CN117024528A - 一种Retatrutide的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Retatrutide的制备方法，属于多肽合成技术领域；该合成方法包括，肽树脂的制备：按Retatrutide的序列顺序，逐个偶联带保护氨基酸或带保护多肽片段至固相载体树脂上，得到肽树脂；粗肽的制备：将肽树脂利用裂解液进行裂解，得到粗肽；Retatrutide精品的制备：将粗肽纯化，得到Retatrutide。本发明Retatrutide的合成方法采用带保护的多肽片段进行合成，具有以下优势：时长周期短，制备难度低，废液排放少，总体收率高，成本低，利于规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一种Retatrutide的制备方法。
背景技术
Retatrutide（LY3437943）是一款GIPR/GLP-1R/GCGR三重激动剂肽，对葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（GIP）、胰高血糖素样多肽（GLP-1）、胰高血糖素受体具有强大的活性；另外，Retatrutide（LY3437943）减轻体重方面也有着显著的效果。Retatrutide（LY3437943）的序列结构如下：H-Tyr-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-αMeLeu-Leu-Asp-Lys-Lys(AEEA-γGlu-Eicosanedioic acid)-Ala-Gln-Aib-Ala-Phe-Ile-Glu-Tyr-Leu-Leu-Glu-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。然而，目前对于Retatrutide（LY3437943）的合成方法的研究较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种合成周期短，合成过程中Retatrutide粗肽的HPLC纯度以及Retatrutide精品肽的纯度和纯化收率高的Retatrutide的合成方法。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种Retatrutide的制备方法，包括，
肽树脂的制备：按Retatrutide的序列顺序，逐个偶联带保护氨基酸或带保护多肽片段至固相载体树脂上，得到肽树脂；
粗肽的制备：将肽树脂利用裂解液进行裂解，得到粗肽；和
Retatrutide精品的制备：将粗肽纯化，得到Retatrutide；
其中，带保护多肽片段选自Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Aib-OH、Fmoc-Lys(AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-OH、Fmoc-Ile-αMeLeu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH或Boc-Tyr(tBu)-Aib-Gln(Trt)-Gly-OH中的至少一种。
Retatrutide的序列结构为：H-Tyr1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Ile12-αMeLeu13-Leu14-Asp15-Lys16-Lys17(AEEA-γGlu-Eicosanedioic acid)-Ala18-Gln19-Aib20-Ala21-Phe22-Ile23-Glu24-Tyr25-Leu26-Leu27-Glu28-Gly29-Gly30-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38-Ser39-NH2。本发明Retatrutide的合成方法采用带保护的多肽片段进行合成，其优势在于：1）大大减少了偶联反应制备Retatrutide的步骤，缩短了Retatrutide的合成周期；2）解决了常规方法偶联困难的问题，使得Retatrutide的制备难度低；3）极大的提高了Retatrutide产品的整体收率，降低了生产成本及废液的产出量，4）降低了Retatrutide的合成成本，有利规模化生产。
在一个实施方案中，固相载体树脂选自Rink Amide AM Resin或Rink Amide MBHAResin。
在一个实施方案中，固相载体树脂的交联度1-2%，固相载体树脂的粒径为100-200目，固相载体树脂的取代度为0.3-1.2mmol/g。
在一个优选的实施方案中，固相载体树脂的取代度为0.3-0.9mmol/g。
在一个实施方案中，Lys17采用Fmoc-Lys(AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioicacid(mon-tBu))-OH片段；Tyr1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5采用Boc-Tyr(tBu)-Aib-Gln(Trt)-Gly-OH片段。
在一个实施方案中，Pro36-Pro37-Pro38采用Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH片段；Ser33-Gly34采用Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH片段。
