CN116966138A - 一种凝胶在制备提升amh值的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于治疗卵巢储备功能下降技术领域，具体公开了一种凝胶在制备提升AMH值的药物中的应用，该凝胶采用复合植物发酵浓缩液作为活性组分，复合植物发酵浓缩液中含有来自复合植物原料发酵得到的小分子卵巢细胞营养素，还含有乳酸杆菌发酵溶胞产物，能够修复卵巢，改善卵巢储备功能减退。该凝胶中的小分子卵巢细胞营养素通过修复和营养卵巢细胞，恢复卵巢功能，改善卵巢储备功能诚退，表现为血清中AMH浓度的增加，对于AMH值较低的育龄妇女，AMH值均有不同程度提高，反应出本凝胶产品对女性卵巢功能和储备功能改善的重大应用前景，市场应用广泛。

Description

一种凝胶在制备提升AMH值的药物中的应用
技术领域
本发明涉及治疗卵巢储备功能下降技术领域，具体来说，涉及一种凝胶在制备提升AMH值的药物中的应用。
背景技术
卵巢功能减退是指卵巢在女性特定年龄段内，通常是40岁以后，逐渐丧失其正常功能的过程。这包括卵巢内卵母细胞的数量减少、质量下降以及激素分泌能力的减弱。其中卵巢内卵母细胞的数量减少和质量下降是卵巢储备功能减退(DOR)的表现，也被称为卵巢储备功能下降。临床表现为月经量减少、月经周期紊乱、闭经、难以怀孕以及出现更年期症状等。抗缪勒管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)通常被认为是反映卵巢储备功能的指标之一，AMH是卵泡中产生的激素，它与卵泡的数量成正相关。因此，AMH水平的下降是卵巢储备功能减退的一种指标。
相比较其他传统的生物学指标，AMH不受下丘脑﹣垂体﹣卵巢轴的调控，在月经周期中基本恒定，是评价卵巢衰老程度及卵巢储备功能最准确的生物标志物。比如中国专利申请CN115297929A公开一种调节卵泡生成以治疗卵巢衰老的组合物和方法，提供了与抗缪勒管激素(AMH)的经修饰蛋白质相关的方法和组合物，用于调节女性的卵泡生成，特别是调节卵泡的活化和成熟以及未成熟(原始)卵泡的耗减。再比如中国专利申请CN113368190A公开了一种治疗卵巢功能减退的中药组合物，该中药组合物由有效成分与药物辅料制备而成，有效成分的组成及其重量份为：炒白术5-30份、熟地8-25份、制黄精10-40份、炒白芍5-20份、鸡血藤10-40份、龟板3-12份、鹿角片3-12份、丹参5-25份、杜仲3-12份、党参8-25份、制香附3-12份和枳壳3-12份，该中药组合物可显著缓解卵巢功能减退相关的月经量减少症状，对反映卵巢储备功能下降的相关激素AMH具有调节作用。但是上述中药组合物因活性功效成分量少且分子量较大，不适合外用且治疗效果相对较差。
所以当前需要一种能够改善卵巢储备功能减退，显著提升AMH值的外用产品。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种凝胶在制备提升AMH值的药物中的应用，该凝胶采用复合植物发酵浓缩液作为活性组份，复合植物发酵浓缩液中含有来自复合植物原料发酵得到的小分子卵巢细胞营养素，还含有乳酸杆菌发酵溶胞产物，对卵巢功能减退和卵巢储备功能减退的女性，能够帮助修复卵巢功能，从而改善卵巢储备功能减退，反映为血清中AMH浓度得到提升。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种凝胶在制备提升AMH值的药物中的应用。
优选地，所述的凝胶按照重量份数计，包括如下组分：复合植物发酵浓缩液10-70份、含银抑菌剂0.2-2份、表面活性剂5-30份、辅料1-10份、纯化水10-50份和丙三醇2-10份；所述的复合植物发酵浓缩液是以葛根提取物、黄精提取物、显齿蛇葡萄提取物、益智提取物、丁香提取物为复合植物原料，经复合乳酸杆菌发酵得到次级代谢产物；所述的复合乳酸杆菌包括植物乳杆菌、干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌。
