CN105106431A - 治疗奶牛卵巢静止和持久黄体不孕症的中药灌注剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗奶牛卵巢静止和持久黄体不孕症的中药灌注剂及其制备方法,其中制备方法包括如下步骤:将中药原料粉碎混匀,以乙醇为溶剂,采用超声辅助提取法进行两阶段提取,其中第一提取阶段采用的溶剂为体积浓度为95%的乙醇,第二提取阶段采用的溶剂为体积浓度为60%的乙醇;中药原料由如下组分组成:淫羊藿18重量份,益母草18-25重量份,阳起石11-17重量份,熟地9-14重量份,枸杞子12-15重量份,当归9-15重量份,赤芍8-14重量份。本发明药物利用率高,效果好。
Description
技术领域
本发明涉及中药制剂技术领域,尤其涉及一种治疗奶牛卵巢静止和持久黄体不孕症的中药灌注剂及其制备方法。
背景技术
奶牛养殖业是我国畜牧业的重要组成部分,牛奶是大多数家庭必不可少的消费品,也是重要的“菜篮子”产品。但是,作为当今奶牛生产中危害最大的疾病之一---奶牛不孕,却严重地制约着奶牛业的发展。在奶牛不孕症中,卵巢静止、持久黄体和子宫炎不孕的比例最大,每年我国仅因奶牛卵巢疾病性不孕造成的经济损失就达数亿元。目前兽医临床上治疗上述病症一般采用激素和抗生素,这类药物副作用大,长期使用不仅危害动物体质,也严重影响着人类的健康和安全。也有采用纯中药制剂,来治疗奶牛不孕。但存在着效果差,药物利用度低,药效发挥时间慢,质量可控性差、使用不便等不足。
发明内容
有鉴于此,本发明实施例提供一种治疗奶牛卵巢静止和持久黄体不孕症的中药灌注剂及其制备方法,主要目的是一种效果好的中药灌注剂。
为达到上述目的,本发明主要提供如下技术方案:
一方面,本发明实施例提供了一种治疗奶牛卵巢静止和持久黄体不孕症的中药灌注剂的制备方法,包括如下步骤:
将中药原料粉碎混匀,以乙醇为溶剂,采用超声辅助提取法进行两阶段提取,其中第一提取阶段采用的溶剂为体积浓度为95%的乙醇,第二提取阶段采用的溶剂为体积浓度为60%的乙醇;
所述中药原料由如下组分组成:淫羊藿18重量份,益母草18-25重量份,阳起石11-17重量份,熟地9-14重量份,枸杞子12-15重量份,当归9-15重量份,赤芍8-14重量份。
作为优选,所述第一提取阶段的料液比1g∶11-13mL,第一提取阶段提取一次,提取25min;所述第二提取阶段的料液比1g∶9-10mL,所述第二提取阶段提取2次,每次提取25min。
作为优选,所述第一提取阶段的料液比1g∶12mL;所述第二提取阶段的料液比1g∶10mL。
作为优选,所述中药原料由如下组分组成:淫羊藿18重量份,益母草21重量份,阳起石14重量份,熟地11重量份,枸杞子13重量份,当归12重量份,赤芍11重量份。
作为优选,将第一提取阶段和第二提取阶段所得滤液合并在一起,回收滤液中的乙醇后得到含有有效组分的浓缩液,浓缩液中添加增溶剂,并用缓冲溶液调节pH值,用灭菌蒸馏水调节药液浓度。
作为优选,所述增溶剂为添加吐温-80;所述缓冲液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液。
作为优选,所述灌注剂pH为6.6~6.8,每毫升灌注剂含生药1.0g。
作为优选,所述灌注剂以250mL单位进行分装,并高压灭菌。
另一方面,本发明实施例提供了一种治疗奶牛卵巢静止和持久黄体不孕症的中药灌注剂,其由上述制备方法制备而成。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
