CN105301152B - 一种适用于盐酸克仑特罗的生物相容性固相萃取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种适用于盐酸克仑特罗的生物相容性固相萃取方法，采用生物相容性固相萃取技术，以非离子型中性表面活性剂Tween‑20动态改性的C18固相萃取柱进行分析，通过动态改性C18固相萃取柱的长碳链的疏水内层和醇羟基覆盖亲水性外层表面结构，对蛋白质等大分子具有屏蔽和排阻作用，降低复杂基质带来干扰，用于动物源食品中克仑特罗的分析，具有简便、高效和成本低等特点。

Description

一种适用于盐酸克仑特罗的生物相容性固相萃取方法

技术领域

本发明涉及克仑特罗，具体涉及一种适用于动物源食品中盐酸克仑特罗的分析方法。

背景技术

盐酸克伦特罗(clenbuterol，CLB)俗称“瘦肉精”，是一种β-受体激动剂药物，常作为支气管扩张兴奋剂，治疗慢性阻塞性肺疾病。因其能促进肌肉组织的形成，提高瘦肉比例，被广泛用作饲料添加剂；但是，其长期或高剂量使用会产生严重的副作用和/或急性毒理反应，因此，作为饲料添加剂被我国和欧盟禁用。但是，在中国、西班牙、意大利等地滥用CLB的情况屡见不鲜，以致于大量滥用后造成人体中毒。

在食品安全检测分析中，动物源食品(如猪肉、牛肉等)因其基质复杂，干扰因素多，用于β-受体激动剂分析的样品前处理十分困难。在兽药残留分析领域中，常用的样品前处理技术除了传统的液相萃取(LPE)外，主要就是固相萃取技术(SPE)。而在目前固相萃取中，最常用的萃取材料就是十八烷基硅胶柱(C18或ODS)，C18萃取柱虽然用途广泛，成本较低，但在用于动物源食品样品的前处理时存在浸润性差易干涸，以及易对蛋白质类大分子和部分脂溶性杂质产生严重吸附等问题，不仅带来严重基体干扰，而且还会导致目标物质与固定相作用位点减少，从而降低萃取效率。在以CLB类β-受体激动剂为分析目标的样品前处理技术中，除了采用C18柱外，还有HLB、SCX、MCX、PCX等类型的SPE柱。这些类型的萃取柱虽然在浸润性上有所改善，但是一般只能萃取相同或相近类型的药物分子，而且也对动物源食品中大分子有严重吸附，此外，这些类型萃取柱的市场价格远远高于普通C18固相萃取柱。因此，在兽药残留分析中，开发一种能有效降低复杂生物基体干扰，且制作简单、成本低廉，具有良好生物相容性的样品前处理技术具有重要意义。

分子印迹技术是近年来的研究热点之一。分子印迹聚合物对模板分子及其类似物具有选择识别的特性，但是分子印迹聚合物有结合位点非均一性，低传质效率等缺点，并且反应的发生需要合适的模板分子、功能单体、交联剂，因而操作复杂，制作成本较高。亲和固相萃取技术亦是生物样品前处理的又一研究热点。亲和固相萃取的原理是利用偶联亲和配基为成相聚合物进行目标产物的双水相萃取，可在配基的亲和作用下促进目标产物在配基相的分配，提高目标产物的分配系数和选择性，是一种分离蛋白质极为有效的方法，但是存在载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难、重复利用差，配基本身要经过分离纯化，配基与载体偶联条件复杂等缺点，从而限制其发展。

发明内容

为了解决现有技术所存在的问题，本发明提供一种适用于盐酸克仑特罗的生物相容性固相萃取方法，该方法采用生物相容性固相萃取技术，能有效降低复杂生物基体干扰，且制作简单、成本低廉，具有良好生物相容性的样品前处理技术具有重要意义。

