CN1170529C

CN1170529C - 15-去氧精胍菌素的应用

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Publication number: CN1170529C
Application number: CNB998062030A
Authority: CN
Inventors: ��һ; 竹迫一任; 齐藤英晴; ֮; 加藤郁之进
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1998-05-15
Filing date: 1999-05-11
Publication date: 2004-10-13
Anticipated expiration: 2019-05-11
Also published as: AU3728699A; EP1080723A4; CN1301153A; EP1080723A1; US6294581B1; US20010049392A1; DE69924105T2; EP1080723B1; WO1999059567A1; KR100569082B1; DE69924105D1; KR20010041348A; ATE290374T1

Abstract

通过口服15-去氧精胍菌素或其药理学上可接受的盐来选择性抑制IgA的产生，从而预防和治疗与IgA相关的免疫疾病，如IgA肾病。

Description

15-去氧精胍菌素的应用

技术领域

本发明涉及IgA产生的抑制，更为具体地说，涉及选择性地抑制IgA的产生以防止和治疗由人和动物IgA抗体产生过量所造成的免疫失调。

背景技术

免疫球蛋白包括一个抗体和一个在结构上和功能上与其相关联的蛋白，它们根据功能特性被分为五类：IgA、IgD、IgE、IgM以及IgG。其中IgA被分为两个亚类，即血清型IgA和分泌型IgA(IgA1和IgA2)。IgA1的轻链与重链共价结合。另一方面，IgA2的轻链之间通过二硫键相互结合，它们并不与重链相结合。90％的血清型IgA是IgA1，而60％的分泌型IgA则是IgA2。

IgA产生的位点存在于粘膜下浆细胞(这些细胞存在于例如，消化道粘膜的固有层中)、唾液腺、乳腺等等中。在人消化道粘膜的固有层中，IgA生成细胞(IgA-producing cells)的数目比IgG生成细胞的数目大很多，其比率大约为20∶1，这不同于在淋巴结或者脾脏中IgA∶IgG的比率(1∶3)。在粘膜分泌中IgA以二聚体的形式被产生出来，它具有一条J-链成分并伴随着一个分泌片段(secretary piece，SC)，后者在血清型IgA中仅是一小部分。当分泌片段从肠道或者呼吸道中的粘膜下浆细胞出来进入粘膜分泌时，它就加入到IgA分子的二聚体中。

生物体中抗体的产生是由特定抗原的刺激所诱导的。例如，已有报道指出口服肠细菌、双歧杆菌可以增加粪便中IgA的总量。

一种能够非特异性地刺激抗体生成细胞(antibody producingcell)更有效地对付抗原的物质通常被称为佐剂。例如已知霍乱毒素(一种由霍乱弧菌产生的致腹泻毒素)可以作用于小肠粘膜上并改变粘膜的离子通透性。这一改变导致大量电解质和水从小肠排泄出来从而导致腹泻症状。霍乱毒素B亚基是一种通过除去毒素的大部分而制得的去毒成分，已知它可以在穿透进入小肠粘膜之后引起一个能够促进IgA抗体生产的免疫反应(即能够诱导IgA)，从而充当一种佐剂。

IgG在人的血清免疫球蛋白(Ig)中占65％，它含有抗几乎所有抗原的多种抗体，在全身性保护性免疫中发挥着重要的作用，另一方面，IgA在局部免疫反应中发挥着重要的作用。粘膜分泌中的分泌型IgA抑制了对具高度病原性的微生物或者对粘膜过敏原的结合。因此，IgA不仅防止了感染，而且也可以通过与食物中可能充当过敏原的成分相结合来防止其通过消化道壁。

例如，当微生物细胞分泌细胞外毒素时，抗体的生物防卫依赖于结合于微生物表面上的抗体的直接作用。因此，抗体可以通过直接结合到微生物上来发挥各种不同的作用。

然而，IgA也已被知道在生物体中发挥病理学作用。例如，IgA肾病就是一种免疫紊乱，它是由对抗原产生的过度IgA免疫发应以及由主要含有IgA的免疫复合物在肾脏的肾小球上沉积所造成的。肾病的发作被认为是由长期的高IgA抗体滴度所造成的。IgA肾病患者血液中IgA抗体的滴度比起健康正常个体的要高出许多。然而，还没有证明参与免疫复合物形成的IgA是属于来源于粘膜以外位置(脾脏、骨髓、外周血液，等)的血清型还是来源于粘膜(消化道、呼吸器官，等)的分泌型。

