CN116917464A - 用于递送多种蛋白质的血小板α颗粒 - Google Patents

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刘茜
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Heathers Healthcare
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Abstract

本公开提供了包含负载有至少两种剂的血小板的组合物和方法，其中每种剂均被负载至血小板的不同的α颗粒类型中。负载至血小板中的剂通常被保护免受降解，并且受试者被保护免受所述剂的毒性，如果有的话。这些益处与血小板归巢至损伤、炎症和/或血管生成部位的天然能力结合有助于确保将治疗有效量的所述剂递送至靶部位。

Description

用于递送多种蛋白质的血小板α颗粒
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年1月27日提交的US 63/142,402的优先权，其全部内容通过引用并入。
序列表
本申请含有序列表，所述序列表已以ASCII格式通过EFS-Web提交并且特此以引用的方式整体并入。所述ASCII副本创建于2022年1月26日，名称为58533-702.601_ST25.txt，并且大小为3,155字节。
背景技术
全身施用的治疗性化合物可在到达其靶部位之前降解；因此，如果它们全部到达，则它们的剂量可能太低而无法实现治疗效果。血小板天然归巢至损伤、炎症和/或血管生成部位，并且已知将天然货物转运至这些部位。如果可将外源性治疗剂负载至血小板中，则所述剂应被保护免受在剂全身施用后可能发生的降解。然而，尚未描述将外源性治疗剂负载至血小板的α颗粒中的机制。因此，对于能够将外源性治疗剂递送至损伤、炎症和/或血管生成部位的负载的血小板存在尚未满足的需求。
发明内容
本公开的一个方面是一种例如用于治疗疾病或病症的组合物。所述组合物包含第一化合物，所述第一化合物包含第一剂和第一多肽，其中所述第一多肽包含能够结合血小板的第一α颗粒类型中的GAG的第一糖胺聚糖(GAG)结合肽；以及第二化合物，所述第二化合物包含第二剂和第二多肽，其中所述第二多肽包含能够结合血小板的第二α颗粒类型中的GAG的第二糖胺聚糖(GAG)结合肽。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素(CS)，并且所述第二GAG结合肽优先结合至硫酸乙酰肝素(HS)。
在各种实施方案中，所述第一GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素A(CSA)，而不优先结合至硫酸乙酰肝素(HS)。
在一些实施方案中，所述第一α颗粒类型是P-选择素相关颗粒，并且第二α颗粒类型是冯维勒布兰德因子(von Willebrand factor,VWF)相关颗粒。
在实施方案中，所述第一α颗粒类型的内容物经由高亲和力凝血酶受体PAR1释放，并且所述第二α颗粒类型的内容物经由低亲和力凝血酶受体PAR4释放，任选地，α颗粒的内容物能够响应于与基质金属蛋白质酶(MMP)、过氧化物酶、磷酸水解酶、纤溶酶或纤溶酶衍生物(如组织纤溶酶原激活剂(tPA))的接触而释放。
在各种实施方案中，所述第一α颗粒类型的内容物在比提供所述第二α颗粒类型的内容物的释放所需的凝血酶浓度更低的凝血酶浓度下释放。
在一些实施方案中，所述第一α颗粒类型的内容物在所述第二α颗粒类型的内容物释放之前释放。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽的长度各自介于约8个氨基酸与约14个氨基酸之间。
在各种实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽中的一者或两者包含至少一个带电氨基酸。在一些情况下，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽两者都包含至少一个带电氨基酸。
在一些实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽中的一者或两者包含至少一个脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。在一些情况下，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽两者都至少包含至少一个脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含与SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13之一具有至少约70％同一性的氨基酸序列。
在各种实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含与SEQID NO:1至SEQ ID NO:13之一具有至少约80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含与SEQID NO:1至SEQ ID NO:13之一具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地相对于SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13中的任一者包含在位置1、位置4、位置7或位置9处的带电荷氨基酸。
在各种实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地相对于SEQID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一者包含在位置1、位置4、位置7和/或位置9处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
在一些实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含至少10个氨基酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述第二GAG结合肽独立地包含11个氨基酸。
在各种实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地由11个氨基酸组成。
在一些实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13之一的氨基酸序列。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1具有至少约90％同一性的氨基酸序列，并且所述第二GAG结合肽包含与SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述第一GAG结合肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述第二GAG结合肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。所述第一GAG结合肽可以由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成，并且所述第二GAG结合肽可以由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
在各种实施方案中，所述第一多肽由第一GAG结合肽组成并且所述第二多肽由第二GAG结合肽组成。
在一些实施方案中，所述第一多肽的N端直接或间接连接至所述第一剂并且/或者所述第二多肽的N端直接或间接连接至第二第一剂。
在实施方案中，所述第一多肽的C端直接或间接连接至所述第一剂并且/或者所述第二多肽的C端直接或间接连接至第二第一剂。
在各种实施方案中，所述第一剂经由第一接头间接连接至所述第一多肽并且/或者所述第二剂经由第二接头间接连接至所述第二多肽。在一些情况下，所述第一接头和/或所述第二接头各自包含一个或多个原子。所述第一接头和/或所述第二接头可各自包含重复单元的聚合物。所述第一接头和/或所述第二接头可以各自包含氨基酸链。
在一些实施方案中，所述第一剂直接连接至所述第一多肽并且/或者所述第二剂直接连接至所述第二多肽。
在实施方案中，所述第一剂直接连接至所述第一多肽或使用马来酰亚胺反应、琥珀酰亚胺酯反应、酶促反应或不影响蛋白质结构或活性的另外缀合系统间接地连接至所述第一多肽，并且/或者所述第二剂直接连接至所述第二多肽或使用马来酰亚胺反应、琥珀酰亚胺酯反应、酶促反应或不影响蛋白质结构或活性的另外缀合系统间接地连接至所述第二多肽。
在各种实施方案中，所述第一剂和/或所述第二剂独立地包含抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白质酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。在一些情况下，所述第一剂和/或所述第二剂包含抗体或荧光部分。
在一些实施方案中，所述第一剂和/或所述第二剂对哺乳动物细胞有害并且/或者对受试者有毒，并且/或者所述第一剂和/或所述第二剂在直接施用到受试者的血流中时易于降解。
在实施方案中，所述第一化合物和/或所述第二化合物还包含荧光部分。
在各种实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述第二GAG结合肽还优先结合丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
在一些实施方案中，所述组合物还包含第三化合物，所述第三化合物包含第三剂和第三多肽，其中所述第三多肽包含能够结合血小板的第三α颗粒类型中的GAG的第三糖胺聚糖(GAG)结合肽；并且其中所述第三GAG结合肽优先结合丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
本公开的另一方面是分离的血小板。所述分离的血小板包含至少一个拷贝的第一化合物，所述第一化合物包含第一剂和第一多肽，其中所述第一多肽包含能够结合血小板的第一α颗粒类型中的GAG的第一糖胺聚糖(GAG)结合肽；以及至少一个拷贝的第二化合物，所述第二化合物包含第二剂和第二多肽，其中所述第二多肽包含能够结合血小板的第二α颗粒类型中的GAG的第二糖胺聚糖(GAG)结合肽。
在实施方案中，所述血小板是合成的、同种异体的、自体的或经修饰的异源血小板。
在各种实施方案中，所述血小板是自体血小板。
在一些实施方案中，所述血小板是同种异体血小板。
在实施方案中，所述血小板从富含血小板的血浆获得。
在各种实施方案中，所述血小板包含1至1000个拷贝的所述第一化合物和1至1000个拷贝的所述第二化合物。在一些情况下，将所述1至1000个拷贝的所述第一化合物负载至血小板的第一α颗粒类型中，并且将所述1至1000个拷贝的所述第二化合物负载至血小板的第二α颗粒类型中。可以将所述至少一个拷贝的所述第一化合物负载至血小板的第二α颗粒类型中，并且可以将所述至少一个拷贝的所述第二化合物负载至血小板的第一α颗粒类型中。
在一些实施方案中，所述第一GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素(CS)，并且所述第二GAG结合肽优先结合至硫酸乙酰肝素(HS)。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素A(CSA)。在各种实施方案中，所述第一α颗粒类型是P-选择素相关颗粒，并且所述第二α颗粒类型是冯维勒布兰德因子(VWF)相关颗粒。
在一些实施方案中，所述第一α颗粒类型的内容物经由高亲和力凝血酶受体PAR1释放，并且所述第二α颗粒类型的内容物经由低亲和力凝血酶受体PAR4释放，任选地，α颗粒的内容物能够响应于与基质金属蛋白质酶(MMP)、过氧化物酶、磷酸水解酶、纤溶酶或纤溶酶(如组织纤溶酶原激活剂(tPA))的接触而释放。
在实施方案中，所述第一α颗粒类型的内容物在比提供所述第二α颗粒类型的内容物的释放所需的凝血酶浓度更低的凝血酶浓度下释放。
在各种实施方案中，所述第一α颗粒类型的内容物在所述第二α颗粒类型的内容物释放之前释放。
在一些实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽的长度各自介于约8个氨基酸与约14个氨基酸之间。在一些情况下，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽中的一者或两者包含至少一个带电氨基酸。所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽两者都可包含至少一个带电氨基酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽中的一者或两者包含至少一个脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。在一些情况下，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽两者都至少包含至少一个脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
在各种实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含与SEQID NO:1至SEQ ID NO:13之一具有至少约70％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含与SEQID NO:1至SEQ ID NO:13之一具有至少约80％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含与SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13之一具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在各种实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地相对于SEQID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一者包含在位置1、位置4、位置7或位置9处的带电荷氨基酸。
在一些实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地相对于SEQID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一者包含在位置1、位置4、位置7和/或位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含至少10个氨基酸。
在各种实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含11个氨基酸。
在一些实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地由11个氨基酸组成。
在实施方案中，所述GAG结合肽由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一者的氨基酸序列组成。
在各种实施方案中，所述第一GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1具有至少约90％同一性的氨基酸序列，并且所述第二GAG结合肽包含与SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一GAG结合肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述第二GAG结合肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成，并且所述第二GAG结合肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
在各种实施方案中，所述第一多肽由第一GAG结合肽组成并且所述第二多肽由第二GAG结合肽组成。
在一些实施方案中，所述第一多肽的N端直接或间接连接至所述第一剂并且/或者所述第二多肽的N端直接或间接连接至第二第一剂。
在实施方案中，所述第一多肽的C端直接或间接连接至所述第一剂并且/或者所述第二多肽的C端直接或间接连接至第二第一剂。
在各种实施方案中，所述第一剂经由第一接头间接连接至所述第一多肽并且/或者其中所述第二剂经由第二接头间接连接至所述第二多肽。在一些情况下，所述第一接头和/或所述第二接头各自包含一个或多个原子。所述第一接头和/或所述第二接头可各自包含重复单元的聚合物。所述第一接头和/或所述第二接头可以各自包含氨基酸链。
在一些实施方案中，所述第一剂直接连接至所述第一多肽并且/或者所述第二剂直接连接至所述第二多肽。
在实施方案中，所述第一剂直接连接至所述第一多肽或使用马来酰亚胺反应、琥珀酰亚胺酯反应、酶促反应或不影响蛋白质结构或活性的另外缀合系统间接地连接至所述第一多肽，并且/或者所述第二剂直接连接至所述第二多肽或使用马来酰亚胺反应、琥珀酰亚胺酯反应、酶促反应或不影响蛋白质结构或活性的另外缀合系统间接地连接至所述第二多肽。
在各种实施方案中，所述第一剂和/或所述第二剂独立地包含抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白质酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。在一些情况下，所述第一剂和/或所述第二剂包含抗体并且/或者包含荧光部分。
在一些实施方案中，所述第一剂和/或所述第二剂对哺乳动物细胞有害并且/或者对受试者有毒，并且/或者所述第一剂和/或所述第二剂在直接施用到受试者的血流中时易于降解。
在实施方案中，所述第一化合物和/或所述第二化合物还包含荧光部分。
在各种实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述第二GAG结合肽还优先结合丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
在一些实施方案中，所述分离的血小板还包含至少一个拷贝的第三化合物，所述第三化合物包含第三剂和第三多肽，其中所述第三多肽包含能够结合血小板的第三α颗粒类型中的GAG的第三糖胺聚糖(GAG)结合肽；并且其中所述第三GAG结合肽优先结合丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