在动物源食品样品前处理技术中，为了既能有效分离萃取目标药物，又能去除复杂基体中各种大分子吸附带来的严重干扰，开发了一种生物相容性的萃取技术十分必要。在研究过程中，发明人发现，限进介质的开发是本课题的重要难题：需要同时兼具针对大分子杂质的体积排阻功能和针对小分子分析物的萃取功能物质；具体表现在，生物或环境样品溶液中的大分子不能进入吸附剂的内孔中去，生物大分子在吸附剂的外表面不会发生不可逆的变性和吸附，从而实现上样过柱时该类吸附剂不会对大分子产生保留，大分子物质在死体积或近于死体积的情况下被洗脱除去；且在生物大分子存在的情况下，实现对小分子分析物的萃取。即便通过现有材料以化学键方式实现上述这种目的，其制作工艺也十分复杂，制作成本非常高。鉴于以上种种技术问题，开发操作简便、低成本、高效分离和萃取的技术十分困难。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种适用于盐酸克仑特罗的生物相容性固相萃取方法，采用生物相容性固相萃取与液相色谱联用，其特征在于：这种生物相容性固相萃取采用经非离子型中性表面活性剂Tween-20动态改性的C18固相萃取柱；所述动态改性的C18固相萃取柱具有长碳链的疏水内层，醇羟基覆盖的亲水性外层表面结构。

上述生物相容性固相萃取材料由以下步骤制备：

依次用3mL甲醇、3mL10％甲醇水溶液活化C18固相萃取柱后，用5mL10％的Tween-20溶液过柱，对C18固相萃取柱进行动态改性。

本发明开发了一种生物相容性固相萃取材料-Tween-20动态改性的C18固相萃取柱，即在常规C18萃取柱的疏水表面上吸附非离子型中性表面活性剂后，形成有长碳链的疏水内层，而外层则是醇羟基覆盖的亲水性表面，这种特殊的双重结构，可对蛋白质等生物大分子起到“屏蔽作用”，而小分子药物可自由渗透而被萃取，是一种高效、经济、方便的“限进材料”，可有效除去猪肉等动物源食品中复杂基质的干扰，同时增加C18柱的浸润性，减少目标样品的流失，提高萃取效率。另外，可在分析样品时，降低色谱柱的压力，从而保护了液相色谱柱，大大降低了检测成本，实现对盐酸克伦特罗等β-受体激动剂简便、快速、经济、高效的选择性萃取净化处理。

上述液相色谱采用的分析条件为：以ODS硅胶柱为液相色谱固定相，以磷酸二氢铵与H₃PO₄水溶液与ACN组成的混合溶液为流动相，采用243nm波长等度检测。

上述磷酸二氢铵浓度、磷酸浓度、ACN比例以及洗脱时间，可由本领域技术人员依具体情况确定。

上述液相色谱法，适用于盐酸克伦特罗的分析。

具体的说，

一种适用于盐酸克仑特罗的生物相容性固相萃取方法，其特征在于，采用以下步骤：

a、生物相容性固相萃取柱的制备，

依次用3mL甲醇、3mL10％甲醇水活化C18固相萃取柱后，上样5mL10％的Tween-20，对C18固相萃取柱进行动态改性。

b、标准溶液的配置，

精密称取盐酸克伦特罗标准品2.0mg，用甲醇定容至10mL，配制成0.200mg/mL的盐酸克伦特罗储备液，置于-4℃冰箱中避光保存，备用。使用时用甲醇将其逐级稀释成0.100mg/mL，0.020mg/mL，0.010mg/mL，0.004mg/mL系列标准溶液。

c、样品的提取，

精密称取猪肉1.0g±0.010g于10mL的离心管中，加入2.5mL 5％HClO₄水溶液，匀浆5min，加入50μL0.200mg/mL的盐酸克伦特罗标准储备液于已匀浆好的肉浆中，涡旋3min，超声20min，12000r/min离心10min，取出上清液。沉淀再用2.5mL 5％HClO₄水溶液重复提取，涡旋3min，超声20min，12000r/min离心10min，取出上清液。合并两次上清液，加入1mL正己烷，涡旋3min，12000r/min离心2min，取出除油后的下清液，用浓氨水调至pH约11，备用。

