蜜；不含有4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的特征峰或4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的含量小于10μg/kg时，则判断蜂蜜样品为除九龙藤蜜以外的其它蜂蜜或为掺假九龙藤蜜。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 九龙藤蜜的特征性标志物4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的发现
分别利用超高效液相串联四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）和超高效液相串联三重四级杆质谱（UPLC-QqQ/MS）对大量的不同年份、不同来源的九龙藤蜜与不同产地来源、不同年份的洋槐蜜、枣花蜜、荆条蜜等其它常见蜂蜜样品进行定性和定量检测分析，发现了一种九龙藤蜜所特有的物质峰，该物质峰在九龙藤植物中同样能提取到。
结合质谱检测结果以及标准品比对，确定该物质峰对应的化合物为4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇，该化合物可作为特征性标志物用于鉴别九龙藤蜜。
实施例2 4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇作为特征性标志物用于九龙藤蜜的鉴别
在广西壮族自治区，于不同年份、不同季节从蜂场直接采集九龙藤蜜，并在全国范围内，于不同年份、不同季节从蜂场直接采集洋槐蜜、枣花蜜和荆条蜜，部分蜂蜜样品来源信息如表1所示。将上述蜂蜜样品用于不同蜂蜜样品中4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的含量检测。
表1 蜂蜜样品来源信息
1、蜂蜜样品的前处理
准确量取5±0.01g蜂蜜放入离心管中，加入5mL水；轻轻搅拌2分钟，彻底溶解；随后，向混合物中加入10mL乙腈，涡旋2分钟；加入QuEChERs萃取袋（EN Method5992-0650）后，继续搅拌两分钟；在4℃下以6000×g的速度离心10分钟，得到上清液；从每个样品中收集同等体积（约8mL）的上清液，在真空条件下以600×g的转速蒸发，温度在35~40℃之间；最后，将干燥后的提取物溶解在1mL甲醇中，然后用孔径为0.22μm的尼龙过滤膜过滤，待进行后续检测。
2、检测方法
2.1 试剂
乙腈：色谱纯，购自Fisher Scientific；
甲酸：购自Sigma。
2.2 仪器
Agilent 1290-6545超高效液相串联四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）联用系统用于化合物定性分析，Agilent 1290-6495超高效液相串联三重四级杆质谱（UPLC-QqQ/MS）联用系统用于化合物定量分析，数据处理采用Agilent Masshunter工作站。
2.3 UPLC-Q-TOF/MS仪器条件
2.3.1 液相色谱条件
色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18 column (2.1×100 mm, 1.8 μm)；
柱温：50℃；
进样量：2μL；
流动相：A) 0.1%甲酸水溶液；B) 含0.1%甲酸的乙腈溶液；
流速：0.3 mL/min；
梯度洗脱程序如表2所示。
表2 梯度洗脱程序
2.3.2 质谱条件
离子源模式：ESI，正离子模式；
干燥气温度：325℃；
干燥气流速：10 L/min；
鞘气温度：370℃；
鞘气流速：12 L/min；
雾化器压力：35 psi；
毛细管电压：3500 V；
碎裂电压：135 V；
采集模式：Full Scan和Auto MS/MS（碰撞能为20 eV）；
2.4 UPLC-QqQ-MS/MS仪器条件
2.4.1 液相色谱条件
色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1×50 mm, 1.8 μm)；
柱温：40℃；
进样量：2μL；
流动相：A) 0.1%甲酸水溶液； B)含0.1%甲酸的乙腈溶液；
流速：0.3 mL/min；
梯度洗脱程序如表3所示。
表3 梯度洗脱程序
2.4.2 质谱条件
离子源模式：ESI，正离子MRM模式；
干燥气温度：200℃；
干燥气流速：15 L/min；
鞘气温度：330℃；
鞘气流速：12 L/min；
雾化器压力：45 psi；
毛细管电压：3500 V；
碎裂电压：120 V。
4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇在UPLC-QqQ-MS/MS检测中的保留时间、MS/MS信息、线性范围、检出限和定量限等信息如表4所示。
表4 目标化合物在UPLC-QqQ-MS/MS检测中的保留时间、MS/MS信息、线性范围、检出限和定量限
注：表4中， 代表定量离子；a：检出限为3倍信噪比；b：定量限为10倍信噪比。
3、实验结果
3.1 定性分析结果
3.1.1 在TIC中提取准确质量数为275.0914的色谱峰，在九龙藤蜜和4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇标准品溶液的TIC图中均能提取到，保留时间为11.865 min。
3.1.2 化合物4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的母离子275.0914在二级质谱检测中可产生子离子260.0512, 243.0650和200.5391。对九龙藤蜜和4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇标准品溶液进行二级质谱检测，发现均含有260.0512、243.0650和200.5391子离子。
上述3.1.1和3.1.2提取质量数时，质量误差（mass error）均小于5 ppm。
