CN104719160A - 用苔草幼苗叶片为外植体的组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用苔草幼苗叶片为外植体的组培快繁方法，其步骤包括：外植体制备、初代培养、继代培养、分化培养、生根培养、炼苗和试管苗移栽。本发明以无菌苔草幼苗的叶片作为外植体，经过初代培养和继代培养生成大量的苔草原球茎，再经过分化培养和生根培养诱导生成芽苗且生根，然后经常规的炼苗和移栽培养实现了苔草的快速繁殖。采用本发明方法比现有技术方法的繁殖速率提高40%，成活率提高60%，为优质苔草品种资源的保护及快速繁殖育苗提供一条有效解决途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种苔草的组织培养快速繁殖方法，特别涉及一种通过苔草幼苗叶片诱导培养快速繁殖苔草的方法。
背景技术
苔草为莎草科多年生草本植物，在我国各地均有分布，品种资源非常丰富,苔草属植物覆盖度好，根系发达，萌生力强，生长快，生长密，适应性强，具有较强的竟争能力和蔓延能力，尤其在北方具有春季返青早、生长季长、耐干旱及低矮、形态优美等特点，是理想的草坪草种和环境保护植物，对恢复与改善生态环境有重要作用，同时在水土保持、公路绿化、城市园林绿化和运动场草坪建设中具有较高的应用价值。
为了丰富我国草坪草的品种，寻找耐旱、适应性强的、美观的草坪资源，不少研究者己进行了苔草种植资源的搜集引种，建立了苔草资源圃，并对其中一些较好的品种如白颖苔草、尖嘴苔草、早春苔草、异穗苔草等进行驯化引种，应用于园林绿化中取得了较好的效果。但由于苔草种子具有强休眠、低萌发率等特性，使其开发利用受到严重制约。中国专利2008100605441公开了“一种金叶苔草茎尖培养快速繁殖方法”，2010102094791公开了“一种金叶苔草的培育方法”，吕秀立等公开了金叶苔草离体培养和快速繁殖技术(杂草科学，2005(3)，30-31页)，以上三种组培方法大同小异，均是先将茎尖组织诱导形成幼芽或分生组织，然后掰成单芽进行增殖培养，再进行壮苗、生根培养及移栽等步骤完成快速繁殖过程。该方法基本属于经典的组培方法，对于苔草种子具有强休眠、低萌发率等特性而言，获取茎尖组织的材料比较紧张，因原始材料少导致其组织效率不高。元杰等公开了异鳞苔草快速繁殖研究(山西农业科学，2012，40(9)：933-935页)，该文考虑到苔草种子强体眠、低萌发率的问题，对苔草的种子先进行了萌发诱导生成小苗后再取茎尖组织同上述方法一样进行快速繁殖。该方法比前三篇文献的方法有所改进，但是苔草快繁的效率还是有限，难以满足市场需求。因此，苔草的快速繁殖研究仍然是亟待解决的问题，其对保护苔草属植物野生资源和促进在园林中应用均具有现实意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种用苔草幼苗叶片为外植体的组培快繁方法，采用本发明的方法能够在短期内获得大量优质的试管苗，解决优质苔草品种规模化生产和大面积应用问题。
本发明的用苔草幼苗叶片为外植体的组培快繁方法，包括如下步骤：
（1）外植体制备 取苔草的种子置于无菌工作台内，用酒精浸泡10-40s，无菌水冲洗3次，0.1%HgCl2浸泡2-5min，无菌水冲洗5次，接种于加有浓度为30g/L的蔗糖的MS培养基,诱导其发芽成苗，培养条件为：17-23℃、光照强度1000—1500Lux、光周期为15h/d，小苗长到2-3片叶、叶长3-5cm时，将叶片剪为0.8-1.2cm长的叶片，备用；
（2）初代培养 以MS培养基为基本培养基，添加1.2-1.8mg/L的6-BA、0.04-0.06mg/L的NAA、0.3-0.5mg/L的2,4-D、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，制成PH为5.8的初代培养基，将（1）准备的叶片消毒后平铺接种于初代培养基中进行培养，培养条件为:17-23℃，暗光培养40-50天，诱导生成原球茎；
（3）继代培养 以1/2MS培养基为基本培养基，添加1.2-1.8mg/L的6-BA、0.02-0.04mg/L的NAA、0.2-0.4mg/L的2,4-D、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，制成PH为5.8的继代培养基，将（2）生成的原球茎置于继代培养基中进行增殖培养，培养条件为:17-23℃，暗光培养20-25天，生成大量原球茎；