在一个优选的实施方案中，Gly29-Gly30采用Fmoc-Gly-Gly-OH片段。
在一个优选的实施方案中，Leu26-Leu27采用Fmoc-Leu-Leu-OH片段。
在一个优选的实施方案中，带保护多肽片段包括Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Aib-OH、Fmoc-Lys(AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-OH、Fmoc-Ile-αMeLeu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH和Boc-Tyr(tBu)-Aib-Gln(Trt)-Gly-OH。
在一个优选的实施方案中，带保护多肽片段包括Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Aib-OH、Fmoc-Lys(AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-OH、Fmoc-Ile-αMeLeu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH和Boc-Tyr(tBu)-Aib-Gln(Trt)-Gly-OH。
在一个更优选的实施方案中，肽树脂的制备中，按如下序列顺序偶联带保护氨基酸或带保护多肽片段：1）Fmoc-Ser(tBu)-OH；2）Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH；3）Fmoc-Ala-OH；4）Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH；5）Fmoc-Ser(tBu)-OH；6）Fmoc-Pro-OH；7）Fmoc-Gly-Gly-OH；8）Fmoc-Glu(OtBu)-OH；9）Fmoc-Leu-OH；10）Fmoc-Leu-OH；11）Fmoc-Tyr(tBu)-OH；12）Fmoc-Glu(OtBu)-OH；13）Fmoc-Ile-OH；14）Fmoc-Phe-OH；15）Fmoc-Ala-OH；16）Fmoc-Gln(Trt)-Aib-OH；17）Fmoc-Ala-OH；18）Fmoc-Lys(AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-OH；19）Fmoc-Lys(Boc)-OH；20）Fmoc-Asp(OtBu)-OH；21）Fmoc-Leu-OH；22）Fmoc-Ile-αMeLeu-OH；23）Fmoc-Ser(tBu)-OH；24）Fmoc-Tyr(tBu)-OH；25）Fmoc-Asp(OtBu)-OH；26）Fmoc-Ser(tBu)-OH；27）Fmoc-Thr(tBu)-OH；28）Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH；29）Boc-Tyr(tBu)-Aib-Gln(Trt)-Gly-OH。按该序列顺序偶联带保护氨基酸或带保护多肽片段，能够大大提高Retatrutide粗肽的HPLC纯度以及Retatrutide精品肽的纯度和纯化收率。
在一个更优选的实施方案中，肽树脂的制备中，按如下序列顺序偶联带保护氨基酸或带保护多肽片段：1）Fmoc-Ser(tBu)-OH；2）Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH；3）Fmoc-Ala-OH；4）Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH；5）Fmoc-Ser(tBu)-OH；6）Fmoc-Pro-OH；7）Fmoc-Gly-Gly-OH；8）Fmoc-Glu(OtBu)-OH；9）Fmoc-Leu-Leu-OH；10）Fmoc-Tyr(tBu)-OH；11）Fmoc-Glu(OtBu)-OH；12）Fmoc-Ile-OH；13）Fmoc-Phe-OH；14）Fmoc-Ala-OH；15）Fmoc-Gln(Trt)-Aib-OH；16）Fmoc-Ala-OH；17）Fmoc-Lys(AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-OH；18）Fmoc-Lys(Boc)-OH；19）Fmoc-Asp(OtBu)-OH；20）Fmoc-Leu-OH；21）Fmoc-Ile-αMeLeu-OH；22）Fmoc-Ser(tBu)-OH；23）Fmoc-Tyr(tBu)-OH；24）Fmoc-Asp(OtBu)-OH；25）Fmoc-Ser(tBu)-OH；26）Fmoc-Thr(tBu)-OH；27）Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH；28）Boc-Tyr(tBu)-Aib-Gln(Trt)-Gly-OH。按该序列顺序偶联带保护氨基酸或带保护多肽片段，能够更进一步提高Retatrutide粗肽的HPLC纯度以及Retatrutide精品肽的纯度和纯化收率。
在一个实施方案中，肽树脂的制备具体包括：
固相载体树脂在脱保护剂中脱保护后得到脱保护树脂；
将脱保护树脂和经缩合剂活化的Fmoc-Ser(tBu)-OH缩合，得到氨基酸-树脂；
重复上述脱保护和缩合过程，按Retatrutide的序列顺序偶联带保护氨基酸或带保护多肽片段，得到肽树脂。
