CN116943624B - 一种磁性固相萃取材料、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于固相萃取技术领域，尤其涉及一种磁性固相萃取材料、其制备方法及应用。本发明所提供的磁性固相萃取材料是由单体1和单体2包覆氨基磁球得到的；所述的单体1为N,N,N,N‑四（对氨基苯基）对苯二胺、4，4'，4''，4''‑(乙烯‑1，1，2，2‑四基)四苯胺或1,3,5‑三甲酰基间苯三酚；所述的单体2为4,4‑联苯二甲醛、对苯二胺或联苯二胺。本发明所提供的磁性固相萃取材料为共价有机框架型磁性材料，这种材料表面的COFs修饰具有特殊复合式异孔结构，与单孔COFs相比，异孔COFs更适合于吸附和分离应用，因为它加速了吸附动力学，增加了活性部位的暴露，提高了吸附吸收率。

Description

一种磁性固相萃取材料、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于固相萃取技术领域，尤其涉及一种磁性固相萃取材料、其制备方法及应用。
背景技术
磁性固相萃取（MSPE）技术将传统的固相萃取技术与磁性功能材料相结合，而衍生出来的一种新型的样品前处理方法，因其环境友好、分离过程快、吸附效率高、易于自动化检测而备受关注。
MSPE以磁性材料作为吸附剂，磁性材料能够在样品溶液中完全分散并吸附分析物。再通过施加外部磁场，可以立即从液相中将磁性材料分离和收集，简化了萃取过程，提高了提取效率；并且功能化的磁性纳米材料具有较强的磁性，易于被外磁场分离，从而避免了复杂的离心操作。
现在常见的磁性功能材料主要由内部含有磁性的纳米粒子比如Fe3O4纳米粒子和包裹在外部的具有特异性吸附能力的修饰部分组成。根据外部修饰部分又主要分为金属有机框架（MOFs）和共价有机框架（COFs）。
共价有机框架（covalent organic frameworks，COFs）类材料是一种由有机小分子单体通过共价键在二维或三维空间内连接而成的一类具有长程有序结构和规整孔道结构的多孔材料。自2005年第一例基于硼酸酯键连接的二维COF报道以来（Science,2005,310,1166-1170），这类材料由于具有高比表面积，规则的孔道结构，丰富可设计的结构和功能，在气体分离，多相催化，传感，能源存储与转化及半导体等领域展现广阔的应用前景。一般来说，形成结晶的COFs需要基于可逆反应对预先形成的无定形框架进行热力学控制的自修复过程结晶。目前已经开发可用于COFs合成的动态共价键主要包括硼酸酯键、亚胺键、酰腙键、酰亚胺键、吩嗪键、芳醚键等，这类化学键具有很好的可逆性，但在稳定性，共轭性以及半导体活性等方面还存在较大的不足。其中，基于吩嗪键和芳醚键，虽然增强了框架材料的稳定性，但在增加框架的π-电子共轭性方面稍显不足。
基于此，2016年，Zhang等人报道了一种氰基取代碳碳双键桥连的全sp2碳共轭的COFs(Polym.Chem.2016,7,4176-4181)。由于稳定的碳碳双键的引入，这类新的COFs材料表现出与以往不同的超高稳定性，并具有全碳骨架的共轭特性。2016年，Zhao等人报道了一种以亚胺键桥联的双孔COFs（Chem.Eur.J.2016,22,17784-17789），从而拓展了COFs领域的拓扑学结构。2017年，Zhao等人报道了一种亚胺桥联的三孔COFs并实现了COFs不同孔径之间的转换（J.Am.Chem.Soc.2017,139,6736-6743）。
然而所有报道的异孔结构共价有机框架材料所需的单体合成都比较复杂且均为亚胺键连接，化学稳定性较差，因此，寻找更多的简便易得的核心单体来合成高稳定性的碳碳双键连接的异孔结构共价有机框架材料，并拓展其种类，丰富其功能具有重大意义。