d、样品的净化，

将得到的提取液上样于已制备好的生物相容性固相萃取柱，然后用1mLpH7～8左右的弱碱溶液淋洗小柱，最后用0.5mL含5％甲醇的1mol/L盐酸溶液洗脱。洗脱液经N₂吹干后，用1‰H₃PO₄复溶至0.2mL，经12000r/min离心1min后，备用。

e、液相色谱法分离检测，

LC-20A液相色谱仪检测，色谱柱：ODS C18，250×4.6mm×5μm；流动相：10mmol/L磷酸二氢铵和1‰H₃PO₄∶ACN＝80∶20(V∶V)；时间：15min；柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1mL/min；检测波长：243nm。

本发明的有益效果有：

1.本发明提供了非离子型中性表面活性剂Tween-20对C18固相萃取柱表面进行动态改性，形成了长碳链的疏水内层，而外层则是醇羟基覆盖的亲水性表面的双重结构。这种特殊的双重结构，兼有屏蔽蛋白质等生物大分子的作用和浸润作用，可用于动物源食品中复杂基质的样品分析。在用于对猪肉中盐酸克伦特罗萃取分析时，除杂效果好，适用于动物源食品中盐酸克仑特罗类β-受体激动剂提取的前处理监测分析。目前尚未见到采用这种基于Tween-20动态改性的固相萃取技术用于动物源食品中盐酸克仑特罗类β-受体激动剂提取与分析的报道。

2.本发明所开发的生物相容性固相萃取柱具有明显的成本优势，这种改性萃取柱的主要成本集中在C18萃取柱，在价格上比HLB、MCX、PCX等SPE柱便宜很多。

3.本发明的生物相容性固相萃取柱用于猪肉中盐酸克伦特罗的萃取后分析，除杂明显，进液相色谱仪分析时不伤色谱柱和分析仪器，半年内在无保护柱情况下，色谱柱的压力基本上没变(分析样品时，新柱压力最高为8.7Mpa，95％ACN冲洗柱子时压力为3.5Mpa；在使用6个月实验完毕后，经历超过900次猪肉样品分析后，分析样品时，压力最高为8.9Mpa，95％ACN冲洗柱子时压力为3.6Mpa)。由此可以看出，相比采用常规样品前处理技术的兽药残留分析中，因引入过多蛋白质等大分子在柱内沉积，带来柱压上升的问题，在本发明中，通过对常规萃取柱采用两性分子Tween-20改性后，能有效降低蛋白质等大分子吸附带来的干扰，减少引入色谱柱的蛋白质量，对色谱柱起到保护作用，降低了分析成本。

附图说明

图1为Tween-20浓度对CLB萃取率及除杂效果的综合比较

图2Tween-20浓度对CLB萃取率的影响

图3Tween-20浓度对CLB除杂效果的影响

图4为Tween-20体积对CLB萃取率及除杂效果的综合比较

图5Tween-20体积对CLB萃取率的影响

图6Tween-20体积对CLB除杂效果的影响

图7Tween-20动态改性固相萃取柱对空白猪肉样品，外加0.5mg/kg CLB的猪肉样品除杂效果的影响

图8不同酸提取对CLB萃取率的影响

图9提取不同时间、次数对CLB萃取率的影响

图10不同上样pH对CLB萃取率的比较图

图11不同酸化甲醇洗脱对CLB萃取率的比较图

图12盐酸克伦特罗标准曲线图

图13考察样品专属性的高效液相色谱图

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

主要仪器

LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；G20型高速医用离心机(北京白洋医疗器械有限公司)；和泰Edi-S系列实验室纯水系统(上海和泰仪器有限公司)；VM-02涡旋混合器(美国精骐有限公司)；奥豪斯先行者电子天平(奥豪斯(上海)有限公司)；MD200系列氮气吹扫仪(杭州奥盛仪器有限公司)；KQ2200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；雷磁pH-3C型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；美国塞分C18固相萃取小柱(100mg，1mL，苏州塞分科技有限公司)

