WO1999059567A1

WO1999059567A1 - Inhibition de la production d'iga

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Publication number: WO1999059567A1
Application number: PCT/JP1999/002414
Authority: WO
Inventors: Kazutoh Takesako; Hideharu Saito; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority date: 1998-05-15
Filing date: 1999-05-11
Publication date: 1999-11-25
Also published as: AU3728699A; EP1080723A4; CN1301153A; EP1080723A1; US6294581B1; US20010049392A1; DE69924105T2; EP1080723B1; KR100569082B1; DE69924105D1; KR20010041348A; CN1170529C; ATE290374T1

Description

明細書 I g A産生の抑制発明の分野

本発明は、 I g A産生の抑制、さらに詳しくは、ヒトおよび動物における過剰な I g A抗体産生が原因で進行する免疫疾患の予防および治療のための I gA産生の選択的抑制に関する。従来の技術

抗体およびこれと構造上、機能上の関連をもつタンパク質である免疫グロブリンは、機能上の性質により 5つのクラス（I gA、 I gD、 I gE、 I gM、 I gG) に分類される。その中の I gAには、血清型 I gAと分泌型 I gAの 2つのサブクラス（I gAlと I gA2) が存在する。 I g A 1の L鎖は共有結合で H鎖と結合しており、一方、 I g A2の L鎖は S— S結合により、 H鎖に結合する代りに、 L鎖同士が結合している。 I gAlはすべての血清型 I gAの 90% を占めているが、分泌型 I gAでは I g A2が全体の 60%を占めている。

I g Aの産生部位は、消化管粘膜固有層等の粘膜下プラズマ細胞や、唾液腺、乳腺中に存在している。ヒト消化管粘膜固有層では、 I g A産生細胞が約 20 ： 1で I gG産生細胞数を圧しており、 1 : 3 (I g A： I gG) の割合のリンパ節や脾臓とは対照的である。粘液分泌物中に見られる I g Aは 1本の J鎖成分をもつ二量体として作られており、血清型 I g Aでは少量しか見られない分泌片

(SC ： secretory piece) を付随している。これは腸や気道の粘膜下にあるプラズマ細胞から粘液分泌液中に出てくる間に二量体 I g A分子に加えられる。上記抗体の生体における産生はある種の抗原刺激により誘導される。例えば、腸内細菌の一つであるビフィドバクテリゥム ·ロンガム（Bifidobacterium longum)のある株は、経口投与により糞便中の総 I g A量を増加させることが報告されている。

また、抗体産生系の細胞を非特異的に刺激して抗原をより有効に処理できるようにする能力を備えた物質があり、この性質はしばしばアジュバントと呼ばれている。例えば、ビブリオ · コレラ（Vibrio cholerae)の産生する下痢症の原因毒素であるコレラトキシンは、小腸粘膜に作用し、そのイオン透過性を変えるため、多量の電解質および水が小腸から排出され下痢症状を弓 Iき起こすことが知られているが、その毒素の本体を除いた無毒成分であるコレラトキシン Bサブュニットは、小腸粘膜内に浸透して I g A抗体の産生を促す免疫応答（I g A誘導能）があり、アジュバントとして作用することが知られている。

ヒトにおいて血清中のィムノグロブリン（Immunoglobulin : I g ) の約 6 5 % を占める I g Gはほとんどすべての抗原に対する免疫抗体を含み全身的な防御免疫に重要な役割を果たしているのに対し、 I g Aは局所免疫反応に重要な役割を果す。粘液分泌液中の分泌型 I g Aは、強力な病原性をもつ微生物やアレルゲンの粘膜への結合を阻害し、したがって、感染を防いでいるだけでなく、アレルゲンとして作用し得る食物の成分と結合し、消化管壁を通らないようにしている。例えば、微生物菌体より菌体外毒素が分泌された場合、抗体による生体防御は微生物表面に結合した抗体の直接作用に依存している。このように、抗体は直接微生物に結合することによって種々の効果を表すことができる。

