CN117004770A - 一种检测呼吸道病原体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测呼吸道病原体的方法。本发明针对多种呼吸道病毒设计特异性扩增引物，并优化多重PCR扩增条件，建立了一种能同时检测多种呼吸道病原体的多重PCR方法。该方法简单快捷，能够实时获取扩增片段的序列信息，特异性强，灵敏度较高，有望为呼吸道病原体的快速筛选和现场检测鉴定提供有力技术支撑。

Description

一种检测呼吸道病原体的方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种检测呼吸道病原体的方法。
背景技术
呼吸道感染(RespiratoryTract Infections,RTIs)是指病原体从人体的鼻腔咽喉、气管和支气管等部位侵入而引起的有传染性的疾病，是一种常见的感染性疾病。能够引起呼吸道感染的病原体的种类繁多，不同的病原体感染具有相似的临床特征和影像学特点，很难通过病史和临床特征判断病原体的种类。尽管目前检测呼吸道病原体的方法众多，如分离培养法，血清学实验，分子生物学方法等，但是目前仍有40-60％的病例未能鉴定出明确的病原体。相比于生化指标及免疫方法，分子诊断灵敏度极高，能够基于不同病原体基因序列的差异性实现病原体种类鉴定以及亚型区分，在疾病的诊疗中具有明显优势。
然而，传统分子诊断方法的一些问题阻碍了该方法在呼吸道病原体感染中的大规模使用。首先是检测流程偏长，操作复杂，涉及到核酸提取以及产物扩增，如何简化操作流程、节省实验时间，对于患者迅速得到正确治疗具有重要意义；其次是目前分子诊断测试多为单重体系，检测项目有限。但是呼吸道病原体种类繁多，单单是引起普通感冒最为常见的鼻病毒就有约145种血清型，单重PCR体系常常会出现患者测试结果为阴性情况，无法对患者给与有价值的信息。多重PCR是指在同一反应体系中，加入多对特异性引物，与此同时，如何让加入的引物不互相干扰并且其检测灵敏度也不低于单重PCR检测灵敏度成为一大技术难点，并且在遇到病危或者紧急情况下，如何提高整个检测过程的效率，让病人得到及时准确的治疗成为一种紧急需求，因此，开发一种快速、检测灵敏度高、具有良好重现性的检测呼吸道病原体感染的多重PCR技术具有明确的临床意义及潜在应用价值。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种同时检测25种呼吸道病原体的方法，通过对多种呼吸道病原体所有编码序列进行筛选，找出每种病原体的特异性区域，设计了每种病原体的扩增引物；使得设计的多对特异性引物能同时进行多重PCR检测。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明第一方面提供了一种检测呼吸道病原体的引物组，所述引物组包括检测博卡病毒、流感病毒、肠道病毒、麻疹病毒、腮腺病毒、冠状病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、疱疹病毒、副肠孤病毒、鼻病毒中的一种或多种引物对。
进一步，所述流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒。
进一步，所述肠道病毒包括肠道病毒CPML_8109/08株、肠道病毒V13-0682株、肠道病毒D68型。
进一步，所述冠状病毒包括中东呼吸综合征冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒2、人类冠状病毒229E型、人类冠状病毒HKU1型、人类冠状病毒NL63型、人类冠状病毒OC43型。
进一步，所述腺病毒包括人类腺病毒C。
进一步，所述呼吸道合胞病毒包括人类呼吸道合胞病毒。
进一步，所述副流感病毒包括人类甲型副流感病毒、人类副流感病毒1型、人类副流感病毒2型、人类副流感病毒3型、人类副流感病毒4型。
进一步，所述疱疹病毒包括人类单纯疱疹病毒3型、人类巨细胞病毒5型、人类巨细胞病毒6型、人类EB病毒4型。
进一步，所述副肠孤病毒包括人类副肠孤病毒1型。