主要试剂

盐酸克伦特罗(纯度≥99.5％，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH)；Tween-20(分析纯，纯度≥99％，上海泰坦科技股份有限公司)；甲醇(色谱纯，美国TEDIA天地试剂公司)；乙腈(色谱纯，美国TEDIA天地试剂公司)；高氯酸(分析纯，质量分数70.0％～72.0％，成都科龙化学试剂厂)；盐酸(分析纯，质量分数36％～38％，成都科龙化学试剂厂)；甲酸(分析纯，纯度≥88％，成都科龙化学试剂厂)；磷酸(分析纯，纯度≥85％，成都科龙化学试剂厂)；氨水(分析纯，质量分数25％～28％，成都科龙化学试剂厂)；正己烷(分析纯，纯度≥97.0％，成都科龙化学试剂厂)；磷酸二氢铵(分析纯，纯度≥99.0％，成都科龙化学试剂厂)；猪肉来自于渝中区袁家岗菜市场。

实施例1

1.生物相容性固相萃取柱的制备，

依次用3mL甲醇、3mL10％甲醇水活化C18固相萃取柱后，上样5mL10％的Tween-20，对C18固相萃取柱进行动态改性。

2.标准溶液的配置，

精密称取盐酸克伦特罗标准品2.0mg，用甲醇定容至10mL，配制成0.200mg/mL的盐酸克伦特罗贮备液，置于-4℃冰箱中避光保存，备用。使用时用甲醇将其逐级稀释成0.100mg/mL，0.020mg/mL，0.010mg/mL，0.0040mg/mL系列标准溶液。

3.样品的提取，

精密称取猪肉1.0g±0.010g于10mL的离心管中，加入2.5mL 5％HClO₄水溶液，匀浆5min，加入50μL0.200mg/mL的盐酸克伦特罗标准储备液于已匀浆好的肉浆中，涡旋3min，超声20min，12000r/min离心10min，取出上清液。沉淀再用2.5mL 5％HClO₄水溶液重复提取，涡旋3min，超声20min，12000r/min离心10min，取出上清液。合并两次上清液，加入1mL正己烷，涡旋3min，12000r/min离心2min，取出除油后的下清液，用浓氨水调至pH约11，备用。

4.样品的净化，

将得到的提取液上样于已制备好的生物相容性固相萃取柱，然后用1mLpH7～8左右的弱碱溶液淋洗小柱，最后用0.5mL含5％甲醇的1mol/L盐酸溶液洗脱。洗脱液经N₂吹干后，用1‰H₃PO₄复溶至0.2mL，经12000r/min离心1min后，备用。

5.液相色谱法分离检测，

LC-20A液相色谱检测仪，色谱柱：ODS C18，250×4.6mm×5μm；流动相：10mmol/L磷酸二氢铵和1‰H₃PO₄∶ACN＝80∶20(V∶V)；时间：15min；柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1mL/min；检测波长：243nm。

影响因素的考察

1.Tween-20上样条件的优化

1.1不同上样浓度的Tween-20对猪肉中CLB萃取率及除杂效果的影响。

Tween-20为黄色或琥珀色澄明的油状液体，其结构特点是醇羟基覆盖的亲水基团向外，碳链形成的疏水基团向内的非离子型中性表明活性剂，这种非离子型中性表明活性剂联合C18固相萃取在对蛋白质等生物大分子具有屏蔽作用，起到净化除杂作用的同时增加C18浸润性。Tween-20的上样浓度是影响CLB萃取率及除杂效果的重要因素。Tween-20上样浓度过低，除杂效果不明显，Tween-20上样浓度过高，在带走蛋白质等生物大分子杂质的同时，亦将CLB带走。因此，本发明考察了0％，2％，3.33％，5％，10％和20％不同上样浓度的Tween-20对猪肉中CLB萃取及除杂效果的综合影响。结果曲线如图1-3所示。可见，在没添加Tween-20的情况下，杂质明显比添加了Tween-20的样品多，10％Tween-20上样后，有80％以上的CLB萃取率，且杂质含量低。因此，发明人采用10％Tween-20上样。