しかし、この I g Aが生体に対し病理的に作用することも知られている。例えば、 I g A腎症（I g A nephropathy) は抗原に対する I g Aの過剰な免疫反応が原因となって進行する免疫疾患であって、 I g Aを主体とする免疫複合体が腎臓の糸球体へ沈着することにより発症する疾患であり、長期間に亙る高 I g A抗体価が腎炎発症の原因であると考えられている。 I g A腎症患者の血中 I g A抗体価は健常人に比べてかなり高いが、免疫複合体の形成に関与している I g Aが非粘膜（脾臓、骨髄、末梢血等）由来の血清型であるのかまたは粘膜（消化管、呼吸器等）由来の分泌型であるのかは明確になっていない。

該免疫反応の原因は上気道や消化管を中心とする抗原刺激が疑われており、候補抗原としては食物（グルテン、牛乳、大豆など）、細菌 [へモフィルス 'パラインフルエンザェ（Haemophilus parainfluenzas) 等]、ウィルス（サイトメガロウイノレス（Cytomegalovirus) 、アデノウイノレス（Adenovirus) 、 E Bウイノレス（Epstein-Barr virus) } が挙げられている [富野康日己（Tomino, Y. ) 、バィォクリニ力（Bio. Clinica) 、第 1 2卷、第 6号、第 375〜 379頁（1 9 97) ]。例えば、 I g A腎症患者の糸球体内および血清中のへモフィルス ·ノ、° ラインフルエンザ（HP) の構成成分と I g A型抗 HP抗体の存在が証明された [スズキ S. (Suzuki, S. ) 、ナカトミ Y. (Nakatomi, Y. ) 、サトウ H. (Sato. H. ) ら、ジャーナルォブアレルギークリニカルィムノロジ一

(Journal of Allergy Clinical Immunology) 、 96 、第丄 152〜 1 16 0頁（1995) ]。

このように I g A腎症の成因ならびに進展の機序の仮説は立てられているが、未だ不明な点が多いため、 I g A腎症に対する特異的な治療は現在のところ無く、減塩や減タンパク食といった食事療法、薬物療法としては糸球体での血液凝固を抑制するための抗血小板薬、血圧上昇を抑制するためのアンジォテンシン転換酵素阻害薬やカルシウム拮抗薬、副腎皮質ステロイド薬が使用されている [堺秀人（Sakai, H.) 、バイオクリニ力、第 16卷、第 372〜 374頁（1 99 7) ]。

現在では、いくつかの免疫抑制剤の非経口投与での効果も検討されているが、これらの多くは I g Aの過剰な生産の抑制のみならず、同時に全身的な免疫機構の抑制、例えば、 I gG産生や細胞性免疫等を抑制するために、重大な副作用を生じる危険性が高く、未だ臨床的に広く使用されるに至っていない。

免疫抑制剤としては、式 1 ：

Gu- (CH₂ ) ₆ -CONHCH (OH) CONH (CH₂ ) ₄ NH

(CH₂) — NH₂

[式中 Guはグァニジノ基を示す]で表される 1 5—デォキシスパガリン（1 5 -deoxyspergualin, 以下、 DSGと称す）が挙げられる。 DSGは腎移殖の際に免疫抑制剤として注射剤の形で臨床的に使用されている。

また、特開平 8— 40887号、特開平 5— 238932号、ォゥクボ M. ら [Okubo, M.ら、ネフロン（N印 hron) 、第 60巻、第336〜341頁（1 9 92) ]、マキノ M. ら [Makino, M.ら、ィムノファーマコロジー

(Immunopharmacology) 、第 14卷、第 107〜： 1 14頁（1987) ]、井上慶一ら [Inoue, K.ら、第 30回日本腎臓学会総会要旨集（Proceedings Japanese Society Nephrology 30th Annual Meeting) 、第 19 1頁（1987) ] により非経口投与による D S Gの抗体産生抑制効果が報告されているが、産生抑制を確認した抗体種は I g E、 I g G、 I g M等であり、 D S Gが I g Aを選択的に抑制することは報告されていない。