进一步，所述鼻病毒包括人类鼻病毒1型、人类鼻病毒2型。
进一步，所述引物组包括如SEQ ID NO.1-58所示的核酸序列。
本发明第二方面提供了一种检测呼吸道病原体的试剂盒，所述试剂盒包括多重PCR反应物；所述多重PCR反应物包括本发明第一方面所述的引物组。
进一步，以所述多重PCR反应物的总体积为基准，所述多重PCR反应物中每条引物的浓度选自0.00125-6.4μM。
进一步，所述每条引物的浓度选自0.025-0.4μM。
进一步，所述每条引物的浓度为0.1μM。
进一步，所述多重PCR反应物还包括多重PCR预混液。
进一步，所述多重PCR预混液包括2×Phusion Multiplex PCRMasterMix、5×HieffCanace PCR Master Mix或2×HieffHG Multiplex PCR Master Mix。
进一步，所述多重PCR预混液为2×Phusion Multiplex PCR Master Mix。
进一步，所述试剂盒还包括样品RNA提取试剂、阳性质控品、阴性质控品中的一种或多种。
进一步，所述阳性质控品为含各目标病毒特异核酸片段的质粒DNA。
进一步，所述质粒的载体为pUC57。
进一步，所述试剂盒还包括使用说明书。
进一步，所述呼吸道病原体包括博卡病毒、流感病毒、肠道病毒、麻疹病毒、腮腺病毒、冠状病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、疱疹病毒、副肠孤病毒、鼻病毒中的一种或多种。
进一步，所述流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒。
进一步，所述肠道病毒包括肠道病毒V13-0682株、肠道病毒D68型。
进一步，所述冠状病毒包括严重急性呼吸综合征冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒2、人类冠状病毒229E型、人类冠状病毒HKU1型、人类冠状病毒NL63型、人类冠状病毒OC43型。
进一步，所述腺病毒包括人类腺病毒C。
进一步，所述呼吸道合胞病毒包括人类呼吸道合胞病毒。
进一步，所述副流感病毒包括人类甲型副流感病毒、人类副流感病毒1型、人类副流感病毒4型。
进一步，所述疱疹病毒包括人类单纯疱疹病毒3型、人类巨细胞病毒5型、人类巨细胞病毒6型、人类EB病毒4型。
进一步，所述副肠孤病毒包括人类副肠孤病毒1型。
进一步，所述鼻病毒包括人类鼻病毒1型、人类鼻病毒2型。
本发明第三方面提供了本发明第一方面所述的引物组在制备本发明第二方面所述的试剂盒中的应用。
本发明第四方面提供了一种非诊断目的的检测呼吸道病原体的方法，所述方法包括使用本发明第一方面所述的引物组。
进一步，所述方法还包括使用多重PCR预混液。
进一步，所述多重PCR预混液包括2×Phusion Multiplex PCRMasterMix、5×HieffCanace PCR Master Mix或2×HieffHG Multiplex PCR Master Mix。
进一步，所述多重PCR预混液为2×Phusion Multiplex PCR Master Mix。
进一步，所述多重PCR反应的退火温度选自55-65℃。
进一步，所述多重PCR反应的退火温度为55℃。
进一步，所述多重PCR反应的基本条件包括：98℃变性30s，98℃变性10s，55℃复性30s，72℃延伸40s，循环35次；72℃延伸5min。
进一步，所述方法还包括鉴定多重PCR扩增产物。
进一步，鉴定多重PCR扩增产物的方法包括使用凝胶电泳和/或测序技术。
进一步，所述测序技术包括使用多重PCR扩增产物构建文库进行测序。
进一步，所述文库包括三代测序文库。
进一步，所述三代测序文库选择试剂盒RBK096的protocol构建文库。
本发明第五方面提供了如下任一项应用：
1)本发明第一方面所述的引物组或本发明第二方面所述的试剂盒在非诊断目的的检测呼吸道病原体中的应用；
2)本发明第一方面所述的引物组或本发明第二方面所述的试剂盒在制备检测呼吸道病原体的产品中的应用；
