JP4891926B2

JP4891926B2 - アルテミシニン誘導体、その調製方法、応用及び該誘導体を含む薬物組成物

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Publication number: JP4891926B2
Application number: JP2007553443A
Authority: JP
Inventors: 英李; 建平左; 忠順楊; 文亮周; 毅隋; 峻霞王; 瑜張; 宇周; 錦明 ▲呉▼
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2005-02-04
Filing date: 2006-01-27
Publication date: 2012-03-07
Anticipated expiration: 2026-01-27
Also published as: EP1845099A1; US20080139642A1; EP1845099A4; JP2008528641A; EP1845099B1; WO2006081771A1; CN101103036B; US7910750B2; CN101103036A; CN1814601A

Description

本発明は、薬物化学分野に関する。具体的には、新しいテルペン類のアルテミシニン（Ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ）誘導体、その調製方法、応用及び当該アルテミシニン誘導体を含む薬物組成物に関する。

アルテミシニンは漢方薬のセイコウ（植物クソニンジンＡｒｔｅｍｉｓｉａａｎｎｕａＬ．）から抽出された抗マラリアの有効成分であり、一種の珍しいペルオクソ基を含むセスキテルペンラクトンである。アルテミシニンとその誘導体であるアルテスネイト(
ａｒｔｅｓｕｎａｔｅ)の化学構造式は、それぞれ以下の通りである。

アルテミシニンは、強力な抗マラリア機能を持つだけでなく、その他の寄生虫（例えば住血吸虫、肝吸虫）にも効果的である。また、当該物質が免疫抑制作用を持つことも発見され、紅斑性狼瘡（ｌｕｐｕｓｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）の臨床実験に用いられたことがある。研究の進展につれ、アルテミシニン誘導体であるアルテスネイトは、より強力な免疫抑制作用を持つことが発見され、紅斑性狼瘡やいくつかの皮膚病に有効で、かつ良い治療効果を示した。これらの臨床実験においてアルテスネイトの免疫抑制作用はアルテミシニンより強いことが証明されたが、患者にとって、長期の静脈注射をする必要があり、使用する場合は非常に不便であった。従来の臨床に広く用いられる免疫抑制剤のシクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）Ａは、値段が高く、腎臓や肝臓に毒性があるので、患者にとって、該薬を使い続けることが困難であった。従って、本発明者はより効果の高い、且つ安全な免疫抑制剤を提供するため研究を進めてきた。

本発明は、より効果の高い、安全かつ免疫抑制剤の効果を持つアルテミシニン誘導体を提供することを目的としている。
本発明は、前記アルテミシニン誘導体の調製方法を提供することをもう一つの目的としている。

本発明は、前記アルテミシニン誘導体を含む薬物組成物を提供することをもう一つの目的としている。
本発明は、前記アルテミシニン誘導体を含む薬物組成物の剤形を提供することをもう一つの目的としている。

本発明は、前記アルテミシニン誘導体の医薬用途を提供することをもう一つの目的としている。
また本発明は、前記アルテミシニン誘導体を含む薬物組成物の医薬用途を提供することをもう一つの目的としている。

本発明によれば、下記の構造式Iで示す構造を持つアルテミシニン誘導体を提供できる
。

式中、Ｘは、Ｏ、Ｏ（ＣＨ₂）ｎ又はＯＣＨＲ₁であり、また前記Ｒ₁はＣ₁−Ｃ₄の炭化
水素基、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅ又はＣＯＯＥｔであり、ｎは１〜４である；Ｐは、Ａｒ−Ｙ−Ｚ又はＡｒ−Ｚであり、その中で、Ａｒは、フェニル基又はナフチル基であり；Ｙは、Ｏ（ＣＨ₂）ｎ、ＯＣＨＭｅ、又はＣ_１−Ｃ_４の炭化水素基で、ｎは１〜４であ
り；Ｚは、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ’、ＣＯＯＲ’又はＣＯＮＨＣＨ₂ＣＯＯＲ’であり、前
記Ｒ’は、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₄のアルキル基、ｏ−メトキシフェニル基又はＣ₁−Ｃ₄のアルキルアミン基である。

具体的には、本発明に係るアルテミシニン誘導体において、
上記Ｘは、Ｏ又はＯＣＨ₂であり；上記Ｐは、Ａｒ−Ｙ−Ｚであり、その中で、前記Ａｒ
はフェニル基であり、Ｙは、Ｏ（ＣＨ₂）ｎ、ＯＣＨＭｅ、Ｃ₁−Ｃ₄の炭化水素基で、ｎ
は１又は２であり、Ｚは、ＣＯＯＲ’であり、その中で、前記Ｒ’はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ又はｏ−メトキシフェニル基である。

本発明に係るアルテミシニン誘導体は、４−メトキシカルボニルメチルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル、４−カルボキシメチルフェニル-ジヒドロアルテミシニン
エーテル、４−エトキシカルボニルメトキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル、３−コハク酸モノアシルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル、４−エトキシカルボニルメチルアミノカルボニルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル、4-メトキシカルボニル（α−メチル）メテニルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル、４−ｏ−メトキシフェノキシカルボニル（α−メチル）メテニルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル、４−エトキシカルボニル（α−メチル）メテニルオキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル、４−カルボキシ（α−メチル）メテニルオキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル、４−ｏ−メトキシフェノキシカルボニル−（α−メチル）メテニルオキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル又は３−ｏ−メトキシフェノキシカルボニル−（α−メチル）メテニルオキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテルから選択されることが好ましい。

本発明によれば、本発明はさらに上記アルテミシニン誘導体の調製方法も提供でき、当該方法は以下のような手順を含む：
１）構造式ＩＩに示された構造を持つジヒドロアルテミシニン又は構造式ＩＩＩに示された構造を持つアセチルジヒドロアルテミシニンを原料として、酸触媒の条件でカルボキシレートを含むフェノール又はグリコールと反応させ、相応するジヒドロアルテミシニンのエーテル類産物を得る工程；

２）次に、ジヒドロアルテミシニンのエーテル類産物を加水分解させ、遊離酸状態の中間産物を得る工程；
３）工程２）の遊離酸状態中間産物を最終産物に調製する工程。

又は当該方法は以下のような手順を含む：
１）酸触媒の条件で、上記構造式ＩＩに示された構造を持つジヒドロアルテミシニン、又は上記構造式ＩＩＩに示された構造を持つアセチルジヒドロアルテミシニンをビスフェノールと反応させ、下記構造式ＩＶに示された構造を持つ化合物を得る工程；
２）次に、前記構造式ＩＶに示された構造を持つ化合物を修飾し、最終産物を生成する工程。

具体的な調製方法について、本発明者の以前の特許ＺＬ９４１１３９８２．４、ＺＬ０１１１３４０７．０と出願番号９９８０７４１６の特許出願の内容を参照できる。
さらに本発明は、前記アルテミシニン誘導体を含む薬物組成物を提供できる。前記薬物組成物は安全、有効な投与量範囲内の上記式Ｉに示された化合物又は薬用塩及び薬学上に受容可能なキャリアを含む。当該薬物組成物は、１〜８５重量％の請求項１に記載されたアルテミシニン誘導体又はその薬用塩、１５〜９９重量％の賦形剤、０〜６０重量％の他の通常用補助原料を含むことが好ましい。