在一个优选的实施方案中，脱保护剂包括哌啶和DMF，其体积比为哌啶:DMF=1:3-5。
在一个更优选的实施方案中，脱保护剂包括六氢哌啶和DMF，其体积比为哌啶:DMF=1:4。
在一个优选的实施方案中，缩合剂为DIC和HOBT。
在一个更优选的实施方案中，HOBT的投料比为带保护氨基酸或带保护多肽片段摩尔数的0.5-1.0倍。
在一个更优选的实施方案中，DIC的投料比为带保护氨基酸或带保护多肽片段摩尔数的0.8-1.2倍。
在一个优选的实施方案中，带保护氨基酸或带保护多肽片段的投料比为树脂摩尔数的1.5-3.5倍。
在一个更优选的实施方案中，带保护氨基酸或带保护多肽片段的投料比为树脂摩尔数的2-3倍。
在一个优选的实施方案中，缩合剂为DIC和HOBT类似物，HOBT类似物的式（I）所示；
式（I）。
Retatrutide的合成过程中，利用该缩合剂缩合脱保护树脂和带保护氨基酸或带保护多肽片段，能够提高Retatrutide粗肽的纯度和Retatrutide精品肽的纯化收率。
在一个更优选的实施方案中，HOBT类似物的投料比为带保护氨基酸或带保护多肽片段摩尔数的0.5-1.0倍。
在一个更优选的实施方案中，DIC的投料比为带保护氨基酸或带保护多肽片段摩尔数的0.8-1.2倍。
在一个更优选的实施方案中，DIC的投料比为带保护氨基酸或带保护多肽片段摩尔数的0.8-1.2倍。
在一个实施方案中，裂解液包括TFA、EDT、TIS和H2O，其体积比为TFA:EDT:TIS:H2O=80-100:1-10:0.5-5:0.5-5:0.5-5。
在一个优选的实施方案中，裂解液包括TFA、EDT、TIS和H2O，其体积比为TFA:EDT:TIS:H2O=90:5:2.5:2.5:2.5。
在一个实施方案中，裂解温度为15-35℃，裂解时间为1-5小时。
在一个优选的实施方案中，裂解温度为20-30℃；裂解时间为1.5-3.5小时。
在一个实施方案中，纯化采用C8填料，经1-3次提纯和1-2次转盐后得到Retatrutide精品。
在一个优选的实施方案中，纯化采用C8填料，经2次提纯和1次转盐后得到Retatrutide精品。
在一个优选的实施方案中，一纯采用的流动相及洗脱梯度为：A相：5-10g/L的醋酸铵/水溶液,pH为6.0-7.0；B相：乙腈，洗脱梯度40% B相-60% B相，洗脱时长45-90分钟。
在一个更优选的实施方案中，一纯采用的流动相及洗脱梯度为：A相：8g/L的醋酸铵/水溶液,用醋酸与氨水调PH到6.5；B相：乙腈，洗脱梯度43%B相-53%B相，洗脱时长60分钟。
在一个优选的实施方案中，二纯采用的流动相及洗脱梯度为：A相：0.5-1.5%醋酸水溶液（V/V）；B相0.5-1.5%醋酸乙腈溶液（V/V），洗脱梯度为40%B相-50%B相，洗脱时长60分钟。
在一个更优选的实施方案中，二纯采用的流动相及洗脱梯度为：A相：1%醋酸水溶液（V/V）；B相1%醋酸乙腈溶液（V/V），洗脱梯度为40%B相-50%B相，洗脱时长45-90分钟。
在一个优选的实施方案中，转盐采用的流动相、转盐过程及洗脱梯度为：使用0.1-1.0M的NaCl水溶液进行替换转盐，A相：水，B相：乙腈，洗脱梯度为50-60%B相，洗脱时长30-60分钟。
在一个更优选的实施方案中，转盐采用的流动相、转盐过程及洗脱梯度为：使用0.5M的NaCl水溶液进行替换转盐，A相：水，B相：乙腈，洗脱梯度为55%B相，洗脱时长40分钟。
本发明还公开了带保护多肽片段在制备Retatrutide中的用途，带保护多肽片段选自Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Aib-OH、Fmoc-Lys(AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-OH、Fmoc-Ile-αMeLeu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH或Boc-Tyr(tBu)-Aib-Gln(Trt)-Gly-OH中的至少一种。
在一个实施方案中，带保护多肽片段包括Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Aib-OH、Fmoc-Lys(AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-OH、Fmoc-Ile-αMeLeu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH和Boc-Tyr(tBu)-Aib-Gln(Trt)-Gly-OH。
在一个优选的实施方案中，带保护多肽片段包括Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Aib-OH、Fmoc-Lys(AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-OH、Fmoc-Ile-αMeLeu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH和Boc-Tyr(tBu)-Aib-Gln(Trt)-Gly-OH。
本发明还公开了缩合剂，其为DIC和HOBT类似物，HOBT类似物的式（I）所示；
式（I）。
多肽的合成过程中，利用DIC和HOBT类似物缩合脱保护树脂和带保护氨基酸或带保护多肽片段，能够提高粗肽的纯度和精品肽的纯化收率。
本发明还公开了上述缩合剂在合成Retatrutide中的用途。
本发明还公开了HOBT类似物的制备方法，包括，