本公开的又一方面是一种药物组合物，所述药物组合物包含任何本文公开的方面或实施方案的分离的血小板和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在实施方案中，所述药物组合物还包含第二分离的血小板，所述第二分离的血小板包含至少一个拷贝的第三化合物，所述第三化合物包含第三剂和第三多肽，其中所述第三多肽包含能够结合血小板的第三α颗粒类型中的GAG的第三糖胺聚糖(GAG)结合肽；并且其中所述第三GAG结合肽优先结合丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
在各种实施方案中，所述药物组合物还包含第二分离的血小板，所述第二分离的血小板包含至少一个拷贝的所述第一化合物，或者还包含第三分离的血小板，所述第三分离的血小板包含至少一个拷贝的第二化合物。
在一些实施方案中，所述药物组合物还包含第二分离的血小板，所述第二分离的血小板包含至少一个拷贝的所述第一化合物，并且包含第三分离的血小板，所述第三分离的血小板包含至少一个拷贝的第二化合物。
在一个方面，本公开提供了任何本文公开的药物组合物用于治疗疾病或病症的用途。在实施方案中，所述疾病或病症是癌症。
在另一个方面，本公开提供了任何本文公开的分离的血小板或任何本文公开的药物组合物在制造用于治疗疾病或病症的药剂中的用途。在各种实施方案中，所述疾病或病症是癌症。
在又一个方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的任何本文公开的药物组合物的步骤。
本公开的一个方面是一种用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的任何本文公开的组合物的步骤。
在以上方法的一些实施方案中，第一α颗粒类型的内容物在第二α颗粒类型的内容物释放之前在靶位点处释放。
在以上方法的实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用第二药物组合物和/或第三药物组合物的步骤，所述第二药物组合物和/或第三药物组合物独立地包含乙酰肝素酶、凝血酶及其片段肽、蛋白酶激活受体1(PAR1)激动剂或拮抗剂肽、蛋白酶激活受体4(PAR4)激动剂或拮抗剂肽、纤溶酶及其片段、金属蛋白质酶、过氧化物酶和/或磷酸水解酶中的一种或多种。在一些情况下，所述第二药物组合物促进第一化合物从第一α颗粒类型释放，并且所述第三药物组合物促进第二化合物从第二α颗粒类型释放。所述第二药物组合物和/或所述第三药物组合物可以在所述药物组合物施用之后施用。所述药物组合物可以在所述第二药物组合物和/或所述第三药物组合物施用之前施用至少两次。
在以上方法的各种实施方案中，所述疾病或病症是癌症。
在以上方法的一些实施方案中，所述疾病或病症是炎症。
在以上方法的各种实施方案中，所述疾病或病症是植入物、移植物、支架或假体的副作用。
在以上方法的实施方案中，所述疾病或病症由缺陷型基因引起。
在以上方法的一些实施方案中，所述疾病或病症是损伤。
本公开的另一方面是一种用于制造负载的血小板的方法。所述方法包括以下步骤：获得血小板；使所述血小板在体外或离体与任何本文公开的组合物接触；以及使所述血小板与所述组合物之间的接触进展，直到所述第一化合物被所述血小板的第一α颗粒类型内化并且所述第二化合物被所述血小板的第二α颗粒类型内化，从而产生负载的血小板。
本公开的又一方面是一种用于制造负载的血小板的方法。所述方法包括以下步骤：获得血小板；使所述血小板在体外或离体与第一化合物接触，所述第一化合物包含第一剂和第一多肽，其中所述第一多肽包含能够结合血小板的第一α颗粒类型中的GAG的第一糖胺聚糖(GAG)结合肽；以及使所述血小板在体外或离体与第二化合物接触，所述第二化合物包含第二剂和第二多肽，其中所述第二多肽包含能够结合血小板的第二α颗粒类型中的GAG的第二糖胺聚糖(GAG)结合肽。
在实施方案中，使所述血小板与第一化合物接触和所述使血小板与第二化合物接触同时发生。
在各种实施方案中，使所述血小板与第一化合物接触和使血小板与第二化合物接触依序发生。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述血小板在体外或离体与第三化合物接触，所述第三化合物包含第三剂和第三多肽，其中所述第三多肽包含能够结合血小板的第三α颗粒类型中的GAG的第三糖胺聚糖(GAG)结合肽；并且其中所述第三GAG结合肽优先结合丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
在一个方面，本公开提供了一种用于治疗疾病或病症的药盒。所述药盒包括任何本文公开的分离的血小板和使用说明书。
在另一个方面，本公开提供了一种用于治疗疾病或病症的药盒。所述药盒包括任何本文公开的药物组合物和使用说明书。
在实施方案中，所述药盒还包括第二药物组合物和/或第三药物组合物，所述第二药物组合物和/或第三药物组合物独立地包含乙酰肝素酶、凝血酶及其片段肽、蛋白酶激活受体1(PAR1)激动剂或拮抗剂肽、蛋白酶激活受体4(PAR4)激动剂或拮抗剂肽、纤溶酶及其片段、金属蛋白质酶、过氧化物酶和/或磷酸水解酶中的一种或多种。
在又一个方面，本公开提供了一种用于制造负载的血小板的药盒。所述药盒包括任何本文公开的组合物和使用说明书。
本文公开的任何方面或实施方案可与如本文公开的任何其他方面或实施方案组合。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考阐述说明性实施方案的以下详细描述和附图(在本文中也为“图(figure)”和“图(FIG.)”)获得对本公开的特征和优点的更好理解，在所述说明性实施方案中利用本发明的原理，其中：
图1A和图1B是示出说明性糖胺聚糖(GAG)结合肽将附接的货物螯合(sequester)至血小板中的能力的图。
图2A是免疫荧光图像，并且图2B是展示说明性糖胺聚糖(GAG)结合肽将附接的货物螯合至血小板的α颗粒中的能力的图。
图3A是描绘等温滴定量热法(ITC)实验的示意图。滴定至含有说明性GAG结合肽的池(cell)中的硫酸软骨素A(CSA)的ITC解离动力学的图形表示显示在图3B(对于SEQ IDNO:1的GAG结合肽)、图3C(对于SEQ ID NO:2的GAG结合肽)和图3D(对于无电荷配体)中。图3B的数据列于图3E中，并且图3C的数据列于图3F中。
图4A示出包括对照肽(CFL；EGGIWFPYGGF；SEQ ID NO:14)和两个PAL(PAL1；ERRIWFPYRRF；SEQ ID NO:1和PAL2；RFR WPYRIREF；SEQ ID NO:2)的肽氨基酸序列。图4B和图4C示出了前面图中的三个说明性GAG结合肽(尽管在与硫酸乙酰肝素(HS)结合时)的亲和色谱数据。图4D示出Fam-PAL-Lucitanib的缀合图。图4E示出各种缀合物的FGFR活性％。缀合的Lucitanib保持如使用来自Promega的ADP-Glo药盒所测试的FGFR1抑制功能。EC50略有下降可能是由于缀合物溶解度降低所致。该图和其他地方(如适用)中包括的缩写如下：A-PAL1——Alexa647标记的PAL1；A-PAL2——Alexa647标记的PAL2；Fam-PAL1--Fam标记的PAL1；Fam-PAL 2--Fam标记的PAL2；Fam-PAL1-Luci——Fam-PAL1缀合的Lucit anib；Fam-PAL2-Luci——Fam-PAL2缀合的Lucitanib；Fam-CFL-Lu ci——Fam-CFL缀合的Lucitanib；和Fam-L-Luci——Fam-接头缀合的Lucitanib。
图5是展示包含糖胺聚糖(GAG)结合肽和剂的说明性化合物负载至血小板中的图。
图6A是免疫荧光图像，并且图6B是展示包含糖胺聚糖(GAG)结合肽和剂的说明性化合物负载至血小板的α颗粒中的能力的图。
图7A至图7C包括滴定至池中的硫酸软骨素A(CSA)的ITC解离动力学的图形表示，所述池含有包含PAL1的说明性化合物(图7A)、包含PAL2的说明性化合物(图7B)和包含CFL的对照化合物(图7C)。图7A的数据列于图7D中，图7B的数据列于图7E中，并且图7C的数据列于图7F中。
图8示出先前图中的三种说明性化合物(尽管在与硫酸乙酰肝素(HS)结合时)的亲和色谱数据。
图9A包括滴定至含有另外的说明性化合物的池中的硫酸软骨素A(CSA)的ITC解离动力学的图形表示。这些另外的说明性化合物被标识为PAL1A至PAL11A，并且分别包含具有SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:13的氨基酸序列的GAG结合肽。图9A的数据列于图9B至图9L中。图9M是描绘另外的说明性化合物和阴性对照化合物的平均解离常数的图。
图10A是示出当形成本公开的化合物时将GAG结合肽缀合至剂的说明性步骤的图。图10B是免疫荧光图像，并且图10C是展示包含糖胺聚糖(GAG)结合肽和剂的说明性化合物负载至血小板的α颗粒中的能力的图。
图11是显示bFGF、VEGF、PDGF和内皮抑素的血小板水平恰好在肿瘤逃离休眠之前发生变化的图，其中平衡朝向肿瘤生长刺激剂。
图12是显示血小板主动螯合癌症特异性蛋白质，并且不主动螯合非特异性蛋白质如白蛋白的MS表达图。
图13是显示血小板含有血管生成的刺激剂(VEGF、bFGF、PDGF)和抑制剂(PF4、内皮抑素)的表格。
图14示出了在干预后6个月时对接受积极的生活方式干预的患有局限性前列腺癌的受试者(蓝色)以及进行观察等待而不改变生活方式的受试者的血小板的SELDI-ToF分析。
图15A和图15B是显示对各受体的抑制不会抑制血小板螯合(图15A)，但苏尔芬(surfen)对肝素结合的抑制导致对血小板α颗粒的蛋白质螯合的显著抑制(图15B)。
图16是显示VEGF和内皮抑素存在于单独的血小板α颗粒中的免疫荧光图像。
图17是显示血管生成刺激剂(例如，VEGF)与P-选择素一起定位在α颗粒中的免疫荧光图像。
图18是显示内皮抑素位于分开且不同(distinct)的α颗粒区室中，并且与冯维勒布兰德因子(VWF)而不是与P-选择素共定位的免疫荧光图像。
图19包括总结伤口愈合中蛋白质的顺序释放以及蛋白质酶激活受体1(PAR1)和PAR4的局部浓度梯度的示意图。
图20是显示血管内皮瘤细胞(EOMA)表面上的GAG对生长因子的螯合的图，其证实了螯合是肝素依赖性的并且随着凝血酶的存在而增加。
图21是示出鼠血管内皮瘤细胞(EOMA)响应于从血小板形成的临时基质释放的生长因子的增殖的图。
图22是显示血小板形成可在肿瘤激活时与内皮细胞交换蛋白质的临时基质的免疫荧光图像。
图23A是示出PAL1或PAL2缀合物向血小板中的负载的免疫荧光图像。图23B是显示Fam-PAL1或Fam-PAL2(顶部)和Fam-PAL1-Lucitanib或Fam-PAL2-Lucitanib(底部)向血小板中的剂量响应性负载的图。负载的血小板似乎保留了静息的、功能齐全的血小板的形态。
图24是显示PAL1和PAL2具有不同的亚细胞定位，即对不同的α颗粒具有偏好的免疫荧光图像。
图25A和图25B是显示PAL1(图中紫色)和PAL2(图中淡蓝色)可以不同地结合硫酸软骨素A(CSA；图25A)和硫酸乙酰肝素(HS；图25B)的结构图。
图26A和图26B显示当PAL1被缀合到小分子上时，PAL1可以将相应的分子引导到血小板α颗粒中。
图27A是说明分级分离血小板颗粒时的步骤的流程图。图27B是示出用于分离血小板颗粒的蔗糖梯度(顶部是卡通)和(底部是照片)的图像。图27C是颗粒级分的蛋白质印迹。图27D包括颗粒级分的免疫荧光图像，该颗粒级分针对FAM、PF4、MRP4或VEGF被标记。图27E是量化每个颗粒级分中的标志物PF4、VEGF和MRP4的图。图27F是显示PAL缀合物在某些颗粒级分中的定位的图。图27G示出了图27E中所示图像的皮尔逊相关分析(PCA)。
具体实施方式
本公开涉及一种负载有超过一种化合物的分离的血小板。第一化合物包含第一剂和第一多肽，其中所述第一多肽包含第一糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述第一GAG结合肽能够结合血小板的第一α颗粒类型中的GAG。第二化合物包含第二剂和第二多肽，其中所述第二多肽包含第二GAG结合肽，所述第二GAG结合肽能够结合血小板的第二α颗粒类型中的GAG。所述第一α颗粒类型和所述第二α颗粒类型的特征在于不同的GAG占优势。
值得注意的是，所述第一GAG结合肽优选结合至主要在第一α颗粒类型(即，P-选择素类型颗粒)上发现的GAG类型，并且所述第二GAG结合肽优选结合至主要在第二α颗粒类型(即，vWF类型颗粒)上发现的GAG类型。通过用第一GAG结合肽工程化第一化合物并且用第二GAG结合肽工程化第二化合物，血小板可以负载有进入两种不同的颗粒类型中的两种活性剂。重要的是，每种颗粒类型均具有单独的释放谱，其部分基于与颗粒类型相关的凝血酶受体(即蛋白质酶激活受体1(PAR1)和PAR4)的特性。PAR1是首先被触发(在低凝血酶条件下)并且释放P-选择素型α颗粒的高亲和力凝血酶受体(此处称为第一α颗粒类型)，而PAR4是仅在已积累足够量的凝血酶时被触发从而释放vWFα颗粒的低亲和力受体(此处称为第二α颗粒类型)。任选地，α颗粒的内容物的释放可以响应于与基质金属蛋白质酶(MMP)、过氧化物酶、磷酸水解酶、纤溶酶或纤溶酶衍生物(诸如组织纤溶酶原激活剂(tPA))的接触而被诱导，这些释放诱导剂能够以药物组合物的形式并且在有利于促进治疗响应所需的剂的释放的时间向受试者施用。
本公开的负载的血小板能够经由不同的α颗粒类型以时间和空间受控的方式释放它的内容物。除了凝血酶及其衍生物的酶活性外，其他组织驻留蛋白酶如过氧化物酶、磷酸水解酶、纤溶酶或纤溶酶衍生物(如组织纤溶酶原激活剂(tPA))也以时间和空间受控的方式选择性地释放血小板α颗粒内容物。
因此，血小板至少负载有具有早期释放谱的第一α颗粒类型中的第一药物和具有较晚释放谱的第二α颗粒类型中的第二药物。因此，可以将治疗剂设计成在治疗早期期间释放所需的第一剂并且在治疗较晚期期间释放所需的第二剂。另外，可以通过向受试者施用刺激释放的药物组合物(例如凝血酶、金属蛋白质酶(MMP)、过氧化物酶、磷酸水解酶、纤溶酶或纤溶酶衍生物，诸如组织纤溶酶原激活剂(tPA))来控制不同α颗粒类型的释放的时机。
本发明部分地基于负载有进入不同的α颗粒类型中的多种剂的血小板的创建。向损伤、病理性炎症和/或血管生成部位提供定向治疗剂的负载的血小板。鳌合在血小板(例如血小板α颗粒)内的此类剂通常被保护免受降解，所述降解可在全身施用时发生。这种益处，与血小板归巢至损伤、炎症和/或血管生成部位的天然能力结合，有助于确保将治疗有效量的剂递送至靶部位。另外，因为可用于本发明中的血小板负载有进入不同的α颗粒类型中的多种不同的剂；所述不同的剂以空间和时间受控的方式从血小板中释放。因此，本发明向损伤部位(例如，用于治疗慢性伤口)、病理性炎症部位(例如，用于治疗关节或肺损伤)和/或血管生成部位(例如，用于治疗癌症)提供定向和受控治疗剂。
在本发明之前，违反直觉的是剂可以通过被锚定到α颗粒中的特定糖胺聚糖(GAG)而内化到血小板中以及特定的GAG结合肽可被用来促进内化过程，更不用说给不同的α颗粒类型特异性地负载不同的化合物。事实上，先前还没有已知的用于将剂负载至血小板α颗粒中的方法，并且也不知道可以给α颗粒类型的亚群负载不同的剂，从而使得该不同的剂能够空间和/或时间受控地释放。这种受控释放允许不同剂的顺序递送，这可产生在同时施用不同剂时可能观察不到的协同治疗效果。
本发明提供了许多益处，包括但不限于：
(1)将剂靶向递送至原发性肿瘤或转移生长部位，这避免了对高剂量的剂的全身施用的需要；因此，需要较低剂量的剂来在靶部位实现所述剂的治疗有效浓度；
(2)鳌合在血小板α颗粒中的剂不能结合脱靶受体；因此，避免了与单独全身施用所述剂相关的副作用(例如毒性)；
(3)鳌合在血小板α颗粒中的剂被保护免受自然过程(例如组织蛋白酶)降解；因此，所述剂的半衰期相对于在单独全身施用所述剂时延长；
(4)选择性地将剂负载至不同的α颗粒类型中，每种类型均具有单独的释放谱，从而允许不同的剂以空间和时间受控的方式从血小板中释放；和
(5)α颗粒的负载的血小板的内容物的释放可响应于与释放诱导剂的接触而被诱导，所述释放诱导剂可以以药物组合物的形式并且在有利于促进治疗响应所需的剂释放的时间向受试者施用。
值得注意的是，本公开的负载的血小板保持为静息的、功能齐全的血小板，而不是被负载过程激活，这种激活将使血小板成为促凝血剂。
血小板、血小板颗粒和糖胺聚糖
本发明提供用于治疗疾病、病症或损伤的化合物、药物组合物和方法，其中血小板是天然的第一响应者，并且其中血小板至少改善所述疾病、病症或损伤的初始症状。说明性的疾病、病症或损伤包括但不限于癌症、类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病、肥胖症、动脉粥样硬化、缺血性心脏病和肢体疾病、溃疡性结肠炎、中风、烧伤和其他伤口。在生理条件下，循环中血小板维持组织的健康和稳定。
关于血小板在伤口和肿瘤微环境中的作用的新信息已经出现；参见例如，Klement等人,“Platelets actively sequester angiogenesis regulators”,Blood.2009；113:2835-42和Klement等人,“The Role of Platelets in Angiogenesis.In:Michelson A,editor.Platelets.第三版Philadelphia,PA:Mosby Elsevier；2013.第487-503页。然而，对血小板/组织相互作用的复杂性以及血小板在调节组织生长和血管生成中的作用的理解进展缓慢。众所周知，血小板含有不同类型的颗粒，包括α颗粒、致密颗粒和溶酶体，它们执行不同的功能。通常含有生长因子的α颗粒是最普遍的颗粒类型。参见，Blair和Flaumenhaft,“Platelet alpha-granules:basic biology and clinical correlates”.Blood Reviews.2009,23(4):177–89以及Harrison和Cramer,“Platelet alpha-granules”.Blood Reviews.1993,7(1):52–62。通常，α颗粒的货物主要包含血管生成的抑制剂。参见例如，Peterson等人,“Normal ranges of angiogenesis regulatory proteinsin human plate-lets.”American journal of hematology.2010；85:487-93。然而，当受试者患有癌症时，血小板货物发生变化，并且α颗粒变得主要负载有刺激剂；参见Peterson等人,American journal of hematology.2010；85:487-93和Peterson等人,“VEGF,PF4and PDGF are elevated in platelets of colorectal cancer patients.”Angiogenesis.2012；15:265-73。
本发明部分地基于以下发现：货物可负载在不同的α颗粒类型中并且这种负载不是受体介导的。而是负载至血小板中，特别是负载至它们的α颗粒中的货物依赖于与血小板的α颗粒中的糖胺聚糖(GAG)的结合，并且一种类型的α颗粒的特征在于一种GAG和其他标记物，并且另一种类型的α颗粒的特征在于第二GAG和其他标志物。当血小板与非特异性GAG抑制剂(即苏尔芬)接触时，减少量的货物负载至血小板中。