「安全、有効な投与量」とは、化合物の用量が症状を著しく改善でき、且つ厳重な副作
用を生じないことを指す。化合物の安全、有効な投与量は治療対象の年齢、体重、治療適応症、投与ルート、治療経過及びいかなる関連治療などの具体的な状況により決められる。一般的に成人は０．１ｍｇ／日から５００ｍｇ／日であり、一回又は数回に分けて投与し、児童は適当に減量する。

「薬学上に受容可能なキャリア」とは、一種類又は多種類の相容性固体や液体充填剤（ｆｉｌｌｅｒ）又は賦形剤を指す。これらは人に適用し、また十分の純度を有し、且つ毒性が十分低くしなければならない。ここで「相容性」とは、組成物中の各成分が本発明の化合物及びそれらの間に混ぜ合わせることができ、且つ化合物の薬効を著しく低下しないことを指す。薬学上に受容可能なキャリアとしては糖類（例えばグルコース、スクロース、乳糖など）、デンプン（例えばトウモロコシデンプン、ポテトデンプンなど）、セルロース及び誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースナトリウム、酢酸エステルセルロース、微晶質セルロースなど）、アクリル酸樹脂、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビドン（ｐｏｌｙｖｉｄｏｎｅ）、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンモノスレアレート、ゼラチン、シリカゲル、滑石粉、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、植物油（例えばダイズ油、ゴマ油、ラッカセイ油、オリーブ油など）が挙げられる。また、乳化剤（例えばトウィーン（Ｒ））、湿潤剤（ｗｅｔｔｉｎｇａｇｅｎｔ）（例えばドデシル硫酸ナトリウム）、可塑剤(例えばセバシン酸ジプチル)、着色剤、調味剤、安定剤、防腐剤、無発熱原の水（ｎｏｎｐｙｒｏｇｅｎｉｃｗａｔｅｒ）なども挙げられる。本発明に係る組成物はキャリアの選択に対し、化合物の投与方式により決められている。また、当業者は従来技術に基づき特定の投与方式に適用するキャリアを選択することができる。

また、本発明は前記薬物組成物の剤形を提供することができる。上記剤形は経口、経胃腸管外投与、経鼻、舌下投与、点眼、吸入又は経直腸投与の投与剤形である。また、上記剤形は腸溶性丸、舌下錠剤、貼付剤、坐薬、クリーム剤、軟膏剤又は皮膚用ゲル剤であることが好ましい。

本発明も、前記アルテミシニン誘導体の免疫系疾患を治療又は予防に用いられる薬物の調製における用途、及び免疫系疾患の治療又は予防における応用を提供する。
また本発明も、前記アルテミシニン誘導体の薬物組成物の免疫系疾患を治療又は予防に用いられる薬物の調製における応用、及び免疫系疾患の治療又は予防における応用を提供する。

本発明に係るアルテミシニン誘導体は、非常に高い免疫抑制剤の活性を持ち、より安全に使用されることができる。当該アルテミシニン誘導体を含む化合物は錠剤、丸剤など長期にわたって容易に使用可能な剤形を調製することができ、幅広い生産と実用の価値を有する。

以下、実施例で本発明を更に説明するが、これらの実施例は本発明についてのいかなる限定をするものではない。
下記実施例において、アルテミシニンの母核はＱで代表される。

波線（）はβ置換又は／及びα置換を示す。
直線（）はβ置換を示す。
破線（）はα置換を示す。

≪調製の実施例≫
〔調製の実施例１：４−メトキシカルボニルメチルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物１）の調製〕

アセチルジヒドロアルテミシニンと４−ヒドロキシフェニル酢酸メチルとをジクロロメタンに溶解させ、トリフルオル酢酸を滴下し、反応が終わった後通常の処理を行い、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離させ、更に再結晶して白い結晶の化合物１を得た。溶解点は１０８〜１１２℃である。

＜元素分析（Ｃ₂₄Ｈ₃₂Ｏ₇）＞
（計算値）Ｃ：６６．６５、Ｈ：７．４５。
（実際の測定値）Ｃ：６７．０３、Ｈ：７．２１。

〔調製の実施例２：４−カルボキシメチルフェニル-ジヒドロアルテミシニンエーテル
（β型）（化合物２）の調製〕

調製の実施例１で得られた化合物をＫＯＨ／Ｃ₂Ｈ₅ＯＨ溶液の中に添加して加水分解反応を行なった後、粗産物が再結晶により、白い結晶の化合物２を得た。溶解点は１５４〜１５６℃である。

＜元素分析（Ｃ₂₃Ｈ₃₀Ｏ₇）＞
（計算値）Ｃ：６６．０１、Ｈ：７．２３。
（実際の測定値）Ｃ：６５．９５、Ｈ：７．２９。

〔調製の実施例３：３−コハク酸モノアシルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物３）の調製〕

３−フェノールフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテルと無水コハク酸とを反応させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、白い結晶の無定形固体の化合物３を得た。

＜元素分析（Ｃ₂₅Ｈ₃₂Ｏ₉・１／２Ｈ₂Ｏ）＞
（計算値）Ｃ：６１．８４、Ｈ：６．８５。
（実際の測定値）Ｃ：６２．０９、Ｈ：６．８６。

〔調製の実施例４：４−（ジメチルアミノエトキシカルボニルメトキシ）フェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物４）の調製〕

４−カルボキシメトキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテルとＮ，Ｎ−ジメチルエタノールアミンとを縮合させ、化合物４を得た。
＜元素分析（Ｃ₂₇Ｈ₃₉ＮＯ₈）＞
（計算値）Ｃ：６４．１４、Ｈ：７．７７、Ｎ：２．７７。

（実際の測定値）Ｃ：６４．３０、Ｈ：７．７９、Ｎ：２．６５。
〔調製の実施例５：４−エトキシカルボニルメチルアミノカルボニルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物５）の調製

４−カルボキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテルとグリジンエチルエステルとを縮合させ、化合物５を得た。
＜元素分析（Ｃ₂₆Ｈ₃₅ＮＯ₈）＞
（計算値）Ｃ：６３．７８、Ｈ：７．２１、Ｎ：２．９６。

（実際の測定値）Ｃ：６４．０４、Ｈ：７．２６、Ｎ：３．３０。
〔調製の実施例６：４−アセトキシ（α−メチル）ベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物６）の調製〕

ジヒドロアルテミシニンと４−アセトキシ−α−メチルベンジルアルコールとを縮合させ、化合物６を得た。
＜元素分析（Ｃ₂₅Ｈ₃₄Ｏ₇）＞
（計算値）Ｃ：６７．２４、Ｈ：７．６７。

（実際の測定値）Ｃ：６７．１４、Ｈ：７．６１。
〔調製の実施例７：４−ヒドロキシ（α−メチル）ベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物7）の調製〕

調製の実施例６で得られた化合物をアルカリ性加水分解させて、化合物７を得た。
＜元素分析（Ｃ₂₃Ｈ₃₂Ｏ₆）＞
（計算値）Ｃ：６８．２９、Ｈ：７．９７。

（実際の測定値）Ｃ：６８．２３、Ｈ：８．２７。
〔調製の実施例８：４−エトキシカルボニルメトキシ（α−メチル）ベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物８）の調製〕

調製の実施例７で得られた化合物とクロル酢酸エチルとを反応させ、化合物８を得た。
＜元素分析（Ｃ₂₇Ｈ₃₈Ｏ₈）＞
（計算値）Ｃ：６６．１０、Ｈ：７．８１。

（実際の測定値）Ｃ：６５．９１、Ｈ：８．１７。
〔調製の実施例９：４−カルボキシメトキシ（α−メチル）ベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物９）の調製〕