优选地，所述复合植物发酵浓缩液由以下重量份数的原料制备得到：纯化水80-90份、葛根提取物4.5-8.0份、黄精提取物1.3-3.5份、显齿蛇葡萄提取物0.7-2.4份、益智提取物0.7-2.2份、丁香提取物0.4-1.3份和复合乳酸杆菌3.5-7.5份。
优选地，所述复合植物发酵浓缩液的制备工艺为：将植物原料葛根提取物、黄精提取物、显齿蛇葡萄提取物、益智提取物、丁香提取物和水混合后，调pH至2-7，加入扩培后的乳酸杆菌，经过发酵、浓缩至20℃相对密度为0.9-1.2，离心、灭菌。
优选地，所述发酵条件为35-39℃发酵5-8天。
优选地，所述离心条件为3000-5000r/min离心10-30min。
优选地，所述含银抑菌剂选自Jewel Silver II、Procare ESI、AC1000-D和HYMAg-M中的至少一种。
优选地，所述表面活性剂选自泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、吐温80、司班80、AES、AOS、AEO-7、椰油酸二乙醇酰胺和椰油酰胺丙基甜菜碱中的一种或多种。
优选地，所述纯化水选自蒸馏水和/或去离子水；所述辅料选自1,2-己二醇、1,2-戊二醇和异戊二醇中的至少一种。
优选地，上述凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、将纯化水加入搅拌锅中，搅拌升温至70-95℃、保温20-40min；
S2、称取复合植物发酵浓缩液和辅料，搅拌均匀得混合物；
S3、向步骤S1的搅拌锅中加入步骤S2的混合物和含银抑菌剂，搅拌至均匀；
S4、在搅拌下加入表面活性剂，保持温度、浸泡1-3h；浸泡完成后，搅拌至溶解、完全透明；
S5、搅拌下，分次加入丙三醇，搅拌至均匀；
S6、抽检合格后，过滤出料，密封静置、检验、灌装、包装、入库。
优选地，步骤S1所述搅拌的速度为10-20转/分钟；步骤S4所述搅拌下加入表面活性剂的搅拌速度和浸泡完成后搅拌的速度为5-10转/分钟，步骤S5所述搅拌的速度为20-30转/分钟。
优选地，所述药物的治疗疾病包括卵巢储备功能减退、多囊卵巢综合征、卵巢炎症和卵巢早衰。
优选地，所述药物的给药途径为腔道给药。
具体地，所述药物的给药途径为阴道给药。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种凝胶在制备提升AMH值的药物中的应用，该凝胶中的小分子卵巢细胞营养素通过修复和营养卵巢细胞，恢复卵巢功能，改善卵巢储备功能减退，表现为血清中AMH浓度的增加。对于AMH值较低的育龄妇女，使用本发明的凝胶后，AMH值均有不同程度提高，这反应出本凝胶产品对女性卵巢功能和储备功能改善的重大应用前景，市场应用广泛。
附图说明
图1为本发明实验例2中用药前AMH含量与年龄的关系图；
图2为本发明实验例2中用药后AMH含量与年龄的关系图；
图3为本发明实验例2中用药前后AMH增量与年龄的关系图；
图4为本发明实验例2中用药前后AMH增长率与年龄的关系图；
图5为本发明实验例3中用药前AMH含量与BMI的关系图；
图6为本发明实验例3中用药后AMH含量与BMI的关系图；
图7为本发明实验例3中用药前后AMH增量与BMI的关系图；
图8为本发明实验例3中用药前后AMH增长率与BMI的关系图；
图9为本发明实验例2中用药前后均值和中位数的AMH含量增长关系图，其中a为均值，b为中位数。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
以下原料来源，为示例性说明：
葛根提取物：KUDZU ROOT P.E.，购自西安天一生物技术股份有限公司；
黄精提取物：PolygonatuM officinale,ext.，购自西安天一生物技术股份有限公司；
显齿蛇葡萄提取物：显齿蛇葡萄(AMPELOPSIS GROSSEDENTATA)提取物，购自湖州浦瑞生物医药技术有限公司；
益智提取物：购自湖南朗林生物资源股份有限公司；
丁香提取物：购自陕西帕尼尔生物科技有限公司；
含银抑菌剂：Jewel Silver II，购自德国哈恩生物科技有限有限公司；