本发明实施例提供的一种治疗奶牛卵巢静止和持久黄体不孕症的中药灌注剂及其制备方法采用中药替代激素、抗生素和化学药品治疗奶牛不孕,大大减少了这些药物对人类健康带来的不良影响,不但是可持续畜牧业发展的需要,也是人们对提高生活质量和绿色食品消费的要求。灌注剂相比全身用药,局部用药可直达患处,直接对病症进行治疗,药物利用率高,药效发挥时间快,质量可控性高,使用方便。
本发明实施例的方法采用超声辅助的溶剂法提取方法,通过超声波辅助增加溶剂穿透力,加速药物有效成分进入溶剂,从而加速药材中有效成分在溶媒中的溶解,缩短提取时间,提高有效成分的溶出率和药材的利用率,节约能源,避免了高温对提取成分的影响,具有成本低、操作简便、提取效率高、产品品质好等优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述,但不作为对本发明的限定。在下述说明中,不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外,一或多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
实施例1
按如下配方称取中药原料:淫羊藿180g,益母草210g,阳起石140g,熟地110g,枸杞子130g,当归120g,赤芍110g;
将上述重要原料粉碎混和均匀,进行两阶段的超声提取;
第一提取阶段:以体积浓度为95%的乙醇作为溶剂对上述混合均匀的原料进行超声提取,料液比为1:12(g/mL),提取时间为25min,过滤得到第一提取滤液;
第二提取阶段:以体积浓度为60%的乙醇作为溶剂进行两次超声提取,每次的料液比1∶10(g/mL),每次提取25min;
将第二提取阶段所得滤液与第一提取阶段所得滤液混合,减压浓缩除去滤液中的乙醇得到含有有效成分的浓缩液,向浓缩液中添加增溶剂,并用缓冲溶液调节pH值,用灭菌蒸馏水调节药液浓度,制成相当于1.0g/mL生药的溶液即为灌注剂。灌注剂pH控制在6.6~6.8范围内。本实施例中增溶剂为吐温-80;缓冲液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液。灌注剂冷藏、备用。
实施例2
与实施例1不同在于中药原料的配比如下:淫羊藿180g,益母草190g,阳起石120g,熟地140g,枸杞子150g,当归140g,赤芍80g。
实施例3
与实施例1不同在于中药原料的配比如下:淫羊藿180g,益母草250g,阳起石165g,熟地95g,枸杞子120g,当归95g,赤芍135g。
本发明实施例的灌注剂对pH值有着严格的要求,一是某些成分的溶解性及稳定性与PH值有关,二是从机体考虑,灌注剂不能引起局部疼痛或刺激反应,更不能引起组织坏死,要有利于生理机能的正常运转。本发明实施例将pH值严格控制在6.6-6.8之间,保证产品质量稳定和用药安全的pH点上。
pH测定的准确性取决于标准缓冲液的准确性。因此本发明实施例采用磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液,保证了灌注剂的pH值的准确。
药物毒性反应的危害是国际社会共同关注的问题。对中药及其制剂用于防治疾病时,必须进行毒性试验。该灌注剂为经奶牛子宫灌注的黏膜类用药,也必须符合黏膜类药物的相关要求。
试验前动物处理
小白鼠和家兔购回后,先预饲一周,使其适应新环境。预饲期间,保持动物生活环境的清洁,提供充足的食物及饮水,并仔细观察其活动情况,若发现有行为异常及生病的,应及时挑出,以免影响试验结果。
急性毒性试验
取健康小白鼠30只,随机分为3组,用药前12小时禁食不禁水,药物腹腔注射量分别是:第一组0.5mL/10g体重,第二组0.25mL/10g体重,第三组0.125mL/10g体重,同时设对照组。给药后常规饲养,观察3天内小白鼠死亡情况,计算LD50。三天内若有死亡,应立即进行尸检;试验结束时也应进行尸检,以便观察其内脏器官的变化情况。