一方、 DSGの経口剤としての使用は特許第 26 10621号、特開平 8— 4

0887号各公報などに記載されているが、特定のクラスの抗体を選択的に抑制することは開示されていない。発明の目的

本発明の主な目的は、ヒトおよび動物における過剰な I g A抗体産生が原因で進行する免疫疾患に対する予防および治療に有用な新規手段を提供することにある。

本発明の他の目的および利点を以下の説明で明らかにする。発明の概要

本発明者らは、抗原刺激により粘膜組織において I g Aを産生するようになつた動物実験モデルを用いて、経口投与した DSGが分泌型の I g A、さらには血清型 I g Aの産生を抑制する効果を有することを確認した。さらに驚くべきことに、静脈内投与を始めとする DSGの非経口投与の際に見られる、強い全身的免疫抑制効果、例えば、 I g A産生抑制効果と同レベルの有意な I gG産生抑制作用等が観察されないことが明らかになった。また、 I g A産生が亢進している動物における DSGの経口投与は、 DSGの抗体産生抑制作用において I gAが優先的に抑制されることを明らかにした。

力べして、本発明においては、 I g A抗体産生を選択的に抑制する必要がある疾患に対して使用される DSGまたはそれらの薬理学的に許容される塩を、従来よりも生体に対して安全な経口投与により投与するものである。

すなわち、本発明の 1つの態様は、 DSGまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する I g A産生を選択的に抑制するヒトまたは動物に対する経口投与用組成物である。また、本発明のもう 1つの態様は、 I g A産生を選択的に抑制するヒトまたは動物に対する経口投与用組成物の製造における D S Gまたはその薬理学的に許容される塩の使用である。

さらに、本発明のもう 1つ他の態様は、 I g A産生の選択的な抑制が必要なヒトまたは動物に D S Gまたはその薬理学的に許容される塩を経口投与することを特徴とするヒトまたは動物における I g A産生の選択的抑制方法である。

本発明によれば、経口摂取された抗原に対する免疫反応、特に I g A抗体産生が抑制され、全身的な免疫抑制作用はほとんど認められないか、弱く、 I gA産生の抑制作用は選択的である。そのため、本発明は、 I g A腎症をはじめとるす I g A関連免疫疾患の予防および治療に有用である。

ここに、 I g A産生の「選択的抑制」とは、 I g A抗体産生が有意に抑制され、 I g G抗体産生および/または遅延型過敏反応が有意に抑制されないことを意味する。発明の詳細な説明

本発明の I g A産生を選択的に抑制する経口投与用組成物の有効成分は、 DS Gのほか、薬理学的に許容される DSGの塩であってもよい。 DSGは酸と塩を形成するが、塩を形成するための酸は薬理学的に許容されるものであれば無機酸、有機酸のどちらでもよい。無機酸としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などが好ましい。有機酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、コノヽク酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、グノレタノレ酸、クェン酸、ベンゼンスノレホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンスノレホン酸、プロパンスルホン酸、ァスパラギン酸、グルタミン酸などが好ましい。

また、本発明においては、式 2 ：

G u-X₀-X j -A-X₂-CO-X₃

[式中 Guはグァニジノ基、 X。は (CH₂) ,_₆または置換基を有してもよいフェニレン基もしくは CH₂C₆H₄、 X は（CH₂) ₂_₇または CH=CH、 Aは CONHまたは NHCOを示す。 Aが CONHのとき、 X₂はひ一アミノ酸のひ —ァミノ基および α—カルボキシル基を除いた残基または ω—アミノ酸の ω—ァミノ基およびひ一カルボキシル基を除いた残基で、残基中に官能基を有していてもよい基を示す。なお、ひ一または ω—アミノ酸から誘導される残基において、光学活性炭素を有するものは、 L一、 D—および DL—型に特に限定されない。また、代表的な具体例としては、グリシン、 α—ヒドロキシグリシン、ひーメトキシグリシン、セリンなどのひ一アミノ酸のひ一アミノ基および α—カルボキシル基を除いた残基、ならびに ]3—ァラニン、 γ—ァミノ酪酸、 δ—アミノ吉草酸、 ί一アミノカプロン酸などのアミノ酸の ω—アミノ基およびひ一カルボキシル基を除いた残基などが挙げられる。 Αが NHCOのとき、 X₂は、単結合、 CH₂N H、 CH₂ Oまたは置換もしくは非置換低級アルキレン基を示す。低級アルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基などが挙げられ、その置換基としては、フッ素、塩素、臭素などのハロゲンや、メトキシ基、エトキシ基などの低級アルコキシ基や、水酸基が挙げられる。本明細書において、置換基における「低級」なる用語は、炭素数 1〜 6程度、好ましくは 1〜3程度を意味する。 X₃は NH— (CH₂) ₄— N (R₀₁) - (CH₂) ₃— NH— R。₂ (式中、 R_Q1は、水素または α—フエニルグリシンのカルボキシル基より水酸基を除いた残基、 R。₂は水素またはアミノ酸もしくはぺプチドのカルボキシル基より水酸基を除いた残基を示す）を示す]で表されるスパガリン関連化合物の 1つであって、 DSGと同様の I g A産生抑制作用を示すもの、またはその、上記のような薬理学的に許容される塩を用いてもよく、本明細書における「1 5—デォキシスパガリン（DSG) 」およびそれらの薬理学的に許容される塩にはこれらの式 2で表されるスパガリン関連化合物から選択された化合物およびその薬理学的に許容される塩も包含する。