表面活性剂：泊洛沙姆407，市售；
乳酸杆菌：植物乳杆菌NDC75017（活菌数2.0×1010CFU/g）、嗜酸乳杆菌NCFM（活菌数2.0×1010CFU/g），东北农业大学乳品科学教育部重点实验室保藏菌株；人源干酪乳杆菌NCU011056（活菌数2.0×1010CFU/g），南昌大学食品科学与技术国家重点实验室保藏菌株；
pH调节剂：柠檬酸，市售；
辅料：1,2-己二醇，市售；
丙三醇、去离子水：市售。
实施例1
1、复合植物发酵浓缩液的制备
（1）培养基制备：将葛根提取物6份、黄精提取物2份、显齿蛇葡萄提取物1.6份、益智提取物1.6份、丁香提取物0.8份、水84份加入三角瓶中，用柠檬酸调pH至3.5，混匀，瓶口加棉塞，包扎报纸，在手提式高压灭菌锅内，115℃温度条件下灭菌20min，取出作为液体培养基备用。
（2）菌种扩培：在无菌条件下，用接种环分别挑取一环植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌菌体，移入已灭菌的不同试管中，划曲线，在32℃条件下，平卧试管培养7天，等菌落长成后，于以上相同操作条件下再次移接，培养条件与上同。菌种经过3代的活化过程后用于实验。
（3）发酵：选择的培养温度为35℃±1℃，将无菌水加入活化后斜面试管中，洗脱孢子，用灭菌移管液吸取孢子悬浮液，以4%的接种量（植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌的质量比为1：1.5：1.5）移入备用的液体培养基中，摇床培养，转速120转/分，培养温度35℃，培养发酵7天。取发酵液浓缩至20℃相对密度为1.05，4000r/min离心20min，灭菌。
2、凝胶的制备
具体配方见表1。制备工艺如下：
1）将纯化水加入搅拌锅中，20转/分钟搅拌，升温至85℃、保温30min；
2）另取一消毒干燥好的容器，称取复合植物发酵浓缩液和辅料，搅拌均匀；
3）待步骤1）的搅拌锅中的物料保温完全，保持搅拌，开启冷却水降温。降至30℃下加入步骤2）的混合物、含银抑菌剂，搅拌至均匀；
4）在缓慢搅拌（10转/分钟）下，加入表面活性剂，保持温度、浸泡2h；浸泡完成后，10转/分钟搅拌至溶解、完全透明；
5）30转/分钟搅拌下，分三次缓慢加入丙三醇，搅拌至均匀；
6）抽检合格后，过滤出料，密封静置、检验、灌装、包装、入库。
对比例1
1、复合植物发酵浓缩液的制备
（1）培养基制备：将葛根提取物8份、黄精提取物4份、水84份加入三角瓶中，用柠檬酸调pH至3.5，混匀，瓶口加棉塞，包扎报纸，在手提式高压灭菌锅内，115℃温度条件下灭菌20min，取出备用。
（2）菌种扩培：同实施例1。
（3）发酵：同实施例1。
2、凝胶的制备
具体配方见表1。制备工艺同实施例1。
表1 实施例和对比例的凝胶配方
对比例2
取葛根提取物6份、黄精提取物2份、显齿蛇葡萄提取物1.6份、益智提取物1.6份、丁香提取物0.8份和水84份，混匀后得组合物备用。
实验例1 凝胶对DOR大鼠的影响
1、建模：将12周龄雌性SD大鼠适应性喂养一周后，连续两周每日定时使用瑞氏-姬姆萨（Wright-Giemsa）复合染液对所有大鼠行阴道脱落细胞观察。使用20μL移液器吸取0.9%氯化钠溶液，缓慢插入大鼠阴道内约0.3cm，反复抽吸3遍，将移液器枪头中含有脱落细胞的液体均匀转移至载玻片上，按照Wright-Giemsa说明书操作进行细胞染色观察，筛选出动情周期正常的大鼠，随机选取其中10只大鼠纳入正常组，剩余大鼠采用一次性腹腔注射环磷酰胺（cyclophosphamide,CTX）75mg/kg诱导DOR模型法，造模前所有大鼠均禁食禁饮12h，用10mL 0.9%氯化钠溶液配制0.2g CTX，将配制好的溶液置于4℃冰箱保存并于2h内注射完毕，腹腔注射部位均选择大鼠左侧下腹部，同时将大鼠处于头低位，针头与腹壁呈45°角进针，避免刺伤膀胱及腹腔脏器，针头刺入腹腔约0.5cm后回抽，确保针头进入腹腔，缓慢推注药物，用拇指顺时针轻柔大鼠腹部10s促使药物分布。正常组大鼠注射同剂量0.9%氯化钠溶液，随后两周每日定时对造模组大鼠行阴道脱落细胞学观察，大鼠正常动情周期为4-5d，若动情周期发生紊乱，并以动情周期延长为主要表现，提示造模成功。