将1-羟基苯并三唑（HOBT）和2,5-呋喃二甲酰氯于25-35℃下反应1-5小时，得到HOBT类似物。
本发明由于大量带保护的多肽片段合成Retatrutide，因而具有如下有益效果：1）大大减少了偶联反应制备Retatrutide的步骤，缩短了Retatrutide的合成周期；2）解决了常规方法偶联困难的问题，使得Retatrutide的制备难度低；3）极大的提高了Retatrutide产品的整体收率，降低了生产成本及废液的产出量，4）降低了Retatrutide的合成成本，有利规模化生产。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
本发明所使用的缩写的结构和名称列于下表1。
表1 缩写的结构和名称
本发明所使用的固相载体树脂的交联度1%-2%，固相载体树脂的粒径为100-200目。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：
一种Retatrutide的制备方法，包括，
1、肽树脂的制备
称取158.73g取代度为0.63的Rink Amide MBHA Resin（100mmol）倒入固相合成反应釜内，加入1500mL的DMF溶胀树脂60分钟，抽滤掉DMF，加入1500mL的DBLK(20%六氢吡啶/DMF溶液)进行去保护30分钟，抽滤掉反应液，用1500ml的DMF洗涤5次，称取77.40g的Fmoc-Ser(tBu)-OH和27.02g的HOBT倒入烧杯中，加入200mL的DMF溶解，并使溶液冷却至0℃，加入31.50mL的DIC活化10分钟，将活化完的氨基酸加入到反应釜内，搅拌反应2小时，抽滤掉反应液，用1500mL的DMF洗涤3次。使用同样的操作流程，继续偶联剩余氨基酸或多肽片段，按表2中投料顺序及投料量进行偶联。偶联完成后，得到以下肽树脂：Boc-Tyr(tBu)-Aib-Gln(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-αMeLeu-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(AEEA-γGlu-Eicosanedioicacid(mon-tBu))-Ala-Gln(Trt)-Aib-Ala-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide-氨基树脂751.18g，合成得率97.87%。
表2 偶联的投料顺序及投料量
| 序号 | 原料名称 | 投料比 | 投料量 | 序号 | 原料名称 | 投料比 | 投料量 |
| 1 | Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH | 2倍 | 106.2g | 2 | Fmoc-Ala-OH | 2倍 | 62.20g |
| 3 | Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH | 2倍 | 88.00g | 4 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 2倍 | 76.60g |
| 5 | Fmoc-Pro-OH | 2倍 | 67.40g | 6 | Fmoc-Gly-Gly-OH | 2倍 | 70.80g |
| 7 | Fmoc-Glu(OtBu)-OH | 2倍 | 85.00g | 8 | Fmoc-Leu-OH | 2倍 | 70.60g |
| 9 | Fmoc-Leu-OH | 2倍 | 70.60g | 10 | Fmoc-Tyr(tBu)-OH | 2倍 | 91.80g |
| 11 | Fmoc-Glu(OtBu)-OH | 2倍 | 85.00g | 12 | Fmoc-Ile-OH | 2倍 | 70.60g |
| 13 | Fmoc-Phe-OH | 2倍 | 77.40g | 14 | Fmoc-Ala-OH | 2倍 | 62.20g |
| 15 | Fmoc-Gln(Trt)-Aib-OH | 2倍 | 139.00g | 16 | Fmoc-Ala-OH | 2倍 | 62.20g |
| 17 | Fmoc-Lys(AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-OH | 2倍 | 215.60g | 18 | Fmoc-Lys(Boc)-OH | 3倍 | 140.40g |
| 19 | Fmoc-Asp(OtBu)-OH | 3倍 | 123.30g | 20 | Fmoc-Leu-OH | 3倍 | 105.90g |
| 21 | Fmoc-Ile-αMeLeu-OH | 2倍 | 96.00g | 22 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 3倍 | 114.90g |
| 23 | Fmoc-Tyr(tBu)-OH | 3倍 | 137.70g | 24 | Fmoc-Asp(OtBu)-OH | 3倍 | 123.3g |
| 25 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 3倍 | 114.90g | 26 | Fmoc-Thr(tBu)-OH | 3倍 | 119.10g |
| 27 | Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH | 2倍 | 108.8g | 28 | Boc-Tyr(tBu)-Aib-Gln(Trt)-Gly-OH | 2倍 | 169.80g |
