CN115611840B - 一种寒冬蜜素及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蜂蜜检测技术领域，尤其涉及一种寒冬蜜素及其制备方法与应用。所述寒冬蜜素，具有式1所示结构：本发明通过对冬蜜的研究，发现了其中所含有的一种新的化合物，可作为判定待测蜂蜜为冬蜜的重要依据，该化合物结合苦蜜素B等可以用于判定冬蜜的真伪，为冬蜜真实性及品质评价体系的构建具有重大意义。
Description
技术领域
本发明涉及蜂蜜检测技术领域，尤其涉及一种寒冬蜜素及其制备方法和应用。
背景技术
冬蜜属于我国广东、广西地区特有的冬季蜜种，也被称为鹅掌柴蜂蜜或寒冬蜜。其蜜源植物为鹅掌柴，鹅掌柴花期为每年11月至次年1月。鹅掌柴蜂蜜为浅琥珀色，味微苦，颗粒细，气味香，属于上等蜂蜜。鹅掌柴蜂蜜市场价值高，存在掺假现象，严重影响消费者以及蜂农的利益，制约了特色鹅掌柴蜂蜜产业的发展。
因此，提取冬蜜中特有化合物，建立一套鉴别冬蜜真假的方法是十分必要和迫切的。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种寒冬蜜素及其制备方法和应用(及冬蜜的鉴别方法)。
第一方面、本发明提供的寒冬蜜素，其式具有式(1)所示的结构：
本发明通过对冬蜜蜂蜜的研究，发现了其中所含有的一种新的化合物，该化合物结合苦蜜素B、3，4，5-三甲氧基苯丙烯醇、反，反式脱落酸、顺，反式脱落酸，可以用于判定冬蜜的真伪。
第二方面，本发明提供的寒冬蜜素的制备方法，包括：通过高效液相色谱法对蜂蜜中的萜烯类成分进行分离获得，所述蜂蜜包括冬蜜。
作为优选，所述高效液相色谱分离条件：流动相A为浓度为0.18-0.22％的乙酸的水溶液，流动相B为浓度为0.18-0.22％的乙酸的甲醇溶液；优选的，所述流动相A为浓度为0.2％的乙酸的水溶液，所述流动相B为浓度为0.2％的乙酸的甲醇溶液；
梯度洗脱程序优选为：0～11min，流动相B由5％上升至14％；11～14min，流动相B由14％上升至15％；14～17min，流动相B由15％上升至16％；17～24min，流动相B由15％上升至16％；24～28min，流动相B由16％上升至17％；28～30min，流动相B由17％上升至22％；30～38min，流动相B由22％上升至25％；38～41min,流动相B由25％上升至30％；41～46min，流动相B由30％上升至33％；46～55min，流动相B保持33％；55～60min，流动相B由33％上升至34％；60～70min，流动相B由34％上升至36％；70～80min，流动相B由36％上升至40％；80～90min，流动相B由40％上升至45％；90～100min，流动相B由45％上升至52％；100～110min，流动相B由52％上升至57％；110～120min，流动相B由57％上升至65％；120～130min，流动相B由65％上升至70％；130～135min，流动相B由70％上升至80％；所述流动相A与所述流动相B的体积之和为100％；
色谱柱优选为Phenomenex Gemini C18色谱柱，流速为0.6-0.8mL/min，进样量为20μL，柱温为34-36℃，检测波长为270nm；优选的，流速为0.7mL/min，柱温为35℃。
作为优选，通过高效液相色谱法对蜂蜜中萜烯类成分进行分离前，包括蜂蜜预处理的步骤，具体包括：将蜂蜜与水混合后，调节pH值为6.5-7，8800-9200rpm离心18-22min后，取上清液备用；优选的，调节pH值为6.7，9000rpm离心20min。本发明中预处理加入水的量以可充分溶解蜂蜜，并利于后续操作为宜。