CN115894834A公开了一种碳碳双键桥连异孔结构共价有机框架材料、制备和应用。其制备方法包括：在惰性气氛的手套箱中，将1,3,5-三（2,6-二甲基吡啶-4-基）苯，苯二甲醛衍生物，苯甲酸和苯甲酸酐加入到安瓿瓶中；在液氮浴中通过冷冻抽真空且补充惰性气氛的方式真空火焰密封安瓿瓶，并将安瓿瓶转移到马弗炉中，进行加热反应；待加热反应结束后，自然冷却至室温，收集滤渣，分别使用不同有机溶剂淋洗滤渣，并用混合溶剂索氏提取，进行真空干燥，最后得到共价有机框架材料。该共价有机框架材料具有较高的化学稳定性、高结晶性，高比表面积、良好的热稳定性，为异孔结构共价有机框架（COFs）在催化领域的开发和利用提供了有利条件。然而，该碳碳双键桥连异孔结构共价有机框架材料不利于脂溶性物质的吸附。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磁性固相萃取材料、其制备方法及应用。本发明所提供的磁性固相萃取材料为共价有机框架型磁性材料，这种材料表面的COFs修饰具有特殊复合式异孔结构，与单孔COFs相比，异孔COFs更适合于吸附和分离应用，因为它加速了吸附动力学，增加了活性部位的暴露，提高了吸附吸收率。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种磁性固相萃取材料，其中，所述的磁性固相萃取材料是由单体1和单体2包覆氨基磁球得到的；所述的单体1为N,N,N,N-四（对氨基苯基）对苯二胺、4，4'，4''，4''-(乙烯-1，1，2，2-四基)四苯胺或1,3,5-三甲酰基间苯三酚；所述的单体2为4,4-联苯二甲醛、对苯二胺或联苯二胺。
本发明提供了一种共价有机框架型磁性材料，通过氮吸附测量和吸附曲峰型表明这种材料表面的COFs修饰具有复合式异孔结构，与单孔COFs相比，异孔COFs更适合于吸附和分离应用，因为它加速了吸附动力学，增加了活性部位的暴露，提高了吸附吸收率。
本发明中，N,N,N,N-四（对氨基苯基）对苯二胺简称为4N，4，4'，4''，4''-(乙烯-1，1，2，2-四基)四苯胺简称为ETTA，1,3,5-三甲酰基间苯三酚简称为TP，4,4-联苯二甲醛简称为BPDA，对苯二胺简称为Pa，联苯二胺简称为BD。
本发明还提供所述的磁性固相萃取材料的制备方法，该方法为将氨基磁球进行表面修饰，所述的表面修饰包括如下步骤：
S2.1、配制如下四种溶液
溶液①：将单体2溶于1.4-二氧六环，得到溶液①；
溶液②：将单体1溶于1.4-二氧六环，得到溶液②；
溶液③：将氨基磁球溶于1.4-二氧六环，得到溶液③；
溶液④：将醋酸加入1.4-二氧六环，得到溶液④；
S2.2、将溶液①超声后摇匀，快速加入溶液③和部分溶液④，振荡混匀；
S2.3、再将溶液②超声后摇匀，快速加入步骤S2.2中溶液，振荡混匀；
S2.4、分批次加入剩余的溶液④，振荡，最后将体系倒入反应釜，反应，即得所述的磁性固相萃取材料。
本发明采用单体1和单体2包覆氨基磁球的方式对氨基磁球进行表面修饰，得到了一种共价有机框架型磁性材料，这种材料表面的COFs修饰具有特殊复合式异孔结构，与单孔COFs相比，异孔COFs更适合于吸附和分离应用，因为它加速了吸附动力学，增加了活性部位的暴露，提高了吸附吸收率。
进一步地，步骤S2.4中，所述的反应为在110～130℃下反应2～4d，优选在120℃下反应3d。
进一步地，步骤S2.2中的部分溶液④和S2.4剩余的溶液④的体积比为1:3。
进一步地，步骤S2.4中，每批次加入1/3剩余的溶液④，每批次加完后间隔1～2min再加入下一批，加的过程中保持振荡。
本发明中，所述的氨基磁球可采用市售的氨基磁珠，也可以采用现有技术的方法制备得到，如可采用下述方法制备得到：
采用1.7克FeCl3•6H2O，加入3.3克无水醋酸钠作为分散剂，在50mL乙二醇溶液中混匀，添加10.8克1,6-己二胺，然后将该溶液移入密闭加热容器中，在200℃条件下进行溶剂热反应，加热时间4-4.5h，得到氨基磁球。
作为一种优选方式，本发明所述的氨基磁球的制备包括如下步骤：
S1.1、配制如下两种溶液
溶液A：将无水醋酸钠溶于乙二醇中，溶解完全后加入FeCl3•6H2O，搅拌均匀，得到溶液A；