3)本发明第一方面所述的引物组或本发明第二方面所述的试剂盒在检测呼吸道病原体毒株遗传变异中的应用；
4)本发明第一方面所述的引物组或本发明第二方面所述的试剂盒在构建呼吸道病原体数据库中的应用。
本发明的优点和有益效果：
本发明通过下载多种呼吸道病原体参考基因组的编码序列文件，对全部病原体的所有编码序列进行筛选，构建相似性矩阵，找出每种病原体的特异性区域，并设计每种病原体的扩增引物。本发明对引物序列进行特异性验证及多重PCR扩增条件如退火温度、引物浓度等进行调整优化，使得设计的多对特异性引物组能通过多重PCR同时检测25种呼吸道病原体。
附图说明
图1是凝胶电泳分析单重PCR引物特异性验证的结果图；
图2是凝胶电泳分析多重PCR退火温度优化的结果图；
图3是凝胶电泳分析多重PCR引物浓度优化的结果图；
图4是三代测序验证多重PCR引物浓度的结果图；
图5是三代测序技术验证多重PCR检测呼吸道病原体灵敏度的结果图。
具体的实施方式
本发明提供了一种同时检测多种呼吸道病原体的引物组。通过下载各呼吸道病原体参考基因组的编码序列文件，对全部病原体的所有编码序列进行筛选，构建相似性矩阵，找出每种病原体的特异性区域，设计每种病原体的扩增引物，并对引物序列进行特异性验证及多重PCR扩增条件如退火温度、引物浓度等进行调整优化，使得设计的多对特异性引物在进行多重PCR时能同时检测25种呼吸道病原体。本发明还使用三代测序验证了多重PCR体系检测呼吸道病原体的灵敏度。
在本发明中，术语“呼吸道”是指鼻、口、舌、喉的区域，包括鼻、口、舌、喉的粘膜。术语“呼吸道病原体”或“呼吸道病毒”是指为感冒和类流感症状的致病原的一种或多种病毒。在一些实施例中，呼吸道病原体包括但不限于博卡病毒、流感病毒、肠道病毒、麻疹病毒、腮腺病毒、冠状病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、疱疹病毒、副肠孤病毒、鼻病毒。进一步，流感病毒包括但不限于甲型流感病毒、乙型流感病毒；肠道病毒包括但不限于肠道病毒CPML_8109/08株、肠道病毒V13-0682株、肠道病毒D68型；冠状病毒包括但不限于中东呼吸综合征冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒2、人类冠状病毒229E型、人类冠状病毒HKU1型、人类冠状病毒NL63型、人类冠状病毒OC43型；腺病毒包括但不限于人类腺病毒C；呼吸道合胞病毒包括但不限于人类呼吸道合胞病毒；副流感病毒包括但不限于人类甲型副流感病毒、人类副流感病毒1型、人类副流感病毒2型、人类副流感病毒3型、人类副流感病毒4型；疱疹病毒包括但不限于人类单纯疱疹病毒3型、人类巨细胞病毒5型、人类巨细胞病毒6型、人类EB病毒4型；副肠孤病毒包括但不限于人类副肠孤病毒1型；鼻病毒包括但不限于人类鼻病毒1型、人类鼻病毒2型。在本发明的具体实施例中，呼吸道病原体包括博卡病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、肠道病毒V13-0682株、肠道病毒D68型、麻疹病毒、腮腺病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒2、人类冠状病毒229E型、人类冠状病毒HKU1型、人类冠状病毒NL63型、人类冠状病毒OC43型、人类腺病毒C、人类呼吸道合胞病毒、人类甲型副流感病毒、人类单纯疱疹病毒3型、人类巨细胞病毒5型、人类巨细胞病毒6型、人类EB病毒4型、人类副流感病毒1型、人类副流感病毒4型、人类副肠孤病毒1型、人类鼻病毒1型、人类鼻病毒2型。
