CN117178892A - 一种白颖苔草组织培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于组织培养领域，具体提供了一种组织培养白颖苔草的方法，所述方法包括如下步骤：S1、以白颖苔草种子为外植体，消毒；S2、以诱导培养基进行诱导培养和增殖培养；S3、以分化培养基进行丛生芽诱导。本发明的白颖苔草组织培养的方法培养过程速度快，再生频率较高，变异率较低，周期相对较短，能较好地保持白颖苔草的遗传稳定性，为白颖苔草离体快繁提供思路，并为转基因工程奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于组织培养领域，具体涉及一种白颖苔草组织培养的方法。
背景技术
白颖苔草(Carexrigescens(Franch)V.Krecz)是莎草科苔草属的一种多年生植物，广泛分布于中国北部的辽宁、河北、河南、山东和内蒙古。白颖苔草对冷、荫、干旱和高温等非生物胁迫具有很强的耐受性。它可以适应各种土壤条件，常用作城市景观和体育场建设草坪草。
由于苔草长期适应了固有的生殖对策，其营养繁殖已占主导，用种子繁殖几乎退化。种子的深休眠、低萌发率较为普遍，这使得该属植物的开发利用和种子扩大繁殖受到严重制约。因此，本发明旨在建立高效的再生体系，为白颖苔草离体快繁提供思路，并为转基因工程奠定基础。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种组织培养白颖苔草的方法及其培养基配方，解决了当前对于白颖苔草的组织培养技术中，诱导率不高、生芽困难、资源消耗量大而且浪费严重的问题。
本发明首先提供一种组织培养白颖苔草的方法，所述方法包括如下步骤：
S1、以白颖苔草种子为外植体，消毒；
S2、以诱导培养基进行诱导培养和增殖培养；
所述诱导培养基为以MS固体培养基为基础培养基，添加2,4-D、6-BA、NAA和蔗糖，获得的固体培养基，所述诱导培养基中2,4-D浓度为2mg/L、6-BA浓度为1mg/L、NAA的浓度为1mg/L、蔗糖的浓度为30g/L；
S3、以分化培养基进行丛生芽诱导；
所述分化培养基为以MS固体培养基为基础培养基，添加6-BA、NAA和蔗糖，获得的固体培养基，所述分化培养基中6-BA浓度为1mg/L、NAA的浓度为1mg/L、蔗糖的浓度为30g/L。
上述方法中，所述诱导培养基和分化培养基的pH值可为5.9-6.0。
本发明的组织培养白颖苔草的方法还包括如下步骤：
S4、以生根培养基进行生根培养；
所述生根培养基为以1/2MS固体培养基为基础培养基，添加蔗糖，获得的固体培养基，所述生根培养基中蔗糖的浓度为30g/L。
上述方法中，所述生根培养基的pH值可为5.9-6.0。
本发明的组织培养白颖苔草的方法还包括炼苗移栽的步骤。
上述方法中，所述增殖培养为继代增殖两至三次，每代的培养时间为25天。
上述方法中，所述诱导培养和增殖培养在黑暗条件下进行。
上述方法中，所述丛生芽诱导的光照条件为每天24小时中16小时光照，其余时间黑暗，光照强度为600Lx。
上述方法中，所述生根培养的光照条件为每天24小时中16小时光照，其余时间黑暗，光照强度为600Lx。
上述方法中，所述培养在温度为25±1℃的环境中进行。
上述方法中，所述固体培养基含有凝固剂，所述丛生芽分化培养基用的凝固剂为凝胶，浓度为3g/L，所述诱导培养基、继代培养基、生根培养基用的凝固剂均为琼脂，浓度为6g/L。
本发明还提供上述方法在白颖苔草种植中的应用。
本发明还提供上述方法在白颖苔草育种中的应用。
本发明以成熟胚作为外植体，发明人经过大量长期实践操作，发现只有成熟胚作为外植体才能实现白颖苔草较高诱导率的保证由于白颖苔草种子有种皮包被且包于果囊，内生菌多，极易污染，如何防止外植体污染是以后繁殖的关键步骤，因此，发明人采用20％浓度NaClO溶液进行消毒处理40min，大大降低了外植体污染的概率。
白颖苔草再生体系的相关研究未见报道，发明人采用适时调整培养基中的激素浓度促进愈伤组织发育，并根据当前生长程度适当调整激素浓度或改用同效激素。
本发明培养过程速度快，再生频率较高，变异率较低，周期相对较短，能较好地保持白颖苔草的遗传稳定性。
附图说明
图1为本发明实施例1诱导产生的愈伤组织照片。
图2为本发明实施例1分化产生的芽的照片。
图3为本发明实施例1生根产生的根的照片。
图4为本发明实施例1产生的生根苗的照片。
图5为本发明实施例1移苗成活的组培苗。
图6为实施例1、实施例4、实施例5和实施例6的长菌率统计结果，其中，**代表显著性分析结果为P<0.01。
图7为实施例1、实施例7、实施例8的诱导率统计结果，其中，**代表显著性分析结果为P<0.01。
图8为实施例1、实施例9、实施例10的生芽率统计结果，其中，**代表显著性分析结果为P<0.01。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。
以下实施例中所涉的白颖苔草品种记载于非专利文献“白颖苔草热激转录因子基因的克隆及其序列分析，孙彦、党卫玲、杨春华、邸超、周禾.草地学报，2011年11月，第19卷第6期1030-1035”。