2、Retatrutide粗肽的制备
称取300g“肽树脂的制备”中得到的肽树脂，配置2000mL裂解液（裂解液中包括TFA、EDT、TIS和H2O，其体积比为TFA:EDT:TIS:H2O=90:5:2.5:2.5:2.5），将裂解液降温至0℃，在搅拌状态下将肽树脂加入到裂解液中，升温至25℃，反应3小时，过滤，取滤液，滤液倒入到与冷冻的冰乙醚中沉淀，离心后取沉淀，并用乙醚洗涤并离心沉淀3次，真空干燥12小时，得到218.54g Retatrutide粗肽，收率115.07%，Retatrutide粗肽的HPLC纯度86.33%。
3、Retatrutide精品的制备
称取“粗肽的制备”中得到的粗肽40g，使用2000mL溶剂（乙腈水溶液，体积比为乙腈:H2O＝1:2）溶解粗肽，利用200mm×250mm柱子进行纯化，填料C8；一纯A相：8g/L的醋酸铵/水溶液，用醋酸与氨水调pH到6.5；B相：乙腈，洗脱梯度43% B相-53% B相，洗脱时长60分钟；对收集液进行检测并合并收集纯度大于98%的部分进行二纯；二纯A相：1%醋酸水溶液；B相1%醋酸乙腈溶液，洗脱梯度为40% B相-50% B相，洗脱时长60分钟，对收集液进行检测并合并收集液大于99.5%部分进行转盐；转盐A相：水；B相：乙腈；上样完毕先使用0.5M的NaCl水溶液进行替换转盐，再以55% B相进行洗脱，洗脱时长40分钟，对收集液进行检测，收取纯度大于99.5%，单杂小于0.1%的组分进行冻干。将转盐的收集液进行冻干，时长72小时，最终得到Retatrutide精品23.17g，Retatrutide精品纯度99.85%，单杂均小于0.1%，纯化收率57.92%（以Retatrutide粗肽计）。
实施例2：
一种Retatrutide的制备方法，包括，
1、肽树脂的制备
与实施例1中“肽树脂的制备”基本相同，不同之处为：按表3中投料顺序及投料量进行偶联剩余氨基酸或多肽片段。偶联完成后，得到以下肽树脂：Boc-Tyr(tBu)-Aib-Gln(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-αMeLeu-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(AEEA-γGlu-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-Ala-Gln(Trt)-Aib-Ala-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide-氨基树脂。
表3 偶联的投料顺序及投料量
| 序号 | 原料名称 | 投料比 | 序号 | 原料名称 | 投料比 |
| 1 | Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH | 2倍 | 2 | Fmoc-Ala-OH | 2倍 |
| 3 | Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH | 2倍 | 4 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 2倍 |
| 5 | Fmoc-Pro-OH | 2倍 | 6 | Fmoc-Gly-Gly-OH | 2倍 |
| 7 | Fmoc-Glu(OtBu)-OH | 2倍 | 8 | Fmoc-Leu-Leu-OH | 2倍 |
| 9 | Fmoc-Tyr(tBu)-OH | 2倍 | 10 | Fmoc-Glu(OtBu)-OH | 2倍 |
| 11 | Fmoc-Ile-OH | 2倍 | 12 | Fmoc-Phe-OH | 2倍 |
| 13 | Fmoc-Ala-OH | 2倍 | 14 | Fmoc-Gln(Trt)-Aib-OH | 2倍 |
| 15 | Fmoc-Ala-OH | 2倍 | 16 | Fmoc-Lys(AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioicacid(mon-tBu))-OH | 2倍 |
| 17 | Fmoc-Lys(Boc)-OH | 3倍 | 18 | Fmoc-Asp(OtBu)-OH | 3倍 |
| 19 | Fmoc-Leu-OH | 3倍 | 20 | Fmoc-Ile-αMeLeu-OH | 2倍 |
| 21 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 3倍 | 22 | Fmoc-Tyr(tBu)-OH | 3倍 |
| 23 | Fmoc-Asp(OtBu)-OH | 3倍 | 24 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 3倍 |
| 25 | Fmoc-Thr(tBu)-OH | 3倍 | 26 | Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH | 2倍 |
| 27 | Boc-Tyr(tBu)-Aib-Gln(Trt)-Gly-OH | 2倍 |
2、Retatrutide粗肽的制备
与实施例1中“Retatrutide粗肽的制备”相同，Retatrutide粗肽的收率112.27%，Retatrutide粗肽的HPLC纯度89.19%。