1.2不同上样体积的Tween-20对猪肉中CLB萃取率及除杂效果的影响。

Tween-20的上样体积亦是影响CLB萃取率及除杂效果的又一重要因素。Tween-20的上样体积过少，除杂效果不理想，Tween-20的上样体积过多，则相当于增大了Tween-20的浓度，在杂质除去的同时，亦将CLB除去，反而使萃取率降低。综合考虑这些因素，本发明考察了0mL，1mL，3mL，5mL，8mL和10mL 10％Tween-20对猪肉中CLB萃取及除杂效果的综合影响。如图4-6所示，在无Tween-20存在的情况下，杂质高又多，这使得分析样品时损害液相色谱柱的同时检测限降低，而上样5mL 10％Tween-20萃取率与上样1mL，3mL10％Tween-20萃取相当，并且杂质明显比上样1mL，3mL减少。上样8mL的效果虽然与上样5mL相当，但所有试剂增多，操作时间延长。综合考虑萃取率、杂质高度与操作时间、试剂用量等因素，发明人采用5mL 10％Tween-20上样。

1.3 Tween-20作为生物相容性固相萃取材料对其除杂效果的评估。

生物样品基体复杂，蛋白质等大分子杂质易对生物样品产生干扰，给样品前处理带来了巨大的困难。Tween-20作为一种新型的生物相容性固相萃取材料，发明人利用Tween-20对C18固相萃取柱表面进行动态改性后，形成了长碳链的疏水内层，而外层则是醇羟基覆盖的亲水性表面的双重结构。这种特殊的双重结构，兼有屏蔽蛋白质等生物大分子的作用和浸润作用，可用于动物源食品中复杂基质的样品分析。本发明考察了Tween-20动态改性的生物相容性固相萃取柱对空白猪肉样品、低浓度(0.5μgCLB)猪肉样品萃取效率及除杂效果的影响。由图7所示，在色谱图上2～4min区间可知改性后的杂质明显比没改性的杂质少。在CLB出峰位置附近无干扰峰出现。由此表明Tween-20作为生物相容性固相萃取材料，对蛋白质等大分子有明显的屏蔽作用，且Tween-20可用于类似结构样品的前处理分析。

1.4 Tween-20作为生物相容性固相萃取材料对色谱柱耐用性的研究。

在分析猪肉样品中的CLB时，本发明采用了岛津ODS C18，250×4.6mm×5μm液相色谱柱。液相条件为10mmol/L磷酸二氢铵和1‰H₃PO₄∶ACN＝80∶20(V∶V)，在没接保护柱情况下，分析样品时，压力最高为8.7Mpa，95％ACN冲洗柱子时压力为3.5Mpa；在使用6个月后，实验完毕，经历超过900次猪肉样品分析后，压力最高时8.9Mpa，95％ACN冲洗柱子时压力为3.6Mpa。由此可以看出，相比采用常规样品前处理技术的兽药残留分析中，因引入过多蛋白质等大分子在柱内沉积，带来柱压上升的问题，在本发明中，通过对常规萃取柱采用两性分子Tween-20改性后，能有效降低蛋白质等大分子带来的干扰，对色谱柱起到了保护作用，降低了分析成本。

2.其他CLB萃取条件的优化

2.1萃取溶剂的选择

盐酸克伦特罗的提取溶剂直接关系到盐酸克伦特罗的提取效率。实际猪肉样品基质复杂，含有大量蛋白质等内源性干扰物质，需采用适当的溶剂对猪肉中的目标成分进行提取，最大限度地提取猪肉中的盐酸克伦特罗而不保留干扰物。参考文献以及考虑到CLB的化学性质，分别采用0.6mol/L(5％HClO₄)高氯酸、0.6mol/L三氯乙酸、0.6mol/L盐酸作为提取溶剂，由图8可知0.6mol/L高氯酸为提取溶剂时提取率最高(约83.8％)，且HClO₄是高效的蛋白质沉淀剂，有利于去除猪肉中蛋白质干扰，因此本发明选0.6mol/L高氯酸为提取溶剂。