溶液B：将PEG6000溶于乙二醇中，溶解完全，得到溶液B；
S1.2、将溶液B倒入溶液A中，磁旋至均匀，将所得液体倒入反应釜中，烘干，得到磁球粉末，取出，备用；
S1.3、将反应釜降至室温，去除上清并将釜中剩余磁球粉末用无水乙醇洗到烧杯中，然后用无水乙醇和蒸馏水交替反复洗涤直至上清液澄清透明，转入真空干燥箱干燥，得到剩余磁球粉末，取出，备用；
S1.4、将步骤S1.2和S1.3取出的磁球粉末合并，进行研磨，得到研磨好的粗磁球粉末；
S1.5、配制如下两种溶液
溶液C：将硅酸四乙酯加入到无水乙醇中备用；
溶液D：将3-氨丙基三乙氧硅烷加入无水乙醇中备用；
S1.6、取一个三颈烧瓶，依次加入蒸馏水、无水乙醇和研磨好的粗磁球粉末，混匀；
S1.7、将三颈烧瓶置于搅拌器上，加入氨水，再加入溶液C，以后每小时加入1mL的硅酸四乙酯；搅拌后，每小时加入1mL的溶液D，搅拌；
S1.8、将搅拌好的溶液转移到烧杯中，去除上清；将沉淀用无水乙醇洗到烧杯中，再用无水乙醇和蒸馏水交替反复洗涤，至上清液澄清透明；最后用无水乙醇洗涤，转入真空干燥箱干燥，得到氨基磁球。
进一步地，步骤S1.6中，加入的蒸馏水、无水乙醇和研磨好的粗磁球粉末的质量体积比为1mL：3.75mL：15mg。
本发明还提供所述的磁性固相萃取材料在磁固相萃取中的应用。
进一步地，所述的应用为用于血清中脂溶性维生素A、D或E的检测。
本发明还提供一种基于磁固相萃取的脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法，该方法包括以下步骤：
1）采用本发明所述的磁性固相萃取材料对脂溶性维生素待测样品进行前处理；
2）将经前处理后的脂溶性维生素待测样品使用非针头式过滤器进行压滤，得到待测滤液；
3）采用液相色谱串联质谱法对待测滤液进行检测。
目前，基于磁固相萃取的脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法中，在对磁固相萃取所得的样品进行液质联用上机定量检测之前，为避免有磁球或其他杂质残留需将待测样品进行离心后再进行上机，这一步骤就需要将待测液从96孔板中吸出至离心管再进行离心，然后将离心后上清液再转移回96孔板中。这一步骤过于繁琐，使得整个分析流程不够自动化、智能化，且增加了样本的处理时间。
本发明中，一方面，采用所提供的磁性固相萃取材料对脂溶性维生素待测样品进行前处理，加速了吸附动力学，增加了活性部位的暴露，提高了吸附吸收率；另一方面，本发明使用非针头式过滤器对经前处理后的脂溶性维生素待测样品进行压滤后，再采用液相色谱串联质谱法对测试样品进行检测，可提高磁固相萃取前处理的自动化程度，更加便捷快速，解决磁固相萃取前处理样品的杂质残留问题，保护液质联用仪器的使用寿命，提高色谱柱的柱效。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
（1）本发明所提供的一种磁性固相萃取材料，这种材料表面的COFs修饰具有特殊复合式异孔结构，与单孔COFs相比，异孔COFs更适合于吸附和分离应用，因为它加速了吸附动力学，增加了活性部位的暴露，提高了吸附吸收率；
（2）本发明使用非针头式过滤器对经前处理后的脂溶性维生素待测样品进行压滤后，再采用液相色谱串联质谱法对测试样品进行检测，可提高磁固相萃取前处理的自动化程度，更加便捷快速，解决磁固相萃取前处理样品的杂质残留问题，保护液质联用仪器的使用寿命，提高色谱柱的柱效。
具体实施方式
以下为本发明的具体实施方式，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。
以下对实施例中所用的试剂的来源进行说明：
（1）25（OH）VD3和25（OH）VD2均购自加拿大Toronto Research Chemicals（TRC）公司公司；
（2）维生素A和维生素E均购自北京世纪奥科生物技术有限公司；