蓄积毒性试验
取健康小白鼠30只,体重约20g,随机分为3组,给药前12小时禁食不禁水,给药量分别是:第一组0.1mL/只,第二组0.2mL/只,第三组0.3mL/只,同时设对照组。给药后常规饲养,连续给药20天,在给药期间每天观察小白鼠的生理状态和活动情况。给药结束后再观察一周,并剖杀尸检,观察其内脏组织器官有无异常。
刺激性试验
选取正常健康家兔6只,采用同体自身对照,用药前先观察并记录角膜、虹膜及结膜情况,剔除有病变或炎症者。试验时在左眼结膜囊内滴入0.lmL生理盐水,右眼滴入0.lmL的促孕灌注剂,然后使其被动闭合眼睛8~l0s,观察给予药物1h,6h,12h,24h,48h,72h后左右眼睛的反应情况,并按下表1进行评分。
表1眼刺激反应评分标准
结果与分析
急性毒性试验结果
小白鼠注射本发明实施例的灌注剂后2h内有轻微不适,食欲减退,饮水量正常;注射药物4~6h,小白鼠活动恢复正常,未见任何异常反应;七天内无小白鼠死亡。断颈处死后解剖观察小白鼠内脏,均无异常。本试验小白鼠注射灌注剂量相当于生药量500g/kg体重,LD50远远大于15g/kg体重毒理学评价标准。证明本发明实施例的促孕灌注剂属无毒类物质。
蓄积毒性试验结果
三组小白鼠分别按0.1mL/只,0.2mL/只,0.3mL/只给药20d后,在给药期间和停药后7d内,小白鼠无死亡现象,也无异常反应。给药结束后再观察一周,并剖杀称重尸检,各试验组小白鼠体重与对照组无显著性差异,观察其内脏组织器官均健康无异常。说明本发明实施例的促孕灌注剂无蓄积毒性。
刺激性试验结果
在给家兔右眼滴入促孕灌注剂6h后,6只家兔出现不同程度的眼结膜血管充血现象,并有少量分泌物,无水肿症状,表明该灌注剂具有较弱的刺激作用,而随着时间的推移,其刺激作用越来越弱,24h后充血现象逐渐减弱,但分泌物的量增加,48h后,充血现象基本消失,除个别有少量分泌物外,角膜、虹膜无任何其它症状出现,综合评分为3分。按药理学实验标准判定为无刺激性药物,表明本发明实施例的促孕灌注剂对黏膜无刺激性,是一种符合黏膜用药的制剂。
中药毒性可以被理解为中药不良反应。本试验从急性毒性试验、蓄积毒性试验、刺激性试验几个方面,对本发明实施例的灌注剂进行了安全性评价。根据兽药安全评价标准,当LD50>15g/kg体重时,药物属于实际无毒性物质。从试验结果可以看出,LD50远远大于15g/kg体重,所以该灌注剂属无毒类药物。在蓄积毒性试验中,给小白鼠连续给药20天,未出现死亡,在停药一周内,小白鼠仍未出现死亡,进一步证实了灌注剂无蓄积毒性。刺激性试验是黏膜类药物必须要进行的检测,该促孕灌注剂是经奶牛子宫灌注的,必须保证药物对奶牛子宫用药的安全性。从刺激性试验结果可知,其符合黏膜类药物的制剂要求,为该药液的临床使用奠定了基础。
本发明实施例的促孕灌注剂稳定性检验
药物稳定性是指药物在生产制备后,经过运输贮藏、周转,直至临床应用前的一系列过程中质量变化的程度。稳定性的研究是为了探测药物在贮藏期内质量变化的规律,保证药物在使用期限内不发生明显的质量变化。中药制剂稳定性研究是中药新药开发与研究的一项重要内容,也是提高中药制剂质量、为临床提供安全有效的中药制剂的保证。本试验选取三组不同批次的促孕灌注剂,经人为创造条件进行高温试验、强光照射试验、高湿度试验、加速试验、并进行常温留样观察试验。结果表明本发明实施例的促孕灌注剂稳定性好。
高温试验
将三组促孕灌注剂放入恒温箱,温度设置分别为40℃、60℃、80℃,按时取样观察并测定相关指标,取样时间为:0天(当天)、第5天、第10天。各测定项以0天为参照。
强光照射试验