在本发明中，术语“引物”或“扩增引物”是指与靶核酸或其补体杂交且参与核酸扩增反应的寡核苷酸。扩增引物与模板核酸杂交，并具有可通过聚合反应延伸的3'-OH(3'-羟基)基团。在一些实施例中，扩增引物是单链的。在一些实施例中，扩增引物是基本上单链的，包含不超过5个连续碱基对的自互补区。在一些实施例中，扩增引物是长度为15-60、15-55、15-50、15-45、15-40、15-35、15-30个碱基。在一些实施例中，扩增引物的长度为18-30个碱基。在一些实施例中，扩增引物的长度为18-60个碱基，并且包含与存在于靶核酸序列中的相应的18-30个核苷酸寡核苷酸杂交序列杂交的18-30个连续碱基(靶杂交区域)。在一些实施例中，18-30个连续的碱基在扩增引物的3'端。扩增引物可以是引物，第一扩增引物(也称为正向扩增引物或上游引物)，第二扩增引物(也称为反向扩增引物或下游引物)。在一些实施例中，特定的扩增引物含有至少约10个连续的碱基，以及任选地至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续的碱基，所述连续的碱基与靶核酸序列或其互补链的一个区域互补。连续的碱基可以与扩增引物结合的靶核酸序列至少约80％、至少约90％、至少约95％或完全互补。在一些实施例中，扩增寡聚物包含与靶核酸序列不互补的另外的3'或5'序列。所属领域的技术人员将理解，所列举的范围包括所述范围内的所有整数和有理数(例如92％或98.377％)。扩增引物可任选地包括修饰核苷酸和/或简并位置。
在本发明中，每条引物的浓度范围选自从约0至约100μM、约0至约50μM、约0至约25μM、约0至约10μM、约0.00125至约6.4μM、约0.02至约3μM、约0.025至约1μM或约0.025至约0.4μM。在本发明的具体实施例中，每条引物的浓度为0.1μM。
在本发明中，试剂盒还包含多重PCR预混液。术语“多重PCR预混液”，也称为“Multiplex PCRMaster Mix”，市面有多种商品，属于多重PCR反应体系的半成品。可以理解的是，所述PCR预混液可以含有能够独立完成PCR反应的全部组分，也可以含有其中部分组分。在一些可选的实施方式中，能够独立完成PCR反应的全部组分的PCR预混液的实例包括但不限于酶制剂、缓冲物质、表面活性剂、盐、dNTP和稳定剂。在一些可选地实施方式中，所述PCR预混液可以只包括部分反应试剂，可选地包括酶制剂、dNTP、盐和缓冲物质；可选地包括dNTP、盐、荧光染料、表面活性剂、稳定剂和缓冲物质。所述多重PCR预混液中的组分可以根据应用场景调整，例如进行常规PCR时，所述PCR预混液中还可以含有凝胶电泳的指示剂；例如进行荧光定量PCR时，其中还可以含有荧光探针或荧光染料；例如以RNA作为起始模板，其中还可以含有RNA酶抑制剂。可以理解的是，这些根据PCR不同应用场景而调整得到的PCR预混液，都属于本发明所述的PCR预混液所包含的范围。
在本发明中，酶制剂的实例包括但不限于：DNA聚合酶，或DNA聚合酶和UDG酶的组合。缓冲物质的实例包括但不限于：Tris、Tricine、Bis-Tricine、MOPS、TES、PIPES、TAPS、HEPES和CAPS中的至少一种，所述PCR反应混合物可以只含有一种缓冲物质，也可以含有多种，例如可选地以Tris和MOPS同时作为缓冲物质，可选地以Bis-Tricine和HEPES同时作为缓冲物质等。盐的实例包括但不限于：氯化钾、醋酸钾、硫酸钾、硫酸铵、氯化铵、醋酸铵、氯化镁、硫酸镁、氯化锰、硫酸锰、氯化钠、醋酸钠和氯化锂中的至少一种，所述PCR反应混合物可以只含有一种盐，也可以含有几种盐，例如同时含有氯化镁和硫酸铵，可选地含有氯化钠和氯化铵等。dNTP实例包括但不限于：dATP、dTTP、dCTP、dGTP和dUTP中的至少一种，例如所述dNTP为dATP、dTTP、dCTP和dGTP，所述dNTP也可以为dATP、dTTP、dCTP、dGTP和dUTP。稳定剂的实例包括但不限于BSA和/或明胶，BSA和明胶可以分别单独使用，也可以同时使用BSA和明胶以及其他的稳定剂。表面活性剂的实例包括但不限于吐温20、TritonX-100和十二烷基硫酸钠中的至少一种，所述PCR反应混合物中可以只含有一种表面活性剂，例如只含有吐温20、TritonX-100或十二烷基硫酸钠，也可以将几种表面活性剂联用，例如同时使用吐温20和TritonX-100，或同时使用TritonX-100和十二烷基硫酸钠。