調製の実施例８で得られた化合物をアルカリ性加水分解させて、化合物９を得た。
＜元素分析（Ｃ₂₅Ｈ₃₄Ｏ₈）＞
（計算値）Ｃ：６４．９２、Ｈ：７．４１。

（実際の測定値）Ｃ：６４．６６、Ｈ：７．５０。
〔調製の実施例１０：４−ヒドロキシ（α−シアン）ベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物１０）の調製〕

ジヒドロアルテミシニンと４−アセトキシ−α−シアンベンジルアルコールとを縮合させ、次にアルカリ性加水分解を行い、化合物１０を得た。
＜元素分析（Ｃ₂₃Ｈ₂₉ＮＯ₆）＞
（計算値）Ｃ：６６．４９、Ｈ：７．０４、Ｎ：３．３７。

（実際の測定値）Ｃ：６６．５３、Ｈ：７．０４、Ｎ：３．１６。
〔調製の実施例１１：３−ヒドロキシ（α−シアン）ベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物１１）の調製〕

ジヒドロアルテミシニンと３−アセトキシ−α−シアンベンジルアルコールとを縮合させ、次にアルカリ性加水分解を行い、化合物１１を生成した。
＜元素分析（Ｃ₂₃Ｈ₂₉ＮＯ₆）＞
（計算値）Ｃ：６６．４９、Ｈ：７．０４、Ｎ：３．３７。

（実際の測定値）Ｃ：６６．３８、Ｈ：６．８４、Ｎ：３．０１。
〔調製の実施例１２：（Ｓ）−２−エトキシカルボニルメトキシ（α−シアン）ベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（化合物１２）および（Ｒ）−２−エトキシカルボニルメトキシ（α−シアン）ベンジル-ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合
物１３）の調製〕

ジヒドロアルテミシニンと２−エトキシカルボニルメトキシ（α−シアン）ベンジルアルコールとを縮合させ、反応が終わった後、通常の処理してからシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離した。

第一フラクションは（Ｓ）−２−エトキシカルボニルメトキシ（α−シアン）ベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテルの白い結晶であり、溶解点は７０〜７１℃である。
＜元素分析（Ｃ₂₇Ｈ₃₅ＮＯ₈）＞
（計算値）Ｃ：６４．６５、Ｈ：７．０３、Ｎ：２．７９。

（実際の測定値）Ｃ：６４．６３、Ｈ：７．３３、Ｎ：２．８５。
第二フラクションは（Ｒ）−２−エトキシカルボニルメトキシ（α−シアン）ベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテルの白い結晶であり、溶解点は８８〜９０℃である。

＜元素分析（Ｃ₂₇Ｈ₃₅ＮＯ₈）＞
（計算値）Ｃ：６４．６５、Ｈ：７．０３、Ｎ：２．７９。
（実際の測定値）Ｃ：６５．０８、Ｈ：７．３３、Ｎ：２．７１。

〔調製の実施例１３：（Ｓ）−２−カルボキシメトキシ（α−シアン）ベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物１４）の調製〕

調製の実施例１２で得られた化合物の（Ｓ）−２−エトキシカルボニルメトキシ（α−
シアン）ベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテルをアルカリ性加水分解させて、白い結晶の化合物１４を得た。溶解点は１４３〜１４４℃である。

＜元素分析（Ｃ₂₅Ｈ₃₁ＮＯ₈）＞
（計算値）Ｃ：６３．４１、Ｈ：６．６０、Ｎ：２．９６。
（実際の測定値）Ｃ：６３．２７、Ｈ：６．５２、Ｎ：２．９７。

〔調製の実施例１４：２−ブロム−５−ヒドロキシ（α−シアン）ベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物１５）の調製〕

ジヒドロアルテミシニンおよび２−ブロム−５−アセトキシ（α−シアン）ベンジルアルコールを原料として、酸性縮合とアルカリ性加水分解とにより、白い結晶の化合物１５を得た。その溶解点は９０〜９２℃である。

＜元素分析（Ｃ₂₃Ｈ₂₈ＢｒＮＯ₆）＞
（計算値）Ｃ：５５．８８、Ｈ：５．７１、Ｎ：２．８３。
（実際の測定値）Ｃ：５５．５２、Ｈ：５．７６、Ｎ：２．８２。

〔調製の実施例１５：４−フルオロ（α−ギ酸メチル）ベンジル-ジヒドロアルテミシ
ニンエーテル（β型）（化合物１６）の調製〕

ジヒドロアルテミシニンと４−フルオロ（α−ギ酸メチル）ベンジルアルコールとを縮合させ、化合物１６を生成した。
＜元素分析（Ｃ₂₄Ｈ₃₁ＦＯ₇）＞
（計算値）Ｃ：６３．９９、Ｈ：６．９３。

（実際の測定値）Ｃ：６４．２９、Ｈ：６．９８。
〔調製の実施例１６：４−ブロム（α−ギ酸エチル）ベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物１７）の調製〕

ジヒドロアルテミシニンと４−ブロム（α−ギ酸エチル）ベンジルアルコールとを縮合させ、化合物１７を生成した。
＜元素分析（Ｃ₂₅Ｈ₃₃ＢｒＯ₇）＞
（計算値）Ｃ：５７．１５、Ｈ：６．３３。

（実際の測定値）Ｃ：５６．８７、Ｈ：６．１６。
〔調製の実施例１７：（Ｓ）−α−ギ酸メチル−１−ナフトベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（化合物１８）および（Ｒ）−α−ギ酸メチル−１−ナフトベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物１９）の調製〕

ジヒドロアルテミシニンとα−ギ酸メチルナフトベンジルアルコール−１とを縮合させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離して二つの化合物１８、１９を得た。
（Ｓ）−α−ギ酸メチル−１−ナフトベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテルは無定形固体である。

＜元素分析（Ｃ₂₈Ｈ₃₄Ｏ₇）＞
（計算値）Ｃ：６９．６９、Ｈ：７．１０。
（実際の測定値）Ｃ：６９．７２、Ｈ：７．１７。

（Ｒ）−α−ギ酸メチル−１−ナフトベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテルは無定形固体である。
＜元素分析（Ｃ₂₈Ｈ₃₄Ｏ₇）＞
（計算値）Ｃ：６９．６９、Ｈ：７．１０。

（実際の測定値）Ｃ：７０．０６、Ｈ：６．９７。
〔調製の実施例１８：（Ｓ）−α−カルボキシ−１−ナフトベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物２０）の調製〕

調製の実施例１７で得られた化合物の（Ｓ）−α−ギ酸メチル−１−ナフトベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテルをアルカリ性加水分解させ、無定形固体の化合物２０を得た。

＜元素分析（Ｃ₂₇Ｈ₃₂Ｏ₇）＞
（計算値）Ｃ：６９．２１、Ｈ：６．８８。
（実際の測定値）Ｃ：６９．２９、Ｈ：６．９０。

〔調製の実施例１９：４−メトキシカルボニル（α−メチル）メテニルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物２１）の調製〕

アセチルジヒドロアルテミシニンと２−（４−ヒドロキシフェニル）イソプロピオン酸メチルとを縮合させ、通常の処理した後シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、無色油状の化合物２１を得た。

＜元素分析（Ｃ₂₅Ｈ₃₄Ｏ₇）＞
（計算値）Ｃ：６７．２４、Ｈ：７．６７。
（実際の測定値）Ｃ：６７．０５、Ｈ：７．８２。

〔調製の実施例２０：４−カルボキシ（α−メチル）メテニルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物２２）の調製〕