なお、スパガリン関連化合物は、バチルス属の生産菌より単離されたスパガリンの誘導体で、誘導体の種類により抗腫瘍活性、免疫増強活性、免疫抑制活性のあることが知られている（特開昭 58— 621 52号、特開昭 61 - 1 29 1 1 9号、特開昭 64— 90164号）。また、式 1で表される D S Gの製造方法は、特公昭 6 1 - 23183号等の各公報に開示されている。

本発明の経口投与用組成物の有効成分である D S Gまたはその薬理学的に許容される塩は上記公知の方法またはそれに準じた方法で製造されたものでょレ、本発明の経口投与用組成物は、 D S Gまたはその薬理学的に許容される塩を単独または賦形剤あるいは担体と混合して、自体公知の方法により製斉 I」ィ匕される。なお、 D S Gは活性立体異性体であってもラセミ体であっても良い。

賦形剤および担体としては、薬理学的に許容されるものであれば、いずれでもよく、例えば、液状担体として水、アルコール類もしくは大豆油、ピーナッッ油、ゴマ油、ミネラル油などの動植物油または合成油が用いられる。固体担体としては、乳糖、マルトース、スクロースなどの糖類、アミノ酸類、ヒドロキシセル口ースなどのセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウムなどの有機酸塩、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、へパリン、ゼラチンなどが使用される。これらの固体担体または液状担体を用いて、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、液剤、ドライシロップ剤、マイクロスフエァ製剤などの経口投与用の剤形とすることができる。単一投与形の剤形が好ましい。

また、本発明における組成物には、 p H調製等の目的で、酸やアルカリまたは適量の緩衝剤を加えてもよい。

さらに、本発明の経口投与用糸且成物には、有効成分である D S Gまたはその薬理学的に許容される塩の経口吸収性を高めるために、ラウリン酸ナトリウム、グリココール酸等の界面活性剤や、 β一シクロデキストリンを添加することが望ましい。また、消化管粘膜からの取込みを促進させ、吸収性を高めるために、生分解性の乳酸重合体、乳酸ーグリコール酸共重合体等を用いてマイクロスフユア製剤にすることも望ましい。

本発明の経口投与用組成物中における D S Gまたはその薬理学的に許容される塩の含量は剤型により種々異なるが、通常、 0 . 1〜1 0 0重量％、好ましくは

；!〜 9 8重量％である。一般に、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤は 5〜： 1 0 0 重量％、好ましくは 2 5〜 9 8重量％の有効成分を含む。

本発明の I g Α産生の選択的抑制方法は、 I g A産生の選択的な抑制が必要なヒトまたは動物に I g A産生抑制有効量の D S Gまたはその薬理学的に許容される塩を経口投与する。

投与量は対象とするヒトまたは動物、例えば、ィヌ、ネコなどのペットや、家畜をはじめとする哺乳動物などの年齢、体重、症状、治療目的などにより決定されるが、治療量は経口投与で 0. 0 l〜5mg/kg ' 日、またはヒトの場合、成人 1人（体重 65 k gの場合）当りの 1 日の投与量が 3〜300mgとなるように投与するのが好ましい。さらに好ましくは少なくとも I g G産生を有意に抑制しない投与量で投与する。このように、本発明の経口投与用の組成物は少なくとも I gG産生を有意に抑制しない投与量においても I g A産生を有意に抑制する特徴がある。