可以理解的是，本申请对多重PCR预混液中组分的选择以及组合的方式没有限制，多重PCR预混液也可商购。在本发明中，可商购的多重PCR预混液的实例包括但不限于2×Phusion Multiplex PCR Master Mix、5×HieffCanace PCR Master Mix或2×HieffHG Multiplex PCRMaster Mix；在本发明的具体实施例中，所述多重PCR预混液为2×Phusion Multiplex PCRMaster Mix。
本发明还提供了用于确定样品中呼吸道病原体的存在与否或者定量其数量的试剂盒。所述的试剂盒包括：本发明所描述的用于扩增呼吸道病原体目的基因的引物组。在一些实施例中，可以在试剂盒中提供本发明所述的任何扩增引物对。在本发明中，术语“试剂盒”是指试剂及其他材料的组合。试剂盒的实例包括但不限于微阵列、芯片、标记物。术语“试剂盒”不意图限于某种特定的试剂和/或材料组合。
在本发明中，试剂盒还包括样品RNA提取试剂、阳性质控品、阴性质控品中的一种或多种；所述阳性质控品为含各目标病原体特异核酸片段的质粒DNA。术语“质粒”是指通过基因工程技术获得的小、环状、双链、自我复制DNA分子，能够将感兴趣的遗传物质转移到细胞中，从而在靶细胞中产生由所述遗传物质(例如蛋白多肽，肽或功能性RNA)编码的产物。此外，术语“质粒”还指小的、环状、双链、自我复制的DNA分子，其通过在病毒载体的生产过程中使用的基因工程技术获得，所述病毒载体作为重组载体基因组的载体。
在本发明中，质粒的实例包括但不限于公知的表达系统(包括原核和真核系统)的可商购表达载体，例如pSE420、pYES2、pNU100、pNU200、pNU211、pHY500、pNU211R2L5、pHT110R2L5、pcDNATM、pVAX、pHT210、pUC57。通过使用常规的技术和容易获得的起始原料，任何可商购的DNA质粒的骨架可以进行修饰以优化在宿主细胞中的蛋白表达，例如逆转某些元件的方向(如复制起点)，替换质粒内源的启动子，和/或替换编码转录的蛋白的多核苷酸序列。在本发明的具体实施例中，所述质粒的载体为pUC57。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例同时检测多种呼吸道病原体
1、实验材料与试剂
2×Phusion Multiplex PCR Master Mix，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；DNAMarker(100-2000bp)，生工生物工程(上海)有限责任公司；Nuclease-free water(无核酸酶水，ddH2O)，英杰生物科技(中国)有限公司；琼脂糖，1×TAE，翌圣生物科技(上海)股份有限公司；6×DNALoading Buffer(6×DNA加样缓冲液)，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；测序相关试剂盒(SQK-RBK096、EXP-FLP002、EXP-WSH004)，R9.4.1Flowcell芯片，MinIONMK1C测序仪，牛津纳米孔科技(上海)有限公司。
2、实验仪器与设备
Sorvall Legend Micro 21R微量离心机，电泳仪及水平电泳槽，凝胶成像仪，T100PCR仪，博莱德生命科学(上海)有限公司；冰箱，西门子(中国)有限公司；涡旋混合器，赛洛捷克(上海)生物科技有限公司；电子天平，长沙湘平科技发展有限公司；生物安全柜，北京东联哈尔仪器制造有限公司。
3、目的基因的选择和质粒的构建
分析病毒种属之间差异，选择特异性的保守基因作为检测目的基因；在美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)中GenBank数据库上下载目的基因的核酸序列，将目标基因的核酸序列与NCBI数据库进行BLAST比对，验证其特异性；送擎科生物股份有限公司进行目的基因质粒的合成(采用pUC57质粒作为载体)，质粒原始浓度为1×1012copies/mL，用ddH2O倍比稀释至1×101copies/mL。
4、引物设计及合成