进一步优选，在进行高效液相色谱分离前，还包括以固相萃取柱对蜂蜜中的萜烯类成分进行提取的步骤；具体采用Strata-X-A固相萃取柱提取，以甲醇作为活化剂、水作为平衡剂和淋洗剂，以浓度为9～11％的甲酸的甲醇溶液作为洗脱剂，将获得的洗脱液吹干，以甲醇复溶后，过滤；优选的，所述洗脱剂为浓度为10％的甲酸的甲醇溶液，和/或，所述过滤时滤膜的孔径为0.22μm。
本发明中，经研究进一步发现，通过采用上述条件下的预处理尤其是结合上述提取方法，可有效去除冬蜜中的干扰成分，实现目标组分的有效富集。
作为优选，通过高效液相色谱法对蜂蜜中的萜烯类成分进行分离后，收集目标峰洗脱液，所述目标峰的保留时间为73.23min。
第三方面，本发明提供所述的寒冬蜜素或所述的寒冬蜜素的制备方法在鉴别冬蜜中的应用。
第四方面，本发明提供的冬蜜的鉴别方法，通过高效液相色谱法对待测蜂蜜中的萜烯类成分进行检测。当所述萜烯类成分中同时包括苦蜜素B、3，4，5-三甲氧基苯丙烯醇、所述寒冬蜜素、反，反式脱落酸、顺，反式脱落酸时，判定所述待测蜂蜜为冬蜜。
本发明鉴别方法中，对所述待测蜂蜜进行高效液相色谱法检测的方法如上所述。
进一步地，本发明的高效液相色谱法可将待测蜂蜜中的苦蜜素B、3，4，5-三甲氧基苯丙烯醇、寒冬蜜素、反，反式脱落酸、顺，反式脱落酸进行有效分离，从而实现真伪的准确判定。
作为优选，当所述待测蜂蜜中所述苦蜜素B含量大于2.69mg/kg，3，4，5-三甲氧基苯丙烯醇含量大于0.80mg/kg，寒冬蜜素的含量大于4.87mg/kg，反，反式脱落酸含量大于4.04mg/k，顺，反式脱落酸含量大于8.56mg/k，判定所述待测蜂蜜为冬蜜。
进一步优选，待测蜂蜜的苦味来源为寒冬蜜素和苦蜜素B时，判定所述待测蜂蜜为冬蜜。
第五方面，本发明提供一种冬蜜的指纹图谱，其通过高效液相色谱法对冬蜜进行处理构建而得，所述高效液相色谱法优选如上所述，具体包括上述蜂蜜预处理的步骤，在以固相萃取柱对蜂蜜中的萜烯类成分进行提取的步骤和进行高效液相色谱检测的步骤；优选的，所述冬蜜的指纹图谱中苦蜜素B的特征峰为30.21min，3，4，5-三甲氧基苯丙烯醇的特征峰为48.00min，寒冬蜜素的特征峰为73.23min，反，反式脱落酸的特征峰为74.82min，顺，反式脱落酸的特征峰为84.21min。
本发明的有益效果至少在于：本发明提供的一种新的化合物，该化合物结合苦蜜素B、3，4，5-三甲氧基苯丙烯醇、反，反式脱落酸、顺，反式脱落酸，可以用于判定冬蜜的真伪。本发明建立了冬蜜中植物化合物的固相萃取及高效液相色谱分离检测方法，并通过HPLC-QTOF方法，共鉴定出冬蜜中含有的有代表性的5种植物化合物，分别为苦蜜素B、3，4，5-三甲氧基苯丙烯醇、寒冬蜜素、反，反式脱落酸，顺，反式脱落酸。将获得的冬蜜植物化合物HPLC图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，初步模拟生成了具有代表意义的冬蜜标准指纹图谱。本发明通过与荆条蜜、洋槐蜜、椴树蜜三种单花蜜的HPLC图谱比较，以及对收集的其他小众蜂蜜如红花蜜、五倍子蜜、枸杞蜜、益母草蜜、九龙藤蜜等的植物化合物的分析比对，均未在冬蜜以外的其他单花蜜中同时检测出苦蜜素B、3，4，5-三甲氧基苯丙烯醇、寒冬蜜素、反，反式脱落酸、顺，反式脱落酸。证明了这五种成分可以作为冬蜜的特征性植物化合物标记物，并应用于冬蜜真实性及品质评价，对保护蜂蜜消费者的合法权益和维护蜂蜜消费行业的健康发展具有重要的现实意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中需要使用的附图作简单介绍，显而易见，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的寒冬蜜素的液质联用一级质谱图。