（4）分化培养 以1/2MS培养基为基本培养基，添加0.1-0.4mg/L的2,4-D、10-30g/L蔗糖、7g/L琼脂，制成PH为5.8的分化培养基，将（3）生成的增殖原球茎自然掰开后置于分化培养基中进行培养，培养条件是：17-23℃、光照强度为1000—1500Lux、光周期为15h/d，经30-40天培养原球茎分化成叶长为2-3cm的芽苗；
（5）生根培养 以1/2MS培养基为基本培养基，添加0.04-0.08mg/L的NAA、10-30g/L蔗糖、7g/L琼脂，制成PH为5.8的生根培养基，将（4）中芽苗置于生根培养基中进行培养，培养条件是：17-23℃、光照强度为1000—1500Lux、光周期为15h/d，培养10-15天后生根；
（6）炼苗 待（5）培养的幼苗根长到1-3cm时，将培养瓶的封口膜打开，炼苗6-8天；
（7）移栽 试管苗移栽基质为泥炭或/和蛭石，基质移栽前用50%多菌灵可湿性粉剂的700-900倍液进行消毒，取出（6）培养的幼苗用自来水洗净根部的培养基，稍晾干表面的水分即可移栽入消毒后的基质中，然后搭建拱棚，将拱棚湿度保持在75%-80%、温度20-25℃，移栽10天后逐渐降低温度至17-20℃，30天后进入常规管理。
与现有技术相比，本发明通过将苔草种子在培养基上培养，为苔草的快速繁殖提供了大量的外植体来源。本发明尤为突出的是以无菌苔草幼苗的叶片作为外植体，经过初代培养和继代培养生成大量的苔草原球茎，再经过分化培养和生根培养诱导生成芽苗且生根，然后经常规的炼苗和移栽培养实现了苔草的快速繁殖。采用本发明方法比现有技术方法的繁殖速率提高40%，成活率提高60%，为优质苔草品种资源的保护及快速繁殖育苗提供一条有效解决途径。
附图说明
图1为本发明用苔草幼苗叶片为外植体继代培养生成的大量原球茎。
图2为原球茎分化生成的芽苗。
实施例1
野外收集白颖苔草种质资源经过筛选后，将表现优良的白颖苔草种子进行如下处理：(1) 外植体制备 将种子置于无菌工作台内，先用酒精浸泡10s，无菌水冲洗3次，再用0.1%HgCl2浸泡2min，无菌水冲洗5次。接种于加有浓度为30g/L的蔗糖的固体MS培养基内诱导其发芽成苗，培养条件为：17-20℃、光照强度1000—1200Lux、光周期为15h/d，待小苗长到2片叶、叶长3cm时，用剪刀将叶片剪为0.8cm长的叶片；(2)初代培养 以MS培养基为基本培养基，添加1.2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、0.04mg/L的a-萘乙酸（NAA）、0.3mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，制成PH为5.8的培养基，将(1)准备的0.8cm长的叶片消毒后平铺接种于初代培养基中进行培养，培养条件为17-20℃，暗光培养40天后可诱导产生原球茎；(3)继代培养 以1/2MS培养基为基本培养基，添加1.2mg/L的6-BA、0.02mg/L的NAA、0.2mg/L的2,4-D、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，制成PH为5.8的继代培养基，将叶片诱导原球茎置于继代培养基中进行增殖培养，培养条件同初代培养，培养20天后可生成大量原球茎；(4)分化培养 以1/2MS培养基为基本培养基，添加0.1mg/L的2,4-D、10g/L蔗糖、7g/L琼脂，制成PH为5.8的分化培养基，将(3)增殖原球茎自然掰开置于分化培养基中进行培养，培养条件是：17-20℃、光照强度为1000—1200Lux、光周期为15h/d，直至原球茎分化成叶长为2cm的芽苗；(5)生根培养 以1/2MS培养基为基本培养基，添加0.04mg/L的NAA、10g/L蔗糖、7g/L琼脂，制成PH为5.8的生根培养基，将分化芽苗置于生根培养基中进行培养，培养条件是：17-20℃、光照强度为1000—1200Lux、光周期为15h/d，培养10天后即可生根；(6)炼苗 待（5）培养的幼苗根长到1cm时，将培养瓶的封口膜打开，炼苗6天；（7）移栽 试管苗移栽基质为泥炭或蛭石，基质移栽前用50%多菌灵可湿性粉剂的700液进行消毒，取出培养的幼苗用自来水洗净根部的培养基，稍晾干表面的水分即可移栽入消毒后的基质中，然后搭建拱棚，将拱棚湿度保持在75%-80%、温度20-25℃，移栽10天后逐渐降低温度至17-20℃，30天后进入常规管理。