下载以下呼吸道病毒参考基因组的编码序列文件，对全部病毒的所有编码序列进行筛选，构建相似性矩阵，找出每种病毒的特异性区域。随后用primer3软件设计每种病毒的扩增引物，MFEprimer软件和Dimer check软件检查引物的特异性和二聚化情况。最后Blast分析检查扩增子特异性情况，引物组信息见表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司代为合成，引物纯化方式为iPAGE，引物合成之后用ddH2O稀释到浓度10μM，-20℃保存备用。
表129对引物组、目的基因和扩增产物长度
5、引物特异性验证
以构建好的质粒DNA为模板，分别对上述29对引物进行单重PCR特异性验证。依据扩增酶说明书推荐的PCR反应体系：PCR预混液(PCRMaster Mix)20μL，DNA模板3.0μL，上下游引物(10μM)各1μL。PCR反应条件：98℃预变性5min；98℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min。PCR产物取20μL用于琼脂糖凝胶电泳分析(质量分数为1.5％)，并将PCR产物进行测序以验证扩增的准确性。
6、多重PCR条件优化
以29种呼吸道病毒的混合质粒DNA为模板构建多重PCR反应体系。多重PCR反应基本体系：2×Multiplex PCR Master Mix 5μL，混合引物2.5μL，混合DNA模板2.5μL，体系总体积10μL；多重PCR反应基本条件：98℃变性30s，98℃变性10s，55℃复性30s，72℃延伸40s，循环35次；72℃延伸5min。琼脂糖凝胶电泳分析条件：核酸染料10μL/100mL，电泳液1×TAE，PCR扩增产物上样量10μL，电压120V，电泳时间约为30min。
1)退火温度优化：根据引物设计结果，理论退火温度为59-61℃之间，本研究遂以55-65℃为区间，2℃为梯度，分别设置退火温度为55.0、57.0、59.0、61.0、63.0、65.0℃进行多重PCR反应。同时在多重PCR反应体系中加入29对引物组和29种呼吸道病毒混合模板，进行多重PCR引物扩增反应及琼脂糖凝胶电泳分析。
2)引物浓度优化：在优化的退火温度条件下，设置引物添加浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4μM的多重PCR反应与电泳凝胶鉴定。根据电泳凝胶结果，本研究继续开展引物浓度梯度的三代测序验证，设置引物添加浓度(每条)为6.4μM、3.2μM、1.6μM、1.2μM、0.8μM、0.4μM、0.2μM、0.1μM、0.05μM、0.025μM和0.00125μM，依据快速建库试剂盒RBK096的protocol进行文库构建，测序平台为MinION MK1C测序仪搭配R9.4.1Flowcell芯片。简要步骤为，准备9μLPCR产物，加入1μL对应的barcode条码，30℃孵育2min，80℃孵育2min后置于冰上冷却。将所有条码标记的文库混合，用AMpure XPbeads纯化，纯化产物加入测序接头后进行上机测序，测序时间4h。
7、结合三代测序技术开展多重PCR灵敏度验证
采用优化的退火温度及引物浓度，对模板浓度1×105copies/mL～1×101copies/mL进行多重PCR反应并建库测序，建库检测程序同引物浓度优化的建库检测程序一致，测序时间为1h，测序完成后进行数据统计。
8、数据及统计学分析
测序数据经过测序仪内置的Guppy软件进行barcode拆分，使用Blast分析软件对下机数据进行物种鉴定，统计各呼吸道病原体的序列数量和检出的病毒种类。
9、实验结果
单重PCR特异性验证实验结果如图1所示，结果显示29种病毒均能扩增出目标条带且无非特异性扩增。且PCR产物的测序结果通过与目的基因进行序列比对，相似率均达到99.6％以上，扩增产物均与目标基因序列高度一致。以上结果表明本发明设计的29种引物具有高度特异性。
多重PCR退火温度优化的实验结果如图2所示，结果显示当退火温度设置为55-65℃时，多重PCR均能扩增出特异性目标条带，55℃时条带亮度较亮，引物二聚体较少，因此本发明挑选55℃作为后续实验的退火温度。