3、Retatrutide精品的制备
与实施例1中“Retatrutide精品的制备”相同，Retatrutide精品的纯度99.91%，单杂均小于0.1%，Retatrutide精品的纯化收率62.35%（以Retatrutide粗肽计）。
与实施例1相比，本实施例2合成方法制得Retatrutide粗肽的HPLC纯度得到了提高；与实施例1相比，本实施例2合成方法制得Retatrutide精品的纯度和纯化收率均得到了提高；以上结果这说明相较与Leu26采用“Fmoc-Leu -OH”片段和Leu27采用“Fmoc-Leu-OH”片段，Leu26-Leu27采用“Fmoc-Leu-Leu-OH”片段能够更进一步提高Retatrutide粗肽的HPLC纯度以及Retatrutide精品肽的纯度和纯化收率。
实施例3：
一种Retatrutide的制备方法，包括，
1、肽树脂的制备
与实施例1中“肽树脂的制备”基本相同，不同之处为：按表4中投料顺序及投料量进行偶联剩余氨基酸或多肽片段。偶联完成后，得到以下肽树脂：Boc-Tyr(tBu)-Aib-Gln(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-αMeLeu-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(AEEA-γGlu-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-Ala-Gln(Trt)-Aib-Ala-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide-氨基树脂。
表4 偶联的投料顺序及投料量
| 序号 | 原料名称 | 投料比 | 序号 | 原料名称 | 投料比 |
| 1 | Fmoc-Pro-OH | 2倍 | 2 | Fmoc-Pro-OH | 2倍 |
| 3 | Fmoc-Pro-OH | 2倍 | 4 | Fmoc-Ala-OH | 2倍 |
| 5 | Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH | 2倍 | 6 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 2倍 |
| 7 | Fmoc-Pro-OH | 2倍 | 8 | Fmoc-Gly-Gly-OH | 2倍 |
| 9 | Fmoc-Glu(OtBu)-OH | 2倍 | 10 | Fmoc-Leu-OH | 2倍 |
| 11 | Fmoc-Leu-OH | 2倍 | 12 | Fmoc-Tyr(tBu)-OH | 2倍 |
| 13 | Fmoc-Glu(OtBu)-OH | 2倍 | 14 | Fmoc-Ile-OH | 2倍 |
| 15 | Fmoc-Phe-OH | 2倍 | 16 | Fmoc-Ala-OH | 2倍 |
| 17 | Fmoc-Gln(Trt)-Aib-OH | 2倍 | 18 | Fmoc-Ala-OH | 2倍 |
| 19 | Fmoc-Lys(AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioicacid(mon-tBu))-OH | 2倍 | 20 | Fmoc-Lys(Boc)-OH | 3倍 |
| 21 | Fmoc-Asp(OtBu)-OH | 3倍 | 22 | Fmoc-Leu-OH | 3倍 |
| 23 | Fmoc-Ile-αMeLeu-OH | 2倍 | 24 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 3倍 |
| 25 | Fmoc-Tyr(tBu)-OH | 3倍 | 26 | Fmoc-Asp(OtBu)-OH | 3倍 |
| 27 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 3倍 | 28 | Fmoc-Thr(tBu)-OH | 3倍 |
| 29 | Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH | 2倍 | 30 | Boc-Tyr(tBu)-Aib-Gln(Trt)-Gly-OH | 2倍 |
2、Retatrutide粗肽的制备
与实施例1中“粗肽的制备”相同，Retatrutide粗肽的收率117.35%，Retatrutide粗肽的HPLC纯度84.05%。
3、Retatrutide精品的制备
与实施例1中“Retatrutide精品的制备”相同，Retatrutide精品的纯度99.58%，单杂均小于0.1%，Retatrutide精品的纯化收率56.24%（以Retatrutide粗肽计）。
与实施例1相比，本实施例3合成方法制得Retatrutide粗肽的HPLC纯度较低；与实施例1相比，本实施例3合成方法制得Retatrutide精品的纯度和纯化收率均较低；以上结果这说明相较与Pro36采用“Fmoc-Pro-OH”片段、Pro37采用“Fmoc-Pro-OH”和Pro38采用“Fmoc-Pro-OH”片段，Pro36-Pro37-Pro38采用“Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH”片段能够更进一步提高Retatrutide粗肽的HPLC纯度以及Retatrutide精品肽的纯度和纯化收率。
实施例4：
一种Retatrutide的制备方法，包括，