本发明进一步部分地基于以下发现：血小板的货物是按功能组构的，其中血管生成的刺激剂和抑制剂被吸收到血小板α颗粒的不同的亚群中；这种不同性是基于货物与至少硫酸软骨素或硫酸乙酰肝素，以及还有丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa的结合亲和力。此外，P-选择蛋白限定的α颗粒亚群吸引对GAG具有较弱亲和力(即较高Kd)的GAG结合化合物，而冯维勒布兰德因子(VWF)限定的α颗粒亚群包含与硫酸软骨素具有强亲和力(即较高Kd)相互作用的蛋白质。
此外，本发明部分地基于出人意料的发现，即α颗粒的货物在聚集和凝结时不会被大量释放。而是血管生成生长刺激剂或抑制剂响应于特定刺激如凝血酶(和/或基质金属蛋白质酶(MMP)、过氧化物酶、磷酸水解酶、纤溶酶或纤溶酶如组织纤溶酶原激活剂(tPA))的局部水平以空间和时间受控的方式释放。以凝血酶为例，用P-选择蛋白标记的α颗粒的早期反应亚群在血管损伤(例如，低凝血酶条件)后和PAR1(高亲和力凝血酶受体)接合时立即释放其内容物；相比之下，用vWF因子标记的α颗粒的晚期反应亚群在被PAR4(即低亲和力凝血酶受体)接合时释放其内容物。
因此，本发明利用血小板的天然能力来靶向血管内皮层中的裂口。在癌症的情况下，这允许将血小板的货物递送至肿瘤部位。重要的是，根据本公开，血小板的不同的α颗粒预先负载有两种或更多种剂，并且这些剂以特异性递送至在肿瘤部位形成的临时基质。重要地，在本发明中，负载至不同的α颗粒类型中的两种或更多种剂由组织蛋白酶以细致的时间和空间受控的酶促作用从临时基质释放。
血小板中存在两种主要GAG：硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素。
硫酸乙酰肝素(HS)是与葡萄糖胺1→4连接的糖醛酸的线性共聚物，但具有高度可变的结构。d-葡萄糖醛酸在HS中占主导地位，尽管可存在大量的l-艾杜糖醛酸。与肝素相比，HS在磺基中的取代率要低得多。
肝素是高度异质的线性多分散多糖，由1→4-连接的吡喃糖醛酸和2-氨基-2-脱氧吡喃葡萄糖(葡糖胺)残基的重复单元组成。糖醛酸残基通常由90％的l-吡喃艾杜糖醛酸(l-艾杜糖醛酸)和10％的d-吡喃葡萄糖醛酸(d-葡萄糖醛酸)组成。葡糖胺残基的氨基可被乙酰基或磺基取代或未取代。葡糖胺残基的3位和6位可被O-磺基取代或未取代。糖醛酸，其可以是l-艾杜糖醛酸或d-葡萄糖醛酸，也可含有2-O-磺基
大多数肝素结合蛋白结合肝素和硫酸乙酰肝素两者。两者均是具有异质糖序列的多分散多糖，其可将大量蛋白质与多种可能的结合位点结合。肝素主要存在于细胞内，而HS蛋白聚糖(HSPG)定位于许多细胞表面并例如通过使生长因子和蛋白质配体稳定而有助于细胞外基质(ECM)的功能。
硫酸软骨素(CS)是以下重复二糖单元的随机序列的线性聚合物：2-乙酰氨基-2-脱氧-4-0-硫酸盐-3 -0-～-D-吡喃葡萄糖基-D-半乳糖；2-乙酰氨基-2-脱氧-6-0-硫酸盐-3 -0-～-D-吡喃葡萄糖基-D-半乳糖；2-乙酰氨基-2-脱氧-4,6-0-二硫酸盐-3-0-～-D-吡喃葡萄糖基-D-半乳糖；和2-乙酰氨基-2-脱氧-6-0-硫酸盐-3 -0-～-2'-0-硫酸盐-D-吡喃葡萄糖基-D-半乳糖。每个单硫酸化二糖单元具有500-600g/mol的分子量，并且其总重量是5-50kDa。硫酸软骨素分子在溶液中的体积比在脱水固体中大得多，因为它具有大量负电荷；在溶液中，可变分支上的负电荷相互排斥并迫使分子进入延伸构象。因此，CS分子上存在许多配体结合位点。
新的非天然GAG结合肽可用于本公开的化合物和方法中，因为它们对于将货物负载至血小板的α颗粒中是必不可少的。本公开的GAG结合肽与剂化学或酶促连接(直接或间接)或遗传表达以产生含有所述剂和结合肽的融合蛋白。GAG结合肽和偶联剂在新的化合物或融合产物中保留其功能。因此，新的化合物或融合产物能够选择性地负载至血小板的特定α颗粒中。
值得注意的是，本公开的负载的血小板保持为静息的、功能齐全的血小板，而不是被负载过程激活，这种激活将使血小板成为促凝血剂。
糖胺聚糖(GAG)结合肽
本公开的糖胺聚糖(GAG)结合肽的特征在于存在带正电荷的碱性氨基酸，所述带正电荷的碱性氨基酸与GAG链上空间上限定的带负电荷的磺基或羧基形成离子对。例如，硫酸乙酰肝素(HS)具有由磺基和羧基提供的每个二糖平均两个负电荷；因此，HS与蛋白质之间最常见类型的相互作用是离子相互作用，尽管其他一些非静电相互作用如氢键合和疏水相互作用也可有助于复合物的稳定性。据信GAG的高阴离子性质导致非特异性结合。然而，在血小板的α颗粒中，GAG结合肽与特定α颗粒亚群中的HS或硫酸软骨素(CS)的结合以高特异性发生。通过匹配GAG结合亲和力和GAG结合肽可促进这种相互作用。GAG肽相互作用部分取决于沿聚合物中的多糖序列的磺基和羧基的限定模式和取向，以及GAG结合肽中碱性氨基酸的正确模式，以确保复合物的适当亲和力和特异性。
静电相互作用在GAG肽相互作用中起主要作用，并且GAG结合肽的结合序列内诸如精氨酸和赖氨酸的碱性氨基酸的位置是相关的。已经进行了许多研究以确定在GAG结合位点中是否存在以特定方式排列的碱性氨基酸的共有序列。例如，对来自四种蛋白质(载脂蛋白B、载脂蛋白E、玻连蛋白和血小板因子4)的肝素结合位点的比较表明，这些区域的特征在于两个氨基酸共有序列：XBBXBX和XBBBXXBX，其中B是碱性残基并且X是亲水性残基。分子建模研究表明，以β链构象建模的序列XBBXBX将碱性氨基酸定向在β链的一个面上，而亲水性残基则指向蛋白质核心。类似地，当序列XBBBXXBX折叠成α-螺旋时，碱性氨基酸展示在螺旋的一侧上。虽然一些肝素结合蛋白包含这种共有序列，但一些不包括。因此，其中碱性残基在空间上接近但在一级氨基酸序列中不一定接近的结构基序也可结合肝素。
肝素结合位点通常含有一个、两个或三个碱性氨基酸簇(XBnX，其中n＝1、2或3)。在天然蛋白质中观察到此类簇的具有一个或两个非碱性残基(BXmB，其中m＝1或2)的间距；这与肝素结合蛋白通常在生物系统中结合HS的观察结果一致。因为HS的电荷密度较低，所以最佳蛋白质结合可涉及间隔的碱性氨基酸簇。精氨酸和赖氨酸是肝素和HS结合蛋白中最常见的残基。尽管两种氨基酸在生理pH下均具有正电荷，但精氨酸约2.5倍更紧密地结合肝素。精氨酸与磺基形成更稳定的氢键以及更强的静电相互作用。非碱性残基也可在肝素-蛋白质相互作用中起重要作用。其中，已发现丝氨酸和甘氨酸是肝素结合肽中最常见的非碱性残基。两者均具有小的侧链，从而为肽与GAG的相互作用提供最小的空间约束和良好的柔性。
本发明部分地基于一种新的、非天然的糖胺聚糖(GAG)结合肽。本公开的GAG结合肽能够结合血小板α颗粒中的GAG。在实施方案中，GAG结合肽通过静电相互作用结合GAG。
在实施方案中，GAG结合肽结合至硫酸软骨素(CS)和/或硫酸乙酰肝素(HS)。在实施方案中，所述GAG结合肽优先结合至CS。在实施方案中，所述GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素A(CSA)。
在实施方案中，第一GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素(CS)，并且第二GAG结合肽优先结合至硫酸乙酰肝素(HS)。在实施方案中，所述第一GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素A(CSA)，而不优先结合至硫酸乙酰肝素(HS)。
在实施方案中，所述GAG结合肽结合至硫酸乙酰肝素(HS)、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。在实施方案中，所述GAG结合肽不优先结合至硫酸乙酰肝素(HS)、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。在实施方案中，所述GAG结合肽不结合至、不会可检测地结合至、基本不结合至或以低亲和力结合至HS、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于约1N NaCl时保持结合至含CS的柱。在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于约2N NaCl时保持结合至含CS的柱。在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于约3N NaCl时不结合至含CS的柱。
在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于介于约0.001N与约0.01N之间的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于至少约0.1N的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于至少约1N的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。
在实施方案中，所述GAG结合肽的长度介于约8个氨基酸与约14个氨基酸之间。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含至少一个带电氨基酸。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含至少一个脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
说明性GAG结合肽包含以下氨基酸序列之一：ERRIWFPYRRF(SEQ ID NO:1)；RFRWPYRIREF(SEQ ID NO:2)；ARRIWFPYRRF(SEQ ID NO:3)；EARIWFPYRRF(SEQ ID NO:4)；ERAIWFPYRRF(SEQ ID NO:5)；ERRAWFPYRRF(SEQ ID NO:6)；ERRIAFPYRRF(SEQ ID NO:7)；ERRIWAPYRRF(SEQ ID NO:8)；ERRIWFAYRRF(SEQ ID NO:9)；ERRIWFPARRF(SEQ ID NO:10)；ERRIWFPYARF(SEQ ID NO:11)；ERRIWFPYRAF(SEQ ID NO:12)；和ERRIWFPYRRA(SEQ ID NO:13)。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约70％同一性、与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约80％同一性或与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
不希望受制于理论，似乎碱性残基(例如，精氨酸)在定义GAG结合肽的性质方面是重要的，并且亲水性残基提供稳定化。
所述GAG结合肽相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一者可包含在位置1、位置4、位置7或位置9处的带电氨基酸。
在实施方案中，所述GAG结合肽相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一者包含在位置1、位置4、位置7和/或位置9处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。作为实例，GAG结合肽包含在位置1、位置4、位置7和位置9处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1和位置4处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1、位置4和位置7和/或位置9处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1、位置4、位置7和位置9处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1和位置7处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1和位置4以及位置9处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1和位置9处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；以及它们之间的任何组合。GAG结合肽可包含在位置1、位置4、位置7和位置9处的脯氨酸；GAG结合肽可包含在位置1、位置4、位置7和位置9处的精氨酸；GAG结合肽可包含在位置1、位置4、位置7和位置9处的异亮氨酸；GAG结合肽可包含在位置1处的脯氨酸，以及在位置4、位置7和位置9处的精氨酸；GAG结合肽可包含在位置1处的脯氨酸、在位置4和位置7处的精氨酸以及在位置9处的异亮氨酸；GAG结合肽可包含在位置1处的脯氨酸、在位置4处的精氨酸和在位置9处的异亮氨酸；或者GAG结合肽可包含在位置4处的精氨酸和在位置9处的脯氨酸。在位置1、位置4、位置7和/或位置9处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸的任何组合都涵盖于本公开中。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含至少10个氨基酸。在实施方案中，所述GAG结合肽包含11个氨基酸。在实施方案中，所述GAG结合肽由11个氨基酸组成。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在实施方案中，所述GAG结合肽由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一者的氨基酸序列组成。
本发明提供了通过产生变体GAG结合肽，例如通过在本文公开的GAG结合肽的氨基酸序列中包含缺失、突变、插入或翻译后修饰来优化GAG结合肽的方法。
变体可在一个氨基酸位置不同于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13的GAG结合肽，只要变体GAG结合肽保留其功能即可。
变体可在两个氨基酸位置不同于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13的GAG结合肽，只要变体GAG结合肽保留其功能即可。
变体可在三个氨基酸位置不同于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13的GAG结合肽，只要变体GAG结合肽保留其功能即可。
变体可在四个氨基酸位置不同于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13的GAG结合肽，只要变体GAG结合肽保留其功能即可。
变体可在五个氨基酸位置不同于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13的GAG结合肽，只要变体GAG结合肽保留其功能即可。
变体可在多于五个氨基酸位置不同于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13的GAG结合肽，只要变体GAG结合肽保留其功能即可。
在实施方案中，氨基酸差异可包括保守性和/或非保守性取代。“保守性取代”可例如基于所涉及的氨基酸残基的极性、电荷、大小、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行。20种天然存在的氨基酸可分为以下六个标准氨基酸组：(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr；Asn、Gln；(3)酸性：Asp，Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；以及(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。如本文所用，“保守性取代”定义为氨基酸被上面所示六个标准氨基酸组中的同一组中列出的另一种氨基酸交换。例如，Asp被Glu交换在这样修饰的多肽中保留一个负电荷。另外，基于甘氨酸和脯氨酸破坏α-螺旋的能力，它们可彼此取代。如本文所用，“非保守性取代”定义为氨基酸被上面所示六个标准氨基酸组(1)至(6)中的不同组中列出的另一种氨基酸交换。可通过包括诸如乙酰化、羧化、磷酸化或糖基化的化学改变来修饰GAG结合肽。
因此，本公开提供了用于表征和优化(例如，增加亲和力)针对各种糖胺聚糖的GAG结合肽的方法。本公开所提供的优化的GAG结合肽可针对存在于血小板α颗粒中的糖胺聚糖。存在于血小板α颗粒中的说明性糖胺聚糖包括硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和GPIIb/IIIa。任何优化的GAG结合肽都可包含在本公开的组合物中；可将任何组合物负载至血小板中，例如，用于包含在药物组合物中和/或用于治疗疾病或病症。
化合物和剂
如本文所公开，血小板的不同的α颗粒类型可选择性地且主动地(即，针对浓度梯度)鳌合血管生成、生长和炎症调控蛋白。本公开是基于以下发现：蛋白质被血小板吸收并基于它们对糖胺聚糖(GAG)的亲和力分离成α颗粒亚群：主要是硫酸乙酰肝素(HS)和硫酸软骨素(CS)。这些GAG的长的线性、带负电荷的链不仅为α颗粒提供结构支持，而且解释α颗粒的功能亚群。血小板中存在的两种主要GAG(即HS和CS)的不同之处主要在于各个链中发现的二糖的数量。硫酸乙酰肝素较小(15-30个二糖/侧链)，而硫酸软骨素具有许多结合位点并且具有多达250个二糖/侧链。两者均不同于大的刚性的GAG，如透明质酸盐(高达50,000个双糖/GAG侧链)，其作用是维持软骨和骨骼的结构和完整性。血小板中GAG的多样性对其功能至关重要，其中硫酸乙酰肝素的侧链较短且结合较弱，从而允许P-选择蛋白颗粒的早期释放；然而，更紧密、更长的链结合允许vWF颗粒的延迟释放。这些特征在本发明中被用于化合物的顺序释放。
本发明包括新的、非天然存在的血小板锚定糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述GAG结合肽至少以非常高的亲和力结合CS并且至少以中等亲和力结合HS。当与本公开的化合物中的剂连接时，GAG结合肽促进所述剂“负载”至血小板的α颗粒中。由于血小板持续循环并粘附至异常内皮的部位，所以本公开的化合物可广泛适用于多种病理性疾患。
本公开的一个方面是一种例如用于治疗疾病或病症的组合物。所述组合物包含第一化合物，所述第一化合物包含第一剂和第一多肽，其中所述第一多肽包含能够结合血小板的第一α颗粒类型中的GAG的第一糖胺聚糖(GAG)结合肽；以及第二化合物，所述第二化合物包含第二剂和第二多肽，其中所述第二多肽包含能够结合血小板的第二α颗粒类型中的GAG的第二糖胺聚糖(GAG)结合肽。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素(CS)，并且所述第二GAG结合肽优先结合至硫酸乙酰肝素(HS)。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素A(CSA)，而不优先结合至硫酸乙酰肝素(HS)。