图2为本发明实施例提供的寒冬蜜素的液质联用二级质谱图。
图3为本发明实施例提供的寒冬蜜素的气质联用谱图。
图4为本发明实施例提供的寒冬蜜素的核磁共振谱图，其中上图为氢谱图，下图为碳谱图。
图5为本发明实施例1中冬蜜萜烯类成分色谱图。
图6为本发明实施例2中二十六个不同产地冬蜜原料蜜的HPLC叠加图谱。图中，R代表基于二十六个不同产地冬蜜原料蜜生成的标准指纹图谱，S1-S26代表二十六个不同产地冬蜜原料蜜。
图7为本发明对比例1中冬蜜萜烯类成分色谱图。
图8为本发明对比例2中冬蜜萜烯类成分色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊方法，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供一种寒冬蜜素，还提供了所述寒冬蜜素的制备方法、冬蜜的鉴别方法及冬蜜鉴别特征性成分指纹图谱的建立。操作方法：
1)冬蜜溶液的准备：准确称量冬蜜20.0g于烧杯中，加入80mL去离子水，用玻璃棒搅拌至蜂蜜充分溶剂，加5％氨水溶液，调节PH值至6.8左右，9000rmp离心20min后，取上清液备用。
2)冬蜜植物化合物的提取富集：使用Strata-X-A固相萃取柱对蜂蜜中的萜烯类成分进行提取，先用3mL甲醇活化、3mL去离子水平衡萃取柱，再加入上述上清液并用去离子水淋洗，最后用10％甲酸的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液。洗脱液用氮气吹干，2.0mL甲醇复溶，0.22μm滤膜过滤备用。
3)冬蜜植物化合物的分离检测：使用高效液相色谱对上述蜂蜜中的萜烯类成分进行分离检测，色谱柱为Phenomenex Gemini C18色谱柱，流动相A为0.2％乙酸的水溶液，流动相B为0.2％乙酸的甲醇溶液，梯度洗脱程序为：0～11min，流动相B由5％上升至14％；11～14min，流动相B由14％上升至15％；14～17min，流动相B由15％上升至16％；17～24min，流动相B由15％上升至16％；24～28min，流动相B由16％上升至17％；28～30min，流动相B由17％上升至22％；30～38min，流动相B由22％上升至25％；38～41min，流动相B由25％上升至30％；41～46min，流动相B由30％上升至33％；46～55min，流动相B保持33％；55～60min，流动相B由33％上升至34％；60～70min，流动相B由34％上升至36％；70～80min，流动相B由36％上升至40％；80～90min，流动相B由40％上升至45％；90～100min，流动相B由45％上升至52％；100～110min，流动相B由52％上升至57％；110～120min，流动相B由57％上升至65％；120～130min，流动相B由65％上升至70％；130～135min，流动相B由70％上升至80％。进样量为20μL，柱温为35℃，检测波长为270nm。按照以上条件进行检测、组分分离，记录色谱图，参见图5。收集各出峰时间的洗脱液，并对其进行鉴定。
具体采用上述液相色谱检测串联二极管阵列检测器(HPLC-PDA)和上述液相色谱检测串联四极杆/飞行时间质谱(HPLC-QTOF)的方法对有效分离、富集获得的植物化合物进行类别鉴定。
具体的鉴定方法如下：
1、将以上述液相色谱条件进行检测后的冬蜜中植物化合物成分进行结构鉴定：
液相质谱分析条件：离子源为ESI源(电喷雾)，离子源喷射电压为4kV，出口电压为130V、加热的温度350℃、氮气(N2)流速为11L/min、碰撞气体为氦气、雾化气流速为80kPa、雾化器的压力40psi、质量扫描范围m/z＝100-900Da。