1、肽树脂的制备
与实施例1中“肽树脂的制备”基本相同，不同之处为：按表5中投料顺序及投料量进行偶联剩余氨基酸或多肽片段。偶联完成后，得到以下肽树脂：Boc-Tyr(tBu)-Aib-Gln(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-αMeLeu-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(AEEA-γGlu-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-Ala-Gln(Trt)-Aib-Ala-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-RinkAmide-氨基树脂。
表5 偶联的投料顺序及投料量
| 序号 | 原料名称 | 投料比 | 序号 | 原料名称 | 投料比 |
| 1 | Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH | 2倍 | 2 | Fmoc-Ala-OH | 2倍 |
| 3 | Fmoc-Gly-OH | 2倍 | 4 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 2倍 |
| 5 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 2倍 | 6 | Fmoc-Pro-OH | 2倍 |
| 7 | Fmoc-Gly-Gly-OH | 2倍 | 8 | Fmoc-Glu(OtBu)-OH | 2倍 |
| 9 | Fmoc-Leu-OH | 2倍 | 10 | Fmoc-Leu-OH | 2倍 |
| 11 | Fmoc-Tyr(tBu)-OH | 2倍 | 12 | Fmoc-Glu(OtBu)-OH | 2倍 |
| 13 | Fmoc-Ile-OH | 2倍 | 14 | Fmoc-Phe-OH | 2倍 |
| 15 | Fmoc-Ala-OH | 2倍 | 16 | Fmoc-Gln(Trt)-Aib-OH | 2倍 |
| 17 | Fmoc-Ala-OH | 2倍 | 18 | Fmoc-Lys(AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioicacid(mon-tBu))-OH | 2倍 |
| 19 | Fmoc-Lys(Boc)-OH | 3倍 | 20 | Fmoc-Asp(OtBu)-OH | 3倍 |
| 21 | Fmoc-Leu-OH | 3倍 | 22 | Fmoc-Ile-αMeLeu-OH | 2倍 |
| 23 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 3倍 | 24 | Fmoc-Tyr(tBu)-OH | 3倍 |
| 25 | Fmoc-Asp(OtBu)-OH | 3倍 | 26 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 3倍 |
| 27 | Fmoc-Thr(tBu)-OH | 3倍 | 28 | Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH | 2倍 |
| 29 | Boc-Tyr(tBu)-Aib-Gln(Trt)-Gly-OH | 2倍 |
2、Retatrutide粗肽的制备
与实施例1中“粗肽的制备”相同，Retatrutide粗肽收率116.44%，HPLC纯度84.96%。
3、Retatrutide精品的制备
与实施例1中“Retatrutide精品的制备”相同，Retatrutide精品纯度99.64%，单杂均小于0.1%，纯化收率56.83%（以Retatrutide粗肽计）。
与实施例1相比，本实施例4合成方法制得Retatrutide粗肽的HPLC纯度较低；与实施例1相比，本实施例4成方法制得Retatrutide精品的纯度和纯化收率均较低；以上结果这说明相较与Ser33采用“Fmoc-Ser(tBu)-OH”和Gly34采用“Fmoc-Ser(tBu)-OH”片段，Ser33-Gly34采用“Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH”片段能够更进一步提高Retatrutide粗肽的HPLC纯度以及Retatrutide精品肽的纯度和纯化收率。
实施例5：
HOBT类似物的制备方法，包括，
将0.1mol 1-羟基苯并三唑（HOBT）溶于1000mL乙醚中，于28℃下搅拌均匀，然后滴加0.13mol 2,5-呋喃二甲酰氯（于30分钟内滴加完毕），于28℃下滴加完毕后继续反应3小时，待反应完成后进行抽滤，然后利用石油醚-乙酸乙酯重结晶，得到式（I）所示的HOBT类似物，产率为91.46%，1H⁃NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.89（d，4H），7.74（s，2H），7.52（t，4H）。
式（I）。
一种Retatrutide的制备方法，包括，
1、肽树脂的制备
与实施例1中“肽树脂的制备”基本相同，不同之处为：利用HOBT类似物替换HOBT。
2、Retatrutide粗肽的制备
与实施例1中“粗肽的制备”相同，Retatrutide粗肽收率113.89%，HPLC纯度87.76%。
3、Retatrutide精品的制备