在实施方案中，所述第一α颗粒类型是P-选择素相关颗粒，并且第二α颗粒类型是冯维勒布兰德因子(VWF)相关颗粒。
在实施方案中，所述第一α颗粒类型的内容物经由高亲和力凝血酶受体PAR1释放，并且所述第二α颗粒类型的内容物经由低亲和力凝血酶受体PAR4释放，任选地，α颗粒的内容物能够响应于与基质金属蛋白质酶(MMP)、过氧化物酶、磷酸水解酶、纤溶酶或纤溶酶衍生物(如组织纤溶酶原激活剂(tPA))的接触而释放。
在实施方案中，所述第一α颗粒类型的内容物在比提供所述第二α颗粒类型的内容物的释放所需的凝血酶浓度更低的凝血酶浓度下释放。
在实施方案中，所述第一α颗粒类型的内容物在所述第二α颗粒类型的内容物释放之前释放。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽的长度各自介于约8个氨基酸与约14个氨基酸之间。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽中的一者或两者包含至少一个带电氨基酸。在一些情况下，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽两者都包含至少一个带电氨基酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽中的一者或两者包含至少一个脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。在一些情况下，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽两者都至少包含至少一个脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含与SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13之一具有至少约70％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含与SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13之一具有至少约80％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含与SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13之一具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地相对于SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13中的任一者包含在位置1、位置4、位置7或位置9处的带电荷氨基酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽相对于SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13中的任一者包含在位置1、位置4、位置7和/或位置9处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含至少10个氨基酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述第二GAG结合肽独立地包含11个氨基酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地由11个氨基酸组成。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13之一的氨基酸序列。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1具有至少约90％同一性的氨基酸序列，并且所述第二GAG结合肽包含与SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述第一GAG结合肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述第二GAG结合肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。所述第一GAG结合肽可以由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成，并且所述第二GAG结合肽可以由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
在实施方案中，所述第一多肽由第一GAG结合肽组成并且所述第二多肽由第二GAG结合肽组成。
在实施方案中，所述第一多肽的N端直接或间接连接至所述第一剂并且/或者所述第二多肽的N端直接或间接连接至第二第一剂。
在实施方案中，所述第一多肽的C端直接或间接连接至所述第一剂并且/或者所述第二多肽的C端直接或间接连接至第二第一剂。
在任何本文公开的方面或实施方案中，剂(第一、第二或第三)和GAG结合肽(第一、第二或第三)可直接连接，或者它们可经由称为接头的部分连接。接头是指包含将剂共价附接至GAG结合肽的共价键或原子链的化学部分。接头包括二价基团如亚烷基、亚芳基、杂亚芳基，部分如：—(CR2)nO(CR2)n—，烷氧基的重复单元的聚合物(例如，聚亚乙基氧基、聚乙二醇(PEG)、聚亚甲基氧基)和烷基氨基的重复单元的聚合物(例如，聚亚乙基氨基、JeffamineTM)；以及二酸酯和酰胺，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺。在实施方案中，接头包含氨基酸链。在实施方案中，氨基酸链接头小于约500个氨基酸长、约450个氨基酸长、约400个氨基酸长、约350个氨基酸长、约300个氨基酸长、约250个氨基酸长、约200个氨基酸长、约150个氨基酸长或约100个氨基酸长。例如，氨基酸链接头的长度可小于约100、约95、约90、约85、约80、约75、约70、约65、约60、约55、约50、约45、约40、约35、约30、约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约12、约11、约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3或约2个氨基酸。在实施方案中，氨基酸链接头介于约15个氨基酸与约3个氨基酸之间，例如介于约10与5个氨基酸之间。
在实施方案中，所述第一剂经由第一接头间接连接至所述第一多肽并且/或者所述第二剂经由第二接头间接连接至所述第二多肽。在一些情况下，所述第一接头和/或所述第二接头各自包含一个或多个原子。所述第一接头和/或所述第二接头可各自包含重复单元的聚合物。所述第一接头和/或所述第二接头可以各自包含氨基酸链。
在实施方案中，所述第一剂直接连接至所述第一多肽并且/或者所述第二剂直接连接至所述第二多肽。
在实施方案中，所述第一剂直接连接至所述第一多肽或使用马来酰亚胺反应、琥珀酰亚胺酯反应、酶促反应或不影响蛋白质结构或活性的另外缀合系统间接地连接至所述第一多肽，并且/或者所述第二剂直接连接至所述第二多肽或使用马来酰亚胺反应、琥珀酰亚胺酯反应、酶促反应或不影响蛋白质结构或活性的另外缀合系统间接地连接至所述第二多肽。
在实施方案中，所述第一剂和/或所述第二剂独立地包含抗体，化学治疗剂，细胞毒性化合物，小分子，荧光部分，放射性元素，免疫检查点抑制剂，生长因子，生长抑制剂，蛋白酶/蛋白质酶，凝血因子，脂质或磷脂，细胞外基质蛋白，激素，酶，趋化因子/化学引诱物，神经营养蛋白，酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)，或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。在一些情况下，所述第一剂和/或所述第二剂包含抗体或荧光部分。
可用于本发明中的说明性抗体(或其片段)包括3F8、8H9、阿巴伏单抗(Abagovomab)、阿昔单抗(Abciximab)、阿比妥珠单抗(Abituzu mab)、阿泽奇单抗(Abrezekimab)、阿利鲁单抗(Abrilumab)、阿克托舒单抗(Actoxumab)、阿达木单抗(Adalimumab)、阿德木单抗(Adecatum umab)、阿度努单抗(Aducanumab)、阿法库单抗(Afasevikumab)、阿非莫单抗(Afelimomab)、培化阿赛珠单抗(Alacizumab pegol)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、阿利库单抗(Alirocumab)、喷替酸阿妥莫单抗(Altum omabpentetate)、阿麦妥昔单抗(Amatuximab)、马安那莫单抗(Anatu momab mafenatox)、安德利昔单抗(Andecaliximab)、雷星-阿奈妥单抗(Anetumab ravtansine)、阿尼鲁单抗(Anifrolumab)、安芦珠单抗(Anru kinzumab)(IMA-638)、阿泊珠单抗(Apolizumab)、伊汀-阿普卢妥单抗(Aprutumab ixadotin)、阿西莫单抗(Arcitumomab)、阿伐苏单抗(Ascrinvacumab)、阿塞珠单抗(Aselizumab)、阿特珠单抗(Atezolizumab)、Atidortoxumab、阿替奴单抗(Atinumab)、阿托木单抗(Atorolimumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、阿妥昔珠单抗维多汀(Azintuxizumab vedotin)、巴匹珠单抗(Bapineuzumab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、巴维昔单抗(Bavituximab)、BCD-100、贝妥莫单抗(Bectumomab)、贝戈罗单抗(Begelomab)、贝兰他单抗莫福汀(Belantamab 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pegol)、西利单抗(Cetrelimab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、赛必妥单抗(Cibisatamab)、西妥珠单抗(Cirmtuzumab)、泊西他珠单抗(Citatuzumab bogatox)、西妥木单抗(Cixutumumab)、克拉吉珠单抗(Clazakizumab)、克立昔单抗(Clenoliximab)、克立瓦妥珠单抗替坦司(Clivatuzumab tetraxetan)、考曲妥珠单抗(Codrituzumab)、培汀-考非妥珠单抗(Cofetuzumab pelidotin)、雷星-考妥昔单抗(Coltuximab ravtansine)、可那木单抗(Conatumumab)、康赛珠单抗(Concizumab)、考韦昔单抗(Cosfroviximab)、CR6261、克瑞奈珠单抗(Crenezumab)、立赞利珠单抗(Crizanlizumab)、克罗特度单抗(Crotedumab)、库萨妥珠单抗(Cusatuzumab)、达西珠单抗(Dacetuzumab)、达利珠单抗(Daclizumab)、达洛妥珠单抗(Dalotuzumab)、培化达匹利珠单抗(Dapirolizumab pegol)、达雷木单抗(Daratumumab)、德屈库单抗(Dectrekumab)、登赛珠单抗(Demcizumab)、玛汀-地宁妥珠单抗(Denintuzumab mafodotin)、地诺单抗(Denosumab)、玛汀-迪妥昔珠单抗(Depatuxizumab mafodotin)、地洛昔单抗生物素(Derlotuximab biotin)、地莫单抗(Detumomab)、迪扎米珠单抗(Dezamizumab)、地努妥昔单抗(Dinutuximab)、地瑞伏单抗(Diridavumab)、多玛洛珠单抗(Domagrozumab)、阿托度单抗(Dorli momab 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uzumab)、法希姆单抗(Fasinumab)、FBTA05、泛维珠单抗(Felvizumab)、(Fezakinumab)、非扎奴单抗非巴珠单抗(Fibatuzumab)、菲拉妥珠单抗(Ficlatuzumab)、芬妥木单抗(Figitumumab)、非利伏单抗(Firivumab)、夫兰妥单抗(Flanvotumab)、夫来库单抗(Fletikumab)、伏妥珠单抗(Flotetuzumab)、芳妥珠单抗(Fontolizumab)、弗雷鲁单抗(Foralumab)、福拉韦单抗(Foravirumab)、瑞玛奈珠单抗(Fremanezumab)、夫苏木单抗(Fresolimumab)、弗洛西单抗(Frovocimab)、夫卢维单抗(Frune vetmab)、伏雷努单抗(Fulranumab)、伏妥昔单抗(Futuximab)、伽奈珠单抗(Galcanezumab)、加利妥昔单抗(Galiximab)、甘妥单抗(Gancotamab)、加尼妥单抗(Ganitumab)、冈特奈卢单抗(Gantenerumab)、伽妥珠单抗(Gatipotuzumab)、加维莫单抗(Gavilimomab)、(Gedivumab)、吉妥珠单抗奥佐米星(Gemtuzumab ozogamicin)、吉伏珠单抗(Gevoki zumab)、吉维单抗(Gilvetmab)、瑾司鲁单抗(Gimsilumab)、吉瑞妥昔单抗(Girentuximab)、维汀-格仑妥木单抗(Glembatumumab vedotin)、戈利木单抗(Golimumab)、戈利昔单抗(Gomiliximab)、Tau蛋白单抗(Gosuranemab)、古赛库单抗(Guselkumab)、伊利尤单抗(Ianalumab)、艾巴利珠单抗(Ibalizumab)、IBI308、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)和90Y-替伊莫单抗、艾芦库单抗(Icrucumab)、依达赛珠单抗(Idaruci zumab)、Ifabotuzumab、伊戈伏单抗(Igovomab)、Iladatuzumab vedotin、IMAB362、伊马单抗(Imalumab)、Imaprelimab、英西单抗(Imciro mab)、英加妥珠单抗(Imgatuzumab)、英拉苏单抗(Inclacumab)、雷星-英达妥昔单抗(Indatuximabravtansine)、维汀-英度妥单抗(Indusatumab vedotin)、英比利珠单抗(Inebilizumab)、英夫利昔单抗(Infliximab)、伊诺莫单抗(Inolimomab)、奥英妥珠单抗(Inotuzumabozogamicin)、英妥木单抗(Intetumumab)、Iomab-B、伊匹单抗(Ipilimumab)、伊妥木单抗(Iratumumab)、艾萨妥昔单抗(Isatuximab)、Iscalimab、艾司妥单抗(Istiratumab)、艾托利珠单抗(Itolizumab)、艾塞吉珠单抗(Ixekizumab)、凯利昔单抗(Keliximab)、拉贝珠单抗(Labetuzumab)、拉妥珠单抗(Lac notuzumab)、Ladiratuzumab vedotin、兰帕珠单抗(Lampalizumab)、拉那芦单抗(Lanadelumab)、兰洛珠单抗(Landogrozumab)、恩星-拉妥昔单抗(Laprituximab emtansine)、拉韦昔单抗(Larcaviximab)、来金珠单抗(Lebrikizumab)、来马索单抗(Lemalesomab)、Lendalizumab、Lenve rvimab、仑兹鲁单抗(Lenzilumab)、乐迪利木单抗(Lerdelimumab)、Leronlimab、来索伏单抗(Lesofavumab)、来利珠单抗(Letolizumab)、来沙木单抗(Lexatumumab)、利韦单抗(Libivirumab)、维汀-利法妥珠单抗(Lifastuzumab vedotin)、利格利珠单抗(Ligelizumab)、利洛妥单抗satetraxetan(Lilotomab satetraxetan)、林妥珠单抗(Lintuzumab)、利瑞鲁单抗(Lirilumab)、洛迪赛珠单抗(Lodelcizumab)、洛吉维单抗(Lokiv etmab)、特司林-朗妥昔单抗(Loncastuximab tesirine)、莫星-洛沃妥珠单抗(Lorvotuzumab mertansine)、维汀-罗妥昔珠单抗(Losatuxizumab vedotin)、鲁卡妥木单抗(Lucatumumab)、培化鲁利珠单抗(Lulizumab pegol)、鲁昔单抗(Lumiliximab)、鲁瑞妥珠单抗(Lumretuzumab)、阿汀-鲁帕妥单抗(Lupartumab amadotin)、鲁吉珠单抗(Lutikizumab)、马帕木单抗(Mapatumumab)、马吉妥昔单抗(Margetuximab)、马塔西单抗(Marstacimab)、马司莫单抗(Maslimomab)、马妥珠单抗(Matuzumab)、玛弗利木单抗(Mavrilimumab)、美泊利单抗(Mepolizumab)、美特利木单抗(Metelimumab)、米拉妥珠单抗(Milatuzumab)、明瑞妥莫单抗(Minretumomab)、米吉珠单抗(Mirikizumab)、索星-米妥昔单抗(Mirvetuximab soravtansine)、米妥莫单抗(Mitumomab)、MK-3475、莫多西单抗(Modotuximab)、莫加利珠单抗(Mogamulizumab)、莫那利珠单抗(Monalizumab)、莫罗木单抗(Morolimumab)、Mosunetuzumab、莫他韦珠单抗(Motavizumab)、帕舒托-莫塞妥莫单抗(Moxetumomab pasudotox)、MPDL328OA、莫罗单抗(Muromonab)-CD3、他托-那考罗单抗(Nacolomab tafenatox)、那米鲁单抗(Namilumab)、埃托-那普妥莫单抗(Naptumomab estafenatox)、恩星-那妥昔单抗(Naratuximabemtansine)、那呐妥单抗(Narnatumab)、那他利珠单抗(Natalizumab)、那赛昔珠单抗(Navicixizumab)、那韦伏单抗(Navivumab)、Naxitamab、奈巴库单抗(Nebacumab)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)、奈莫利珠单抗(Nemolizumab)、NEOD001、奈瑞利莫单抗(Nerelimomab)、奈伐苏单抗(Nesvacumab)、尼塔奇单抗(Netakimab)、尼莫妥珠单抗(Nimotuzumab)、(Nirsevimab)、纳武单抗(Nivolumab)、巯诺非妥莫单抗(Nofetu