有人猜测免疫反应的起因是主要存在于上呼吸道和消化道中的抗原刺激。候选的抗原包括食物(如：谷蛋白、牛奶、大豆)、细菌(如：副流感嗜血菌)、病毒(如：巨细胞病毒、腺病毒、Epstein-Barr(EB)病毒)[Tomino，Y.，Bio.Clinica，12(6)：375-379(1997)]。例如，已经证明副流感嗜血菌(HP)的一种成分和一种IgA类型的抗-HP抗体存在于IgA肾病患者的肾小球和血清中[Suzuki，S.，Nakatomi，Y.，Sato，H.等，过敏性临床免疫学杂志，96：1152-1160(1995)]。

虽然已经有人提出了如上所述的IgA肾病的起因及其发展机制的假说，其中仍然有许多是不清楚的。目前没有治疗IgA肾病的特异性疗法。因此，使用的是食物疗法或药物疗法。食物疗法使用低盐饮食或低蛋白饮食。药物疗法使用阻止肾小球中的血凝固的抗血小板、血管紧张素转化酶抑制剂或阻止血压升高的钙拮抗剂、或肾上腺皮质类固醇[Sakai，H.，Bio.Clinica，16：372-374(1997)]。

目前通过胃肠外用药来检测几种免疫抑制剂的效果。然而，由于它们中许多除了对IgA过量产生进行抑制之外，还全身性地抑制诸如IgG的产生和细胞免疫等免疫机制，所以存在引起严重副作用的高度风险。所以这类免疫抑制剂仍没有被广泛地用于临床。

免疫抑制剂的例子包括式1的15-去氧精胍菌素(以下将其称为DSG)：

Gu-(CH₂)₆-CONHCH(OH)CONH(CH₂)₄NH(CH₂)₃-NH₂

其中Gu代表一个胍类基团。在临床上，DSG以可注射的形式在肾脏移植中充当免疫抑制剂。

可选地，通过胃肠外施用DSG来抑制抗体的产生在日本专利8-40887、日本专利5-238932，Okubo，M.等，Nephron，60：336-341(1992)，Makino，M.等，免疫药理学，14：107-114(1987)，Inoue，K.等，日本肾脏科学第30届年会会议录，191页(1987)中已有报道。这些报道已经证实了DSG对抗体IgE、IgG、IgM及其类似物的产生的抑制。然而，DSG没有被报道可以对IgA进行选择性抑制。

另一方面，在日本专利2610621和JP-A8-40887中已经描述了在一种口服组合物中使用DSG。然而，对特定类型的抗体的选择性抑制并没有见公开。

发明目的

本发明的一个目的是提供一种阻止和治疗人和动物体内由IgA抗体的过量产生而引起的免疫疾病的有用的、新颖的方法。

本发明的其它目的和优点在以下的描述中将是显而易见的。

发明概要

本发明者们已经通过使用一种动物实验模型(用一种抗原对该模型进行刺激以使其在粘膜组织产生IgA)证实了口服的DSG可以有效地抑制分泌型IgA和血清型IgA的产生。令人惊讶的是，又进一步证明了并没有观察到DSG产生强的全身性免疫抑制作用(这在胃肠外施用(如：静脉内施用)中可以观察到)，如同等程度地显著地抑制IgG和IgA的产生。另外，本发明者们已经证明对IgA产生增加的动物口服施用DSG，在要被DSG抑制的抗体中主要抑制IgA。

因此，在本发明中，向需要选择性抑制IgA抗体产生的病人口服施用DSG或其药理学上可接受的盐，这对于生物体来说比常规的方法更安全。

本发明的一个实施方案是一种用于口服施用到人或动物中以选择性抑制IgA产生的组合物，它含有作为活性成分的DSG或其药理学上可接受的盐。

本发明的另一个实施方案是使用DSG或其药理学上可接受的盐来制造一种用于口服施用到人或动物中以选择性抑制IgA产生的组合物。

本发明的又一个实施方案是在人或动物中对IgA的产生进行选择性抑制的方法，其特征在于该方法包括对需要选择性抑制IgA产生的人或动物口服施用DSG或其药理学上可接受的盐。