特殊な環境で生育された実験動物、例えば、マウスでは免疫感作されておらず、 I g Aも産生されていない。そこで抗原を経口投与することにより粘膜免疫感作し、粘膜型 I g Aおよび血清型 I g Aを産生するようなった実験モデルを用いて本発明の経口投与用組成物の I g A産生の選択的な抑制効果が確認できる。一方、ヒトまたは家畜の場合、食物など経口的に摂取された異物抗原により既に粘膜免疫感作されており I g A産生状態にある。したがって、本発明の経口投与用組成物は実験モデルと同様、ヒトまたは家畜においても経口接種された抗原に対する粘膜型 I g Aおよび血清型 I g A産生の選択的な抑制効果を示す。

力べして、粘莫型 I g Aおよび Zまたは血清型 I g Aに起因する疾患として、例えば、 I g A腎症があり、本発明の経口剤は、 I g A腎症の治療に有用である。以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。以下の実施例において用いた DSGは、いずれも上記式 1で表されるものである。

実施例 1

経口投与された抗原に対する D S Gの分泌型 I g A産生抑制効果

経口投与した DSGの分泌型 I g A産生抑制作用の確認は、コレラトキシンを経口投与したマウスの糞中の抗コレラトキシン I g A抗体価を測定することにより確認した。

まず、コレラトキシン溶液および D S G溶液を調製した。コレラトキシン溶液は、コレラトキシン [シグマ（S I GMA) 社製]を 0· 2M NaHC0₃に 5 0 μ g Zm 1 となるよう溶解した。 D S G溶液は D S G (宝酒造社製凍結乾燥原末）を生理食塩水に 5mgZm 1および 1. 25 m g /m 1 となるよう溶解した。つぎに、各コレラトキシン溶液を 3群の C 57 B L/ 6マウス（7週令、雌、 1群 5匹）に、 0. 2m lずつ 2回（0日目および 7日目）経口投与した。以下実施例における日数は、コレラトキシンを最初に投与した日を 0日目として起算している。 3群のマウスにそれぞれ 5mgZm 1の DSG溶液、 1. 25mg/ m 1の DSG溶液または生理食塩水を 0. 2m l/回、 1日 1回ずつ 7日目より 1 1日目まで 5回経口投与した。各群の DSG経口投与量はそれぞれ 5 Omg/ k g、 12. 5mg/k g、 Omg/k gである。 7日目および 14日目に各群のマウスより糞を採取し、 Q. 1 gの糞中の抗体を 1 m 1のリン酸緩衝生理食塩水（PBS) で抽出した。以下、該抽出液を糞抗体抽出液と称す。なお、 7日目の糞は D S G投与前に採取した糞である。

糞抗体抽出液中の I g A抗体価は E L I S A法により測定した。 E L I S A法における固相は、 0. 2M N a HC〇₃に 10 μ g/m 1 となるよう溶解したコレラトキシン溶液をィムノ 'モジュール [ヌンク（Nunc) ネ ± ]に 50μ 1ずつ加え、 4°Cで 16時間放置しコレラトキシンをコーティングした物とした。次に該固相をゥシ血清アルブミン（シグマ社製）を 1% (W/V) となるように PB Sに溶解した B S A溶液でブロッキング後、各糞抗体抽出液を 50 μ 1ずつ加え、

37°Cで 1時間反応させた。 HRP (Horse Raddish Peroxidase) 標識ゥサギ抗マウス I g A抗体 [ザィメッド（Zymed) 社製]を 50 _μ 1加え 37 °Cで 1時間反応後、 HR Pの基質である ABT S (Azino Bis-ethylbenzothizsoline

Sulfonic acid, ナカライテスク社製）を 2. 75 m g /m 1 となるようクェン酸ーリン酸緩衝液に溶解した A B T S溶液を 50 μ 1加え、室温で 1 5分反応後、波長 405 nmにおける吸光度（〇D._W5) を測定した。

結果を表 1に示す。なお表 1において分泌型 I g A抗体産生増加量とは 7日目と 14日目との I g A産生量差を意味し、 14日目の糞抗体抽出液を用いて得られた OD^値より 7日目の糞抗体抽出液を用いて得られた OD₄。₅値の差（平均値士標準偏差）で示している。