momabmerpentan)、奥托萨昔单抗(Obiltoxaximab)、奥比妥珠单抗(Obinutuzumab)、奥卡妥珠单抗(Ocaratuzumab)、奥瑞利珠单抗(Ocrelizumab)、奥度莫单抗(Odulimomab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、奥拉妥单抗(Olaratumab)、奥来鲁单抗(Oleclumab)、奥仑达利珠单抗(Olenda lizumab)、奥洛吉珠单抗(Olokizumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、Omburtamab、OMS721、奥纳妥珠单抗(Onartuzumab)、昂妥昔珠单抗(Ontuxizumab)、奥瓦利单抗(Onvatilimab)、奥匹努单抗(Opicinumab)、蒙托-奥珀妥珠单抗(Oportuzumab monatox)、奥瑞戈沃单抗(Oregovomab)、奥替苏单抗(Orticumab)、奥特昔珠单抗(Otelixizumab)、Otilimab、奥乐妥珠单抗(Otlertuzumab)、奥塞鲁单抗(Oxelumab)、奥扎奈珠单抗(Ozanezumab)、奥佐利珠单抗(Ozoralizumab)、帕吉昔单抗(Pagibaximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、潘瑞鲁单抗(Pamrevlumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、帕尼库单抗(Pankomab)、帕诺巴库单抗(Panobacumab)、帕萨妥珠单抗(Parsatuzumab)、帕考利珠单抗(Pascolizumab)、帕妥昔珠单抗(Pasotuxizumab)、帕特利珠单抗(Pateclizumab)、帕曲妥单抗(Patritumab)、PDR001、派姆单抗(Pembrolizumab)、培妥莫单抗(Pemtumomab)、培拉凯珠单抗(Perakizumab)、帕妥珠单抗(Pertu zumab)、培塞利珠单抗(Pexelizumab)、匹地利珠单抗(Pidilizumab)、维汀-匹那妥珠单抗(Pinatuzumab vedotin)、平妥莫单抗(Pintumomab)、普拉鲁单抗(Placulumab)、洛扎利珠单抗(Plozalizumab)、泊加丽珠单抗(Pogalizumab)、维汀-珀拉妥珠单抗(Polatuzumab vedotin)、泊奈珠单抗(Ponezumab)、珀韦昔单抗(Porgaviximab)、Prasinezumab、普瑞利珠单抗(Prezalizumab)、普立昔单抗(Priliximab)、瑞托萨昔单抗(Pritoxaximab)、普瑞妥木单抗(Pritumumab)、PRO 140、奎利珠单抗(Quilizumab)、雷妥莫单抗(Racotumomab)、雷曲妥单抗(Radretumab)、雷非韦卢单抗(Rafivirumab)、雷泮赛珠单抗(Ralpancizumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、雷奈维单抗(Ranevetmab)、雷珠单抗(Ranibizumab)、Ravagalimab、雷夫利珠单抗(Ravulizumab)、雷昔巴库单抗(Raxibacu mab)、瑞法奈珠单抗(Refanezumab)、瑞加韦单抗(Regavirumab)、Relatlimab、壬托鲁单抗(Remtolumab)、瑞司利珠单抗(Reslizumab)、瑞洛妥木单抗(Rilotumumab)、利努苏单抗(Rinucumab)、利散吉珠单抗(Risankizumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、培戈-利伐巴珠单抗(Rivabazu mab pegol)、Rmab、洛巴妥木单抗(Robatumumab)、罗来度单抗(Roledumab)、若奇单抗(Romilkimab)、洛莫索珠单抗(Romosozumab)、隆他利珠单抗(Rontalizumab)、洛曼妥珠单抗(Rosmantuzumab)、特司林-洛伐妥珠单抗(Rovalpituzumab tesirine)、洛维利珠单抗(Rovelizumab)、洛利昔珠单抗(Rozanolixizumab)、卢普利珠单抗(Ruplizumab)、SA237、戈维替康-沙西妥珠单抗(Sacituzumab govitecan)、萨玛利珠单抗(Samalizumab)、维汀-沙马妥单抗(Samrotamabvedotin)、萨瑞鲁单抗(Sarilumab)、萨特利珠单抗(Satralizumab)、沙妥莫单抗喷他肽(Satumomab pendetide)、苏金单抗(Secukinumab)、塞鲁单抗(Selicrelumab)、瑟瑞妥单抗(Seribantumab)、瑟托萨昔单抗(Setoxaximab)、Setrus umab、司韦单抗(Sevirumab)、SGN-CD19A、SHP647、西罗珠单抗(Sibrotuzumab)、西法木单抗(Sifalimumab)、司妥昔单抗(Siltuximab)、辛妥珠单抗(Simtuzumab)、西普利珠单抗(Siplizumab)、维汀-斯妥尤单抗(Sirtratumab vedotin)、司卢库单抗(Sirukumab)、维汀-索非妥珠单抗(Sofituzumabvedotin)、索拉奈珠单抗(Solanezumab)、索利托单抗(Solitomab)、索尼普西珠单抗(Sonepcizumab)、索土珠单抗(Sontuz umab)、Spartalizumab、司达鲁单抗(Stamulumab)、硫索单抗(Sulesomab)、舒他伏单抗(Suptavumab)、苏替莫单抗(Sutimlimab)、苏韦珠单抗(Suvizumab)、苏托舒单抗(Suvratoxumab)、他巴鲁单抗(Tabalumab)、他珠单抗(Tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗(Tadocizumab)、塔妥珠单抗(Talacotuzumab)、他利珠单抗(Talizumab)、坦妥维单抗(Tamtu vetmab)、他奈珠单抗(Tanezumab)、帕他莫单抗(Taplitumomab paptox)、他瑞妥单抗(Tarextumab)、他利昔珠单抗(Tavolimab)、特非巴珠单抗(Tefibazumab)、阿替莫单抗(Telimomab aritox)、维汀-特立妥珠单抗(Telisotuzumab vedotin)、特那妥莫单抗(Tenatumomab)、替奈昔单抗(Teneliximab)、特普利珠单抗(Teplizumab)、Tepoditamab、特普妥木单抗(Teprotumumab)、特度鲁单抗(Tesidolumab)、替妥罗单抗(Tetulomab)、特折鲁单抗(Tezepelumab)、TGN1412、替布利珠单抗(Tibulizumab)、替加妥珠单抗(Tigatuzumab)、替曲吉珠单抗(Tildrakizumab)、替米妥珠单抗(Timigutuzumab)、替莫鲁单抗(Timolumab)、Tiragotumab、替雷利珠单抗(Tislelizumab)、维汀-替索妥单抗(Tisotumab vedotin)、TNX-650、托珠单抗(Tocilizumab)、托木妥昔单抗(Tomuzot uximab)、托雷利珠单抗(Toralizumab)、托萨托舒单抗(Tosatoxumab)、托西莫单抗(Tositumomab)和131I-托西莫单抗、托维妥单抗(Tovetumab)、曲洛吉努单抗(Tralokinumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、恩星-曲妥珠单抗(Trastuzumab emtansine)、TRBS07、曲加利珠单抗(Tregalizumab)、曲美木单抗(Tremelimumab)、曲戈卢单抗(Trevogrumab)、图考珠单抗西莫白介素(Tucotuzumabcelmoleukin)、妥韦单抗(Tuvirumab)、乌利妥昔单抗(Ublituximab)、乌洛鲁单抗(Ulocuplumab)、乌瑞鲁单抗(Urelumab)、乌珠单抗(Urtoxazumab)、乌司奴单抗(Ustekinumab)、乌托鲁单抗(Utomilumab)、他立林-伐达妥昔单抗(Vadastuximabtalirine)、Vanalimab、维汀-万多妥珠单抗(Vandortuzumab vedotin)、万替妥单抗(Vantictumab)、伐努赛珠单抗(Vanucizumab)、伐帕利昔单抗(Vapaliximab)、伐利苏单抗(Varisacumab)、伐立鲁单抗(Varlilumab)、伐特利珠单抗(Vatelizumab)、维多利珠单抗(Vedolizumab)、维妥珠单抗(Veltuzumab)、维帕利莫单抗(Vepalimomab)、维森苏单抗(Vesencumab)、威司利珠单抗(Visilizumab)、沃巴利珠单抗(Vobarilizumab)、伏洛昔单抗(Volociximab)、珀伽利珠单抗(Vonlerolizumab)、Vopratelimab、玛汀-沃瑟妥珠单抗(Vorsetuzumab mafodotin)、伏妥莫单抗(Votumumab)、伏那吉珠单抗(Vunakizumab)、珍妥珠单抗(Xentuzumab)、XMAB-5574、扎鲁妥木单抗(Zalutumumab)、扎木单抗(Zanolimumab)、扎妥昔单抗(Zatuximab)、泽妥珠单抗(Zenocutuzumab)、齐拉木单抗(Ziralimumab)、Zolbetuximab(IMAB362、(Claudiximab))以及阿托-佐利莫单抗(Zolimomab aritox)。
已经达到或正在等待监管批准并且可用于本发明中的示例性抗体(或其片段)包括莫罗单抗-CD3(ORTHOCLONE OKT3)、依法利珠单抗(RAPTIVA)、托西莫单抗-I131(BEXXAR)、奈巴库单抗(CENTOXIN)、依决洛单抗(PANOREX)、卡妥索单抗(REMOVAB)、达利珠单抗(ZINBRYTA；ZENAPAX)、阿昔单抗(REOPRO)、利妥昔单抗(MABTHERA，RITUXAN)、巴利昔单抗(SIMULECT)、帕利珠单抗(SYNAGIS)、英夫利昔单抗(REMICADE)、曲妥珠单抗(HERCEPTIN)、阿达木单抗(HUMIRA)、替伊莫单抗(ZEVALIN)、奥马珠单抗(XOLAIR)、西妥昔单抗(ERBITUX)、贝伐单抗(AVASTIN)、那他利珠单抗(TYSABRI)、帕尼单抗(VECTIBIX)、雷珠单抗(LUCENTIS)、依库利珠单抗(SOLIRIS)、培化塞妥珠单抗(CIMZIA)、乌司奴单抗(STELARA)、卡那单抗(ILARIS)、戈利木单抗(SIMPONI)、奥法木单抗(ARZERRA)、托珠单抗(ROACTEMRA，ACTEMRA)、地诺单抗(PROLIA)、贝利木单抗(BENLYSTA)、伊匹单抗(YERVOY)、维汀-本妥昔单抗(ADCETRIS)、帕妥珠单抗(PERJETA)、阿多-曲妥珠单抗恩他新(KADCYLA)、雷昔巴库单抗)、奥比妥珠单抗(GAZYVA，GAZYVARO)、司妥昔单抗(SYLVANT)、雷莫芦单抗(CYRAMZA)、维多利珠单抗(ENTYVIO)、纳武单抗(OPDIVO)、派姆单抗(KEYTRUDA)、博纳吐单抗(BLINCYTO)、阿仑单抗(LEMTRADA；MABCAMPATH，CAMPATH-1H)、依沃苏单抗(REPATHA)、依达赛珠单抗(PRAXBIND)、耐昔妥珠单抗(PORTRAZZA)、地努妥昔单抗(UNITUXIN)、苏金单抗(COSENTYX)、美泊利单抗(NUCALA)、阿利库单抗(PRALUENT)、达雷木单抗(DARZALEX)、埃罗妥珠单抗(EMPLICITI)、艾塞吉珠单抗(TALTZ)、瑞司利珠单抗(CINQAERO，CINQAIR)、奥拉妥单抗(LARTRUVO)、贝洛托单抗(ZINPLAVA)、阿特珠单抗(TECENTRIQ)、奥托萨昔单抗(ANTHIM)、布罗达单抗(SILIQ，LUMICEF)、度匹鲁单抗(DUPIXENT)、奥英妥珠单抗(BESPONSA)、古赛库单抗(TREMFYA)、萨瑞鲁单抗(KEVZARA)、阿维鲁单抗(BAVENCIO)、依米赛珠单抗(HEMLIBRA)、奥瑞利珠单抗(OCREVUS)、贝那利珠单抗(FASENRA)、德瓦鲁单抗(IMFINZI)、吉妥珠单抗奥佐米星(MYLOTARG)、厄瑞努单抗、厄瑞努单抗-aooe(AIMOVIG)、伽奈珠单抗、伽奈珠单抗-gnlm(EMGALITY)、布洛舒单抗、布洛舒单抗-twza(CRYSVITA)、拉那芦单抗、拉那芦单抗-flyo(TAKHZYRO)、莫加利珠单抗、莫加利珠单抗-kpkc(POTELIGEO)、替曲吉珠单抗；替曲吉珠单抗-asmn(ILUMYA)、瑞玛奈珠单抗、瑞玛奈珠单抗-vfrm(AJOVY)、雷夫利珠单抗、雷夫利珠单抗-cwvz(ULTOMIRIS)、西米普利单抗、西米普利单抗-rwlc(LIBTAYO)、艾巴利珠单抗、艾巴利珠单抗-uiyk(TROGARZO)、依玛鲁单抗、依玛鲁单抗-lzsg(GAMIFANT)、帕舒托-莫塞妥莫单抗、帕舒托-莫塞妥莫单抗-tdfk(LUMOXITI)、卡普赛珠单抗、卡普赛珠单抗-yhdp(CABLIVI)、利散吉珠单抗、利散吉珠单抗-rzaa(SKYRIZI)、维汀-珀拉妥珠单抗、维汀-珀拉妥珠单抗-piiq(POLIVY)、洛莫索珠单抗、洛莫索珠单抗-aqqg(EVENITY)、布罗鲁珠单抗、布罗鲁珠单抗-dbll(BEOVU)、立赞利珠单抗；立赞利珠单抗-tmca(ADAKVEO)、维汀-恩弗妥单抗、维汀-恩弗妥单抗-ejfv(PADCEV)、[fam-]德卢替康-曲妥珠单抗、fam-德卢替康-曲妥珠单抗-nxki(ENHERTU)、特普妥木单抗、特普妥木单抗-trbw(TEPEZZA)、依普奈珠单抗、依普奈珠单抗-jjmr(VYEPTI)、艾萨妥昔单抗、艾萨妥昔单抗-irfc(SARCLISA)、戈维替康-沙西妥珠单抗；戈维替康-沙西妥珠单抗-hziy(TRODELVY)、英比利珠单抗；英比利珠单抗-cdon(UPLIZNA)、萨特利珠单抗(ENSPRYNG)、多塔利单抗(TSR-042)、苏替莫单抗(BIVV009)、Leronlimab、纳索利单抗(Narsoplimab)、Tafasitamab、REGNEB3、Naxitamab、蒙托-奥珀妥珠单抗、贝兰他单抗莫福汀、马吉妥昔单抗、他奈珠单抗、特普利珠单抗、阿度努单抗、依维苏单抗、曲洛吉努单抗以及Omburtamab。
抗体的片段将包含至少上述抗体的抗原结合结构域。在实施方案中，抗原结合结构域是抗体、抗体片段、scFv、Fv、Fab、(Fab')2、单结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域或骆驼科动物VHH结构域，例如人scFv、人Fv、人Fab、人(Fab')2、人单结构域抗体(SDAB)或人VH或VL结构域或人源化scFv、人源化Fv、人源化Fab、人源化(Fab')2、人源化单结构域抗体(SDAB)或人源化VH或VL结构域。
可用于本发明中的说明性化学治疗剂包括2,3,4,5,6-五氟-N-(3-氟-4-甲氧基苯基)苯磺酰胺、3’,4’-二脱氢-4’-脱氧-8’-去甲长春质碱、5-FU(氟尿嘧啶)、阿贝西尼、醋酸阿比特龙、阿比曲特(甲氨蝶呤)、白蛋白结合型紫杉醇(紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、阿卡卢替尼(Acalabrutinib)、AC-T、ADE、阿霉素(多柔比星)、二马来酸阿法替尼、Afinitor(依维莫司)、Afinitor Difsperz(依维莫司)、Akynzeo(奈妥吡坦和帕洛诺司琼)、艾特乐(咪喹莫特)、阿地白介素、Alecensa(阿雷替尼)、阿雷替尼、爱宁达(培美曲塞)、Aliqopa(盐酸考泮利司)、爱克兰(美法仑)、阿乐喜(盐酸帕洛诺司琼)、六甲蜜胺、Alunbrig(布加替尼)、氯氨布西(苯丁酸氮芥)、Amboclorin(苯丁酸氮芥)、氨磷汀、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、脱水长春碱、阿瑞匹坦、阿可达(帕米膦酸盐)、瑞宁得(阿那曲唑)、阿诺新(依西美坦)、阿伦恩(奈拉滨)、三氧化二砷、天冬酰胺酶菊欧文氏菌、奥瑞斯他汀、西罗来塞-阿卡他近(Axicabtagene Ciloleucel)、阿西替尼、阿扎胞苷、BEACOPP、卡氮芥(卡莫司汀)、Beleodaq(贝利司他)、贝利司他、盐酸苯达莫司汀、BEP、贝沙罗汀、比卡鲁胺、BiCNU(卡莫司汀)、Blenoxane(博来霉素)、BMS184476、硼替佐米、Bosulif(博舒替尼)、博舒替尼、布加替尼、BuMel、白消安、白舒非(白消安)C、卡巴他赛、Cabometyx(卡博替尼)、S-苹果酸卡博替尼、CAF、Calquence(阿卡卢替尼)、Camptosar(盐酸伊立替康)、卡培他滨、CAPOX、Caprelsa(凡德他尼)、Carac(氟尿嘧啶-局部)、卡铂、卡铂-紫杉酚、卡非佐米、Carmubris(卡莫司汀)、卡莫司汀、康士得(比卡鲁胺)、恶病质素(Cachectin)、CeeNU(洛莫司汀)、CEM、西马多丁、色瑞替尼、Cerubidine(道诺霉素)、希瑞适(重组HPV二价疫苗)、CEV、瘤可宁、瘤可宁-泼尼松、CHOP、顺铂、克拉屈滨、Clafen(环磷酰胺)、氯法拉滨、Clofarex(氯法拉滨)、科罗拉(氯法拉滨)、CMF、考比替尼、Cometriq(卡博替尼)、盐酸考泮利司、COPDAC、COPP、COPP-ABV、Cosmegen(更生霉素)、Cotellic(考比替尼)、念珠藻素、克唑替尼、CVP、环磷酰胺、Cyfos(异环磷酰胺)、阿糖孢苷、阿糖胞苷脂质体、赛德萨-U(阿糖孢苷)、癌得星(环磷酰胺)、癌得星(癌得星)、达拉菲尼、达卡巴嗪、达克金(地西他滨)、更生霉素、达沙替尼、盐酸柔红霉素、盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、DaunoXome(道诺霉素脂质体复合物)、Decadron(地塞米松)、地西他滨、去纤苷酸钠、Defitelio(去纤苷酸钠)、地加瑞克、地尼白介素-毒素连接物、DepoCyt(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松、地塞米松浓缩口服液(地塞米松)、Dexpak