实施例2
野外收集尖嘴苔草种质资源经过筛选后，将表现优良的尖嘴苔草种子进行如下处理：(1) 外植体制备 将种子置于无菌工作台内，先用酒精浸泡40s，无菌水冲洗3次，再用0.1%HgCl2浸泡5min，无菌水冲洗5次，接种于加有浓度为30g/L的蔗糖的固体MS培养基内诱导其发芽成苗，培养条件为：20-23℃、光照强度1200—1500Lux、光周期为15h/d，待小苗长到3片叶、叶长5cm时，用剪刀将叶片剪为1.2cm长的叶片；(2)初代培养 以MS培养基为基本培养基，添加1.8mg/L的6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、0.06mg/L的a-萘乙酸（NAA）、0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，制成PH为5.8的培养基，将(1)准备的1.2cm长的叶片消毒后平铺接种于初代培养基中进行培养，培养条件为20-23℃，暗光培养50天后可诱导产生原球茎；(3)继代培养 以1/2MS培养基为基本培养基，添加1.8mg/L的6-BA、0.04mg/L的NAA、0.4mg/L的2,4-D、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，制成PH为5.8的继代培养基，将叶片诱导原球茎置于继代培养基中进行增殖培养，培养条件同初代培养，培养25天后可生成大量原球茎；(4)分化培养 以1/2MS培养基为基本培养基，添加0.4mg/L的2,4-D、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，制成PH为5.8的分化培养基，将(3)增殖原球茎自然掰开置于分化培养基中进行培养，培养条件是：20-23℃、光照强度为1200—1500Lux、光周期为15h/d，直至原球茎分化成叶长为3cm的芽苗；(5)生根培养 以1/2MS培养基为基本培养基，添加0.08mg/L的NAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，制成PH为5.8的生根培养基，将分化芽苗置于生根培养基中进行培养，培养条件是：20-23℃、光照强度为1200—1500Lux、光周期为15h/d，培养15天后即可生根；(6)炼苗 待（5）培养的幼苗根长到3cm时，将培养瓶的封口膜打开，炼苗8天；（7）移栽 试管苗移栽基质为泥炭或蛭石，基质移栽前用50%多菌灵可湿性粉剂的900液进行消毒，取出培养的幼苗用自来水洗净根部的培养基，稍晾干表面的水分即可移栽入消毒后的基质中，然后搭建拱棚，将拱棚湿度保持在75%-80%、温度20-25℃，移栽10天后逐渐降低温度至17-20℃，30天后进入常规管理。
实施例3
野外收集早春苔草种质资源经过筛选后，将表现优良的早春苔草种子进行如下处理：（1）外植体制备 将种子置于无菌工作台内，用酒精浸泡10-40s，无菌水冲洗3次，0.1%HgCl2浸泡2-5min，无菌水冲洗5次，接种于加有浓度为30g/L的蔗糖的MS培养基,诱导其发芽成苗，培养条件为：17-23℃、光照强度1000—1500Lux、光周期为15h/d，小苗长到2-3片叶、叶长3-5cm时，将叶片剪为0.8-1.2cm长的叶片；（2）初代培养 以MS培养基为基本培养基，添加1.2-1.8mg/L的6-BA、0.04-0.06mg/L的NAA、0.3-0.5mg/L的2,4-D、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，制成PH为5.8的初代培养基，将（1）准备的叶片消毒后平铺接种于初代培养基中进行培养，培养条件为:17-23℃，暗光培养40-50天，诱导生成原球茎；（3）继代培养 