（3）25（OH）VD2-d6和25（OH）VD3-d6均购自美国Medical Isotopes公司；
（4）VA-d8和VE-d6均为购自上海甄准生物科技有限公司的Isoreag品牌同位素；
（5）牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）和乙腈（色谱纯）购自美国Sigma公司；
（6）甲醇（色谱纯）购自美国Fisher；
（7）实验用水均为双蒸水，购自广州屈臣氏集团有限公司；
（8）磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline，PBS）干粉购自北京Solarbio公司；
（9）无水醋酸钠、FeCl3•6H2O购自天津Heowns Biochem LLC（中国天津）；
（10）聚乙二醇（PEG 6000）购自上海麦克林生化科技有限公司（中国上海）；
（11）硅酸四乙酯、3-氨丙基三乙氧硅烷、1.4-二氧六环、N,N,N,N-四（对氨基苯基）对苯二胺（4N）、4,4-联苯二甲醛（BPDA）、4，4'，4''，4''-(乙烯-1，1，2，2-四基)四苯胺（ETTA ）、1,3,5-三甲酰基间苯三酚（TP）、对苯二胺（Pa）、联苯二胺（BD）均购自Energy Chemical（中国上海）；
（12）乙二醇、氨水、醋酸均购自天津协和科技有限公司（中国天津）。
实施例1、磁性固相萃取材料的制备
该实施例以包被50mg氨基磁球（上海泽叶生物）为例，对采用单体1（4N）和单体2（BPDA）对氨基磁球进行包覆的方法进行说明：
S2.1、配制如下四种溶液：
溶液①：53.5mg单体2（BPDA）溶于500mL1.4-二氧六环，得到溶液①；
溶液②：60.05mg单体1（4N）溶于1mL1.4-二氧六环，得到溶液②；
溶液③：50mg氨基磁球溶于1mL1.4-二氧六环，得到溶液③；
溶液④：300μL6mol/L醋酸加入500μL1.4-二氧六环，得到溶液④；
S2.2、将溶液①超声后摇匀，快速加入溶液③和200ul溶液④，振荡混匀1-2min；
S2.3、再将溶液②超声后摇匀，快速加入步骤S2.2中溶液，振荡混匀1-2min；
S2.4、分批次加入溶液④，每次200ul，间隔1-2min，保持振荡，最后将体系倒入反应釜，120℃反应3d，即得所述的磁性固相萃取材料。
实施例2、磁性固相萃取材料的制备
S1、氨基磁球的制备
以制备300mg左右氨基磁球为例。
S1.1、配制两种溶液
溶液A：称取3.6g无水醋酸钠溶于40mL乙二醇中（超声辅助溶解），溶解完全后加入1.35gFeCl3•6H2O（现成，易吸水），加入磁子不加热磁旋至搅拌均匀；
溶液B：称取1.5g的PEG6000溶于40mL乙二醇中，70℃下溶解完全。
S1.2、将溶液B倒入A中，磁旋至均匀，将液体倒入反应釜中。在200℃下烘干，得到磁球粉末，取出，备用；
S1.3、将反应釜降至室温，去除上清并将釜中剩余磁球粉末用无水乙醇洗到烧杯中，然后用无水乙醇和蒸馏水交替反复洗涤直至上清液澄清透明，转入真空干燥箱干燥8h，得到剩余磁球粉末，取出，备用。
S1.4、将步骤S1.2和S1.3取出的磁球粉末合并，倒入玛瑙研钵中研磨，得到研磨好的粗磁球粉末；
S1.5、配制两种溶液备用：
溶液C：将500μL硅酸四乙酯加入到2.5mL的无水乙醇中，得到溶液C，备用；
溶液D：将500μL 3-氨丙基三乙氧硅烷加入到2.5mL的无水乙醇中，得到溶液D，备用。
S1.6、取一个三颈烧瓶，依次加入20mL蒸馏水、75mL无水乙醇、约300mg研磨好的粗磁球粉末，超声辅助混匀。
S1.7、将三颈烧瓶置于搅拌器上，加入2mL氨水，再加入1mL的溶液C（逐滴加入），以后每小时加入1mL的硅酸四乙酯（逐滴加入）；搅拌12h后，再每小时加入1mL的溶液D（逐滴加入），搅拌12h。
S1.8、将搅拌好的溶液转移到烧杯中，去除上清。将沉淀用无水乙醇洗到烧杯中，再用无水乙醇和蒸馏水交替反复洗涤，至上清液澄清透明。最后用无水乙醇洗涤，转入真空干燥箱干燥8h。