Taperpak(地塞米松)、盐酸右雷佐生、Docefrez(多西他赛)、多西他赛、多西紫杉醇(Docetaxol)、尾海兔素、多烯紫杉醇(Doxetaxel)、Doxil(盐酸阿霉素脂质体)、盐酸阿霉素、盐酸阿霉素脂质体、Dox-SL(盐酸阿霉素脂质体)、Droxia(羟基脲)、DTIC(达卡巴嗪)、DTIC-Dome(达卡巴嗪)、Efudex(氟尿嘧啶—局部)、Eligard(亮丙瑞林Leuprolide)、埃立特(拉布立酶)、Ellence(Ellence(表阿霉素))、乐沙定(奥沙利铂)、Elspar(天冬酰胺酶)、艾曲波帕乙醇胺、Emcyt(雌莫司汀)、Emend(阿瑞匹坦)、甲磺酸依那德尼、恩扎鲁胺、盐酸表阿霉素、EPOCH、甲磺酸艾日布林、Erivedge(维莫德吉)、盐酸埃罗替尼、Erwinaze(天冬酰胺酶菊欧文氏菌)、Ethyol(氨磷汀)、凡毕复(磷酸依托泊苷)、依托泊苷、磷酸依托泊苷、Eulexin(氟他胺)、Evacet(盐酸阿霉素脂质体)、依维莫司、易维特(盐酸雷洛昔芬)、Evomela(盐酸美法仑)、依西美坦、法乐通(托瑞米芬)、Farydak(帕比司他)、Faslodex(氟维司群)、FEC、Femara(来曲唑)、非格司亭、Firmagon(地加瑞克)、非那雄胺、FloPred(泼尼松龙)、福达华(氟达拉滨)、磷酸氟达拉滨、Fluoroplex(氟尿嘧啶)、氟尿嘧啶、氟他胺、Folex(甲氨蝶呤)、Folex PFS(甲氨蝶呤)、FOLFIRI、FOLFIRINOX、FOLFOX、弗洛泰(普拉曲沙)、FUDR(FUDR(氟尿苷))、FU-LV、氟维司群、加德西(重组HPV四价疫苗)、加德西9(重组HPV九价疫苗)、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、健择(吉西他滨)、吉泰瑞(二马来酸阿法替尼)、吉泰瑞(阿法替尼)、格列卫(甲磺酸伊马替尼)、Gliadel(卡莫司汀)、羧肽酶、醋酸戈舍瑞林、Halaven(甲磺酸艾日布林)、Hemangeol(盐酸普萘洛尔)、克瘤灵(六甲蜜胺)、重组HPV二价疫苗、重组HPV九价疫苗、重组HPV四价疫苗、Hycamtin(盐酸拓扑替康)、Hycamtin(拓扑替康)、Hydrea(羟基脲)、羟基脲、羟基脲紫杉烷、Hyper-CVAD、Ibrance(帕博西尼)、依鲁替尼、ICE、Iclusig(帕纳替尼)、Idamycin PFS(伊达比星)、盐酸伊达比星、艾代拉里斯、Idhifa(依那德尼)、Ifex(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、Ifosfamidum(异环磷酰胺)、甲磺酸伊马替尼、Imbruvica(依鲁替尼)、咪喹莫特、Imlygic(拉他莫金冻干混悬剂)、Inlyta(阿西替尼)、易瑞沙(吉非替尼)、盐酸伊立替康、盐酸伊立替康脂质体、Istodax(罗米地辛)、伊沙匹隆、柠檬酸艾沙佐米、Ixempra(伊沙匹隆)、Jakafi(磷酸鲁索替尼)、Jakafi(鲁索替尼)、JEB、Jevtana(卡巴他赛)、Keoxifene(盐酸雷洛西芬)、Kepivance(帕利夫明)、Kisqali(瑞博西尼)、Kyprolis(卡非佐米)、醋酸兰瑞肽、Lanvima(乐伐替尼)、二甲苯磺酸拉帕替尼、来那度胺、甲磺酸乐伐替尼、Lenvima(甲磺酸乐伐替尼)、来曲唑、亚叶酸钙、瘤可宁(苯丁酸氮芥)、Leukine(沙格司亭)、醋酸亮丙瑞林、Leustatin(克拉屈滨)、Levulan(氨基乙酰丙酸)、利阿唑、Linfolizin(苯丁酸氮芥)、LipoDox(盐酸阿霉素脂质体)、洛莫司汀、氯尼达明、Lonsurf(曲氟尿苷和地匹福林)、利普安(亮丙瑞林)、Lynparza(奥拉帕尼)、Lysodren(米托坦)、Marqibo(硫酸长春新碱脂质体)、Marqibo药盒(长春新碱脂质体复合物)、甲基苄肼(丙卡巴肼)、盐酸氮芥、梅格施(甲地孕酮)、醋酸甲地孕酮、Mekinist(曲美替尼)、美法仑、盐酸美法仑、巯嘌呤、Mesnex(美司钠)、Metastron(氯化锶-89)、Methazolastone(替莫唑胺)、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤LPF(甲氨蝶呤)、溴化甲基纳曲酮、Mexate(甲氨蝶呤)、Mexate-AQ(甲氨蝶呤)、米哚妥林、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、Mitozytrex(丝裂霉素C)、米伏布林羟乙基磺酸盐、MOPP、Mostarina(泼尼莫司汀)、Mozobil(普乐沙福)、Mustargen(氮芥)、Mutamycin(丝裂霉素)、马勒兰(白消安)、Mylosar(阿扎胞苷)、纳米颗粒紫杉醇(紫杉醇白蛋白稳定化的纳米颗粒制剂)、诺维苯(长春瑞滨)、奈拉滨、Neosar(环磷酰胺)、马来酸来那替尼、Nerlynx(来那替尼)、盐酸奈普坦和帕洛诺司琼、Neulasta(非格司亭)、Neulasta(培非格司亭)、优保津(非格司亭)、Nexavar(索拉非尼)、Nilandron(尼鲁米特)、尼罗替尼、尼鲁米特、Ninlaro(艾沙佐米)、Nipent(喷司他丁)、甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物、(N,n-二甲基-l-缬氨酰-l-缬氨酰-n-甲基-l-缬氨酰-l-脯氨酰-1-l脯氨酸-t-丁酰胺)、诺瓦得士(他莫昔芬)、Novantrone(米托蒽醌)、Nplate(罗米司亭)、Odomzo(索尼德吉)、OEPA、OFF、奥拉帕尼、高三尖杉酯碱、奥那司酮、Oncaspar(培门冬酶)、Oncovin(长春新碱)、盐酸昂丹司琼、Onivyde(盐酸伊立替康脂质体)、Ontak(地尼白介素-毒素连接物)、Onxol(紫杉醇)、OPPA、Orapred(泼尼松龙)、奥希替尼、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定化的纳米颗粒制剂、PAD、帕博西尼、帕利夫明、盐酸帕洛诺司琼、盐酸帕洛诺司琼和奈妥吡坦、帕米膦酸二钠、帕比司他、Panretin(阿利维A酸)、Paraplat(卡铂)、盐酸帕唑帕尼、PCV、PEB、Pediapred(泼尼松龙)、培门冬酶、培非格司亭、培美曲塞二钠、Platinol(顺铂)、PlatinolAQ(顺铂)、普乐沙福、Pomalyst(泊马度胺)、盐酸帕纳替尼、普拉曲沙、泼尼氮芥、泼尼松、盐酸丙卡巴肼、Proleukin(阿地白介素)、Promacta(艾曲波帕乙醇胺)、盐酸普萘洛尔、Purinethol(巯基嘌呤)、Purixan(巯基嘌呤)、二氯化镭223、盐酸雷洛昔芬、拉布立酶、R-CHOP、R-CVP、Reclast(唑来膦酸)、重组人乳头瘤病毒(HPV)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)九价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)四价疫苗、瑞戈非尼、Relistor(溴化甲基纳曲酮)、R-EPOCH、Revlimid(来那度胺)、Rheumatrex(甲氨蝶呤)、根霉素、瑞博西尼、R-ICE、盐酸罗拉吡坦、罗米地辛、罗米司亭、Rpr109881、Rubex(阿霉素)、红比霉素(盐酸柔红霉素)、Rubraca(卢卡帕尼)、樟脑磺酸卢卡帕尼、磷酸鲁索替尼、Rydapt(米哚妥林)、善宁(奥曲肽)、善宁LAR储库(奥曲肽)、Sclerosol胸膜内气雾剂(滑石)、色替纳弗(Sertenef)、Soltamox(他莫苷芬)、索马杜林储库(醋酸兰瑞肽)、索尼德吉、甲苯磺酸索拉非尼、Sprycel(达沙替尼)、STANFORD V、Sterapred(泼尼松)、Sterapred DS(泼尼松)、无菌滑石粉末(滑石)、Steritalc(滑石)、Sterecyst(泼尼莫司汀)、Stivarga(瑞戈非尼)、磷酸雌莫司汀、链脲霉素、苹果酸舒尼替尼、Supprelin LA(组氨瑞林)、索坦(苹果酸舒尼替尼)、索坦(舒尼替尼)、Synribo(高三尖杉酯碱)、Tabloid(硫鸟嘌呤)、TAC、Tafinlar(达拉菲尼)、Tagrisso(奥希替尼)、滑石、拉他莫金冻干混悬剂、柠檬酸他莫昔芬、Tarabine PFS(阿糖孢苷)、特罗凯(埃罗替尼)、Targretin(贝沙罗汀)、Tasigna(达卡巴嗪)、Tasigna(尼罗替尼)、他索纳明、泰素(紫杉醇)、泰素帝(Docetaxel)、Temodar(替莫唑胺)、替莫唑胺、西罗莫司、Tepadina(噻替派)、沙利度胺、Thalomid(沙利度胺)、TheraCys BCG(BCG)、硫鸟嘌呤、Thioplex(噻替派)、噻替派、TICE BCG(BCG)、Tisagenlecleucel、Tolak(氟尿嘧啶—局部)、Toposar(依托泊苷)、盐酸拓扑替康、托瑞米芬、Torisel(西罗莫司)、Totect(盐酸右雷佐生)、TPF、曲贝替定、曲美替尼、Treanda(盐酸苯达莫司汀)、Trelstar(曲普瑞林)、维甲酸、Trexall(甲氨蝶呤)、盐酸曲氟尿苷和地匹福林、Trisenox(三氧化二砷)、Tykerb(拉帕替尼)、尿苷三乙酸酯、VAC、戊柔比星、Valstar(膀胱内戊柔比星)、Valstar(戊柔比星)、VAMP、凡德他尼、Vantas(组氨瑞林)、Varubi(罗拉吡坦)、VeIP、Velban(长春花碱)、万珂(硼替佐米)、Velsar(硫酸长春碱)、威罗菲尼、Venclexta(维奈托克)、凡毕士(依托泊苷)、Verzenio(阿贝西尼)、Vesanoid(维甲酸)、Viadur(醋酸亮丙瑞林)、Vidaza(阿扎胞苷)、长春碱、Vincasar PFS(长春新碱)、Vincrex(长春新碱)、硫酸长春新碱、硫酸长春新碱脂质体、硫酸长春地辛、长春氟宁、酒石酸长春瑞滨、VIP、维莫德吉、Vistogard(尿苷三乙酸酯)、Voraxaze(羧肽酶)、伏立诺他、Votrient(帕唑帕尼)、Vumon(替尼泊苷)、Vyxeos(盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体)、W,Wellcovorin(亚叶酸钙)、Wellcovorin IV(亚叶酸)、Xalkori(克唑替尼)、XELIRI、希罗达(卡培他滨)、XELOX、Xofigo(二氯化镭223)、Xtandi(恩杂鲁胺)、Yescarta(西罗来塞-阿卡他近)、Yondelis(曲贝替定)、Zaltrap(Ziv-阿柏西普)、Zanosar(链脲菌素)、Zarxio(非格司亭)、Zejula(尼拉帕尼)、Zelboraf(威罗菲尼)、Zinecard(盐酸右雷佐生)、Ziv-阿柏西普、枢复宁(盐酸昂丹司琼)、诺雷德(戈舍瑞林)、唑来膦酸、Zolinza(伏立诺他)、择泰(唑来膦酸)、Zortress(依维莫司)、Zydelig(艾代拉里斯)、Zykadia(色瑞替尼)、Zytiga(醋酸阿比特龙)以及Zytiga(阿比特龙)。化学治疗剂的其他实例可在VT Devita和S.Hellman(编辑)的Cancer Principles and Practice ofOncology,第6版(2001年2月15日),Lippincott Williams&Wilkins Publishers中找到，其内容以引用的方式整体并入本文。
在实施方案中，例如来自以上列表的化学治疗剂可作为剂包含在本公开的化合物中。可替代地或另外地，例如来自以上列表的化学治疗剂可与本公开的化合物结合使用，即在组合疗法中。作为实例，可向受试者施用负载有以下化合物中的一种或两种的血小板：包含作为剂的多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)的化合物和包含作为剂的烟曲霉素的化合物，并且还施用化学治疗剂；这种组合可用于治疗胰腺癌、肺癌或结肠癌。可向受试者施用负载有以下化合物中的一种或两种的血小板：包含作为剂的EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)的化合物和包含作为活性剂的多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)的化合物，并且还施用化学治疗剂；这可用于治疗肺癌。此外，可向受试者施用负载有以下化合物中的一种或两种或所有三种的血小板：包含作为剂的EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)的化合物、包含作为剂的多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)的化合物和包含作为剂的ALK/ROS1/NTRK抑制剂(例如，克唑替尼)的化合物，并且还施用化学治疗剂；这可用于治疗非小细胞肺癌。
可用于本发明中的说明性免疫检查点抑制剂包括A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CD122、CD137、CD27、CD28、CD28、CD40、CTLA-4、GITR、ICOS、ICOS、IDO、KIR、KIR.、LAG3、NOX2、OX40、PD-1、SIGLEC7、SIGLEC9、TIM-3和VISTA的配体或受体的全长或片段。
可用于本发明中的说明性生长因子包括血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血小板源性生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)和血管生成素。
可用于本发明中的说明性生长抑制剂包括血管抑素、内皮抑素、肿瘤抑素(tumstatin)、血小板反应蛋白-1(TSP1)、血小板因子4(PF4、CXCL4)和金属蛋白质酶的组织抑制剂(TIMP)。
可用于本发明中的说明性蛋白酶/蛋白质酶包括基质金属蛋白质酶(MMP)、凝血酶、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶和链激酶。
可用于本发明中的说明性凝血因子包括因子II(凝血酶)、抗凝血酶III(ATIII)、激肽释放酶、组织因子(TF)、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI和因子XII、因子XIII、纤维蛋白原、蛋白S、蛋白C、血栓调节蛋白、纤溶酶原和组织因子途径抑制剂(TFPI)。
可用于本发明中的说明性脂质或磷脂包括载脂蛋白E(ApoE)、血小板磷脂和鞘氨醇-1-磷酸(SIP)。
可用于本发明中的说明性细胞外基质蛋白包括整联蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、粘着斑蛋白(FAK)、纽蛋白(vinculin)、踝蛋白(talin)、肌动蛋白丝和胶原蛋白。
可用于本发明中的说明性激素包括胰岛素、类固醇(例如雌激素、孕酮和睾酮及其变体)、促红细胞生成素、血小板生成素和甲状腺激素。
可用于本发明中的说明性酶包括乙酰肝素酶或基质金属蛋白质酶(MMP)。
可用于本发明中的说明性趋化因子/化学引诱物包括结缔组织生长因子(CTGF)、基质细胞源性因子-1(SDF-1)(CXCL12)、白细胞介素(IL1、2、6、8)和CD40配体(CD40L、CD154)。
可用于本发明中的说明性神经营养蛋白包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)和神经营养蛋白4/5(NT-4/5)。
在实施方案中，剂选自以下非详尽列表，其包括各种类别的有用剂：3-4-(1-甲酰基哌嗪-4-基)-亚苄基-2-吲哚酮、阿巴西普、ABT-869、阿卡卢替尼、阿法替尼、阿法赛特、艾乐替尼、阿来西普、AMG 108、抗淋巴细胞免疫球蛋白(马)、抗胸腺细胞免疫球蛋白(兔)、阿普单抗、阿福他酶α(Asfotase alfa)、Asunercept、AVE9633、阿昔替尼、贝拉西普、贝伐单抗锆Zr-89、BIIB015、比伐单抗、博舒替尼、布加替尼、卡博替尼、卡奈替尼、卡马替尼、西地尼布、色瑞替尼、CR002、克瑞兰尼、克唑替尼、CT-011、达克替尼、达沙替尼、达妥昔单抗、多韦替尼、依屈肽、恩曲替尼、厄达替尼、埃罗替尼、依那西普、法米替尼、菲卓替尼、非拉司特、氟马替尼、弗瑞替尼、福他替尼、吉非替尼、格尔德霉素、染料木黄酮、吉特替尼、格来替尼、GMA-161、格瑞巴单抗(Gremubamab)、GS-5745、人巨细胞病毒免疫球蛋白、人免疫球蛋白G、人水痘-带状疱疹免疫球蛋白、替伊莫单抗、依鲁替尼、埃克替尼、IGN311、伊马替尼、铟In-111沙妥莫单抗喷他肽、IPH 2101、拉贝妥珠单抗戈维替康、拉帕替尼、拉罗替尼(Larotrectinib)、仑卡奈单抗(Lecanemab)、乐伐替尼、来他替尼、Lorukafuspα、米哚妥林、米妥昔单抗索他新、Mitazalimab、莫特塞尼、莫罗单抗、伊那图莫单抗、NAV 1800、来那替尼、尼罗替尼、尼达尼布、奥希替尼、帕利替尼、帕佐帕尼、PD173955、培达替尼、白皮杉醇、普纳替尼、根赤壳菌素、雷多替尼、瑞戈非尼、RI 624、特司林-洛伐妥珠单抗、Rozrolimupab、鲁索替尼、塞卡替尼、沙弗替尼、SB-1578、塞尔帕替尼、司美替尼、索拉非尼、舒尼替尼、他法西他单抗(Tafasitamab)、坦度替尼、TB-402、锝Tc-99m阿西莫单抗、特伐替尼、TNX-901、托拉利单抗、托西莫单抗、德卢替康-曲妥珠单抗、妥卡替尼、他立林-伐达妥昔单抗、伐那福司α(Valanafusp alfa)、凡德他尼、伐他拉尼、威罗菲尼、VS-4718、XmAb 2513、XTL-001和佐贝妥昔单抗(Zolbetuximab)。
在实施方案中，所述剂是EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)。
在实施方案中，所述剂是VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗)。
在实施方案中，所述剂是PDL1抑制剂(例如，派姆单抗)。
在实施方案中，所述剂是FN1抑制剂(例如，奥克纤溶酶)。
在实施方案中，所述剂是多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)。
在实施方案中，所述剂是FGFR2拮抗剂(例如，沙利度胺)。
在实施方案中，所述剂是凝血酶及其类似物。
在实施方案中，所述剂是CSF3R激动剂(例如，非格司亭)。
在实施方案中，所述剂是PSMB5抑制剂(例如，硼替佐米)。
在实施方案中，所述剂是烟曲霉素。
在实施方案中，所述剂是ALK/ROS1/NTRK抑制剂(例如，克唑替尼)。
在实施方案中，所述第一剂和/或所述第二剂对哺乳动物细胞有害并且/或者对受试者有毒，并且/或者所述第一剂和/或所述第二剂在直接施用到受试者的血流中时易于降解。
在实施方案中，所述第一化合物和/或所述第二化合物还包含荧光部分。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述第二GAG结合肽还优先结合丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