調製の実施例１９で得られた化合物をアルカリ性加水分解し、再結晶により、白い結晶の化合物２２を得た。その溶解点は１５２〜１５４℃である。
＜元素分析（Ｃ₂₄Ｈ₃₂Ｏ₇）＞
（計算値）Ｃ：６６．６５、Ｈ：７．４６。

（実際の測定値）Ｃ：６６．６３、Ｈ：７．５３。
〔調製の実施例２１：４−ｏ−メトキシフェノキシカルボニル（α−メチル）メテニルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物２３）の調製〕

調製の実施例２０で得られた化合物と２−メトキシフェノールとを縮合させ、白い無定形固体の化合物２３を得た。
＜元素分析（Ｃ₃₁Ｈ₃₈Ｏ₈）＞
（計算値）Ｃ：６９．１３、Ｈ：７．１１。

（実際の測定値）Ｃ：６９．０８、Ｈ：７．００。
〔調製の実施例２２：４−エトキシカルボニル−（α−メチル）メテニルオキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物２４）の調製〕

アセチルジヒドロアルテミシニンと２−（４−ヒドロキシフェノキシ）プロピオン酸エチルとを縮合させ、反応が終わった後通常の処理を行い、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、無色油状の化合物２４を得た。

＜元素分析（Ｃ₂₆Ｈ₃₆Ｏ₈）＞
（計算値）Ｃ：６５．５３、Ｈ：７．６１。
（実際の測定値）Ｃ：６５．４６、Ｈ：７．６６。

〔調製の実施例２３：４−カルボキシ−（α−メチル）メテニルオキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物２５）の調製〕

調製の実施例２２で得られた化合物をアルカリ性加水分解させ、白い無定形固体の化合物２５を得た。
＜元素分析（Ｃ₂₄Ｈ₃₂Ｏ₈）＞
（計算値）Ｃ：６４．２７、Ｈ：７．１９。

（実際の測定値）Ｃ：６４．２５、Ｈ：７．４０。
〔調製の実施例２４：４−ｏ−メトキシフェノキシカルボニル−（α−メチル）メテニルオキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物２６）の調製〕

４−カルボキシ−（α−メチル）メテニルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテルに対してカルボキシ基の芳香族エステル化を行い、化合物２６を得た。白い結晶であり、その溶解点は１４２〜１４４℃である。

＜元素分析（Ｃ₃₁Ｈ₃₈Ｏ₉）＞
（計算値）Ｃ：６７．１３、Ｈ：６．９１。
（実際の測定値）Ｃ：６７．０９、Ｈ：６．９２。

〔調製の実施例２５：３−ｏ−メトキシフェノキシカルボニル−（α−メチル）メテニルオキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物２７）の調製〕

３−カルボキシ−（α−メチル）メテニルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテルに対してカルボキシ基の芳香族エステル化を行い、化合物２７を得た。白い無定形の固体である。

＜元素分析（Ｃ₃₁Ｈ₃₈Ｏ₉）＞
（計算値）Ｃ：６７．１３、Ｈ：６．９１。
（実際の測定値）Ｃ：６７．１２、Ｈ：７．０４。

〔調製の実施例２６：３−エトキシカルボニル−（α−メチル）メテニルオキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（α型）（化合物２８）の調製〕

アセチルジヒドロアルテミシニンと２−（３−ヒドロキシフェノキシ）プロピオン酸エチルとを縮合させ、反応が終わった後通常の処理を行い、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、無色油状の化合物２８を得た。

＜元素分析（Ｃ₂₆Ｈ₃₆Ｏ₈）＞
（計算値）Ｃ：６５．５３、Ｈ：７．６１。
（実際の測定値）Ｃ：６５．１７、Ｈ：７．７６。

〔調製の実施例２７：３−カルボキシ−（α−メチル）メテニルオキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（α型）（化合物２９）の調製〕

調製の実施例２６で得られた化合物をアルカリ性加水分解させ、白い無定形固体の化合物２９を得た。
＜元素分析（Ｃ₂₄Ｈ₃₂Ｏ₈）＞
（計算値）Ｃ：６４．２７、Ｈ：７．１９。

（実際の測定値）Ｃ：６４．４２、Ｈ：７．５０。
〔調製の実施例２８：３−ｏ−メトキシフェノキシカルボニル−（α−メチル）メテニルオキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（α型）（化合物３０）の調製〕

調製の実施例２７で得られた化合物に対して遊離酸のエステル化を行い、白い無定形固体の化合物３０を得た。
＜元素分析（Ｃ₃₁Ｈ₃₈Ｏ₉）＞
（計算値）Ｃ：６７．１３、Ｈ：６．９１。

（実際の測定値）Ｃ：６７．５２、Ｈ：７．３３。
〔調製の実施例２９：３−エトキシカルボニル−（α−メチル）メテニルオキシベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物３１）および３−エトキシカルボニル−（α−メチル）メテニルベンジルオキシ-ジヒドロアルテミシニンエーテル（α型
）（化合物３２）の調製〕

ジヒドロアルテミシニンと２−（３−ヒドロキシメチルフェノキシ）プロピオン酸エチルとを縮合させ、通常の処理を行ってからシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、二つの無色油状の化合物３１、３２を得た。

＜元素分析（Ｃ₂₇Ｈ₃₈Ｏ₈）＞
（計算値）Ｃ：６６．１０、Ｈ：７．８１。
（実際の測定値）（β型）Ｃ：６６．３１、Ｈ：７．６７；（α型）Ｃ：６６．１５、Ｈ：７．９１。

〔調製の実施例３０：３−カルボキシ−（α−メチル）メテニルオキシベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物３３）および３−カルボキシ−（α−メチル）メテニルオキシベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（α型）（化合物３４）の調製〕

調製の実施例２９で得られた化合物をアルカリ性加水分解させ、二つの白い無定形固体の化合物３３、３４を得た。
＜元素分析（Ｃ₂₅Ｈ₃₄Ｏ₈）＞
（計算値）Ｃ：６４．９２、Ｈ：７．４１。

（実際の測定値）（β型）Ｃ：６４．６４、Ｈ：７．６１；（α型）Ｃ：６６．７６、Ｈ：７．６６。
〔調製の実施例３１：３−ｏ−メトキシフェノキシカルボニル−（α-メチル）メテニ
ルオキシベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物３５）の調製〕

調製の実施例３０で得られたβ型化合物３３に対して、カルボキシ基の芳香族エステル化を行い、無色油状の化合物３５を得た。
＜元素分析（Ｃ₃₂Ｈ₄₀Ｏ₉）＞
（計算値）Ｃ：６７．５９、Ｈ：７．０９。

（実際の測定値）Ｃ：６７．５４、Ｈ：７．１７。
〔調製の実施例３２：４−エトキシカルボニル−（α−メチル）メテニルオキシベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物３６）および４−エトキシカルボニル−（α−メチル）メテニルオキシベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（α型）（化合物３７）の調製〕

ジヒドロアルテミシニンと２−（４−ヒドロキシメチルフェノキシ）プロピオン酸エチルとを縮合させ、通常の処理を行ってからシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、二つの無色油状の化合物３６、３７を得た。

＜元素分析（Ｃ₂₇Ｈ₃₈Ｏ₈）＞
（計算値）Ｃ：６６．１０、Ｈ：７．８１。
（実際の測定値）（β型）Ｃ：６６．０３、Ｈ：７．７０；（α型）Ｃ：６６．１８、Ｈ：７．４９。