表 1

DSG投与量 (mg/kg) 分泌型 I g A抗体産生増加量有意差 P

0 0. 409±0. 091

1 2. 5 0. 249±0. 092 < 0. 05 50 0. 082±0. 01 7 < 0. 0001 表 1の結果から明らかなように 5 OmgZk gおよび 12. 5mg/k gの D SGの経口投与により、経口投与した抗原に対する分泌型 I g Aの産生増加量が DSG非投与群に比べ有意に低下し、経口投与による DSGの I g A産生抑制作用が確認された。

実施例 2

経口投与された抗原に対する D S Gの I g A産生の選択的抑制効果

経口投与した DSGの抗体産生抑制作用は、コレラトキシンを経口投与したマウスの糞中の抗コレラトキシン I g A抗体価および血中の抗コレラトキシン I g A抗体価ならびに抗コレラトキシン I g G抗体価を測定することにより確認、した。実施例 1と同様の方法で 5群の C 57 BLZ6マウス（7週令、雌、 1群 5 匹）にコレラトキシンの経口投与を行った。 DSGを生理食塩水にそれぞれ、 5 mg/m l、 1. 25mgZm 1、または 0. 313 m g /m 1 となるように溶解した 3種の DSG溶液または生理食塩水を、コレラトキシン投与マウス 4群にそれぞれ 0. 2m lZ回、 1日 1回ずつ、 7日目から 1 7日目まで 1 3日目を除き 10回経口投与した。各群の DSG経口投与量はそれぞれ 5 OmgZk g、 1 2. 5mg/kg、 3. 13mgZk g、 0 m g Z k gである。残るコレラトキシン投与マウス 1群には、 0. 31 3mgZm 1の DSG溶液を 7日目より 0. 2m l Z回で 1 日 1回ずつ、 13日目を除く 1 7日目まで 10回腹腔内投与した。 DSG腹腔内投与量は 3. 1 3mg/k gである。

7日目および 18日目に各群のマウスより糞を採取し、 0. l gの糞中の抗体を 1 m 1の P B Sで抽出した。以下、該抽出液を糞抗体抽出液と称す。なお 7日目の糞は D S G投与前に採取した糞である。

一方各群のマウスよりエーテル麻酔下 7日目に眼窩静脈叢より部分採血、およぴ 18日目に全採血を行い、得られた血液より血清を分離、 50倍希釈した。以下、該希釈液を血中抗体試料と称す。なお 7日目の採血は D S G投与前に実施した。

糞抗体抽出液および血中抗体試料中のコレラトキシンに対する I g A抗体価を EL I S A法により測定した。測定は実施例 1と同様に行った。なお、血中抗体試料を用い、コレラトキシンに対する血中 I g G抗体の産生量の確認も同時に行つた。抗体価の測定は EL I S A法により測定し、該測定に用いた固相は、実施例 1における EL I S A法による I g A抗体価測定に用いた固相と同一である。つぎに、実施例 1と同様に該固相を B S A溶液でブロッキング後、各抗体試料を 50μ 1ずつ加え、 37 °Cで 1時間反応させた。 HRP標識ゥサギ抗マウス I g G抗体（ザィメッド社製）を 50 μ 1加え 37 °Cで 1時間反応後、 2. 75 Z m 1 ABT S溶液を 50 μ 1.加え、室温で 1 5分反応後波長 405 nmにおける吸光度（〇D₄。₅) を測定した。

結果を表 2に示す。表 2は 7日目と 18日目との各種抗体産生量差を意味し、 1 8日目の糞抗体抽出液または血中抗体試料における OD._W5値より 7日目の糞抗体抽出液または血中抗体試料を用いて得られた OD₄。₅値の差（平均値土標準偏差）で示している。

表 2

D SG 抗体価

投与量 (mg/kg) 分泌型 I g A 血中 I g A 血中 I g G

0 0.308 ±0.075 0.051±0.013 0.493 ±0.148

3.13 (ρ·ο.) 0.327 ±0.065 0.035±0.012 0.472±0.112 12.5 (p.o.) 0.112±0.116 * 0.028±0.012 * 0.570±0.107