S2、表面修饰
S2.1、以包被50mg1.4.1合成的氨基磁球为例，配制如下四种溶液：
溶液①：53.5mg单体2（BPDA）溶于500mL1.4-二氧六环，得到溶液①；
溶液②：60.05mg单体1（4N）溶于1mL1.4-二氧六环，得到溶液②；
溶液③：50mg步骤S1制得的氨基磁球溶于1mL1.4-二氧六环，得到溶液③；
溶液④：300μL 6mol/L醋酸加入500μL1.4-二氧六环，得到溶液④；
S2.2、将溶液①超声后摇匀，快速加入溶液③和200ul溶液④，振荡混匀1-2min；
S2.3、再将溶液②超声后摇匀，快速加入步骤S2.2中溶液，振荡混匀1-2min；
S2.4、分批次加入溶液④，每次200ul，间隔1-2min，保持振荡，最后将体系倒入反应釜，120℃反应3d，即得所述的磁性固相萃取材料。
实施例3、磁性固相萃取材料的制备
该实施例同实施例2，与实施例2所不同的是步骤S2.4中，将体系倒入反应釜后，在110℃下反应4d。
实施例4、磁性固相萃取材料的制备
该实施例同实施例2，与实施例2所不同的是步骤S2.4中，将体系倒入反应釜后，在130℃下反应2d。
实施例5、磁性固相萃取材料的制备
该实施例同实施例1，与实施例1所不同的是所用的单体1为ETTA，所用的单体2为BPDA。
实施例6、磁性固相萃取材料的制备
该实施例同实施例2，与实施例2所不同的是所用的单体1为ETTA，所用的单体2为BPDA。
实施例7、磁性固相萃取材料的制备
该实施例同实施例1，与实施例1所不同的是所用的单体1为TP，所用的单体2为Pa。
实施例8、磁性固相萃取材料的制备
该实施例同实施例2，与实施例2所不同的是所用的单体1为TP，所用的单体2为Pa。
实施例9、磁性固相萃取材料的制备
该实施例同实施例1，与实施例1所不同的是所用的单体1为TP，所用的单体2为BD。
实施例10、磁性固相萃取材料的制备
该实施例同实施例2，与实施例2所不同的是所用的单体1为TP，所用的单体2为BD。
实施例11、磁性固相萃取材料的应用
本实施例提供采用本发明所述的磁性固相萃取材料进行前处理，并结合LC-MS/MS对于血清中脂溶性维生素A、D或E进行检测的方法。
下面对上述应用进行具体描述：
采用本发明所述的磁性固相萃取材料进行前处理后进行压滤，并结合LC-MS/MS对于血清中脂溶性维生素A、D或E进行检测的方法包括如下步骤：
（1）样本前处理
使用96孔板添加样品后再放入自动化磁固相萃取仪进行提取，96孔板每一列加入的试剂和运行程序如下：
第一列：50ul浓度10mg/ml的磁球溶液+350ul活化液（甲醇）；低速混合1min，磁铁吸附转移到第二列。
第二列：200ul蛋白沉淀剂（甲醇：乙腈=1：1）+100ul血清（血浆样本离心后获得）+10ul内标溶液+稀释液（水）；高速混合3min，磁铁吸附转移到第三列。
第三列：400ul0.05%甲酸水；中速混合3min，磁铁吸附转移到第四列。
第四列：400ul0.05%甲酸水；中速混合3min，磁铁吸附转移到第五列。
第五列：100ul洗脱液（甲醇）；高速混合3min，磁铁吸附转移到第六列。
第六列：400ul甲醇，回收磁球。低速混合1min，使磁球回收到甲醇中。
磁球分别为本发明实施例2制得的磁性固相萃取材料（简写为4N-BPDA）、本发明实施例6制得的磁性固相萃取材料（缩写为ETTA-BPDA）、本发明实施例8制得的磁性固相萃取材料（缩写为TP-Pa）以及本发明实施例8制得的磁性固相萃取材料（缩写为TP-BD）；
磁球溶液：称取10mg磁球加入到1000ul甲醇中，混匀，得到10mg/ml的磁球溶液；
内标溶液：分别将25（OH）VD2-d6、25（OH）VD3-d6、VA-d8和VE-d6用氘代甲醇溶解，再用甲醇配制混合内标工作液，各内标的终浓度：25（OH）VD2-d6/25（OH）VD3-d6：250ng/mL；VA-d8：10μg/mL；VE-d6：10μg/mL。
（2）压滤