将三组促孕灌注剂放入自制木箱,接上100W白炽灯全天照射灌注剂,按时取样观察并测定相关指标,取样时间为:0天(当天)、第5天、第10天。各测定项以0天为参照。
高湿度试验
在干燥器下部放置KNO3溶液,使其达到温度25℃,相对湿度90±5%的条件,再将三组灌注剂放入干燥器内按时取样观察并测定相关指标,取样时间为:0天(当天)、第5天、第10天。各测定项以0天为参照。
加速试验
将三组促孕灌注剂在温度40±2℃,相对湿度75±5%的条件下放置5个月,试验期间每个月取样观察并测定相关指标。
室温留样观察试验
取三批促孕灌注剂样品,在室温下放置18个月。每隔3个月取样观测其外观色泽、澄清度、测定pH值。
试验结果
高温试验结果
三组促孕灌注剂在温度为40~60℃的条件下放置10天,物理性状几乎没有改变,外观均为棕色的清亮液体;在温度为80℃的条件下放置10天后,有微量杂质出现,但药液气味芳香,pH值基本不变,经取样测定其黄酮含量,基本无变化,均符合原灌注剂的要求。
强光照射试验结果
三组促孕灌注剂在100W强光照射的条件下放置10天,物理性状没有改变,外观均为棕色的清亮液体;药液气味芳香,pH值基本不变。
高湿度条件下的试验结果
三组促孕灌注剂在温度25℃,相对湿度90±5%的条件下,物理性状几乎没有改变,外观均为棕色的清亮液体,无任何杂质,气味芳香,pH值基本不变。
加速试验结果
在温度40℃,相对湿度75%的条件下观察5个月,从每月的取样观察、测定结果可知该促孕灌注剂的物理性状几乎没有改变,外观均为棕色的清亮液体,澄清无沉淀,气味芳香,pH值基本不变。
室温留样观察试验结果
促孕灌注剂样品室温下放置18个月,每三个月取样观察,三组药液均无异常现象,物理性状几乎没有改变,外观仍为棕色的清亮液体,无杂质,pH值保持在6.6~6.8。
由高温试验可知,当温度为40℃和60℃时,促孕灌注剂的物理性状和pH值没有发生变化,这与刚制备出的新鲜促孕灌注剂几乎没有区别。随着温度升高,药液的物理性状会发生变化,温度为80℃时,药液颜色、pH值基本上没有变化,但有微量杂质出现,这可能与促孕灌注剂中添加的附加剂性质有关。
由高湿度试验和加速试验结果可以看出,该促孕灌注剂具有良好的稳定性。
本品因用于奶牛子宫腔内灌注,必须无菌,故应按要求进行无菌检验。
实验方法
取三个不同批次促孕灌注剂样品,相对应分别以无菌操作将所取样品接种于细菌培养基、真菌培养基各3管;另将细菌培养基、真菌培养基各1管分别对应接种金黄色葡萄球菌、白色念珠菌,作为阳性对照;再取无菌蒸馏水,以相同方式分别接种于两种培养基内,作为阴性对照。将金黄色葡萄球菌培养基管置35℃培养箱,白色念珠菌培养基管置25℃,共培养7日。培养期内每天观察有无细菌、真菌生长。
结果与分析
无菌检验结果见表2。
表2各组药物无菌检测结果
组别 | 金黄色葡萄球菌 | 白色念珠菌 |
A | — | — |
B | — | — |
C | — | — |
阴性对照组 | — | — |
阳性对照组 | + | + |
注:凡检出阳性者为“+”,检出为阴性者为“—”。
从表中可以看出,三个不同批次促孕灌注剂的金黄色葡萄球菌、白色念珠菌检测均为阴性,灭菌蒸馏水组均为阴性,而各阳性对照组检测均有生长,说明三个不同批次促孕灌注剂均符合无菌要求。
药物的无菌检验是指检查药品、敷料及适用于兽药典要求无菌检查的其他品种是否无菌的一种方法。
从以上试验可以看出,三个不同批次促孕灌注剂的金黄色葡萄球菌、白色念珠菌检测均为阴性,而各阳性对照组检测均有生长,说明按本发明实施例制备的三个不同批次的促孕灌注剂均符合无菌要求。
为了验证促孕灌注剂治疗奶牛卵巢静止和持久黄体不孕症的疗效,进行了临床应用。