2、分组与用药：将造模成功的大鼠随机分模型组、实施例1组、对比例1和对比例2，每组10只，实施例1组和对比例1组分别使用实施例1和对比例1的凝胶0.3g/kg，缓慢插入大鼠阴道内约0.3cm给药；对比例2组灌胃对比例2的组合物0.8g/kg；正常组和模型组给药同剂量的氯化钠溶液，各组每天给药一次，给药3周后，以10%的水合氯醛(0.6ml/只)的剂量进行腹腔注射，在麻醉状态下进行腹主动脉取血，于室温下静置1h，以3000r/min进行离心10min，随后取出血清静置待用。用大鼠AMH ELISA试剂盒（上海科艾博生物技术有限公司，货号CB10627-Ra）检测AMH，并按试剂盒的说明书严格进行操作。
3、实验结果：模型组相比正常组，AMH值显著降低；实施例与模型组相比，能够显著提高AMH的值，而对比例虽然能够升高AMH含量，但是效果并不显著。说明本发明的凝胶能够显著提高AMH值。具体结果如表2所示。
表2 各组对DOR大鼠AMH的影响
注：与正常组比较，##代表P<0.01，与模型组比较，代表P<0.01。
实验例2 凝胶对不同年龄样本的AMH值的影响
志愿者选取标准：对自身卵巢健康特别关注的女性志愿者，先进行一轮填表筛选，触发了自然不孕，月经不调，性欲下降，潮热出汗等四项中任一项的志愿者被选入意向名单。然后判断卵巢功能比较低的，相应基础AMH值可能也都比较低的安排参加体检。
实验方法：选取符合要求的志愿者43名（30-50周岁），使用实施例1的凝胶，将本产品直接推入阴道中。2.5克1支，非经期每天使用1支，连续使用21天。检测AMH值。使用pearson相关性分析43名志愿者的AMH增值随年龄变化的趋势：其中30-44周岁（32名）的志愿者较为集中，按30-34，35-39和40-44岁对其进行年龄分层分析，具体结果如表3和图1-图4所示。使用t检验和wilcox检验分别分析用药前后志愿者均值和中位数的AMH增长情况（具体计算方法为：使用凝胶前，43位志愿者的AMH值取平均数作为用药前的均值，按AMH值大小排序，第22位志愿者的AMH值作为用药前的中间值；使用凝胶后，43位志愿者的AMH值取平均数作为用药后的均值，按AMH值大小排序，第22位志愿者的AMH值作为用药后的中间值。）。并将使用凝胶后AMH增高的用户定义为有效，分析用药的有效率和增长率，具体结果如表4-表5和图9所示。
图1-图9中R表示相关系数，是研究变量之间线性相关程度的量，取值为正值时，表示两个随机变量之间呈正相关关系；取值为负值时，表示两个随机变量之间呈负相关关系；取值为0时，表示两个随机变量之间线性无关；P表示用于判断实际观察结果与原假设之间的一致性，如果P值较小（通常小于0.05），则认为观察结果与原假设不一致，即可以拒绝原假设，本发明中原假设是指使用了本发明产品后AMH值没有变化，基于P值小于0.05，从而推翻了该假设，得出了使用本发明产品前后，AMH值有了显著变化。
表3 凝胶对不同年龄段的有效率和增长率占比
根据表3结果可知，不同年龄段用户之间的有效率并无显著差异，具有可比性。
表4 使用凝胶前后的均值和中位数的增长率情况
根据表4和图9结果对比可知，与用药前相比，在使用凝胶后，43位志愿者AMH平均值增加约43%，中间值增加约83%，说明使用本发明的凝胶后可以显著增加AMH值。
表5 使用凝胶前后的有效率情况
根据表5可知，使用凝胶后，总有效用户占比为72%，显著高于50%。
根据图1和图2结果可知，无论使用凝胶与否，随着年龄的增长，AMH值逐步降低，至50岁左右，AMH值降低到接近0，这也客观反映了卵巢储备功能随年龄增加递减的规律。
根据图3可知，使用21支凝胶后，不同年龄段AMH增加值有所不同，增加值随年龄有递减趋势。这说明，越早调节，AMH增加值越高。
根据图4可知，使用21支凝胶后，虽然AMH增加值随年龄递减，但AMH增长率却随年龄有递增的趋势。这说明，对于年龄较大的人群，虽然AMH增加值相对降低，但因其基数较低，AMH值增长率却有所增加。