在实施方案中，所述组合物还包含第三化合物，所述第三化合物包含第三剂和第三多肽，其中所述第三多肽包含能够结合血小板的第三α颗粒类型中的GAG的第三糖胺聚糖(GAG)结合肽；并且其中所述第三GAG结合肽优先结合丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
分离的血小板
通常，用于治疗疾病或病症的剂可对人细胞有害和/或对受试者有毒，并且尤其是当向受试者全身施用时。使血小板负载包含有害剂的化合物避免受试者中的意外和不期望的细胞、组织和/或器官损伤。此外，某些剂在直接施用至受试者的血流中时易于降解。使血小板负载包含可降解剂的化合物避免剂浓度的降低，所述降低在直接施用至受试者的血流中时会发生；因此，负载的血小板在施用于受试者时避免剂量减少(例如，低于有效剂量)。一起，负载的血小板以期望的剂量和较少的副作用提供定位于靶部位的剂的富集。
与其他靶向递送系统相比，血小板促进的剂递送的技术具有许多优点。与纳米颗粒促进递送不同，没有向受试者提供外来物质。类似地，虽然脂质体制剂由于网状内皮系统(RES)的吞噬作用而具有短保质期、差稳定性和短体内半衰期，但本公开的血小板递送系统延长体内半衰期并且不改变原始化合物的稳定性和制剂。此外，靶向异常血管系统的大多数合成归巢机制如RGD肽尚未达到天然血小板的特异性。最后，在本发明中使用自体血小板消除他人的感染因子的风险；这增加程序的安全性和血小板负载速度(数秒至数分钟)，而无需解冻和/或制备捐赠和储存的血小板。总之，本公开的血小板促进的剂递送可迅速地且容易地转化为临床。
本公开的另一方面是分离的血小板。所述分离的血小板包含至少一个拷贝的第一化合物，所述第一化合物包含第一剂和第一多肽，其中所述第一多肽包含能够结合血小板的第一α颗粒类型中的GAG的第一糖胺聚糖(GAG)结合肽；以及至少一个拷贝的第二化合物，所述第二化合物包含第二剂和第二多肽，其中所述第二多肽包含能够结合血小板的第二α颗粒类型中的GAG的第二糖胺聚糖(GAG)结合肽。
在实施方案中，所述血小板是合成的、同种异体的、自体的或经修饰的异源血小板。
在实施方案中，所述血小板是自体血小板。
在实施方案中，所述血小板是同种异体血小板。
在实施方案中，所述血小板从富含血小板的血浆获得。
在实施方案中，所述血小板包含1至1000个拷贝的所述第一化合物和1至1000个拷贝的所述第二化合物。在一些情况下，将所述1至1000个拷贝的所述第一化合物负载至血小板的第一α颗粒类型中，并且将所述1至1000个拷贝的所述第二化合物负载至血小板的第二α颗粒类型中。可以将所述至少一个拷贝的所述第一化合物负载至血小板的第二α颗粒类型中，并且可以将所述至少一个拷贝的所述第二化合物负载至血小板的第一α颗粒类型中。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素(CS)，并且所述第二GAG结合肽优先结合至硫酸乙酰肝素(HS)。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素A(CSA)。在实施方案中，所述第一α颗粒类型是P-选择素相关颗粒，并且所述第二α颗粒类型是冯维勒布兰德因子(VWF)相关颗粒。
在实施方案中，所述第一α颗粒类型的内容物经由高亲和力凝血酶受体PAR1释放，并且所述第二α颗粒类型的内容物经由低亲和力凝血酶受体PAR4释放，任选地，α颗粒的内容物能够响应于与基质金属蛋白质酶(MMP)、过氧化物酶、磷酸水解酶、纤溶酶或纤溶酶(如组织纤溶酶原激活剂(tPA))的接触而释放。
在实施方案中，所述第一α颗粒类型的内容物在比提供所述第二α颗粒类型的内容物的释放所需的凝血酶浓度更低的凝血酶浓度下释放。
在实施方案中，所述第一α颗粒类型的内容物在所述第二α颗粒类型的内容物释放之前释放。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽的长度各自介于约8个氨基酸与约14个氨基酸之间。在一些情况下，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽中的一者或两者包含至少一个带电氨基酸。所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽两者都可包含至少一个带电氨基酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽中的一者或两者包含至少一个脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。在一些情况下，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽两者都至少包含至少一个脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
在实施方案中，GAG结合肽相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一者包含在位置1、位置4、位置7和/或位置9处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。作为实例，GAG结合肽包含在位置1、位置4、位置7和位置9处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1和位置4处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1、位置4和位置7和/或位置9处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1、位置4、位置7和位置9处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1和位置7处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1和位置4以及位置9处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1和位置9处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；以及它们之间的任何组合。GAG结合肽可包含在位置1、位置4、位置7和位置9处的脯氨酸；GAG结合肽可包含在位置1、位置4、位置7和位置9处的精氨酸；GAG结合肽可包含在位置1、位置4、位置7和位置9处的异亮氨酸；GAG结合肽可包含在位置1处的脯氨酸，以及在位置4、位置7和位置9处的精氨酸；GAG结合肽可包含在位置1处的脯氨酸、在位置4和位置7处的精氨酸以及在位置9处的异亮氨酸；GAG结合肽可包含在位置1处的脯氨酸、在位置4处的精氨酸和在位置9处的异亮氨酸；或者GAG结合肽可包含在位置4处的精氨酸和在位置9处的脯氨酸。在位置1、位置4、位置7和/或位置9处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸的任何组合都涵盖于本公开中。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含与SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13之一具有至少约70％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含与SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13之一具有至少约80％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含与SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13之一具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地相对于SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13中的任一者包含在位置1、位置4、位置7或位置9处的带电荷氨基酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽相对于SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13中的任一者包含在位置1、位置4、位置7和/或位置9处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含至少10个氨基酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含11个氨基酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地由11个氨基酸组成。
在实施方案中，所述GAG结合肽由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一者的氨基酸序列组成。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1具有至少约90％同一性的氨基酸序列，并且所述第二GAG结合肽包含与SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述第二GAG结合肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成，并且所述第二GAG结合肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
在实施方案中，所述第一多肽由第一GAG结合肽组成并且所述第二多肽由第二GAG结合肽组成。
在实施方案中，所述第一多肽的N端直接或间接连接至所述第一剂并且/或者所述第二多肽的N端直接或间接连接至第二第一剂。
在实施方案中，所述第一多肽的C端直接或间接连接至所述第一剂并且/或者所述第二多肽的C端直接或间接连接至第二第一剂。
在实施方案中，所述第一剂经由第一接头间接连接至所述第一多肽并且/或者其中所述第二剂经由第二接头间接连接至所述第二多肽。在一些情况下，所述第一接头和/或所述第二接头各自包含一个或多个原子。所述第一接头和/或所述第二接头可各自包含重复单元的聚合物。所述第一接头和/或所述第二接头可以各自包含氨基酸链。
在实施方案中，所述第一剂直接连接至所述第一多肽并且/或者所述第二剂直接连接至所述第二多肽。
在实施方案中，所述第一剂直接连接至所述第一多肽或使用马来酰亚胺反应、琥珀酰亚胺酯反应、酶促反应或不影响蛋白质结构或活性的另外缀合系统间接地连接至所述第一多肽，并且/或者所述第二剂直接连接至所述第二多肽或使用马来酰亚胺反应、琥珀酰亚胺酯反应、酶促反应或不影响蛋白质结构或活性的另外缀合系统间接地连接至所述第二多肽。
在实施方案中，所述第一剂和/或所述第二剂独立地包含抗体，化学治疗剂，细胞毒性化合物，小分子，荧光部分，放射性元素，免疫检查点抑制剂，生长因子，生长抑制剂，蛋白酶/蛋白质酶，凝血因子，脂质或磷脂，细胞外基质蛋白，激素，酶，趋化因子/化学引诱物，神经营养蛋白，酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)，或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。在一些情况下，所述第一剂和/或所述第二剂包含抗体并且/或者包含荧光部分。
在实施方案中，所述第一剂和/或所述第二剂对哺乳动物细胞有害并且/或者对受试者有毒，并且/或者所述第一剂和/或所述第二剂在直接施用到受试者的血流中时易于降解。
在实施方案中，所述第一化合物和/或所述第二化合物还包含荧光部分。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述第二GAG结合肽还优先结合丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
在实施方案中，所述分离的血小板还包含至少一个拷贝的第三化合物，所述第三化合物包含第三剂和第三多肽，其中所述第三多肽包含能够结合血小板的第三α颗粒类型中的GAG的第三糖胺聚糖(GAG)结合肽；并且其中所述第三GAG结合肽优先结合丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
值得注意的是，本公开的负载的血小板保持为静息的、功能齐全的血小板，而不是被负载过程激活，这种激活将使血小板成为促凝血剂。
药物组合物
本公开的负载的血小板可被配制成至少一旦施用于受试者就增强血小板的稳定性和有效性的药物组合物。此外，此类药物组合物在施用于受试者之前增强血小板的稳定性。
本公开的又一方面是一种药物组合物，所述药物组合物包含任何本文公开的方面或实施方案的分离的血小板和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在实施方案中，所述药物组合物还包含第二分离的血小板，所述第二分离的血小板包含至少一个拷贝的第三化合物，所述第三化合物包含第三剂和第三多肽，其中所述第三多肽包含能够结合血小板的第三α颗粒类型中的GAG的第三糖胺聚糖(GAG)结合肽；并且其中所述第三GAG结合肽优先结合丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
在实施方案中，所述药物组合物还包含第二分离的血小板，所述第二分离的血小板包含至少一个拷贝的所述第一化合物，或者还包含第三分离的血小板，所述第三分离的血小板包含至少一个拷贝的第二化合物。
在实施方案中，所述药物组合物还包含第二分离的血小板，所述第二分离的血小板包含至少一个拷贝的所述第一化合物，并且包含第三分离的血小板，所述第三分离的血小板包含至少一个拷贝的第二化合物。
药物组合物包含药学上可接受的载剂或媒介物。此类药物组合物可任选地包含适合的量的药学上可接受的赋形剂以便提供用于适当施用的形式。药物赋形剂可以是液体，如水和油，包括石油、动物、植物或者合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药物赋形剂可例如是盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、硅胶、尿素等。此外，可使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在实施方案中，当施用给受试者时，药学上可接受的赋形剂是无菌的。当静脉内施用本文公开的任何剂时，水是有用的赋形剂。盐溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液也可用作液体赋形剂，特别是对于可注射的溶液。适合的药物赋形剂还包括淀粉、葡萄糖(即右旋糖)、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水，乙醇等。如果需要，本文公开的任何剂还可包含少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。合适的药用赋形剂的实例描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences 1447-1676(Alfonso R.Gennaro编辑,第19版1995)(以引用的方式并入本文)中。
本文公开的药物组合物可包含盐水缓冲液(包括但不限于NaCl溶液、TBS、PBS、林格氏溶液等)。
在实施方案中，本文公开的药物组合物以适合于无菌注射的形式存在，其与血液近似等渗并且具有介于约7.3与7.5之间的pH(即，血液的pH)。
在实施方案中，本文公开的药物组合物根据常规程序配制为适用于本文公开的施用模式的药物组合物。
在一个方面，本公开提供了任何本文公开的药物组合物用于治疗疾病或病症的用途。在实施方案中，所述疾病或病症是癌症。
在另一个方面，本公开提供了任何本文公开的分离的血小板或任何本文公开的药物组合物在制造用于治疗疾病或病症的药剂中的用途。在实施方案中，所述疾病或病症是癌症。
治疗方法
如前所公开，负载有两种或更多种包含两种或更多种剂的化合物的血小板避免了剂浓度的降低(例如，低于有效剂量)，所述降低在所述剂在不负载至血小板中的情况下施用于受试者时发生。此外，负载有包含有害(例如，有毒)剂的化合物的血小板避免受试者中的意外和不期望的细胞、组织和/或器官损伤。血小板自然地归巢至损伤、炎症和/或血管生成部位。本公开的血小板被选择性地负载有进入不同的α颗粒类型(该α颗粒类型中的每一种均具有单独的释放谱)中的两种或更多种剂，从而允许不同的剂以空间和时间受控的方式从血小板中释放。最后，α颗粒的负载的血小板的内容物的释放可响应于与释放诱导剂的接触而被诱导，所述释放诱导剂可以以药物组合物的形式并且在有利于促进治疗响应所需的剂释放的时间向受试者施用。总之，负载的血小板有助于确保将治疗有效量的两种或更多种剂递送至靶部位并且副作用更少。
以组织炎症或组织损伤为特征并且以血小板为第一响应者为特征的疾病和病症都可根据所公开的方法进行治疗。这些疾病和病症包括但不限于瘤形成、血液系统恶性肿瘤、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、中风、缺血性心脏病、动脉粥样硬化、烧伤和移植物上皮形成。
本发明提供的一个优点是相对于直接施用于血流的剂，当负载至血小板中时剂(在受试者的血流中)的半衰期延长。本发明使剂的自然消除减慢，显著降低。通常，剂通过肾过滤、酶降解、网状内皮系统(RES)摄取以及在非靶向器官和组织中累积而从循环中消除。然而，在本发明中，剂在血小板的寿命(通常为4-7天)内或直到递送至靶部位都被保护在血小板内。此外，本发明通过避免剂广泛分布至非靶部位(例如，组织和器官)来限制剂的全身暴露。所述益处允许使用较低剂量的剂(相对于未负载至血小板中的剂的施用)。这种较低剂量的使用至少有助于减少不希望的副作用并降低经济成本。
此外，可用于本发明中的血小板负载有多种不同的剂；所述不同的剂可以空间和时间受控的方式从不同的α颗粒类型中释放。因此，本发明向损伤部位(例如，用于治疗慢性伤口)、病理性炎症部位(例如，用于治疗关节或肺损伤)和/或血管生成部位(例如，用于治疗癌症)提供定向和受控治疗剂。
在又一个方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的任何本文公开的药物组合物的步骤。
本公开的一个方面是一种用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的任何本文公开的组合物的步骤。
在以上方法的实施方案中，第一α颗粒类型的内容物在第二α颗粒类型的内容物释放之前在靶位点处释放。
在以上方法的实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用第二药物组合物和/或第三药物组合物的步骤，所述第二药物组合物和/或第三药物组合物独立地包含乙酰肝素酶、凝血酶及其片段肽、蛋白酶激活受体1(PAR1)激动剂或拮抗剂肽、蛋白酶激活受体4(PAR4)激动剂或拮抗剂肽、纤溶酶及其片段、金属蛋白质酶、过氧化物酶和/或磷酸水解酶中的一种或多种。在一些情况下，所述第二药物组合物促进第一化合物从第一α颗粒类型释放，并且所述第三药物组合物促进第二化合物从第二α颗粒类型释放。所述第二药物组合物和/或所述第三药物组合物可以在所述药物组合物施用之后施用。所述药物组合物可以在所述第二药物组合物和/或所述第三药物组合物施用之前施用至少两次。