根据本发明，抑制了对口服摄入的抗原的免疫应答，特别是IgA抗体的产生，导致了很少或微弱的全身性免疫抑制以及对IgA产生的选择性抑制。因此，本发明对于阻止和治疗IgA相关的免疫学疾病(如IgA肾病)是有用的。

如此处所用的，IgA产生的“选择性抑制”指的是IgA抗体的产生被显著地抑制，而IgG抗体的产生以及/或者迟发型超敏反应并没有被明显抑制。

本发明的详细描述

根据本发明，在用于口服施用以选择性抑制IgA产生的组合物中的活性成分可以是DSG或DSG的一种药理学上可接受的盐。DSG与酸形成盐。用于形成盐的酸可能是一种无机酸或一种有机酸，只要它是药理学上可接受的。优选的无机酸包括，例如，盐酸、硫酸、硝酸和磷酸。优选的有机酸包括，例如，乙酸、丙酸、丁二酸、延胡索酸、顺丁烯二酸、苹果酸、酒石酸、戊二酸、柠檬酸、苯磺酸、甲苯亚磺酸、甲磺酸、乙磺酸、丙磺酸、天冬氨酸及谷氨酸。

此外，在本发明中，可以使用式2的与精胍菌素相关的一种化合物：

Gu-X₀-X₁-A-X₂-CO-X₃

其中Gu代表一种胍基，X₀代表(CH₂)_1-6、或亚苯基或CH₂C₆H₄(可能带有取代基团)，X₁代表(CH₂)_2-7或CH＝CH，A代表CONH或NHCO，X₂代表一种残基，其中一个α-氨基和一个α-羧基被从一个α-氨基酸或一个残基上除去，在上述的残基中，一个ω-氨基和一个α-羧基被从一种ω-氨基酸上除去，而且在该残基上可能存在一个功能基团；一个来自具有一个光学活性碳的α-或ω-氨基酸的残基的立体化学并不特定地局限于L-、D-或DL-型；典型的、具体的例子包括：一种残基，其中一个α-氨基和一个α-羧基被从一种α-氨基酸(如甘氨酸、α-羟基甘氨酸、α-甲氧甘氨酸和丝氨酸)中除去，以及一种残基，其中的ω-氨基和α-羧基被从一种氨基酸(如β-丙氨酸、γ-氨酪酸、δ-氨基戊酸和ε-氨基己酸)中除去；当A是NHCO时，X₂代表一个单键、CH₂NH、CH₂O、或一个被取代或未被取代的低级烯基；低级烯基包括，例如，亚甲基、乙烯基和丙烯基，以及它们的取代物，包括卤素(如氟、氯和溴)、低级羟氧基(如甲氧基和乙氧基)、和羟基；如此处所用的，用于描述取代物的术语“低级”指的是具有1-6、优选的是1-3个碳的取代物；X₃代表NH-(CH₂)₄-N(R₀₁)(CH₂)₃-NH-R₀₂，其中R₀₁代表氢或一个残基，其中的羟基被从α-苯基甘氨酸中的羧基中除去，R₀₂代表氢或一个残基，其中的羟基被从一个氨基酸或一个肽的羧基中除去；可采用对IgA产生的抑制效果与上述的DSG或其药理学上可接受的盐类似的那些化合物。如此处所用的，“15-去氧精胍菌素(DSG)”及其药理学上可接受的盐包括选自由式2表示的与精胍菌素相关的化合物的一种化合物及其药理学上可接受的盐。

与精胍菌素相关的化合物是从杆菌类的一种生产菌株中分离出来的精胍菌素的一种衍生物，已知它具有抗肿瘤活性、免疫增强活性或免疫抑制活性，这依赖于衍生物的类型(JP-A 58-62152，JP-A61-129119，JP-A 64-90164)。另外，生产式1的DSG的方法在出版物(如JP-B 61-23183)中已有公布。