凝胶电泳鉴定引物浓度优化的实验结果如图3所示，结果显示引物浓度为0.1μM时，条带较亮，0.2μM与0.4μM其次，扩增产物条带长度与目的条带长度相符。三代测序验证引物浓度优化的结果如图4所示，在引物添加浓度为0.1μM-3.2μM之间时，检出病原体种类数稳定在20种左右，而0.1μM浓度组病原体序列数最高，与凝胶图结果一致。因此，综合选择0.1μM作为本发明多重PCR体系的最佳引物浓度。
多重PCR灵敏度验证实验结果如图5所示，结果显示当模板浓度为1×105copies/mL和1×104copies/mL时，扩增产物读长(reads)和病毒种类结果较为稳定，除了表1中的Enterovirus sp.isolate CPML_8109/08、MERS_Cov、Human parainfluenza 2和Humanparainfluenza 3不能稳定检出，其它的25种呼吸道病毒均能同时检出。其中序列占比较高的病原体是Enterovirus D68、Human parechovirus 1、Human parainfluenza 1和Humanrhinovirus 1等病原体，病毒reads占比均在10％以上，占比较低的病原体是Humanrespiratory syncytial virus、Human coronavirus 229E、Human coronavirus OC43和MERS_CoV等病原体，病毒reads占比均在1％左右。当模板浓度1×103copies/mL-1×101copies/mL，反应体系几乎无法检出病原体序列。因此，1×104copies/mL是本检测体系的灵敏度极限值。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种检测呼吸道病原体的引物组，其特征在于，所述引物组包括检测博卡病毒、流感病毒、肠道病毒、麻疹病毒、腮腺病毒、冠状病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、疱疹病毒、副肠孤病毒、鼻病毒中的一种或多种引物对；
优选地，所述流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒；
优选地，所述肠道病毒包括肠道病毒CPML_8109/08株、肠道病毒V13-0682株、肠道病毒D68型；
优选地，所述冠状病毒包括中东呼吸综合征冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒2、人类冠状病毒229E型、人类冠状病毒HKU1型、人类冠状病毒NL63型、人类冠状病毒OC43型；
优选地，所述腺病毒包括人类腺病毒C；
优选地，所述呼吸道合胞病毒包括人类呼吸道合胞病毒；
优选地，所述副流感病毒包括人类甲型副流感病毒、人类副流感病毒1型、人类副流感病毒2型、人类副流感病毒3型、人类副流感病毒4型；
优选地，所述疱疹病毒包括人类单纯疱疹病毒3型、人类巨细胞病毒5型、人类巨细胞病毒6型、人类EB病毒4型；
优选地，所述副肠孤病毒包括人类副肠孤病毒1型；
优选地，所述鼻病毒包括人类鼻病毒1型、人类鼻病毒2型；
优选地，所述引物组包括如SEQ ID NO.1-58所示的核酸序列。
2.一种检测呼吸道病原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括多重PCR反应物；所述多重PCR反应物包括权利要求1所述的引物组；
优选地，以所述多重PCR反应物的总体积为基准，所述多重PCR反应物中每条引物的浓度选自0.00125-6.4μM；
优选地，所述每条引物的浓度选自0.025-0.4μM；
优选地，所述每条引物的浓度为0.1μM。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR反应物还包括多重PCR预混液；