将经前处理后的脂溶性维生素待测样品使用非针头式过滤器进行压滤，得到待测滤液。
（3）质谱条件
采用液相色谱串联质谱法对待测滤液进行检测。
液相色谱检测条件为：
色谱柱：Kinetex C18（3.0×50 mm，2.6μm，100Å）
流动相A为0.05%甲酸水溶液，流动相B为0.05%甲酸甲醇溶液；
梯度洗脱程序：0-0.7min，80%B；0.7-1.8min，97%B；1.8-2.8min，97%B；2.8-3min，100%B；3-5min，100%B；5-6min，80%B；6-6.5min，80%B；
流速：0.4mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃。
质谱条件为：
离子源：电喷雾ESI离子源，正离子扫描方式，电喷雾电压5500V，气帘气50psi，雾化气（GS1）70psi，辅助气（GS2）80psi，离子源温度为450℃。
质谱采集参数如下表1所示：
表1、脂溶性维生素和内标的质谱参数
（3）标准溶液的配制
标准曲线工作溶液、质量控制工作溶液：分别将25（OH）VD3、25（OH）VD2、VA、VE标准品用甲醇溶解，然后将溶解后的标准品（25（OH）VD3 1mg/mL、25（OH）VD2 1mg/mL、VA 1mg/mL、VE 100mg/mL）用甲醇按一定比例混合稀释为一系列的标准品曲线工作溶液。也同时得到低、中、高三个浓度水平的质控工作溶液，如表2。
表2、脂溶性维生素标准曲线工作溶液、质控工作溶液浓度
混合内标工作液：分别将25（OH）VD2-d6、25（OH）VD3-d6、VA-d8和VE-d6用氘代甲醇溶解，再用甲醇配制混合内标工作液，各内标的终浓度：25（OH）VD2-d6/25（OH）VD3-d6：250ng/mL；VA-d8：10μg/mL；VE-d6：10μg/mL。
空白血清替代基质（4%BSA）溶液制备：由于脂溶性维生素为内源性物质，需要制作替代基质。将PBS干粉溶解到2L的蒸馏水中，配制成浓度为0.01mol/L、pH=7.2-7.4（25℃）的PBS溶液。再称量4g的牛血清白蛋白，用100ml的配制的PBS溶液溶解后得到4%的BSA溶液。
标准曲线样本制备：取90μL4%BSA溶液加入10μL标准曲线工作溶液，涡旋混匀，即得6个浓度水平的标准曲线样本。
质控样本制备：取90μL4%BSA溶液加入10μL质控工作溶液，涡旋混匀，即得3个浓度水平的质控样本。
（4）线性
对2个数量级水平的校准品样品进行样品前处理，并进样进行LC-MS/MS分析，通过将每种维生素与其IS的面积比与标准品样品中的理论浓度以权重1/X2来构建校准曲线。LLOQ是校准曲线的最低水平，信噪比（S/N）≥10，精密度偏差和精密度均小于等于20%。检测限LOD在信噪比为3时确定。
结果如表3所示：
表3、线性方程的斜率和截距，每种维生素的相关系数（r），线性范围和LLOQ
（5）精密度
在同一天和三个不同日的六次重复中测量低、中和高3个浓度的样品，使用RSD计算重复测定的精密度，不应超过20%和15%。准确度由测量浓度的百分比除以理论浓度确定，应在80-120%和85-115%的范围内。
结果如表4-1和表4-2所示：
表4-1、脂溶性维生素LC-MS/MS分析的方法验证：质控样品中不同浓度下的精密度和准确度值
表4-2、脂溶性维生素LC-MS/MS分析的方法验证：质控样品中不同浓度下的精密度和准确度值
从表4-1和表4-2的结果可以看出，采用本发明所述的磁性固相萃取材料进行前处理，并结合LC-MS/MS对于血清中脂溶性维生素A、D或E进行检测的方法，其精密度和准确度在标准范围内，能满足方法学的标准。
试验例1
该试验例考察了采用不同的磁性固相萃取材料的吸附吸收率。
磁性固相萃取材料：
试验组1：本发明实施例2制得的磁性固相萃取材料，简写为4N-BPDA；
试验组2：本发明实施例6制得的磁性固相萃取材料，缩写为ETTA-BPDA；
试验组3：本发明实施例8制得的磁性固相萃取材料，缩写为TP-Pa；