2、冬蜜中植物化合物的结构鉴定分析过程和结果：
(1)保留时间为30.21min的洗脱液中化合物结构解析如下：
该化合物在正离子模式下有m/z241.1424[M+H]+、m/z263.1248[M+Na]+和m/z481.2785[2M+H]+的分子离子峰，负离子模式下有m/z239.1276[M-H]-的分子离子峰，根据一级质谱信息，判断该化合物的分子量为240，该化合物在246nm波长处有最大紫外吸收峰。结合质谱数据，标准品图谱的保留时间和最大紫外吸收波长，同时依据标准品液相色谱验证，最终确定该化合物的结构式为：
其化学名称为2-(1,2-dihydroxypropyl)-4,8,8-trimethyl-1-oxaspiro[2.5]oct-4-en-6-one，本发明中将其命名为苦蜜素B。
(2)保留时间为48.00min的洗脱液中化合物结构解析如下：
该化合物在正离子模式下有m/z225.1476[M+H]+和m/z471.2662[2M+Na]+的分子离子峰，根据一级质谱信息，判断该化合物的分子量为224，分子式为C12H16O4。该化合物的环加双键值为5，且在二级谱图的低质量端含有m/z 77，m/z 91的碎片离子，可以确定分子结构中含有苯环。结合碰撞能量分析，由m/z 225到m/z 181相差44，通过元素拟合中性丢失为CH3CHO；由m/z 181到m/z 151相差30，通过元素拟合中性丢失为HCO；由m/z 151到m/z 121相差30，通过元素拟合中性丢失为HCO；由m/z 121到m/z 91相差30，通过元素拟合中性丢失为HCO。该化合物的裂解过程涉及三次HCHO的丢失，这通常与芳香甲醚结构的氢重排反应有关。综上，最终确定该化合物的结构式为：
其化学名称为3，4，5-三甲氧基苯丙烯醇。
(3)保留时间为73.23min的洗脱液中化合物结构解析如下：
在液相质谱的一级质谱图(图1)下，该化合物有m/z241.1420[M+H]+的分子离子峰，m/z481.2771[2M+H]+的分子离子峰,可以判断出其分子量为240。结合液相二级质谱(图2)、气相质谱(图3)的结果，确定分子式为C13H20O4，计算其不饱和度为Ω＝4。由分子离子峰m/z 240得到m/z 222，表明结构中含有羟基；m/z 240得到m/z 212，表明结构中含有羰基；m/z 240得到m/z 198，表明丢失的为乙烯酮，来源由多种，一般为乙酸酯或含乙酰基及通过氢重排可形成乙酰基的结构，谱图的低质量端由显著的m/z 43，为乙酰基；m/z 240得到m/z184，丢失56Da，常见的为丁烯或异丁烯。中质量段碎片离子较为丰富，且强度显著，表明这类离子应该是具有多个环或还有不饱和键，m/z 154得到m/z 139，表明丢失的为甲基，得到m/z 153是脱氢，一般是来自于α碎裂反应途径，得到m/z 126为脱CO，进一步脱甲基得到m/z111，m/z 70的产生为m/z 126脱丁烯或异丁烯丢失56Da，这与m/z 184的途径相类似。
通过核磁共振分析，得到了该化合物的核磁共振图谱(图4)，该化合物的化学位移如表1所示。
表1该化合物的化学位移
因此判断出该化合物的结构为：
其化学名称为3，4-二羟基茶螺烷酮，将其命名为寒冬蜜素。
(4)保留时间为74.82min的洗脱液中化合物结构解析过程如下：
该化合物在正离子模式下有m/z265。1417[M+H]+的分子离子峰，在负离子模式下可以观察到分子离子峰有m/z263.1292[M-H]-，判断其分子量为264。结合质谱数据、反，反式脱落酸标准品图谱的保留时间和最大紫外吸收波长，同时依据反，反式脱落酸标准品液相色谱验证，最终确定该化合物为反，反式脱落酸。