〔調製の実施例３３：４−カルボキシ−（α−メチル）メテニルオキシベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物３８）および４−カルボキシ−（α−メチル）メテニルオキシベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（α型）（化合物３９）の調製〕

調製の実施例３２で得られた化合物をアルカリ性加水分解させ、二つの白い無定形固体の化合物３８、３９を得た。
＜元素分析（Ｃ₂₅Ｈ₃₄Ｏ₈）＞
（計算値）Ｃ：６４．９２、Ｈ：７．４１。

（実際の測定値）（β型）Ｃ：６４．７２、Ｈ：７．６７；（α型）Ｃ：６４．５６、Ｈ：７．７５。
〔調製の実施例３４：４−ｏ−メトキシフェノキシカルボニル−（α−メチル）メテニルオキシベンジル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物４０）の調製〕

調製の実施例３３で得られた前記β型化合物３８に対して、カルボキシ基の芳香族エステル化を行ない、無色油状の化合物４０を得た。
＜元素分析（Ｃ₃₂Ｈ₄₀Ｏ₉）＞
（計算値）Ｃ：６７．５９、Ｈ：７．０９。

（実際の測定値）Ｃ：６７．５５、Ｈ：７．２１。
〔調製の実施例３５：４−エトキシカルボニル−（α−メチル）メテニルオキシ（α−メチル）ベンジル-ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（化合物４１）および４−
エトキシカルボニル−（α−メチル）メテニルオキシ（α−メチル）ベンジル−１１−α−メチルジヒドロアルテミシニンエーテル（化合物４２）の調製〕

ジヒドロアルテミシニンと２−［４−（α−メチル）ヒドロキシメチルフェノキシ］プロピオン酸エチルとを縮合させ、通常の処理した後シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、二つの無色油状の化合物４１、４２を得た。

＜元素分析（Ｃ₂₈Ｈ₄₀Ｏ₈）＞
（計算値）Ｃ：６６．６５、Ｈ：７．９９。
（実際の測定値）（１１−β型）Ｃ：６６．６０、Ｈ：７．８８；（１１−α型）Ｃ：６６．７７、Ｈ：８．１１。

〔調製の実施例３６：４−エトキシカルボニルメトキシフェニル-ジヒドロアルテミシ
ニンエーテル（β型）（化合物４３）の調製〕

４−カルボキシメトキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテルに対してエチルエステル化を行い、白い無定形固体の化合物４３を得た。
＜元素分析（Ｃ₂₅Ｈ₃₄Ｏ₈）＞
（計算値）Ｃ：６４．９２、Ｈ：７．４１。

（実際の測定値）Ｃ：６４．６２、Ｈ：７．４０。
〔調製の実施例３７：４−カルボキシ（α−メチル）メテニルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）の錠剤の調製〕
処方は以下の通りであり、各成分の含有量は重量パーセントで示す。

４−カルボキシ（α−メチル）メテニルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）３５％、デンプン２５％、微晶質セルロース３０％、デンプングリコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｓｔａｒｃｈ）３％、デンプンペースト（１０％）６％、およびステアリン酸マグネシウム１％。

活性成分を粉砕させ、１００メッシュで篩分けてから微晶質セルロース、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムと混合させた後、１０％デンプンペーストを適当に入れ、柔らかい材料を製造した。２０メッシュの篩（２０ｍｅｓｈｓｉｅｖｅ）により顆粒を製造し、６０℃で乾燥したあと整粒し、潤滑剤としてステアリン酸マグネシウムを添加し、均質に混ぜてからプレボーミングして調製した。

〔調製の実施例３８：３−コハク酸モノアシルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）の錠剤の調製〕
処方は以下の通りであり、各成分の含有量は重量パーセントで示す。

３−コハク酸モノアシルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル(β型)３０％、微晶質セルロース６５％、クロスリンクポリビドン（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄｐｏｌｙｖｉｄｏｎｅ）１．５％、微粉化のポリエチレングリコール４０００３％、および微粉のシリカゲル０．５％。

活性成分を粉砕させ、１００メッシュで篩分けた後、充填剤である微結晶セルロース、
崩解剤であるクロスリンクポリビドン、潤滑剤である微粉化のポリエチレングリコール４０００、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）である微粉のシリカゲルと混合させた後、直接にプレボーミングして調製した。

〔調製の実施例３９：４−（２−メトキシフェノキシ）カルボニル（α−メチル）メテニルオキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル塩の腸溶性錠剤の調製〕
処方は以下の通りであり、各成分の含有量は重量パーセントで示す。

４−（２−メトキシフェノキシ）カルボニル（α−メチル）メテニルオキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル３５％、アルファ化デンプン（ｐｒｅｇｅｌａｔｉｎｉｚｅｄｓｔａｒｃｈ）２０％、微晶質セルロース３５％、クロスリンクカルボキシメチルセルロースナトリウム４％、ポリビドン水溶液（８％）４％、および滑石粉２％。

活性成分を粉砕させ、１００メッシュで篩分けてから微晶質セルロース、アルファ化デンプン、クロスリンクカルボキシメチルセルロースナトリウムと混合させた後、８％のポリビドン水溶液を適当に入れ、柔らかい材料を製造し、２０メッシュの篩により顆粒を製造し、６０℃で乾燥したあと整粒し、潤滑剤として滑石粉を添加し、均質に混ぜてからプレボーミングにより錠剤の芯を得た。

次に、錠剤の芯に対して３％のヒドロキシプロピルメチルセルロース（Ｅ５）グリコールを使用し、重量が８％増えるように隔離の膜で包んだ。なお、更にＥｕｄｒａｇｉｔＬ３０Ｄで重量が１０％増えるように腸溶性の膜（ｅｎｔｅｒｉｃｃｏａｔｉｎｇ）で包んでも良い。

〔調製の実施例４０：４−メトキシカルボニルメチルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）の硬いカプセルの調製〕
処方は以下の通りであり、各成分の含有量は重量パーセントで示す。

４−メトキシカルボニルメチルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）５０％、アルファ化デンプン４０％、滑石粉９％、および微粉のシリカゲル１％。
活性成分と補助材料とを十分に混ぜ合わせて、空のカプセルに入れることにより調製した。

〔調製の実施例４１：４−エトキシカルボニルメトキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）の柔らかいカプセルの調製〕
処方は以下の通りであり、各成分の含有量は重量パーセントで示す。

４−エトキシカルボニルメトキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）４５％、ポリエチレングリコール４００−１０００３０％、および懸濁化剤（１０〜３０％油とワックスとの混合物）２５％。

活性成分を研磨させ篩分けた後、他の成分を添加して十分に混ぜ、丸薬機で柔らかいカプセルに調製した。
〔調製の実施例４２：４−メトキシカルボニル（α−メチル）メテニルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）のゲル剤の調製〕
処方は以下の通りであり、各成分の含有量は重量パーセントで示す。

４−メトキシカルボニル（α−メチル）メテニルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）５％、架橋型ポリアクリル酸ナトリウム２％、ポリエチレングリコール４０００８％、グリセリン１０％、臭化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ
ｂｒｏｍｉｄｅ）１％、および水７４％。

ポリエチレングリコール４０００、グリセリンを加熱して溶解した後、研磨し篩分けられた活性成分を添加して均質になるように混ぜ合わせた。さらに、架橋型ポリアクリル酸ナトリウムの中に適量の水（６０℃）を添加し、十分の撹拌により均質にした後、基質、活性成分、ポリエチレングリコール４０００とグリセリンを均質になるように混合させ、十分の量まで水を添加して得た。