50 (p. o. ) 0.009 ±0.054 ' 0.016±0.020 * 0.330±0.169

3.13(i.p.) 0.008±0.016 * -0.009 ±0.009 *** 0.034 ±0.035 ** なお、表 2において各値の右肩に付した *は有意差が P < 0. 05、 * *は有意差 Pく 0. 001、 ***は有意差 Pく 0. 0001であったことを示す。また p.o.は DSG経口投与群、 i.p.は DSG腹腔内投与群であることを示す。

D S Gの腹腔内投与での糞中および血中での抗体産生抑制は非常に強く、分泌型 I gA、血中 I g Aおよび血中 I g Gすべての抗体産生を完全に抑制しており、全身的な免疫抑制が生じていると示唆された。経口投与による抗体産生抑制は、分泌型 I g Aおよび血中 I g Aの抗体産生を投与量依存的に抑制した。経口投与による抗体産生の抑制の程度は腹腔内投与に比べると弱いこと、また、血中 I g

Gの産生は抑制されなかったことから、投与による全身的な免疫抑制は軽微であると示唆された。

実施例 3

皮下投与された抗原に対する D S Gの抗体産生および遅延型過敏反応の抑制実施例 1および 2とは異なり、皮下投与抗原に対する抗体産生に対する経口投与した D SGの効果を確認した。すなわち、マウスにォブアルブミンを皮下投与後 D S Gを経口投与し、マウス糞中の抗ォブアルブミン I g A抗体価および血中の抗ォブアルブミン I g A抗体価ならびに抗ォブアルブミン I g G抗体価を測定することにより確認した。さらにォブアルブミンに対する遅延型過敏反応に対する D S Gの影響を確認した。

( 1 ) 抗体産生の抑制：皮下投与用ォブアルブミン懸濁液は、ォブアルブミン

(シグマ社製）を完全フロイントアジュバントに 20 0 μ g/m 1となるよう混合した。 D SG溶液は実施例 1と同様、 D S Gを生理食塩水に 5mgZm 1、 1. 2 5 m g/m 1または 0. 3 1 3 m g/m 1 となるよう溶解した。

つぎに、ォブアルブミン懸濁液を 3群の C 5 7 B LZ 6マウス（7週令、雌、 1群 5匹）に、 0. 1 m 1ずつ 2回（0日目および 1 4日目）皮下投与した。以下、実施例における日数は、ォブアルプミンを最初に投与した日を 0日目として起算している。ついで、上記 D S G溶液または生理食塩水を、ォブアルブミン投与マウス 3群にそれぞれ 0. 2m lZ回、 1 日 1回ずつ 1 4日目から 24日目まで 2 0日目を除き 1 0回経口投与した。各群の D SG経口投与量はそれぞれ 5 0 mg/k g , 1 2. 5mg/k g, Omg/k gである。残るォブアルブミン投与マウス 1群には、 0. 3 1 3mgZm 1の D SG溶液を 0. 2m l /回、 1日 1回ずつ 1 4日目より 2 5日目まで 2 0日目を除く 1 0回腹腔内投与した。 D S G腹腔内投与量は 3. 1 3mg/k gである。

1 4日目および 2 5日目に各群のマウスより糞を採取し、 0. l gの糞中の抗体を 1 m 1の P B Sで抽出した。以下、該抽出液を糞抗体抽出液と称す。なお、 1 4日目の糞は D S G投与前に採取した糞である。

—方、各群のマウスよりエーテル麻酔下 1 4日目に眼窩静脈叢より部分採血、および 2 5日目に全採血を行い、得られた血液より血清を分離した。得られた血清は 5 0倍希釈および 2 5 0倍希釈した。以下、該希釈液を血中抗体試料と称す。なお、 1 4日目の採血は D S G投与前に実施した。

糞抗体抽出液および血中抗体試料中のォブアルブミンに対する抗体価を E L I S A法により測定した。測定は、固相に用いる抗原をコレラトキシンからォブァルブミンに変更した以外は実施例 2における E L I S A法と同様に行った。

ォブアルブミンの皮下投与では I g A抗体量は糞中および血中とも上昇しなかつた。一方血中 I g Gの抗体量はォブアルブミンの皮下投与により上昇した。血中 I g G抗体産生量変化の結果を表 3に示す。表 3は 1 4日目と 2 5日目との各種抗体産生量差を示し、 2 5 0倍希釈した 1. 4日目の血中抗体試料における O D .,。₅値より 2 5 0倍希釈した 2 5日目の血中抗体試料を用いて得られた OD₄。₅値の差（平均値 ±標準偏差）、る _c