(5)保留时间为84.21min的洗脱液中化合物结构解析过程如下：
该化合物在正离子模式下有m/z287.1269[M+Na]+、m/z 247.1339[M-H2O]+、m/z529.2823[2M+H]+、m/z 551.2635[2M+Na]+的分子离子峰，可以在负离子模式下观察到的分子离子峰有m/z 263.1203[M-H]-，因此判断该化合物的分子量为264，该化合物在262nm波长处有最大紫外吸收峰。结合质谱数据、顺，反式脱落酸标准品图谱的保留时间和最大紫外吸收波长，同时依据顺，反式脱落酸标准品液相色谱验证，最终确定该化合物为顺，反式脱落酸。
实施例2
本实施例以实施例1的高效液相色谱法对二十六个蜂场的冬蜜进行检测，通过外标法对检测到的这些冬蜜的成分进行定量分析。
具体蜂蜜来源信息如下表2:
表2冬蜜原料蜜
获得的二十六个不同产地的冬蜜的色谱图叠加图谱见图6。
二十六个蜂蜜样品中，苦蜜素B平均含量为5.84mg/kg；3，4，5-三甲氧基苯丙烯醇的平均含量为2.08mg/kg；寒冬蜜素的平均含量为10.82mg/kg；反，反式脱落酸平均含量为6.85mg/kg；顺，反式脱落酸平均含量为14.26mg/kg。详细结果见表3：
表3各冬蜜化合物含量测定结果(mg/kg)
实施例3
本实施例采用实施例1的高效液相色谱法，通过高效液相色谱仪对荆条蜜、洋槐蜜、椴树蜜、红花蜜、五倍子蜜、枸杞蜜、益母草蜜、九龙藤蜜进行成分分析(具体原料蜜来源信息见表4)，并将上述蜂蜜与实施例1中的冬蜜的HPLC图谱分析对比。结果表明，均未在冬蜜以外的其他单花蜜中同时检测出化合物苦蜜素B、3，4，5-三甲氧基苯丙烯醇、寒冬蜜素、反，反式脱落酸和顺，反式脱落酸。具体检测结果见表5：
表4其他原料蜜来源信息
表5其他蜂蜜中是否含有五种标志性化合物信息表
实施例4
本实施例采用实施例1的高效液相色谱法，使用高效液相色谱仪对七例市售(来自于不同销售平台的不同品牌商品)冬蜜进行检测分析。通过HPLC色谱图分析对比，七个品牌的冬蜜品质较好，均检测出苦蜜素B、3，4，5-三甲氧基苯丙烯醇、寒冬蜜素、反，反式脱落酸、顺，反式脱落酸，具体平均含量分别为6.46mg/kg，0.48mg/kg，5.49mg/kg，2.87mg/kg，6.23mg/kg。判断7个品牌中，3个品牌为品质较好的冬蜜，4个为冬蜜中掺杂了其他成分。
实施例5
对冬蜜进行感官鉴定，冬蜜味道微苦，使用VirtualTaste(charite.de)对寒冬蜜素、苦蜜素B的苦味程度进行评估，寒冬蜜素的苦味度达到0.81，大于苦蜜素B的0.67。
分别配置300mg/L的苦蜜素B溶液、寒冬蜜素溶液和奎宁溶液，5.84mg/L苦蜜素B与10.82mg/L奎宁混合溶液，5.84mg/L奎宁与10.82mg/L寒冬蜜素混合溶液，5.84mg/L苦蜜素B与10.82mg/L寒冬蜜素混合溶液，5mg/L苦蜜素B、5mg/L寒冬蜜素和5mg/L奎宁溶液三者混合溶液、以及5mg/L的奎宁溶液样品。随机筛选20个成年人进行感官鉴定，进行苦味排序。结果显示，样品的苦味程度从高到低依次为：300mg/L奎宁溶液>300mg/L寒冬蜜素溶液>300mg/L苦蜜素B溶液>5.84mg/L苦蜜素B与10.82mg/L奎宁混合溶液>5.84mg/L奎宁与10.82mg/L寒冬蜜素混合溶液>5mg/L苦蜜素B、5mg/L寒冬蜜素和5mg/L奎宁溶液三者混合溶液>冬蜜＝5.84mg/L苦蜜素B与10.82mg/L寒冬蜜素混合溶液>5mg/L奎宁溶液。冬蜜的苦味程度与苦蜜素B和寒冬蜜素的混合液的苦味相当。用相同浓度的奎宁替代苦蜜素B或者寒冬蜜素，都苦于冬蜜。并且，将同样浓度的5mg/L奎宁、苦蜜素B和寒冬蜜素混合之后也比冬蜜苦。因此，冬蜜的苦味来源于寒冬蜜素、苦蜜素B，并且寒冬蜜素比苦蜜素B更苦。