在根据本发明的用于口服的组合物中作为活性成分的DSG或其药理学上可接受的盐，可以根据上述的已知的方法或其修改的方法进行生产。

根据本发明的用于口服的组合物是根据已知的方法，使用DSG或其药理学上可接受的盐、或将其与一种赋形剂或载体相混合来配制的。DSG可以是一种具有活性的立体异构体或是一种外消旋化合物。

任何药理学上可接受的物质可以被用作赋形剂和载体。例如，水、乙醇、动物或植物油，如大豆油、花生油、芝麻油和矿物油、或合成油可以被用作液体载体。糖类(如乳糖、麦芽糖和蔗糖)、氨基酸、纤维素衍生物(如氧化纤维素)、有机盐(如硬脂酸镁)、葡聚糖、糖酐酯、硫酸软骨素、肝磷脂、凝胶及其类似物被用作固体载体。这些固体载体或液体载体可以被用于制备口服制剂，如片剂、胶囊、粉末、颗粒、溶液、固体糖浆或微球体配方。单一剂量形式的制剂是优选的。

另外，根据本发明，可以将酸或碱或适当量的缓冲液加入到组合物中以调节pH。

此外，将表面活性剂(如月桂酸钠或甘胆酸、或环糊精)加入到根据本发明的口服组合物中以降低组合物中作为活性成分的DSG或其药理学上可接受的盐的口服吸收能力是合乎需求的。使用生物可降解的乳酸盐聚合体、乳酸盐-甘醇酸酯共聚物等等来制备微球体配方以促进从消化道粘膜的吸收及增加吸收能力也是合乎需求的。

虽然在根据本发明的口服组合物中DSG或其药理学上可接受的盐的含量根据制剂有所变化，但其含量通常为质量比的0.1-100％，优选的是质量比的1-98％。通常，在片剂、胶囊、粉末或颗粒中活性成分的含量为质量比的5-100％，优选的为质量比的25-98％。

在根据本发明的对IgA的产生进行选择性抑制的方法中，用于抑制IgA产生的DSG或其药理学上可接受的盐是通过口服施用到需要选择性抑制IgA产生的人或动物中的。

剂量根据年龄、体重、疾病状况、治疗目的或作为患者的人或动物，如哺乳动物，包括宠物(如狗或猫)和家畜，的需要而定。口服的治疗剂量优选的是0.01-5毫克/千克/天或每个成人(体重65公斤)每天3-300毫克。更优选的，剂量根据IgG的产生至少不被明显抑制而定。因此，根据本发明的口服组合物的特征在于它可以显著地抑制IgA的产生，甚至当其剂量并不对IgG的产生产生明显抑制时也如此。

一些特定的试验动物，如在特定环境下成长的小鼠并没有被免疫致敏以产生IgA。根据本发明的口服组合物对IgA产生的选择性抑制作用可以通过使用一种试验模型来确定，通过口服用于粘膜免疫致敏的抗原使该模型产生粘膜型IgA和血清型IgA。另一方面，人或家畜由于口服摄入异源抗原(如食物中的)已经发生粘膜免疫致敏并产生IgA。因此，根据本发明的口服组合物对人或家畜中响应通过口服接种的抗原所发生的粘膜型IgA和血清型IgA的产生发生选择性抑制，在与其在试验模型中的作用是一样的。

由粘膜型IgA和/或血清型IgA引起的疾病可以通过，例如，IgA肾病来例证。根据本发明的口服组合物对治疗IgA肾病是有用的。

以下的实施例更详细的说明了本发明，但不应被认为限制了本发明的范围。实施例中所用的DSG是如以上所描述的式1的组合物。

实施例1

DSG对响应口服抗原的分泌型IgA产生的抑制作用

口服的DSG对分泌型IgA产生的抑制作用是通过测定口服施用霍乱毒素的小鼠的粪便中的抗霍乱毒素IgA抗体的滴度来证实。

首先，制备霍乱毒素溶液和DSG溶液。将霍乱毒素(Sigma)以50微克/毫升的浓度溶于0.2M NaHCO₃中以获得霍乱毒素溶液。将DSG(Takara Shuzo，冻干的原始药品)以5毫克/毫升或1.25毫克/毫升的浓度溶于盐水中以获得DSG溶液。