表 3

D S G投与量 (m_g/kg) 血中 I g G 有意差 P

0 0.437±0.173

1 2. 5 (p. o. ) 0.286 ±0.074

5 0 (p. o. ) 0.125±0.141 < 0. 0 5

3. 1 3 (i.p. ) 0.064 ±0.080 < 0. 00 1

なお、表 3において ρ·ο·は D SG経口投与群、 i.p.は D SG腹腔内投与群であることを示す。

5 Omg/k gの D S G投与により、血中 I g G抗体産生が有意に抑制されたが、 1 2. 5mg/k gでは有意に抑制されなかった。一方、 3. 1 3mg/k gの D S Gの腹腔内投与により血中での抗体産生は強く抑制され、その抑制は D SGの 5 0mgZk g経口投与より強かった。

上記の結果よ D S G経口投与による抗体産生への抑制効果は、非経口的に接種される抗原より経口的に摂取される抗原に対して選択的に抗体産生を抑制することができることが示された。

(2) 遅延型過敏反応の抑制：上記実施例 3の（1 ) のマウス各実験群において、ォブアルブミン投与後 24日目にォブアルブミンを水溶液（ 400 μ g /in 1 ) を 2 5 μ 1づっ各マウスのフットパッドに皮下投与した。ォブアルブミン皮下投与後の 24時間目にフットパッドの腫れを測定した。結果を表 4に示す。表 4

DSG投与量 (mg/kg) フットパッドの腫れ（ X 10— ²画）

0 88.6±57.2

1 2. 5 (p.o.) 83.2±41.4

50 (p.o.) 62.0±24.8

3. 1 3 (i.p. ) 22.8±35·3

5 Omg/k gの DSG経口投与ではフットパッドの腫れは非投与群と差は認められなかった。一方、 3. 13mgZk gの DSG腹腔内投与では非投与群に比べ、フットパッドの腫れは小さくなつた。すなわち、 DSG経口投与では遅延型過敏反応は抑制されず、 DSGの全身的な免疫抑制は引き起こされないと示唆された。

実施例 4

I g A抗体産生抑制経口剤の製造 '

顆粒剤

DSG 50重量部、乳糖 600重量部、結晶セルロース 330重量部およびヒドロキシプロピルセルロース 20重量部をよく混和し、口ール型圧縮機 (口一ラーコンパクタ一登録商標）を用いて圧縮し、破碎して、 16メッシュと 60メッシュの間に入るように篩過し、顆粒とした。

錠剤

DSG 30重量部、結晶乳糖 1 20重量部、結晶セルロース 147重量部およびステアリン酸マグネシウム 3重量部を V型混合機で混合した後、打錠し、 1錠 30 Omgの錠剤を得た。

以上記載したごとく、本発明の D S Gまたはその薬理学的に許容される塩を含有する経口剤は、経口摂取された抗原に対する免疫反応、特に I g A抗体産生を抑制するが、全身的な免疫抑制作用はほとんど認められないか、弱い。したがつて、本発明の DSGまたはその薬理学的に許容される塩を含有する経口剤は、 I g A腎症を始めとする I g A関連免疫疾患の治療および予防に使用することがでさる。

Claims

請求の範囲

1 . 1 5—デォキシスパガリンまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する I g A産生を選択的に抑制するヒトまたは動物に対する経口投与用組成物。

2 . I g A腎症の予防または治療用である請求項 1記載の組成物。

3 . I g A産生を選択的に抑制するヒトまたは動物に対する経口投与用組成物の製造における 1 5—デォキシスパガリンまたはその薬理学的に許容される塩の使用。

4 . I g A腎症の予防または治療用の組成物である請求項 3記載の使用。

5 . I g A産生の選択的な抑制が必要なヒトまたは動物に 1 5—デォキシスパガリンまたはその薬理学的に許容される塩を経口投与することを特徴とするヒトまたは動物における I g A産生の選択的抑制方法。

6 . I g A腎症の予防または治療のためのものである請求項 5記載の方法。