以1/2MS培养基为基本培养基，添加1.2-1.8mg/L的6-BA、0.02-0.04mg/L的NAA、0.2-0.4mg/L的2,4-D、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，制成PH为5.8的继代培养基，将（2）生成的原球茎置于继代培养基中进行增殖培养，培养条件为:17-23℃，暗光培养20-25天，生成大量原球茎；（4）分化培养 以1/2MS培养基为基本培养基，添加0.1-0.4mg/L的2,4-D、10-30g/L蔗糖、7g/L琼脂，制成PH为5.8的分化培养基，将（3）生成的增殖原球茎自然掰开后置于分化培养基中进行培养，培养条件是：17-23℃、光照强度为1000—1500Lux、光周期为15h/d，经30-40天培养原球茎分化成叶长为2-3cm的芽苗；（5）生根培养 以1/2MS培养基为基本培养基，添加0.04-0.08mg/L的NAA、10-30g/L蔗糖、7g/L琼脂，制成PH为5.8的生根培养基，将（4）中芽苗置于生根培养基中进行培养，培养条件是：17-23℃、光照强度为1000—1500Lux、光周期为15h/d，培养10-15天后生根；（6）炼苗 待（5）培养的幼苗根长到1-3cm时，将培养瓶的封口膜打开，炼苗6-8天；（7）移栽 试管苗移栽基质为泥炭或/和蛭石，基质移栽前用50%多菌灵可湿性粉剂的700-900倍液进行消毒，取出（6）培养的幼苗用自来水洗净根部的培养基，稍晾干表面的水分即可移栽入消毒后的基质中，然后搭建拱棚，将拱棚湿度保持在75%-80%、温度20-25℃，移栽10天后逐渐降低温度至17-20℃，30天后进入常规管理。
Claims (1)
1. 用苔草幼苗叶片为外植体的组培快繁方法，包括如下步骤：
（1）外植体制备 取苔草的种子置于无菌工作台内，用酒精浸泡10-40s，无菌水冲洗3次，0.1%HgCl2浸泡2-5min，无菌水冲洗5次，接种于加有浓度为30g/L的蔗糖的MS培养基,诱导其发芽成苗，培养条件为：17-23℃、光照强度1000—1500Lux、光周期为15h/d，小苗长到2-3片叶、叶长3-5cm时，将叶片剪为0.8-1.2cm长的叶片，备用；
（2）初代培养 以MS培养基为基本培养基，添加1.2-1.8mg/L的6-BA、0.04-0.06mg/L的NAA、0.3-0.5mg/L的2,4-D、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，制成PH为5.8的初代培养基，将（1）准备的叶片消毒后平铺接种于初代培养基中进行培养，培养条件为:17-23℃，暗光培养40-50天，诱导生成原球茎；
（3）继代培养 以1/2MS培养基为基本培养基，添加1.2-1.8mg/L的6-BA、0.02-0.04mg/L的NAA、0.2-0.4mg/L的2,4-D、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，制成PH为5.8的继代培养基，将（2）生成的原球茎置于继代培养基中进行增殖培养，培养条件为:17-23℃，暗光培养20-25天，生成大量原球茎；
（4）分化培养 以1/2MS培养基为基本培养基，添加0.1-0.4mg/L的2,4-D、10-30g/L蔗糖、7g/L琼脂，制成PH为5.8的分化培养基，将（3）生成的增殖原球茎自然掰开后置于分化培养基中进行培养，培养条件是：17-23℃、光照强度为1000—1500Lux、光周期为15h/d，经30-40天培养原球茎分化成叶长为2-3cm的芽苗；
（5）生根培养 以1/2MS培养基为基本培养基，添加0.04-0.08mg/L的NAA、10-30g/L蔗糖、7g/L琼脂，制成PH为5.8的生根培养基，将（4）中芽苗置于生根培养基中进行培养，培养条件是：17-23℃、光照强度为1000—1500Lux、光周期为15h/d，培养10-15天后生根；
（6）炼苗 待（5）培养的幼苗根长到1-3cm时，将培养瓶的封口膜打开，炼苗6-8天；
（7）移栽 试管苗移栽基质为泥炭或/和蛭石，基质移栽前用50%多菌灵可湿性粉剂的700-900倍液进行消毒，取出（6）培养的幼苗用自来水洗净根部的培养基，稍晾干表面的水分即可移栽入消毒后的基质中，然后搭建拱棚，将拱棚湿度保持在75%-80%、温度20-25℃，移栽10天后逐渐降低温度至17-20℃，30天后进入常规管理。
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