选取石河子地区患卵巢静止或持久黄体的病牛进行临床试验,用自制的促孕灌注剂经子宫灌注1~2个疗程,观察记录奶牛的发情和受胎情况。结果显示疗效显著,发情率和受胎率明显提高。患牛经治疗后血清孕酮下降,表明该灌注剂能通过调节患牛血清孕酮的含量,使其恢复正常的发情周期,达到治愈的效果。
试验动物
选择石河子垦区奶牛场的临床病例,在排除传染病、寄生虫病、没有肉眼可见的生殖道疾病以及先天性因素的基础上,对3个月以上不发情的奶牛,经直肠检查2次以上,根据兽医产科学诊断标准确认为持久黄体和卵巢静止的奶牛列入试验。
用药方法
向病牛子宫灌注促孕灌注剂,每天80mL,隔天灌注一次,灌注三次为1个疗程;用药后观察10d,仍不见发情者再灌注1个疗程。用药时按人工授精直肠把握法用输精器一次向子宫内注入。
促孕灌注剂对奶牛卵巢静止和持久黄体有良好的治愈效果,经临床证实,发情率达93%以上,受胎率90%以上。
促孕灌注剂注入奶牛子宫后,奶牛无不适反应,可知药液对奶牛没有不良刺激,验证了药液前期的刺激性试验的准确性。
本发明实施例的促孕灌注剂由淫羊藿、益母草、阳起石等组方而成,君药为淫羊藿、益母草,依据君臣佐使的原理进行配伍。本发明实施例的中药灌注剂有催情促孕,活血化瘀的功效。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (9)
1.治疗奶牛卵巢静止和持久黄体不孕症的中药灌注剂的制备方法,包括如下步骤:
将中药原料粉碎混匀,以乙醇为溶剂,采用超声辅助提取法进行两阶段提取,其中第一提取阶段采用的溶剂为体积浓度为95%的乙醇,第二提取阶段采用的溶剂为体积浓度为60%的乙醇;
所述中药原料由如下组分组成:淫羊藿18重量份,益母草18-25重量份,阳起石11-17重量份,熟地9-14重量份,枸杞子12-15重量份,当归9-15重量份,赤芍8-14重量份。
2.根据权利要求1所述的治疗奶牛卵巢静止和持久黄体不孕症的中药灌注剂的制备方法,其特征在于,所述第一提取阶段的料液比1g∶11-13mL,第一提取阶段提取一次,提取25min;所述第二提取阶段的料液比1g∶9-10mL,所述第二提取阶段提取2次,每次提取25min。
3.根据权利要求2所述的治疗奶牛卵巢静止和持久黄体不孕症的中药灌注剂的制备方法,其特征在于,所述第一提取阶段的料液比1g∶12mL;所述第二提取阶段的料液比1g∶10mL。
4.根据权利要求1所述的治疗奶牛卵巢静止和持久黄体不孕症的中药灌注剂的制备方法,其特征在于,所述中药原料由如下组分组成:淫羊藿18重量份,益母草21重量份,阳起石14重量份,熟地11重量份,枸杞子13重量份,当归12重量份,赤芍11重量份。
5.根据权利要求1所述的治疗奶牛卵巢静止和持久黄体不孕症的中药灌注剂的制备方法,其特征在于,将第一提取阶段和第二提取阶段所得滤液合并在一起,回收滤液中的乙醇后得到含有有效组分的浓缩液,浓缩液中添加增溶剂,并用缓冲溶液调节pH值,用灭菌蒸馏水调节药液浓度。
6.根据权利要求5所述的治疗奶牛卵巢静止和持久黄体不孕症的中药灌注剂的制备方法,其特征在于,所述增溶剂为添加吐温-80;所述缓冲液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液。
7.根据权利要求1所述的治疗奶牛卵巢静止和持久黄体不孕症的中药灌注剂的制备方法,其特征在于,所述灌注剂pH为6.6~6.8,每毫升灌注剂含生药1.0g。
8.根据权利要求1所述的治疗奶牛卵巢静止和持久黄体不孕症的中药灌注剂的制备方法,其特征在于,所述灌注剂以250mL单位进行分装,并高压灭菌。
9.治疗奶牛卵巢静止和持久黄体不孕症的中药灌注剂,其由权利要求1-8任一项所述的制备方法制备而成。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151202 |