然后，给三组C57BL/6小鼠(七周龄，雌性，每组五只小鼠)口服施用0.2毫升霍乱毒素溶液两次(在第0天和第7天时)。以下在本实施例中，天数是从第0天开始计算，即从首次施用霍乱毒素的那一天开始计算。对这三组小鼠分别口服施用五次(从第7天到第11天每天一次)每剂0.2毫升的5毫克/毫升的DSG溶液、1.25毫克/毫升的DSG溶液或盐。口服施用于到各组中的DSG的剂量分别为50毫克/千克、12.5毫克/千克及0毫克/千克。在第7天和第14天时收集各组小鼠的粪便。0.1克粪便中的抗体用1毫升磷酸缓冲液(PBS)来提取。提取物在下文被称为粪便抗体提取物。第7天的粪便是在施用DSG之前收集的。

在粪便抗体提取物中的IgA抗体的滴度是通过ELISA方法测定的。向Immuno Modules(Nunc)中加入溶解在0.2M NaHCO₃中的浓度为10微克/毫升的霍乱毒素溶液，每份50微升，让其在4℃下保持16小时以涂覆霍乱毒素，获得用于ELISA方法的固相。然后用溶解在PBS中的含有1％(w/v)牛血清白蛋白(Sigma)的BSA溶液封阻固相，向其中加入50微升/份的粪便抗体提取物，然后在37℃下反应1小时。加入50微升用辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鼠IgA抗体(Zymed)并在37℃下反应1小时。然后向其中加入50微升溶解在柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的含有2.75毫克/毫升连氮基二-ethylbenzothizoline*磺酸(ABTS，HRP的底物，nacalai tesque)的ABTS溶液，在室温下反应15分钟，然后测定405nm波长(OD₄₀₅)下的吸收。

结果示于表1中。在表1中，分泌型IgA抗体产量的增加意味着IgA的产量在第7天和第14天是不同的。这一差异用第7天的粪便抗体提取物的OD₄₀₅值与第14天的粪便抗体提取物的OD₄₀₅值之间的差异(平均值±标准偏差)来表示。

表1

DSG的剂量分泌型IgA抗体产生的增加量显著差异P

(mg/kg)

0 0.409±0.091

12.5 0.249±0.092 ＜0.05

50 0.082±0.017 ＜0.0001

从表1的结果可以看出，与在没有接受DSG的组群中所观察到的相比，口服施用50mg/kg和12.5mg/kg的DSG导致响应口服抗原的分泌型IgA产生的增加量明显降低。这些结果证实了口服的DSG对IgA产生的抑制作用。

实施例2

DSG对响应口服抗原的IgA产生的选择性抑制作用

口服的DSG对抗体产生的抑制作用是通过测定粪便中抗霍乱毒素的IgA抗体的滴度，以及对口服霍乱毒素的小鼠的血液中抗霍乱毒素IgA抗体和抗霍乱毒素IgG抗体的滴度来证实的。

对五组如实施例1中所描述的C57BL/6小鼠(七周龄，雌性，每组五只小鼠)口服施用霍乱毒素。将三种DSG溶液或盐中的一种以0.2毫升/剂分别口服施用十次(从第7天到第17天，每天一次，除了第13天)给四组小鼠以进行霍乱毒素的施用。溶液含有溶解在盐水中的浓度为5mg/ml、1.25mg/ml或0.313mg/ml的DSG。口服施用到各组中的DSG的剂量分别为50mg/kg、12.5mg/kg、3.13mg/kg和0mg/kg。以0.2毫升/剂的剂量腹膜内施用0.313mg/ml的DSG溶液十次(从第7天到第17天，除了第13天以外每天一次)到剩下的一组中以进行霍乱毒素的施用。腹膜内施用的DSG的剂量为3.13mg/kg。

在第7天和第18天收集各组小鼠的粪便。0.1克粪便中的抗体用1毫升磷酸缓冲液(PBS)来提取.提取物在下文被称为粪便抗体提取物。第7天的粪便是在施用DSG之前收集的。

另一方面，在第7天时，在醚麻醉下从每组一只的小鼠的眼窝静脉网状组织中收集部分血液，在第18天时收集全身血液。从如此获得的血液中分离血清并稀释50倍。稀释液在下文被称为血液抗体样品。第7天的血液是在施用DSG之前收集的。