〔調製の実施例４３：３−（２−メトキシフェノキシ）カルボニル（α−メチル）メテニルオキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテルの坐剤の調製〕
処方は以下の通りであり、各成分の含有量は重量パーセントで示す。

３−（２−メトキシフェノキシ）カルボニル（α−メチル）メテニルオキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル１５％、およびポリオキシエチレン（４０）モノステアレート８５％。

活性成分を研磨させて篩分けた後、先に少量の溶解した基質を添加し、十分に研磨して混ぜた後、更に他の溶解した基質と混ぜ、保温したまま坐剤の膜に注入することにより調製した。

〔調製の実施例４４：４−エトキシカルボニルメチルアミノカルボニルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテルのクリーム剤の調製〕
処方は以下の通りであり、各成分の含有量は重量パーセントで示す。

４−エトキシカルボニルメチルアミノカルボニルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル２．５％、モノステアリン酸グリセリン８．５％、ステアリン酸１５％、白色ワセリン１０％、グリセリン８％、トウィーン−８０３％、および水５３％。

活性成分を少量のアセトンに溶解させ、モノステアリン酸グリセリン、ステアリン酸、白色ワセリンを添加して加熱しながら融解させ、８０℃で保温した。また、トウィーン−８０、グリセリンと水を８０℃まで加熱させた後前記油相の中へゆっくり入れ、白い色の細かいクリームになるまでに同じ方向で撹拌し続けることにより得た。

〔調製の実施例４５：４−（ジメチルアミノエトキシカルボニルメトキシ）フェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル(β型)の貼付剤の調製〕
処方は以下の通りであり、各成分の含有量は重量パーセントで示す。

４−（ジメチルアミノエトキシカルボニルメトキシ）フェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル(β型)１５％、アクリル酸樹脂５５％、セバシン酸ジブチル２５％およびアセトン５％。

基質としてアクリル酸樹脂を用い、可塑剤として処方量のセバシン酸ジブチル、溶剤として適量のアセトンを添加し、それを均質になるように混合させた。更にアセトンに分散した活性成分を添加し、微熱の条件で撹拌して透明の溶液になった後、それを均質に基材又は粘着防止層に塗布させ、６０℃で乾燥した後、投与量により分割させて調製した。

≪実験の実施例≫
本発明者は以下のような方法を用い、本発明のアルテミシニン誘導体について体外と体内における免疫抑制活性のスクリーニング及び研究を行った（参照：「現代薬理実験方法」、張均田編集、北京医科大学／中国協和医科大学聯合出版社、１９９８年出版）。

＜実験材料＞
（実験動物）純粋種Ｂａｌｂ／ｃとＣ５７ＢＬ／６とのオスのマウス、６〜８週齢。
ＲＰＭＩ−１６４０培養液（Ｇｉｂｃｏから購入し、ｐＨ７．２）の中に１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジニルエタンスルホン酸（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ））、及び５０μＭの２−ＭＥ（２−メルカプトエタノール（２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ））を添加した。

（イリタント）植物レクチン（ＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ；ＣｏｎＡ）、細菌リポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａＣｏｌｉ０５５：Ｂ５由来）、使う前にＲＰＭＩ−１６４０培養液で適当な濃度まで希釈した。

＜実験方法＞
Ａ：リンパ球の毒性実験
（１）頚椎脱臼法でＢａｌｂ／ｃマウスを死亡させ、無菌状態でその脾臓を取り出し、研磨して単細胞の懸濁液に調製した。ＭＴＴ溶解液（１０％ＳＤＳ、５０％ジメチルホルムアミド、ｐＨ７．２）を用いて赤血球を取り除いた後、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培養液でその細胞濃度を５×１０⁶／ｍＬになるように調製した。

（２）９６穴の培養プレートに８０μＬの細胞懸濁液、４０μＬのサンプル、４０μＬの１０％ＦＢＳ含有培養液を添加した。対照の穴に８０μＬの培養液を添加し、合計体積を１６０μＬにし、且つ空白の対照を設定した。

（３）３７℃、５％ＣＯ₂の培養器に入れて４８時間培養した。培養終了前の６〜７時
間の際に、１穴当り１６μＬのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）を添加した。
（４）培養が終わった時に、１穴当り８０μＬのＭＴＴ溶解液（１０％ＳＤＳ、５０％ジメチルホルムアミド、ｐＨ７．２）を添加し、さらに、培養器の中に６〜７時間放置した後、酵素標識キットを用いて５７０ｎｍにおけるＯＤ₅₇₀値を測定した。

Ｂ：リンパ球の増殖実験
（１）頚椎脱臼法でマウスを死亡させ、無菌状態でその脾臓を取り出して単細胞の懸濁液に調製した。１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培養液でその細胞濃度を４×１０⁶／ｍＬになるように調製した。

（２）９６穴の培養プレートに１００μＬの細胞懸濁液、５０μＬのサンプル溶液、５０μＬのＣｏｎＡ（植物レクチン、ＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ）又はＬＰＳ（細菌リポ多糖、ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を添加した。対照の穴に５０μＬの１０％ＦＢＳ含有培養液を添加し、合計体積を２００μＬになるようにした。

（３）３７℃、５％ＣＯ₂の培養器で４８時間培養した。培養終了前の７〜８時間の際
に、１穴当り０．５μＣｉ［³Ｈ］−チミジン（２５μＬ／穴）を添加した。
（４）培養が終わった後、細胞収集器（ＨＡＲＶＥＳＴＥＲ９６（Ｒ）、ＴＯＭＴＥＣ）を用い細胞をガラス繊維膜上に収集し、シンチ液を添加した。液体シンチカウンタ（ＭｉｃｒｏＢｅｔａＴｒｉｌｕｘ（Ｒ）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用い、細胞増殖の状況を反映するために細胞ＤＮＡ中の［³Ｈ］−チミジンの混合量を測定した。

Ｃ：同種異体の混合リンパ球の増殖反応（ＭＬＲ）
（１）頚椎脱臼法でＣ５７ＢＬ／６及びＢａｌｂ／ｃのマウスを死亡させ、無菌状態でその脾臓を取り出し、研磨して単細胞の懸濁液に調製した。赤血球を取り除いた後、１０％仔牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培養液でその細胞濃度を４×１０⁶／ｍＬになるように調製した。

（２）Ｃ５７ＢＬ／６の脾臓細胞を反応細胞として、またＢａｌｂ／ｃの脾臓細胞（コバルト６０により照射、３０００ｒａｄｓ）を刺激細胞として、二種類の細胞を同じ体積で混合させた。

（３）９６穴の培養プレートに１００μＬの細胞懸濁液、１００μＬのサンプルを添加した。対照の穴に１００μＬの１０％血清含有培養液を添加し、且つ二種類の細胞の単独培養を対照として行った。

（４）３７℃、５％ＣＯ₂の培養器で３、４又は５日間培養した。培養終了前の１日時
点で、³Ｈの希釈液２５μＬ（即ち、３．８×１０¹⁰Ｂｑの［³Ｈ］−チミジン）を添加した。

（５）培養が終わった時、培養プレートを−２０℃の冷蔵庫に冷凍させた。
（６）細胞収集器（ＨＡＲＶＥＳＴＥＲ９６（Ｒ）、ＴＯＭＴＥＣ）を用い細胞をガラス繊維膜上に収集した。また、液体シンチカウンタ（ＭｉｃｒｏＢｅｔａＴｒｉｌｕｘ（Ｒ）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用い、細胞増殖の状況を反映するために細胞ＤＮＡ中の［³Ｈ］−チミジンの混合量を測定した。