实验例3 凝胶对不同BMI样本的AMH值的影响
实验方法：选取实验例2中的43名志愿者，按“BMI=体重kg/(身高cm/100)^2”计算得到BMI值，使用pearson相关性分析使用前后AMH值与BMI变化的趋势，按“BMI<20”为过轻，“20-25”为正常，“>25”为过重，对BMI进行分组，使用实施例1的凝胶，将本产品直接推入阴道中。2.5克1支，非经期每天使用1支，连续使用21天。检测AMH值，比较AMH变化值与BMI的关系。
具体结果如图5-图8所示。
根据图5，图6，图7可知，使用凝胶前的AMH值，使用凝胶后的AMH值，以及AMH增长差值这三个指标随着BMI变化并没有显著变化趋势（P值均大于0.05）。这说明AMH值高低与BMI关联性不大；使用凝胶干预后，AMH增加值对不同BMI人群增加值没有明显差异。
根据图8可知，使用凝胶后，AMH增长率随着BMI的增大显著增大，说明本发明的凝胶对BMI指数偏大的患者增长效果好。
以上是结合具体实施例对本发明进一步的描述，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种凝胶在制备提升AMH值的药物中的应用，其特征在于，所述的凝胶按照重量份数计，包括如下组分：复合植物发酵浓缩液10-70份、含银抑菌剂0.2-2份、表面活性剂5-30份、辅料1-10份、纯化水10-50份和丙三醇2-10份。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的复合植物发酵浓缩液是以葛根提取物、黄精提取物、显齿蛇葡萄提取物、益智提取物、丁香提取物为复合植物原料，经复合乳酸杆菌发酵得到次级代谢产物；所述的复合乳酸杆菌包括植物乳杆菌、干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述复合植物发酵浓缩液由以下重量份数的原料制备得到：纯化水80-90份、葛根提取物4.5-8.0份、黄精提取物1.3-3.5份、显齿蛇葡萄提取物0.7-2.4份、益智提取物0.7-2.2份、丁香提取物0.4-1.3份和复合乳酸杆菌3.5-7.5份。
4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述含银抑菌剂选自Jewel Silver II、Procare ESI、AC1000-D和HYMAg-M中的至少一种；所述表面活性剂选自泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、吐温80、司班80、AES、AOS、AEO-7、椰油酸二乙醇酰胺和椰油酰胺丙基甜菜碱中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纯化水选自蒸馏水和/或去离子水；所述辅料选自1,2-己二醇、1,2-戊二醇和异戊二醇中的至少一种。
6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、将纯化水加入搅拌锅中，搅拌升温至70-95℃、保温20-40min；
S2、称取复合植物发酵浓缩液和辅料，搅拌均匀得混合物；
S3、向步骤S1的搅拌锅中加入步骤S2的混合物和含银抑菌剂，搅拌至均匀；
S4、在搅拌下加入表面活性剂，保持温度、浸泡1-3h；浸泡完成后，搅拌至溶解、完全透明；
S5、搅拌下，分次加入丙三醇，搅拌至均匀；
S6、抽检合格后，过滤出料，密封静置、检验、灌装、包装、入库。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的治疗疾病包括卵巢储备功能减退、多囊卵巢综合征、卵巢炎症和卵巢早衰。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的给药途径为腔道给药。
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