综上所述，通过对冬蜜和荆条蜜、洋槐蜜、椴树蜜、红花蜜、五倍子蜜、枸杞蜜、益母草蜜、九龙藤蜜的植物化合物成分的分析比对，均未在冬蜜以外的其他单花蜜中同时检测出化合物石山苦蜜素B、3，4，5-三甲氧基苯丙烯醇、寒冬蜜素、反，反式脱落酸、顺，反式脱落酸。因此苦蜜素B、3，4，5-三甲氧基苯丙烯醇、寒冬蜜素、反，反式脱落酸、顺，反式脱落酸可以作为冬蜜的特征性植物化合物标记物，并将其应用于冬蜜真实性及品质评价体系的构建。
对比例1
进行冬蜜植物化合物的提取富集时，不使用Strata-X-A固相萃取柱对蜂蜜中成分进行提取，直接将待测冬蜜样品进行高效液相分离检测，得到待测蜂蜜的高效液相色谱图(图7)，结果表明，未经Strata-X-A固相萃取柱富集的冬蜜样品，各成分间无法得到有效的分离。表明本发明实施例1中冬蜜植物化合物提取方法效果显著。
对比例2
当梯度洗脱程序、色谱柱型号、流速、进样量、柱温、检测波长等其他高效液相色谱分离条件均与实施例1一致，只将流动相变为：流动相A为纯水溶液，流动相B为乙腈溶液时，得到待测蜂蜜的高效液相色谱图(图8)，结果表明，与实施例1中冬蜜植物化合物的分离检测方法相比，此方法无法有效的分离寒冬蜜素与顺，反式脱落酸。表明本发明实施例1中高效液相分离检测方法效果显著。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.寒冬蜜素的制备方法，其特征在于，通过高效液相色谱法对蜂蜜中的萜烯类成分进行分离获得，所述蜂蜜为冬蜜；高效液相色谱分离条件：流动相A为浓度为0.18％-0.22％的乙酸的水溶液，流动相B为浓度为0.18％-0.22％的乙酸的甲醇溶液；色谱柱为PhenomenexGemini C18色谱柱，采用梯度洗脱程序；通过高效液相色谱法对蜂蜜中萜烯类成分进行分离前，包括蜂蜜预处理的步骤，具体包括：将蜂蜜与水混合后，调节pH值为6.5-7，8800-9200rpm离心18-22min后，取上清液备用；在进行高效液相色谱分离前，还包括以固相萃取柱对蜂蜜中的萜烯类成分进行提取的步骤；具体采用Strata-X-A固相萃取柱提取，以甲醇作为活化剂、水作为平衡剂和淋洗剂，以浓度为9～11％的甲酸的甲醇溶液作为洗脱剂，将获得的洗脱液吹干，以甲醇复溶后，过滤；所述寒冬蜜素具有式1所示结构：
2.根据权利要求1所述的寒冬蜜素的制备方法，其特征在于，所述蜂蜜预处理的步骤，具体包括：将蜂蜜与水混合后，调节pH值为6.7，9000rpm离心20min。
3.根据权利要求1所述的寒冬蜜素的制备方法，其特征在于，
所述流动相A为浓度为0.2％的乙酸的水溶液，所述流动相B为浓度为0.2％的乙酸的甲醇溶液；
梯度洗脱程序为：0～11min，流动相B由5％上升至14％；11～14min，流动相B由14％上升至15％；14～17min，流动相B由15％上升至16％；17～24min，流动相B由15％上升至16％；24～28min，流动相B由16％上升至17％；28～30min，流动相B由17％上升至22％；30～38min，流动相B由22％上升至25％；38～41min，流动相B由25％上升至30％；41～46min，流动相B由30％上升至33％；46～55min，流动相B保持33％；55～60min，流动相B由33％上升至34％；60～70min，流动相B由34％上升至36％；70～80min，流动相B由36％上升至40％；80～90min，流动相B由40％上升至45％；90～100min，流动相B由45％上升至52％；100～110min，流动相B由52％上升至57％；110～120min，流动相B由57％上升至65％；120～130min，流动相B由65％上升至70％；130～135min，流动相B由70％上升至80％；所述流动相A与所述流动相B的体积之和为100％；