下述实施案例中，使用SPSS软件对数据进行统计分析，样本间两两比较使用独立样本t-检验(Student’st-test)；多重比较使用单因素方差分析的邓肯检验(Duncantest)对数据进行差异分析，结果以平均值±标准差的形式呈现。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
MS培养基和1/2MS培养基均以m519干粉(phyto Technology)为溶质进行配制。
实施例1：
本发明实施例提供一种组织培养白颖苔草的方法及其培养基配方，具体如下:
S1、以白颖苔草种子为外植体，消毒。
材料预备：选择饱满、大小一致的白颖苔草的种子，用质量分数20％的NaOH浸泡处理40min，用无菌水冲洗干净，用体积分数20％的NaClO浸泡处理40min，用无菌水冲洗干净，至清水浸泡不变色为止。
S2、诱导培养。
将S1处理好的白颖苔草种子接种到诱导培养基上，放置于黑暗条件下培养，7-8天种子开始发芽，40天开始长出愈伤组织，培养温度为25±1℃。
设置5个培养瓶作为重复，每个重复接种40种子。
所述诱导培养基为MS+2mg/L 2,4-D+1mg/L 6-BA+1mg/L NAA+30g/L蔗糖，pH5.9-6.0。即以MS固体培养基为基础培养基，添加2,4-D、6-BA、NAA和蔗糖，获得pH值为5.9-6.0的诱导培养基，所述诱导培养基中2,4-D浓度为2mg/L、6-BA浓度为1mg/L、NAA的浓度为1mg/L、蔗糖的浓度为30g/L。将愈伤组织切成小块进行增殖继代培养，继代两至三次，每代的培养时间为25天，之后将愈伤组织挪入分化培养基进行丛生芽的诱导。
实施例1诱导产生的愈伤组织照片见图1。
S3、丛生芽诱导和增殖培养。
将S2获得的愈伤组织切转入分化培养基，诱导丛生芽生长，培养条件为16h/d的光照时长，光照强600Lx左右，培养温度为25±1℃。
设置20个培养瓶作为重复，每个重复接种10块愈伤组织。
所述分化培养基为MS+6-BA 1mg/L+NAA 1mg/L+蔗糖30g/L，pH5.9-6.0。即以MS固体培养基为基础培养基，添加6-BA、NAA和蔗糖，获得的pH值为5.9-6.0的分化培养基，所述分化培养基中6-BA浓度为1mg/L、NAA的浓度为1mg/L、蔗糖的浓度为30g/L。
分化产生的芽的照片见图2。
S4、生根培养。
将S3继代增殖培养获得的丛生芽转入生根培养基中培养得到生根苗。培养条件为16h/d的光照时长，光照强600Lx左右，培养温度为25±1℃。
设置70个培养瓶作为重复，每个重复接种3株无根的组培苗。
所述生根培养基为1/2MS+蔗糖30g/L，pH5.95；即以1/2MS固体培养基为基础培养基，添加蔗糖，获得的pH值为5.9-6.0的生根培养基，所述生根培养基中蔗糖的浓度为30g/L。
本实施例生根培养产生根的照片见图3，产生的生根苗的照片见图4。
S5、炼苗移栽。
将生根培养得到的生根苗炼苗后移入移栽基质中培养。
所述的基质为蛭石与营养土(是肥沃的大田土与腐熟厩肥混合并且含有丰富的矿质元素)按体积比1:1混合得到，营养土混合前需要用高压灭菌锅100摄氏度60分钟高温灭菌。
移苗成活的组培苗照片见图5。
本实施例中所有固体培养基均含有凝固剂，其中丛生芽分化培养基用的凝固剂为凝胶，浓度为3g/L，诱导培养基、继代培养基、生根培养基用的凝固剂均为琼脂，浓度为6g/L。
实施例2：
本实施例培养方法与使用的配方原料均与实施例1相同，区别仅在于S1步骤中选取白颖苔草无菌苗的嫩叶片作为外植体进行愈伤组织诱导，其余均同于实施例1。
实施例3：
本实施例培养方法与使用的配方原料均与实施例1相同，区别仅在于S1步骤中选取白颖苔草无菌苗的嫩茎作为外植体进行愈伤组织诱导，其余均同于实施例1。
实施例4:
本实施例培养方法与使用的配方原料均与实施例1相同，区别仅在于S1步骤中NaClO浓度为10％，消毒时间为30min，其余均同于实施例1。
实施例5:
本实施例培养方法与使用的配方原料均与实施例1相同，区别仅在于S1步骤中NaClO浓度为10％，消毒时间为40min，其余均同于实施例1。
实施例6:
本实施例培养方法与使用的配方原料均与实施例1相同，区别仅在于S1步骤中NaClO浓度为20％，消毒时间为30min，其余均同于实施例1。
实施例7:
本实施例培养方法与使用的配方原料均与实施例1相同，区别仅在于S2步骤中，诱导培养基为MS+1mg/L2,4-D+1mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖，其余均同于实施例1。
实施例8:
本实施例培养方法与使用的配方原料均与实施例1相同，区别仅在于S2步骤中，诱导培养基为MS+1.5mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA+1mg/LNAA+30g/L蔗糖，其余均同于实施例1。
实施例9:
本实施例培养方法与使用的配方原料均与实施例1相同，区别仅在于S3步骤中，MS固体培养基+6-BA1.5mg/L+NAA1 mg/L+蔗糖30g/L，其余均同于实施例1。
实施例10:
本实施例培养方法与使用的配方原料均与实施例1相同，区别仅在于S3步骤中，MS固体培养基+6-BA1mg/L+NAA1.5mg/L+蔗糖30g/L，其余均同于实施例1。
对上述实施例1-10进行长菌率统计、诱导率、生芽率测试和统计，结果如表1-4所示:
表1不同外植体种类愈伤组织诱导率统计
| 实施例 | 诱导率(％) |
| 实施例1 | 87±0.02a |
| 实施例2 | 0±0b |
| 实施例3 | 0±0b |
注：表中不同的小写字母表示在0.05水平下差异显著。
诱导率的计算公式为：诱导率＝诱导出愈伤组织的外植体数/所有外植体数
其中，种子采用发芽种子数计算。
表1的结果表明实施例1-实施例3中外植体相比，实施例1中用种子作为外植体的效果最佳。
表2长菌率统计
| 实施例 | 长菌率(％) |
| 实施例1 | 0±0d |
| 实施例4 | 35±0.02a |
| 实施例5 | 17±0.04b |
| 实施例6 | 9±0.01c |
注：表中不同的小写字母表示在0.05水平下差异显著。
长菌率的计算公式为：长菌率＝长菌种子数/发芽种子数×100％
表2以及图6的结果表明实施例1、实施例4、实施例5和实施例6中步骤S1的消毒方法相比，实施例1中用体积分数20％的NaClO浸泡处理40min的方法取得的消毒效果最佳。
表3诱导率统计
| 实施例 | 诱导率(％) |
| 实施例1 | 87±0.02a |
| 实施例7 | 41±0.02c |
| 实施例8 | 62±0.01b |
注：表中不同的小写字母表示在0.05水平下差异显著。
诱导率的计算公式为：诱导率＝诱导出愈伤种子数/发芽种子数×100％
表3和图7的结果表明实施例1、实施例7、实施例8中步骤S2的诱导培养基相比，实施例1中MS+2mg/L 2,4-D+1mg/L 6-BA+1mg/L NAA+30g/L蔗糖的培养基取得的诱导率最高。
表4生芽率统计
| 实施例 | 生芽率(％) |
| 实施例1 | 70±0.03a |
| 实施例9 | 56±0.03b |
| 实施例10 | 48±0.01c |
注：图中不同的小写字母表示在0.05水平下差异显著。
生芽率的计算公式为：生芽率＝生芽愈伤数/总愈伤数×100％
表4的结果表明实施例1、实施例9、实施例10中步骤S3的分化培养基相比，实施例1中MS+6-BA 1mg/L+NAA 1mg/L+蔗糖30g/L的培养基取得的生芽率最高。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本发明欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本发明中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种组织培养白颖苔草的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、以白颖苔草种子为外植体，消毒；
S2、以诱导培养基进行诱导培养和增殖培养；
所述诱导培养基为以MS固体培养基为基础培养基，添加2,4-D、6-BA、NAA和蔗糖，获得的固体培养基，所述诱导培养基中2,4-D浓度为2mg/L、6-BA浓度为1mg/L、NAA的浓度为1mg/L、蔗糖的浓度为30g/L；
S3、以分化培养基进行丛生芽诱导；
所述分化培养基为以MS固体培养基为基础培养基，添加6-BA、NAA和蔗糖，获得的固体培养基，所述分化培养基中6-BA浓度为1mg/L、NAA的浓度为1mg/L、蔗糖的浓度为30g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：
S4、以生根培养基进行生根培养；
所述生根培养基为向1/2MS固体培养基添加蔗糖和凝固剂获得的固体培养基，所述生根培养基中蔗糖的浓度为30g/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法还包括炼苗移栽的步骤。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述增殖培养为继代增殖两至三次，每代的培养时间为25天。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述诱导培养和增殖培养在黑暗条件下进行。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述丛生芽诱导的光照条件为每天24小时中16小时光照，其余时间黑暗，光照强度为600Lx。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述生根培养的光照条件为每天24小时中16小时光照，其余时间黑暗，光照强度为600Lx。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述培养在温度为25±1℃的环境中进行。
9.权利要求1-8任一所述的方法在白颖苔草种植中的应用。
10.权利要求1-8任一所述的方法在白颖苔草育种中的应用。
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