2.2提取次数、提取时间对CLB回收率的影响

盐酸克伦特罗的提取次数、提取时间也是关系盐酸克伦特罗提取萃取率高低的重要因素。提取过程中，提取次数过少、时间太短，则提取不完全，造成目标物损失；提取次数过多、时间太长，则既浪费试剂又使操作变复杂，操作时间延长，工作效率较低。本发明考察了提取1次、提取2次、提取3次分别超声提取10min、20min、30min的提取回收率比较，提取曲线由图9所示，提取3次，每次提取30min回收率虽然要略高于提取2次，每次提取20min，但是因其耗时耗力，且随着提取时间增加，杂质亦增多等缺点的考虑，发明人最终选择提取2次，每次提取30min作为提取次数与提取时间。

2.3不同上样pH的比较

上样溶液的pH值是决定提取猪肉中CLB提取效率的最重要的因素。由于本发明采用非离子型中性表面活性剂Tween-20动态改性的C18固相萃取柱上样，是以非极性十八烷基键合硅胶为填料，根据相似相容的原理，其对以分子形式出现的CLB有较强的吸附，以离子形式出现的CLB吸附弱，甚至是无保留，因此高pH有利于CLB吸附在柱子上。本发明考察了pH2，pH4.6，pH6，pH7，pH9，pH10，pH11和pH12系列的上样pH。由图10所示，将提取液的pH调至11时，CLB回收率最高，足以有80％以上的CLB回收率，pH12时的回收率反而低很多，这是因为常规C18柱在极高pH条件下，硅胶发生溶解。因此，发明人选pH11为最佳上样pH。

2.4不同洗脱溶剂的比较

通过参考以往文献及本发明的特点，需采用酸化甲醇进行洗脱。本发明分别考察了0.1mo/L，1.0mol/L和2.0mol/L的5％盐酸化甲醇，5％甲酸化甲醇，5％高氯酸化甲醇洗脱，洗脱曲线如图11所示。可见，1.0mol/L(5％盐酸化甲醇)与2.0mol/L(5％甲酸化甲醇)洗脱后的萃取率相当。根据低耗有机溶剂与低成本的原则，发明人最终选1.0mol/L(5％盐酸化甲醇)为洗脱溶剂。

3.方法学验证

3.1标准曲线的绘制及检测限与定量限

准确量取适量的标准储备液，分别添加到1.0±0.010g的阴性猪肉样品中，制得含量为0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、5.0mg/kg、10.0mg/kg的系列样品溶液，按“2.3、2.4、2.5”项下条件提取、净化、分析。以CLB峰面积为纵坐标，以对应各点浓度为横坐标绘制标准曲线，如图12所示。回归方程：y＝1.5×10⁵X-11073；相关系数R²＝0.9986，按信噪比(S/N)＝3时的最低添加浓度检出限(LOD)为25.0μg/kg，S/N＝10时的定量限(LOQ)为83.0μg/kg。

3.2特异性考察

空白猪肉样品、CLB标准品、加标猪肉样品的色谱图见图13。CLB的保留时间为9.46±0.10min。结果表明：猪肉样品中的杂质对CLB出峰无干扰，本发明方法专属性好。

3.3加标回收率与精密度

在空白的阴性猪肉中分别添加0.5mg/kg、1.0mg/kg、5.0mg/kg 3个水平含量的盐酸克伦特罗标准溶液，每个含量水平平行处理5份，按“2.3、2.4、2.5”项下条件提取、净化、分析。根据测得峰面积，计算CLB的绝对回收率。