以上结果表明，九龙藤蜜中含有4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇。
3.2 定量分析结果
3.2.1 利用UPLC-QqQ-MS/MS建立4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇检测方法的基质标曲、线性范围及方法检出限和定量限
4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的保留时间为2.76 min，定量离子对为243.0/275.0，基质标曲的线性范围为2-300μg/kg，R2=0.9996，检出限为0.5μg/kg，定量限为2μg/kg；
3.2.2 方法回收率和重现性验证
向空白蜂蜜样品中分别添加2μg/kg、4μg/kg、40μg/kg的4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇，设置6次重复。经基于UPLC-QqQ-MS/MS建立的定量方法检测获得4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的日内回收率为75.89-119.34%，相对标准偏差为0.33-8.96%；日间回收率为71.61-115.96%，相对标准偏差为4.85-9.21%（表5），方法回收率和重现性满足定量需求，可用于真实样品检测。
表5 目标化合物添加于空白蜂蜜样品中的检测回收率及相对标准偏差（RSD）
3.2.3 九龙藤蜜中4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的含量
检测九龙藤蜜中4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的含量，获得含量为19-27μg/kg。
4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇标准品、九龙藤单花蜂蜜以及九龙藤植物甲醇提取液的UPLC-QqQ/MS分析特征离子多反应监测（MRM）图分别如图1、图2、图3、图4、图5和图6所示。
3.2.4 其它蜂蜜中4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的含量
洋槐蜜、枣花蜜、荆条蜜中均没有检测到4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇。但在九龙藤蜜中检测到4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的含量为19-27μg/kg。因此，可以将4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇作为九龙藤蜜的特征性标志物。
上述蜂蜜样品的检测结果汇总如表6所示。
表6 实际蜂蜜样品检测结果
表1中所示的部分九龙藤蜜样品的具体检测结果如表7所示。
表7 部分九龙藤蜜样品中4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的含量检测结果
根据上述检测结果，若蜂蜜样品中4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的含量不低于10μg/kg，则判断蜂蜜样品为九龙藤蜜。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (4)
1.4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇作为九龙藤蜜特征性标志物的应用。
2.4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇在鉴别九龙藤蜜中的应用。
3.4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇在检测九龙藤蜜的真实性中的应用。
4.一种九龙藤蜜的鉴别方法，其特征在于，以4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇作为特征性标志物并采用超高效液相串联三重四级杆质谱检测蜂蜜样品，若所述蜂蜜样品中4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的含量不低于10μg/kg，则判断所述蜂蜜样品为九龙藤蜜；若所述蜂蜜样品中4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的含量小于10μg/kg，则判断所述蜂蜜样品为除九龙藤蜜以外的其它蜂蜜或为掺假九龙藤蜜；
所述超高效液相串联三重四级杆质谱检测的液相条件如下：采用C18色谱柱，以0.1%甲酸水溶液为流动相A，以含0.1%甲酸的乙腈溶液为流动相B；采用梯度洗脱程序分离：0min，90%的流动相A；1min，90%的流动相A；2min，5%的流动相A；6min，5%的流动相A；6.1min，90%的流动相A；7min，90%的流动相A；后运行1min，90%的流动相A；柱温为39~41℃，流动相的流速为0.25~0.35mL/min；
所述超高效液相串联三重四级杆质谱检测的质谱条件如下：离子源模式：ESI，正离子MRM模式；干燥气温度：200℃；干燥气流速：15 L/min；鞘气温度：330℃；鞘气流速：12 L/min；雾化器压力：45 psi；毛细管电压：3500 V；碎裂电压：120 V；
4,7,8-三甲基氧化二苯并呋喃-3-醇的定量离子对为243.0和275.0 m/z；
在超高效液相串联三重四级杆质谱检测前，还包括对所述蜂蜜样品进行预处理的步骤，所述预处理包括：将所述蜂蜜样品与水以1g：1mL的配比混合，并搅拌溶解；加入2倍水体积用量的乙腈，混合，加入QuEChERs EN Method萃取袋，搅拌，在4℃下离心分离上清液；将上清液在真空、温度35~40℃条件下蒸发，得到干燥的提取物，将干燥的提取物溶解在甲醇中，过滤后进行检测。
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