Ｄ：細胞因子が生じた誘導及び測定
（１）頚椎脱臼法でマウスを死亡させ、無菌状態でその脾臓を取り出し、研磨して単細胞の懸濁液に調製した。赤血球を取り除いた後、１０％仔牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培養液でその細胞濃度を５×１０⁶／ｍＬになるように調製した。

（２）２４穴の培養プレートに１ｍＬの細胞懸濁液、サンプル及びＣｏｎＡ（最終濃度は５μｇ／ｍＬである）又はＳａｃ（ブドウ球菌Ａタンパク質を含む菌体、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）（最終濃度は０．０１％である）をそれぞれ０．５ｍＬ添加した。対照の穴に０．５ｍＬの１０％仔牛血清含有培養液を添加し、総体積を２ｍＬにした。

（３）３７℃、５％ＣＯ₂の培養器で２４又は４８時間培養した後、その培養した上澄
み液を収集し、−２０℃の冷蔵庫に冷凍し、細胞因子の測定前の準備を完了した。
（４）二抗体サンドイッチの酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）で細胞因子の生成の測定を行い、ＴＭＢを酵素反応基質として４５０ｎＭで吸光度ＯＤを測定した。標準検量線によりサンプルの細胞因子の生成量を換算した。

Ｅ：遅延型過敏反応の動物モデル（ＤＴＨ）
（１）０日目に、Ｂａｌｂ／ｃマウス（メス、６〜８週齢）のうしろ足当りを２０μＬの０．５％ＤＮＦＢ（２，４−ジニトロフルオロベンゼン（２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ））により、アレルギー化させた。次の日にアレルギー化を強化させた（ＤＮＦＢが油剤（アセトン：オリーブ油＝４：１）の中に溶けている）。

（２）７〜９日目に、マウス左耳の内外両側はそれぞれ１０μＬの０．４％ＤＮＦＢで攻撃された。
（３）攻撃の１時間前に一回腹腔注射又は胃灌流をした。１２時間後再び一回投薬した
。

（４）攻撃後の２４〜４８時間に各指標を測定した。
注意点：Ｂａｌｂ／ｃマウス（メス、６〜８週齢）で、感作物質（ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇａｇｅｎｔ）の濃度は０．７％で、攻撃剤の濃度は０．６％である。

Ｆ：マウスＢ細胞抗羊赤血球の特異性抗体の生成
（１）新鮮の羊赤血球（ＳＲＢＳ、ｓｈｅｅｐｒｅｄｂｌｏｏｄｃｅｌｌｓ）をｐＨ７．２、ＰＢＳにより三回洗浄し、１：２０で希釈した。

（２）新鮮なモルモット血清を１：１０で希釈した。
（３）２×１０⁷／ｍＬマウス脾臓の細胞懸濁液を調製した。
（４）三者をそれぞれ１ｍＬ取り混ぜて、３７℃、１．５時間、２５００ｒｐｍ×１５分間で遠心分離し、その上澄み液を取り、５２０ｎＭでそのＯＤ値を測定した。

Ｂａｌｂ／ｃマウスは投与された後三日目にアレルギー化された。羊赤血球を生理食塩水で三回洗浄し、ＳＲＢＣを５％に希釈した。マウス当りに０．２ｍＬの腹腔注射を行い、アレルギー化された後六日目に解剖し脾臓細胞を取り、その抗体の生成量を測定した。

Ｇ：ラットのアジュバンド関節炎のモデル
６０匹オスのＳＤラットを無作為に５組に分け、不活性化されたＢＣＧを滅菌の液体パラフィン油で１０ｇ／Ｌになるように調製し、また均質になるまで振盪させ、ラットの左後ろ足のマット内に０．１ｍＬの皮内注射をした。注射した後２８日間観察し続き、注射した側と異なる側の続発性足腫脹を関節炎発生の徴候とした。１２日目から四日間置きに排水法を用いて足関節以下の足の体積を測定した同時に、多発性関節炎病変の程度について以下の標準に基づき採点を行った。即ち、０：腫脹なし；１：小さい足指関節がすこし腫脹すること；２：足指関節及び足指が腫脹すること；３：足関節以下の足指が腫脹すること；４：足関節を含むすべての足指が腫脹すると設定した。ラット当りの最大採点は１６であった。免疫の二日前から腹腔注射で投与し、ずっと免疫後の２８日目まで続いた。薬物がラットのアジュバンド関節炎のモデルに対する誘発及び予防治療を観察した。
実験により本発明の実施例で調製された化合物のリンパ球毒性が低く、ある物質は対照物質であるアルテミシニンとアルテスネイトの毒性より低いことが確認された。同時にこれらの化合物は、Ｔリンパ球とＢリンパ球とがマイトゲン（ｍｉｔｏｇｅｎ）の誘発により発生した増殖反応を著しく抑制することができた。表１の中には、幾つかの化合物の半数リンパ球毒性値（ＣＣ₅₀、その数値が大きいほど毒性が低い）、及びＣｏｎＡが誘導したＴリンパ球増殖反応とＬＰＳが誘導したＢリンパ球増殖反応とを抑制する半数抑制活性濃度（ＩＣ₅₀、その数値が小さいほど抑制活性が強い）が示された。この結果から、幾つかの化合物の免疫抑制活性は対照物質であるアルテミシニンとアルテスネイトより良いことが確認された。具体的な実験結果は以下の表１に示す通りである。

いくつかの化合物は体内投与（腹腔からの投与）された後に、ジニトロフルオロベンゼンにより誘発されたマウス耳の腫脹反応及び羊赤血球によりマウスの特異性抗羊赤血球抗体の分泌を著しく抑制していた。これらの化合物は体内の実験システムにおいて、優れた免疫抑制活性を持つことを示している。

例えば、調製の実施例３で調製された３−コハク酸モノアシルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル（β型）（ＳＭ７３５）について薬理学実験を行なった。図１のＡに示すように、ＭＴＴ方法を用い、ＳＭ７３５とＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞を共に４８時間培養した後の細胞毒性を測定し、ＣＣ₅₀は５３．１±７．８μＭであった。図１のＢに示すように、ＳＭ７３５は、ＣｏｎＡが誘導した脾臓細胞の４８時間増殖反応を抑制し、ＩＣ₅₀は０．３３±０．０６μＭであった。図１のＣに示すように、ＳＭ７３５は、ＬＰＳが誘導した脾臓細胞の４８時間増殖反応を抑制し、ＩＣ₅₀は０．２７±０．０２μＭであった。図１のＤに示すように、ＳＭ７３５は一方向混合リンパ球反応を抑制し、ＩＣ₅₀は０．８６±０．１８μＭであった。マイトマイシンＣで不活性化されたＢａｌｂ／ｃマウス脾臓細胞とＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞を共に９６時間培養し、ＳＭ７３５を添加した。三回の異なる実験は同じ結果を示した。なお、全てのデータは平均値±標準誤差
である。データを数化処理してからＯｒｉｇｉｎ（Ｒ）統計プログラムで計算を行なった。相関係数は、（Ａ）Ｒ²＝０．９６０、（Ｂ）Ｒ²＝０．９９３、（Ｃ）Ｒ²＝０．９９
７、（Ｄ）Ｒ²＝０．９８４である。図２に示すように、Ｂａｌｂ／ｃマウスは、実験の
開始日と１日目に、２，４−ジニトロフルオロベンゼンによりアレルギー化させ、９日目に攻撃を行なった。実験の７〜１０日目に溶剤の対照としてシクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）ＡとＳＭ７３５とを連続的に４日間投与した。攻撃から４８時間経って耳の片を取り、耳の腫脹程度を測定した。即ち左耳片の体積（ＤＮＦＢ処理）マイナス右耳片の体積（処理しない）である。データは平均値±標準誤差であり、^*Ｐ＜０．０５、^**
Ｐ＜０．０１、
Ｎ＝１０マウス／組であった。三回の独立の実験は同じ結果を示している。図３に示すように、羊赤血球でＢａｌｂ／ｃマウスを免疫し、マウスＢリンパ球が抗体を生成する能力を測定した。なお、１グループ当り（６匹）のマウスにはそれぞれ溶剤の対照を与え、即ち２５ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド又はＳＭ７３５を連続的に４日間投与した。マウス脾臓の細胞懸濁液と羊赤血球とモルモットの補体は３７℃で半時間培養された。Ｂリンパ球が抗体を生成する能力を反映するために、５２０ｎｍの波長で培養された上澄み液の吸光度を測定した。データは平均値±標準誤差であり、^*Ｐ＜０．０５、^**Ｐ＜０．０１
（ｄｏｕｂｌｅｄ−ｔａｉｌｅｄＳｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔ）であった。