优选地，所述多重PCR预混液包括2×Phusion Multiplex PCRMaster Mix、5×HieffCanace PCR Master Mix或2×HieffHG Multiplex PCR Master Mix；
优选地，所述多重PCR预混液为2×Phusion Multiplex PCRMaster Mix。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品RNA提取试剂、阳性质控品、阴性质控品中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含各目标病毒特异核酸片段的质粒DNA；
优选地，所述质粒的载体为pUC57。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括使用说明书；
优选地，所述呼吸道病原体包括博卡病毒、流感病毒、肠道病毒、麻疹病毒、腮腺病毒、冠状病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、疱疹病毒、副肠孤病毒、鼻病毒中的一种或多种；
优选地，所述流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒；
优选地，所述肠道病毒包括肠道病毒V13-0682株、肠道病毒D68型；
优选地，所述冠状病毒包括严重急性呼吸综合征冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒2、人类冠状病毒229E型、人类冠状病毒HKU1型、人类冠状病毒NL63型、人类冠状病毒OC43型；
优选地，所述腺病毒包括人类腺病毒C；
优选地，所述呼吸道合胞病毒包括人类呼吸道合胞病毒；
优选地，所述副流感病毒包括人类甲型副流感病毒、人类副流感病毒1型、人类副流感病毒4型；
优选地，所述疱疹病毒包括人类单纯疱疹病毒3型、人类巨细胞病毒5型、人类巨细胞病毒6型、人类EB病毒4型；
优选地，所述副肠孤病毒包括人类副肠孤病毒1型；
优选地，所述鼻病毒包括人类鼻病毒1型、人类鼻病毒2型。
7.权利要求1所述的引物组在制备权利要求2-6任一项所述的试剂盒中的应用。
8.一种非诊断目的的检测呼吸道病原体的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的引物组；
优选地，所述方法还包括使用多重PCR预混液；
优选地，所述多重PCR预混液包括2×Phusion Multiplex PCRMaster Mix、5×HieffCanace PCR Master Mix或2×HieffHG Multiplex PCR Master Mix；
优选地，所述多重PCR预混液为2×Phusion Multiplex PCRMaster Mix；
优选地，所述多重PCR反应的退火温度选自55-65℃；
优选地，所述多重PCR反应的退火温度为55℃；
优选地，所述多重PCR反应的基本条件包括：98℃变性30s，98℃变性10s，55℃复性30s，72℃延伸40s，循环35次；72℃延伸5min。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括鉴定多重PCR扩增产物；
优选地，鉴定多重PCR扩增产物的方法包括使用凝胶电泳和/或测序技术；
优选地，所述测序技术包括使用多重PCR扩增产物构建文库进行测序；
优选地，所述文库包括三代测序文库；
优选地，所述三代测序文库选择试剂盒RBK096的protocol构建文库。
10.如下任一项应用：
1)权利要求1所述的引物组或权利要求2-6任一项所述的试剂盒在非诊断目的的检测呼吸道病原体中的应用；
2)权利要求1所述的引物组或权利要求2-6任一项所述的试剂盒在制备检测呼吸道病原体的产品中的应用；
3)权利要求1所述的引物组或权利要求2-6任一项所述的试剂盒在检测呼吸道病原体毒株遗传变异中的应用；
4)权利要求1所述的引物组或权利要求2-6任一项所述的试剂盒在构建呼吸道病原体数据库中的应用。
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