通过ELISA方法测定粪便抗体提取物或血液抗体样品中抗霍乱毒素的IgA抗体的滴度。测定如实施例1中所描述的方法进行。血液抗体样品也被用于确定血液中产生的抗霍乱毒素的IgG抗体的量。在用ELISA方法滴定抗体中使用的固相与实施例1中用ELISA方法滴定IgA抗体中使用的是相同的。

在如实施例1中所述的用BSA溶液封阻固相之后，向其中加入每种抗体样品50微升，然后在37℃下反应1小时。然后向其中加入2.75mg/ml ABTS溶液50微升，在室温下反应15分钟，然后405nm(OD₄₀₅)的波长下测定吸光度。

结果示于表2。表2显示了在第7天和在第18天产生的抗体的量的各种差异。该差异是通过第7天的粪便抗体提取物或血液抗体样品的OD₄₀₆值和第18天的粪便抗体提取物或血液抗体样品的OD₄₀₅值(平均值±标准偏差)之间的差异来表示的。

表2

DSG 抗体滴度

剂量(mg/kg) 分泌型IgA 血液IgA 血液IgG

0 0.308±0.075 0.051±0.013 0.493±0.148

3.13(p.o.) 0.327±0.065 0.035±0.012 0.472±0.112

12.5(p.o.) 0.112±0.116^* 0.028±0.012^* 0.570±0.107

50(p.o.) 0.009±0.054^** 0.016±0.020^* 0.330±0.169

3.13(i.p.) 0.008±0.016^*** -0.009±0.009^*** 0.034±0.035^**

在表2中，在数字右方的上标符号，*、**和***，分别表示显著性差异P＜0.05，P＜0.001以及P＜0.0001。另外，p.o.表示口服施用DSG的一组，i.p.表示腹膜内施用DSG的一组。

在粪便和血液中，腹膜内施用的DSG对抗体产生的抑制作用很强。分泌型IgA、血液IgA或血液IgG中的任何一种抗体的产生都被完全抑制，这提示了全身性抑制免疫反应的产生。口服施用以剂量依赖的方式抑制了分泌型IgA和血液IgA的抗体产生。口服施用对抗体产生的低水平的抑制(与腹膜内施用相比而言)以及在血液中不对IgG产生抑制作用提示了施用的全身性抑制免疫反应是微弱的。

实施例3

DSG对响应皮下施用的抗原的抗体产生和迟发型超敏反应的抑制作用

与实施例1和2相反，口服施用的DSG对响应于皮下施用的抗原的抗体产生的影响被证实。简要地说，在将卵清蛋白皮下施用到小鼠体内之后，口服施用DSG。测定鼠粪便中抗卵清蛋白IgA抗体的滴度以及血液中的抗卵清蛋白IgA抗体的滴度和抗卵清蛋白IgG抗体的滴度以确证该影响。另外，DSG对抗卵清蛋白的迟发型超敏反应的影响也被证实。

(1)对抗体产生的抑制作用：通过将卵清蛋白(Sigma)和浓度为200微克/毫升的弗罗因德完全佐剂混合来制备用于皮下施用的卵清蛋白悬浮液。DSG溶液的制备是如实施例1中所述的方法进行的，将DSG以5mg/ml、1.25mg/ml或0.313mg/ml的浓度溶解在盐中。

然后将0.1毫升卵清蛋白悬液皮下施用两次(第0天和第14天)到三组C57VL/6小鼠(七周龄，雌性，每组五只小鼠)中。下面在本实施例中，天数是从第0天开始计算，即从首次施用卵清蛋白的那一天开始计算。然后将DSG溶液或盐以0.2毫升/剂的剂量口服施用十次(从第14天到第24天，除了第20天以外每天一次)到三组小鼠中以进行卵清蛋白的施用。口服施用到各组中的DSG的剂量分别为50mg/kg、12.5mg/kg和0mg/kg。以0.2毫升/剂的剂量腹膜内施用0.313毫克/毫升的DSG溶液十次(从第14天到第25天，除了第20天以外每天一次)到剩下的一组中以进行卵清蛋白的施用。腹膜内施用的DSG的剂量为3.13mg/kg。

在第14天和第25天收集各组小鼠的粪便。用1毫升磷酸缓冲液(PBS)提取0.1克粪便中的抗体。提取物在下文被称为粪便抗体提取物。第14天的粪便是在施用DSG之前收集的。