実験の結果から、３−コハク酸モノアシルフェニル-ジヒドロアルテミシニンエーテル
（β型）（ＳＭ７３５）は以下の体内外免疫抑制活性を持つことが明らかになった。
（ｉ）非特異性リンパ球の毒性が非常に低く、ＣＣ₅₀（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ５０％、半数細胞の毒性濃度）は５３．１±７．８μＭ又は２７μｇ／ｍＬである（図１Ａ）。

（ｉｉ）ＣｏｎＡが誘導したＴ細胞の増殖反応を強く抑制し、ＩＣ₅₀（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、半数抑制濃度）は０．３３±０．０６μＭ又は０．１３μｇ／ｍＬである（図１Ｂ）。

（ｉｉｉ）ＬＰＳが誘導したＢ細胞の増殖反応を強く抑制し、ＩＣ₅₀は０．２７±０．０２μＭ又は０．１２μｇ／ｍＬである（図１Ｃ）。
（ｉｖ）同種異体の混合リンパ球の培養により増殖反応を強く抑制し、ＩＣ₅₀は０．８６±０．１８μＭ又は２．１μｇ／ｍＬである（図１Ｄ）。

（ｖ）リンパ球を活性化した時に細胞因子の分泌に対し抑制作用があり、ＰＭＡで刺激した時にＴＮＦ−α、特にＩＬ−６の生成を著しく抑制し、また投与量に依存し、ＩＦＮ−γとＩＬ−１２との二つ主なＴｈ１型Ｔ細胞分化促進因子の生成に対して抑制効果がある（結果を表２に示す）。

（ｖｉ）体内投与でマウスＢ細胞（抗体形成細胞）の抗体と補体との生成を抑制する（図２）。
（ｖｉｉ）ＤＮＦＢが誘導したＤＴＨ反応を抑制することができる（図３）。

（ｖｉｉｉ）ラットのアジュバンド関節炎のモデルにおいて予防治療の効果がある（図４）。

備考：刺激物とＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞を共に２４時間培養した。培養上澄み液をＥＬＩＳＡ法でその細胞因子の生成を測定した。データは平均値±標準誤差であり、^*
Ｐ＜０．０５、^**Ｐ＜０．０１（ｄｏｕｂｌｅｄ−ｔａｉｌｅｄＳｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔ）であった。

図１は、本発明に係る化合物が非特異性リンパ球の毒性に影響を与えること、ＣｏｎＡに誘導されたＴ細胞の増殖反応の作用を抑制すること、ＬＰＳに誘導されたＢ細胞の増殖反応の作用を抑制すること、及び同種異体リンパ球混合培養により増殖反応の作用を抑制することを示した図である。図２は、本発明に係る化合物が体内投与によりマウスＢ細胞（抗体形成細胞）の抗体と補体との発生を抑制することを示した図である。図３は、本発明に係る化合物がＤＮＦＢに誘導されたＤＴＨ反応を抑制することを示した図である。図４は、本発明に係る化合物がラットのアジュバンド関節炎の動物モデルにおいて一定の予防と治療作用を持つことを示した図である。

Claims

４−メトキシカルボニルメチルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル、４−カルボキシメチルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル、４−エトキシカルボニルメトキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル、３−コハク酸モノアシルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル、４−エトキシカルボニルメチルアミノカルボニルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル、４−メトキシカルボニル（α−メチル）メテニルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル、４−ｏ−メトキシフェノキシカルボニル（α−メチル）メテニルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル、４−エトキシカルボニル（α−メチル）メテニルオキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル、４−カルボキシ（α−メチル）メテニルオキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル、４−ｏ−メトキシフェノキシカルボニル−（α−メチル）メテニルオキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル、３−ｏ−メトキシフェノキシカルボニル−（α−メチル）メテニルオキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテル又は４−カルボキシ−（α−メチル）メテニルフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテルあるいは３−エトキシカルボニル−（α−メチル）メテニルオキシフェニル−ジヒドロアルテミシニンエーテルから選択されることを特徴とするアルテミシニン誘導体。
アルテミシニン誘導体の調製方法であって、
１）構造式ＩＩで表されるジヒドロアルテミシニン又は構造式ＩＩＩで表されるアセチルジヒドロアルテミシニンを原料として、酸触媒の条件でカルボキシレートを含むフェノール又はグリコールと反応させ、相応のジヒドロアルテミシニンのエーテル類産物を得る工程と、

２)次に、ジヒドロアルテミシニンのエーテル類産物を加水分解させ、遊離酸状態の中間産物を得る工程と、
３)前記工程２)の遊離酸状態の中間産物を最終産物に調製する工程；
または、当該方法は：
１)酸触媒の条件で、上記構造式ＩＩで表されるジヒドロアルテミシニン又は上記構造式ＩＩＩで表されるアセチルジヒドロアルテミシニンを、ビスフェノールと反応させ、下記構造式ＩＶで表される化合物を得る工程と、
２)次に、前記構造式ＩＶで表される化合物を修飾し、最終産物を生成する工程；
からなる請求項１に記載のアルテミシニン誘導体の調製方法。
安全、有効な投与量範囲内の請求項1に記載のアルテミシニン誘導体及び薬学上受容可能なキャリアを含むことを特徴とする、免疫系疾患の治療又は予防に応用するための薬物組成物。
前記薬物組成物は、１〜８５重量％の請求項1に記載のアルテミシニン誘導体、１５〜９９重量％の賦形剤、０〜６０重量％の他の通常の補助原料を含むことを特徴とする請求項３に記載の薬物組成物。
上記薬物組成物は、経口、経胃腸管外投与、経鼻、舌下投与、点眼、吸入又は経直腸投与で投与する剤形に調製されることを特徴とする請求項３に記載の薬物組成物。
上記剤形は錠剤、腸溶性丸、舌下錠剤、貼付剤、坐薬、クリーム剤、軟膏剤又は皮膚用ゲル剤であることを特徴とする請求項５に記載の薬物組成物。
請求項１に記載のアルテミシニン誘導体の免疫系疾患の治療又は予防に用いる薬物の調製への応用。
請求項３に記載の薬物組成物の免疫系疾患の治療又は予防に用いる薬物の調製への応用。