表1：猪肉中加标回收率与精密度

由表1可知，CLB的平均回收率在82.8％～83.6％之间；RSD在2.61～3.75之间，表明猪肉样品的精密度好，本发明符合方法学验证要求。

3.4稳定性试验考察

在空白的阴性猪肉中添加10.0mg/kg的盐酸克伦特罗标准溶液，按“2.3、2.4、2.5”项下条件提取、净化、分析。分别于0、1、3、6、12、24h进样测定，记录出峰时间与峰面积，由表2可知，出峰时间稳定性和样品稳定性的RSD％分别为0.754、1.580。表明样品在24h内变化小，本发明稳定性良好。

表2：稳定性试验

4.结论

本发明开发了一种生物相容性的固相萃取技术，经非离子型中性表面活性剂Tween-20动态改性后的C18固相萃取柱，具有良好的表面亲水性，对复杂基体中的大分子有屏蔽和排阻作用，能有效降低复杂样品中的基体干扰，具有良好的生物相容性，是一种经济、简便、高效、准确的前处理技术。该技术与高效液相色谱仪联用，不仅可以用于猪肉中盐酸克伦特罗的测定，在原理上也适用于其它动物源食品中的兽药残留分析工作。

Claims (4)

1.一种适用于盐酸克仑特罗的生物相容性固相萃取方法，采用生物相容性固相萃取与液相色谱联用，其特征在于：这种生物相容性固相萃取采用经非离子型中性表面活性剂Tween-20改性的C18固相萃取柱；所述的C18固相萃取柱具有长碳链的疏水内层，醇羟基覆盖的亲水性外层表面结构。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物相容性固相萃取采用的萃取柱由以下步骤制备：

依次用3mL甲醇、3mL10％甲醇水溶液活化C18固相萃取柱后，上样5mL10％的Tween-20溶液，对C18固相萃取柱进行动态改性。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述液相色谱采用的分析条件为：以ODS硅胶柱为液相色谱固定相，以磷酸二氢铵与H3PO4水溶液与ACN组成的混合溶液为流动相，采用243nm波长等度检测。

4.一种适用于盐酸克仑特罗的生物相容性固相萃取方法，其特征在于，采取如下操作步骤：

a、生物相容性固相萃取柱的制备，

依次用3mL甲醇、3mL10％甲醇水活化C18固相萃取柱后，上样5mL10％的Tween-20，对C18固相萃取柱进行动态改性；

b、标准溶液的配制，

精密称取盐酸克伦特罗标准品2.0mg，用甲醇定容至10mL，配制成0.200mg/mL的盐酸克伦特罗标准储备液，置于-4℃冰箱中避光保存，备用；使用时用甲醇将其逐级稀释成0.100mg/mL，0.020mg/mL，0.010mg/mL，0.004mg/mL的系列标准溶液；

c、样品的提取，

精密称取猪肉1.0g±0.010g于10mL的离心管中，加入2.5mL 5％HClO₄水溶液，匀浆5min，加入50μL0.200mg/mL的盐酸克伦特罗标准储备液于已匀浆好的肉浆中，涡旋3min，超声20min，12000r/min离心10min，取出上清液；沉淀再用2.5mL 5％HClO₄水溶液重复提取，涡旋3min，超声20min，12000r/min离心10min，取出上清液；合并两次上清液，加入1mL正己烷，涡旋3min，12000r/min离心2min，取出除油后的下清液，用浓氨水调至pH约11，备用；

d、样品的净化，

将得到的提取液上样于已制备好的生物相容性固相萃取柱中，然后用1mLpH7～8左右的弱碱溶液淋洗小柱，最后用0.5mL含5％甲醇的1mol/L盐酸溶液洗脱；洗脱液经N₂吹干后，用1‰H₃PO₄复溶至0.2mL，经12000r/min离心1min后，备用；

e、液相色谱法分离检测，

LC-20A液相色谱仪检测，色谱柱：ODS C18，250×4.6mm×5μm；流动相：10mmol/L磷酸二氢铵和1‰H₃PO₄∶ACN＝80∶20(V∶V)；时间：15min；柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1mL/min；检测波长：243nm。