色谱柱为Phenomenex Gemini C18色谱柱，流速为0.6-0.8mL/min，进样量为20μL，柱温为34-36℃，检测波长为270nm。
4.根据权利要求3所述的寒冬蜜素的制备方法，其特征在于，所述流速为0.7mL/min，所述柱温为35℃。
5.根据权利要求1-4任一项所述的寒冬蜜素的制备方法，其特征在于，通过高效液相色谱法对蜂蜜中的萜烯类成分进行分离后，收集目标峰洗脱液，所述目标峰的保留时间为73.23min。
6.权利要求1-5任一项所述的寒冬蜜素的制备方法在鉴别冬蜜中的应用。
7.冬蜜的鉴别方法，其特征在于，通过高效液相色谱法对待测蜂蜜中的萜烯类成分进行检测；当所述萜烯类成分中同时包括苦蜜素B、3，4，5-三甲氧基苯丙烯醇、寒冬蜜素、反，反式脱落酸、顺，反式脱落酸时，判定所述待测蜂蜜为冬蜜；
所述寒冬蜜素具有式1所示结构：
所述苦蜜素B具有式2所示结构：
8.根据权利要求7所述的鉴别方法，其特征在于，当所述待测蜂蜜中所述苦蜜素B含量大于2.69mg/kg，3，4，5-三甲氧基苯丙烯醇含量大于0.80mg/kg，寒冬蜜素的含量大于4.87mg/kg，反，反式脱落酸含量大于4.04mg/kg，顺，反式脱落酸含量大于8.56mg/kg，判定所述待测蜂蜜为冬蜜。
9.一种冬蜜的鉴别方法，其特征在于，待测蜂蜜的苦味来源为寒冬蜜素和苦蜜素B时，判定所述待测蜂蜜为冬蜜；
所述寒冬蜜素具有式1所示结构：
所述苦蜜素B具有式2所示结构：
10.冬蜜的指纹图谱，其特征在于，通过高效液相色谱法对冬蜜进行处理构建而得；所述冬蜜的指纹图谱中苦蜜素B的特征峰为30.21min，3，4，5-三甲氧基苯丙烯醇的特征峰为48.00min，寒冬蜜素的特征峰为73.23min，反，反式脱落酸的特征峰为74.82min，顺，反式脱落酸的特征峰为84.21min；
所述寒冬蜜素具有式1所示结构：
所述苦蜜素B具有式2所示结构：
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| CN106501408A (zh) * | 2016-10-26 | 2017-03-15 | 江南大学 | 一种基于hplc‑elsd和偏最小二乘判别分析法的蜂蜜掺假检测方法 |
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Classifi cation and Characterization of Manuka Honeys Based on Phenolic Compounds and Methylglyoxal;Stefanie Oelschlaegel et al;Journal of Agricultural and Food Chemistry;第60卷;7229-7237 * |
| LC-ESI/LTQ-Orbitrap-MS Based Metabolomics in Evaluation of Bitter Taste of Arbutus unedo Honey;Paola Montoro et al;Molecules;第26卷;全文 * |
| Structure elucidation of four new megastigmanes from Sonneratia ovata Backer;Thi Hoai Thu Nguyen et al;Magnetic Resonance in Chemistry;第52卷(第12期);795-802 * |
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