与实施例1中“Retatrutide精品的制备”相同，Retatrutide精品纯度99.89%，单杂均小于0.1%，纯化收率61.05%（以Retatrutide粗肽计）。
与实施例1相比，本实施例5合成方法制得Retatrutide粗肽的HPLC纯度更高，Retatrutide精品的纯化收率也更高；以上结果这说明相较采用DIC和本实施例5制得的HOBT类似物作为缩合剂制备Retatrutide，能够提高Retatrutide粗肽的纯度和Retatrutide精品肽的纯化收率。
实施例6：
一种Retatrutide的制备方法，包括，
1、肽树脂的制备
与实施例2中“肽树脂的制备”基本相同，不同之处为：利用实施例5制得的HOBT类似物替换HOBT。
2、Retatrutide粗肽的制备
与实施例2中“粗肽的制备”相同，Retatrutide粗肽收率108.62%，HPLC纯度91.01%。
3、Retatrutide精品的制备
与实施例1中Retatrutide精品的制备”相同，Retatrutide精品纯度99.92%，单杂均小于0.1%，纯化收率64.39%（以Retatrutide粗肽计）。
与实施例2相比，本实施例6合成方法制得Retatrutide粗肽的HPLC纯度更高，Retatrutide精品的纯化收率也更高；以上结果这说明相较采用DIC和本实施例5制得的HOBT类似物作为缩合剂制备Retatrutide，能够提高Retatrutide粗肽的纯度和Retatrutide精品肽的纯化收率。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包括在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种Retatrutide的制备方法，包括，
肽树脂的制备：按Retatrutide的序列顺序，逐个偶联带保护氨基酸或带保护多肽片段至固相载体树脂上，得到肽树脂；
粗肽的制备：将所述肽树脂利用裂解液进行裂解，得到粗肽；和
Retatrutide精品的制备：将所述粗肽纯化，得到Retatrutide；
其中，带保护多肽片段选自Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Aib-OH、Fmoc-Lys(AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-OH、Fmoc-Ile-αMeLeu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH或Boc-Tyr(tBu)-Aib-Gln(Trt)-Gly-OH中的至少一种。
2. 根据权利要求1所述的一种Retatrutide的制备方法，其特征在于：固相载体树脂选自Rink Amide AM Resin或Rink Amide MBHA Resin。
3.根据权利要求1或2所述的一种Retatrutide的制备方法，其特征在于：固相载体树脂的交联度1-2%，固相载体树脂的粒径为100-200目，固相载体树脂的取代度为0.3-1.2mmol/g。
4. 根据权利要求1所述的一种Retatrutide的制备方法，其特征在于：Lys17采用Fmoc-Lys(AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-OH片段；Tyr1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5采用Boc-Tyr(tBu)-Aib-Gln(Trt)-Gly-OH片段。
5.根据权利要求1或4所述的一种Retatrutide的制备方法，其特征在于：Pro36-Pro37-Pro38采用Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH片段；Ser33-Gly34采用Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH片段。
6.根据权利要求5所述的一种Retatrutide的制备方法，其特征在于：Gly29-Gly30采用Fmoc-Gly-Gly-OH片段。
7.根据权利要求5所述的一种Retatrutide的制备方法，其特征在于：Leu26-Leu27采用Fmoc-Leu-Leu-OH片段。
8.根据权利要求1所述的一种Retatrutide的制备方法，其特征在于：裂解液包括TFA、EDT、TIS和H2O，其体积比为TFA:EDT:TIS:H2O=80-100:1-10:0.5-5:0.5-5:0.5-5。
9.根据权利要求1所述的一种Retatrutide的制备方法，其特征在于：纯化采用C8填料，经1-3次提纯和1-2次转盐后得到Retatrutide精品。
10. 带保护多肽片段在制备Retatrutide中的用途，带保护多肽片段选自Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Aib-OH、Fmoc-Lys(AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-OH、Fmoc-Ile-αMeLeu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH或Boc-Tyr(tBu)-Aib-Gln(Trt)-Gly-OH中的至少一种。
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