另一方面，在第14天时，在醚麻醉下从每组一只的小鼠的眼窝静脉网状组织中收集部分血液，在第25天时收集全身血液。从如此获得的血液中分离血清并稀释50或250倍。稀释液在下文中被称为血液抗体样品。第14天的血液是在施用DSG之前收集的。

通过ELISA方法测定粪便抗体提取物或血液抗体样品中抗卵清蛋白抗体的滴度。测定如实施例2中所述的ELISA方法进行，除了用于固相的抗原从霍乱毒素变为卵清蛋白。

卵清蛋白的皮下施用没有提高粪便或血液中IgA抗体的量。另一方面，卵清蛋白的皮下施用提高了血液中IgG抗体的量。血液中所产生的IgG抗体量的变化结果如表3中所示。表3显示了在第14天和第25天产生的各种抗体量之间的差异。该差异通过第14天的稀释250倍的血液抗体样品的OD₄₀₅值和第25天的稀释250倍的血液抗体样品的OD₄₀₅值(平均值±标准偏差)之间的差异来表示的。

表3

DSG的剂量

血液IgG 显著差异P

(mg/kg)

0 0.437±0.173

12.5(p.o.) 0.286±0.074

50(p.o.) 0.125±0.141 ＜0.05

3.13(i.p.) 0.064±0.080 ＜0.001

在表3中，p.o.表示口服施用DSG的一组，i.p.表示腹膜内施用DSG的一组。

以50mg/kg施用DSG明显抑制了血液中IgG抗体的产生，然而以12.5mg/kg施用的DSG对其并没有产生显著的抑制。另一方面，以3.13mg/kg腹膜内施用DSG比以50mg/kg口服施用DSG更强烈地抑制了血液中抗体的产生。

上述的结果显示口服施用DSG选择性抑制了响应口服抗原的抗体产生，而不是抑制了响应肠道外接种的抗原的抗体产生。

(2)对迟发型超敏反应的抑制作用：在卵清蛋白施用的24天之后，将25微升卵清蛋白的水溶液(400微克/毫升)皮下施用到实施例3(1)中的各试验组中的一只小鼠的爪垫处.在皮下施用卵清蛋白的24小时之后测定爪垫的肿胀.结果显示在表4中。

表4

DSG的剂量爪垫的肿胀

(mg/kg) (×10 ^-2 mm)

0 88.6±57.2

12.5(p.o.) 83.2±41.4

50(p.o.) 62.0±24.8

3.13(i.p.) 22.8±35.3

在口服施用50mg/kg DSG的组中所观察到的爪垫的肿胀与在没有施用的组中所观察到的肿胀没有发现存在区别。另一方面，与在没有施用的组中所观察到的相比，腹膜内施用3.13mg/kg DSG的组中所观察到的爪垫的肿胀降低。因此，认为口服施用DSG并不抑制迟发型超敏反应，也不造成由DSG引发的全身性免疫抑制反应。

实施例4

用于抑制IgA抗体产生的口服组合物的制备

颗粒

按重量比将50份DSG、600份乳糖、330份结晶纤维素以及20份羟丙基纤维素充分混合，使用滚动型挤压机(Roller Compactor^TM)压紧、研磨并使其通过16-孔到60-孔之间的筛子以获得颗粒。

片剂

用V-型混合器混合按重量比的30份DSG、120份结晶乳糖、147份结晶纤维素以及3份硬脂酸镁，然后压缩以获得片剂(300毫克/片)。

如上所述，含有根据本发明的DSG或其药理学上可接受的盐的口服组合物抑制了响应口服抗原的免疫反应，尤其是IgA抗体的产生，然而仅观察到很小或微弱的全身性免疫抑制。因此，含有根据本发明的DSG或其药理学上可接受的盐的口服组合物可以被用于治疗及预防与IgA相关的免疫疾病，如IgA肾病。

Claims

1.15-去氧精胍菌素或其药用上可接受的盐在制造用于口服施用到人或动物中以选择性抑制IgA产生的组合物中的应用。

2.如权利要求1中所述的应用，其中的组合物用于阻止或治疗IgA肾病。