试验组4：本发明实施例8制得的磁性固相萃取材料，缩写为TP-BD；
对照组1：HLB磁球（购自天津博蕴纯化装备材料科技有限公司）；
对照组2：天大化工学院陈老师课题组FEO磁球（购自天津贝思乐）。
试验方法：分别采用各组磁性固相萃取材料进行前处理，并结合LC-MS/MS对于血清中脂溶性维生素A、D或E进行检测，方法同实施例11所述。测定各个维生素中一个离子对的质谱峰面积。
结果见表5所示：
表5
从上述表5的结果可以看出，采用本发明的磁性固相萃取材料对于血清中脂溶性维生素A、D或E进行检测时，各个维生素中一个离子对的质谱峰面积更大，表明其具有更高的吸附吸收率。

Claims (3)

1.一种磁性固相萃取材料在血清中脂溶性维生素A、D或E的检测中的应用，其特征在于，所述的磁性固相萃取材料的制备方法为氨基磁球的制备及对氨基磁球进行表面修饰，所述的氨基磁球的制备包括如下步骤：
S1.1、配制如下两种溶液
溶液A：将无水醋酸钠溶于乙二醇中，溶解完全后加入FeCl3•6H2O，搅拌均匀，得到溶液A；
溶液B：将PEG6000溶于乙二醇中，溶解完全，得到溶液B；
S1.2、将溶液B倒入溶液A中，磁旋至均匀，将所得液体倒入反应釜中，烘干，得到磁球粉末，取出，备用；
S1.3、将反应釜降至室温，去除上清并将釜中剩余磁球粉末用无水乙醇洗到烧杯中，然后用无水乙醇和蒸馏水交替反复洗涤直至上清液澄清透明，转入真空干燥箱干燥，得到剩余磁球粉末，取出，备用；
S1.4、将步骤S1.2和S1.3取出的磁球粉末合并，进行研磨，得到研磨好的粗磁球粉末；
S1.5、配制如下两种溶液
溶液C：将硅酸四乙酯加入到无水乙醇中备用；
溶液D：将3-氨丙基三乙氧硅烷加入无水乙醇中备用；
S1.6、取一个三颈烧瓶，依次加入蒸馏水、无水乙醇和研磨好的粗磁球粉末，混匀；
S1.7、将三颈烧瓶置于搅拌器上，加入氨水，再加入溶液C，以后每小时加入1mL的硅酸四乙酯；搅拌后，每小时加入1mL的溶液D，搅拌；
S1.8、将搅拌好的溶液转移到烧杯中，去除上清；将沉淀用无水乙醇洗到烧杯中，再用无水乙醇和蒸馏水交替反复洗涤，至上清液澄清透明；最后用无水乙醇洗涤，转入真空干燥箱干燥，得到氨基磁球；
所述的表面修饰包括如下步骤：
S2.1、配制如下四种溶液
溶液①：将单体2溶于1.4-二氧六环，得到溶液①；
溶液②：将单体1溶于1.4-二氧六环，得到溶液②；
溶液③：将氨基磁球溶于1.4-二氧六环，得到溶液③；
溶液④：将醋酸加入1.4-二氧六环，得到溶液④；
S2.2、将溶液①超声后摇匀，快速加入溶液③和部分溶液④，振荡混匀；
S2.3、再将溶液②超声后摇匀，快速加入步骤S2.2中溶液，振荡混匀；
S2.4、分批次加入剩余的溶液④，振荡，最后将体系倒入反应釜，反应，即得所述的磁性固相萃取材料；
其中：
所述的单体1为1,3,5-三甲酰基间苯三酚；所述的单体2为对苯二胺或联苯二胺；
步骤S2.4中，所述的反应为在110～130℃下反应2～4d；
步骤S2.2中的部分溶液④和S2.4剩余的溶液④的体积比为1：3；
步骤S2.4中，每批次加入1/3剩余的溶液④，每批次加完后间隔1～2min再加入下一批，加的过程中保持振荡。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤S1.6中，加入的蒸馏水、无水乙醇和研磨好的粗磁球粉末的质量体积比为1mL：3.75mL：15mg。
3.一种基于磁固相萃取的脂溶性维生素A、D或E的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1）采用权利要求1所述应用中的磁性固相萃取材料对脂溶性维生素A、D或E待测样品进行前处理；
2）将经前处理后的脂溶性维生素A、D或E待测样品使用非针头式过滤器进行压滤，得到待测滤液；
3）采用液相色谱串联质谱法对待测滤液进行检测。
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