在实施方案中，所述疾病或病症是癌症。癌症通常是由不适当的高增殖率和/或不适当的低细胞凋亡率引起的疾病。
在实施方案中，癌症选自听神经瘤；急性红白血病；急性白血病；急性成淋巴细胞性白血病；急性淋巴细胞性白血病；急性单核细胞性白血病；急性成髓细胞性白血病；急性髓细胞性白血病；急性粒单核细胞白血病；急性早幼粒细胞白血病；腺癌；AIDS相关淋巴瘤；血管肉瘤；星形细胞瘤；基底细胞癌；B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤)；胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；支气管癌；巨大肿块非霍奇金淋巴瘤；消化系统癌症；头颈癌；腹膜癌；呼吸系统癌症；泌尿系统癌症；宫颈癌；软骨肉瘤；脊索瘤；绒毛膜癌；慢性白血病；慢性淋巴细胞性白血病；慢性成髓细胞性白血病；慢性髓细胞性白血病；结肠癌和直肠癌；结缔组织癌；颅咽管瘤；囊腺癌；胚胎癌；子宫内膜癌、内皮肉瘤、室管膜瘤；上皮癌、食道癌、尤文氏瘤；眼癌、纤维肉瘤、胃癌(包括胃肠癌)；胶质母细胞瘤、胶质瘤；毛细胞白血病；重链病；血管母细胞瘤、肝癌、肝细胞瘤、高级成免疫细胞性非霍奇金淋巴瘤；高级成淋巴细胞性非霍奇金淋巴瘤；高级小无裂细胞非霍奇金淋巴瘤；霍奇金和非霍奇金淋巴瘤；中级弥漫性非霍奇金淋巴瘤；中级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤；上皮内肿瘤；肾癌或肾癌；喉癌；平滑肌肉瘤；脂肪肉瘤；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；肺癌；淋巴管内皮肉瘤；淋巴管肉瘤；淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金病)；套细胞淋巴瘤；髓样癌；髓母细胞瘤；梅基综合征；黑素瘤；脑膜瘤；间皮瘤；骨髓瘤；粘液肉瘤；成神经细胞瘤；胆管癌；少突胶质细胞瘤；口腔癌(唇癌、舌癌、口腔癌和咽癌)；成骨肉瘤；卵巢癌；胰腺癌；乳头状腺癌；乳头状癌；松果体瘤；真性红细胞增多症；移植后淋巴组织增生性病症(PTLD)以及与瘢痣病相关的异常血管增生、水肿(如与脑肿瘤相关的)；前列腺癌；直肠癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；肉瘤；神经鞘瘤；皮脂腺癌；精原细胞瘤；皮肤癌；小淋巴细胞(SL)非霍奇金淋巴瘤；鳞状细胞癌；胃癌；汗腺癌；滑膜瘤；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；外阴癌；瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；和威尔姆氏肿瘤。
在实施方案中，所述疾病或病症癌症是增生性病症，例如淋巴增生性疾病。
在实施方案中，疾病是损伤，例如烧伤、脊柱损伤、整形外科损伤和伤口。
在实施方案中，疾病或病症是血友病关节积血。
在实施方案中，疾病或病症是炎症，例如急性或慢性炎症，包括关节炎症和肺部炎症。
在实施方案中，疾病或病症是糖尿病性溃疡。
在实施方案中，所述疾病或病症是植入物、移植物、支架或假体的副作用。
在实施方案中，通过本公开的方法治疗的疾病或病症由缺陷型基因引起。在这些实施方案中，剂可以是替代缺失或功能失调的蛋白质的重组多肽。可替代地或另外，重组蛋白可以是本文公开的基于多肽的剂中的任一者，即抗体(或其抗原结合片段)、化疗剂、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白质酶、凝血因子、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物或神经营养蛋白。
由基因中的缺陷引起的一些疾病可能影响GAG的合成。例如，染色体3长臂上的硫酸软骨素蛋白多糖5(CSPG5)中的缺陷可导致脑畸形发生，而DBQD1基因中的缺陷导致肢端纤细型侏儒症，也称为“伴手部异常的Desbuquois发育不良”，并且基因异常可影响血小板中GAG的合成。
本文公开的药物组合物的施用使得通过静脉内或动脉内注射或输注将负载的血小板递送至血流中。可替代地，将本文公开的药物组合物直接再施用至活动性疾病部位。其他施用途径包括例如皮下、腹膜内、肌肉内或皮内注射。
包含本文公开的负载的血小板的药物组合物的剂量以及给药方案可取决于各种参数，包括但不限于所治疗的疾病、受试者的一般健康状况和施用医生的判断。
剂量可取决于若干因素，所述因素包括疾患的严重程度、是要治疗还是预防所述疾患以及待治疗受试者的年龄、体重和健康状况。另外，关于特定受试者的药物基因组学(基因型对治疗剂的药物动力学、药效学或功效分布的影响)信息可影响所用剂量。此外，可根据多种因素稍微调整精确的单个剂量，所述因素包括所施用的剂的特定组合、施用时间、施用途径、制剂的性质、排泄速率、所治疗的特定疾病、病症的严重程度以及病症的解剖学位置。可预期一些剂量的变化。
一般而言，包含特定量的负载至血小板中的剂的药物组合物的剂量将在当所述剂在没有负载至血小板中的情况下施用时的剂量范围内。在实施方案中，本文公开的药物组合物中剂的剂量将低于未负载至血小板中的剂的剂量，因为本发明在受试者中提供增加的靶特异性和对剂降解的抗性。
包含本文公开的负载的血小板的任何药物组合物可以单次每日剂量施用，或者总每日剂量可每日两次、三次或四次的分次剂量施用。此外，包含本文公开的负载血小板的任何药物组合物可在整个给药方案中连续而不是间歇地施用。
可将负载的血小板重复地输注到患者体内，例如每周一次，因为血小板的半衰期是4至7天。
重组多肽表达
本发明进一步提供了包含重组多肽剂的氨基酸序列与包含糖胺聚糖(GAG)结合肽的多肽偶联(直接或间接)的融合蛋白。
包含GAG结合肽的重组多肽可作为单独的肽表达并连接在一起。可替代地，包含GAG结合肽的重组多肽被表达为单一融合蛋白，所述单一融合蛋白包含与GAG结合肽可操作地连接的多肽剂。
本发明的重组多肽实际上是使用本领域技术人员已知的任何方法产生的。通常，重组多肽是通过在合适的表达媒介物中用全部或部分编码多肽的核酸分子或其片段转化合适的宿主细胞而产生。
分子生物学领域的技术人员将理解，可使用多种表达系统中的任一种来表达重组多肽。所使用的精确宿主细胞对本发明来说不是关键的。本发明的重组多肽可在原核宿主(例如大肠杆菌)或真核宿主(例如酿酒酵母)、昆虫细胞(例如Sf21细胞)或哺乳动物细胞(例如NIH 3T3、HeLa，或优选COS细胞)中产生。此类细胞可从多种来源(例如，ATCC,Rockland,Md.；还参见例如，Ausubel等人,Current Protocol in Molecular Biology,NewYork:John Wiley and Sons,1997)获得。转化或转染的方法以及表达媒介物的选择将取决于所选择的宿主系统。转化和转染方法描述于例如，Ausubel等人中，表达媒介物可选自例如Cloning Vectors:A Laboratory Manual(P.H.Pouwels等人.,1985,增刊1987)中所提供的那些。
一旦本发明的重组多肽被表达，它就可被分离、浓缩和/或纯化。
例如，可使用亲和色谱分离重组多肽。在一个实例中，针对重组多肽产生的抗体可附接至柱上并用于分离重组多肽。在亲和色谱之前裂解和分解分离携带多肽的细胞可通过标准方法进行(参见例如，Ausubel等人,)或者，使用与镍柱结合的序列标签，如六组氨酸标签来分离重组多肽。
一旦分离，如果需要，可进一步纯化重组蛋白，例如通过高效液相色谱法(参见例如，Fisher,Laboratory Techniques In Biochemistry and Molecular Biology,编辑,Work and Burdon,Elsevier,1980)。
本发明的多肽，特别是短肽片段，也可通过化学合成(例如，通过Solid PhasePeptide Synthesis,第2版,1984The Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.中描述的方法)产生。
多肽表达和纯化的这些一般技术也可用于产生和分离有用的肽片段或类似物(本文描述的)。
组合疗法
在实施方案中，任何本文公开的药物组合物或治疗方法还可包含不与糖胺聚糖(GAG)结合肽连接和/或不负载至血小板中的另外剂。在组合疗法的一个实例中，药物组合物包含负载的血小板和另外的剂。在组合疗法的另一个实例中，向受试者施用包含负载的血小板的第一物组合物和包含另外的剂的第二药物组合物。组合疗法还可包括包含负载的血小板和第一另外剂的第一药物组合物和包含第二另外剂的第二药物组合物；这里，第一另外剂和第二另外剂可以是相同的或者可以是不同的剂。任何本文公开的剂都可用作另外的剂。
在涉及多于一种药物组合物的组合疗法的实施方案中，第一药物组合物可在第二药物组合物之前施用，第一药物组合物可在第二药物组合物之后施用，或者第一药物组合物可与第二药物组合物同时施用。
此外，组合疗法可将本公开的药物组合物与另一种治疗方案组合。其他治疗方案包括放射疗法、激素疗法、手术和冷冻手术。治疗疗法可包含本文所述的任何剂。
在组合疗法的实施方案中，化学治疗剂与本公开的化合物组合使用。作为实例，组合疗法可包括负载有以下化合物中的一种或两种的血小板：包含作为剂的多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)的化合物、包含作为剂的烟曲霉素的化合物；和化学治疗剂；这种组合可用于治疗胰腺癌、肺癌或结肠癌。组合疗法可包括负载有以下化合物中的一种或两种的血小板：包含作为剂的EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)的化合物、包含作为活性剂的多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)的化合物；和化学治疗剂；这可用于治疗肺癌。组合疗法可包括负载有以下化合物中的一种或两种或所有三种的血小板：包含作为剂的EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)的化合物、包含作为剂的多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)的化合物、包含作为剂的ALK/ROS1/NTRK抑制剂(例如，克唑替尼)的化合物；和化学治疗剂；这可用于治疗非小细胞肺癌。
在另外的实施方案中，组合疗法包括负载有VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗)和药物瑞德西韦的血小板；这可用于治疗可能与COVID相关的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
在组合疗法的实施方案中，药物组合物可在另一种治疗方案之前施用，药物组合物可在另一种治疗方案之后施用，或者药物组合物可与另一种治疗方案同时施用。
制造方法
本公开的另一方面是一种用于制造负载的血小板的方法。所述方法包括以下步骤：获得血小板；使所述血小板在体外或离体与任何本文公开的组合物接触；以及使所述血小板与所述组合物之间的接触进展，直到所述第一化合物被所述血小板的第一α颗粒类型内化并且所述第二化合物被所述血小板的第二α颗粒类型内化，从而产生负载的血小板。
本公开的又一方面是一种用于制造负载的血小板的方法。所述方法包括以下步骤：获得血小板；使所述血小板在体外或离体与第一化合物接触，所述第一化合物包含第一剂和第一多肽，其中所述第一多肽包含能够结合血小板的第一α颗粒类型中的GAG的第一糖胺聚糖(GAG)结合肽；以及使所述血小板在体外或离体与第二化合物接触，所述第二化合物包含第二剂和第二多肽，其中所述第二多肽包含能够结合血小板的第二α颗粒类型中的GAG的第二糖胺聚糖(GAG)结合肽。
在实施方案中，使所述血小板与第一化合物接触和所述使血小板与第二化合物接触同时发生。
在实施方案中，使所述血小板与第一化合物接触和使血小板与第二化合物接触依序发生。
在实施方案中，所述方法还包括使所述血小板在体外或离体与第三化合物接触，所述第三化合物包含第三剂和第三多肽，其中所述第三多肽包含能够结合血小板的第三α颗粒类型中的GAG的第三糖胺聚糖(GAG)结合肽；并且其中所述第三GAG结合肽优先结合丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
血小板和组合物(或第一化合物和第二化合物)之间的接触可以在37℃下进行至少约15分钟和/或直到第一化合物被血小板的第一α颗粒类型内化并且第二化合物被血小板的第二α颗粒类型内化。当剂具有显著的全身毒性时，使用合适的缓冲液洗涤血小板以防止输注尚未负载至血小板中的剂。
药盒
在一个方面，本公开提供了一种用于治疗疾病或病症的药盒。所述药盒包括任何本文公开的分离的血小板和使用说明书。
在另一个方面，本公开提供了一种用于治疗疾病或病症的药盒。所述药盒包括任何本文公开的药物组合物和使用说明书。
在实施方案中，所述药盒还包括第二药物组合物和/或第三药物组合物，所述第二药物组合物和/或第三药物组合物独立地包含乙酰肝素酶、凝血酶及其片段肽、蛋白酶激活受体1(PAR1)激动剂或拮抗剂肽、蛋白酶激活受体4(PAR4)激动剂或拮抗剂肽、纤溶酶及其片段、金属蛋白质酶、过氧化物酶和/或磷酸水解酶中的一种或多种。
在又一个方面，本公开提供了一种用于制造负载的血小板的药盒。所述药盒包括任何本文公开的组合物和使用说明书。本发明提供了用于治疗或预防涉及损伤、炎症或肿瘤血管生成部位的疾病或病症的药盒。在一个实施方案中，所述药盒包括治疗性或预防性组合物，所述治疗性或预防性组合物含有有效量的负载有呈单位剂量形式的两种或更多种剂的血小板。在一些实施方案中，所述药盒包括容纳治疗性或预防性组合物的无菌容器；此类容器可以是盒子、安瓿、瓶子、小瓶、管、袋子、小袋、泡罩包装或本领域已知的其他合适的容器形式。此类容器可由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适于容纳药剂的其他材料制成。
如果需要，包含本公开的分离的血小板的药物组合物连同用于将其施用于患有疾病或病症或有发展疾病或病症风险的受试者的说明书一起提供。说明书可包括关于使用药物组合物治疗或预防疾病或将分离的血小板递送至有需要的组织的信息。在其他实施方案中，说明书包括以下中的至少一者：剂的描述；用于治疗或预防疾病或其症状的剂量时间表和施用；预防措施；警告；适应症；禁忌症；过量用药信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文献。说明书可直接打印在容器(当存在时)上，或作为标记应用于容器，或作为单独的页、小册子、卡片或在容器中或与容器一起提供的文件夹。
本文公开的任何方面或实施方案可与如本文公开的任何其他方面或实施方案组合。
等效案
尽管已经结合本发明具体的实施方案描述了本发明，但应理解本发明能够具有另外的修改，并且本申请意图涵盖通常遵循本发明原理的、包括虽然不属于本发明所公开内容范围但属于本发明所属领域的公知技术或常用的技术手段并可以应用于上文中阐述和所附权利要求的范围所列出的必要特征的任何变型、用途或者变更。
本领域技术人员仅使用常规实验将会认识到或将能够确定本文中确切描述的具体实施方案的许多等效方案。此类等效方案意图涵盖在所附权利要求书的范围中。
定义
本文所用的术语仅是出于描述特定情况的目的而并不旨在限制。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“一个/种(a/an)”和“所述”旨在包括复数形式以及单数形式，除非上下文另有明确说明。
本公开和/或权利要求书中使用的术语“包含(comprise)”、“包含(comprising)”，“含有(contain)”、“含有(containing)”、“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“带有(with)”或其变体旨在以类似于术语“包含(comprising)”的方式包括在内。
术语“约”或“近似”意指由本领域普通技术人员测定的特定值处于可接受的误差范围内，这将部分取决于所述值的测量或测定方式，例如，测量系统的限制性。例如，“约”可表示大于或小于所陈述值10％。在另一个实例中，“约”可表示根据给定值的实践，在1个或超过1个标准偏差内。在申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应假定术语“约”表示特定值的可接受的误差范围。
术语“基本上”在很大程度上意味着在极大程度上；或本质上。换言之，术语基本上可意味着与所需属性几乎完全一样或与确切的属性略有不同。基本上可能与所需属性无法区分。基本上可与所需属性区分开来，但差异不重要或可忽略不计。
术语“至少第二”是指第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第二十、第三十、第十四、第五十、第六十、第七十、第八十、第九十、第一百或更多以及其间的任何迭代。术语“一个或多个”包括一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、二十、三十、四十、五十、六十、七十、八十、九十、一百或更多以及之间的任何数字。
术语“货物”是指可负载至血小板，例如血小板的α颗粒中的化合物或剂。这种负载通过化合物的糖胺聚糖(GAG)结合肽发生。在一些实施方案中，术语“剂”和“货物”可以是同义词。
参考文献
以下参考文献的内容通过引用整体并入：
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实施例
实施例1：糖胺聚糖(GAG)结合肽将附接的货物螯合至血小板的α颗粒中
在此实施例中，确定了说明性糖胺聚糖(GAG)结合肽引导货物直接负载至血小板的α颗粒中的能力。
测试了在图1A和图1B中标识为PAL1和PAL2的Alexa647标记的GAG结合肽和Alexa647标记的对照肽(充当阴性对照的无电荷配体(CFL))对糖胺聚糖(如硫酸软骨素)的结合亲和力，以及它们进入血小板的能力。PAL1具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，PAL2具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，CFL具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
Alexa647标记的肽(或作为阴性对照的单独Alexa647)的剂量响应曲线显示在图1A中。将Alexa647标记的肽或单独的Alexa647与分离的血小板在37℃下共孵育一小时以允许血小板负载。相应的血小板负载能力通过孵育后上清液中的荧光降低来指示。对于对照，在没有孵育期的情况下进行相同的实验(在图中标记为“完整”)。然后将共孵育后的血小板以800g离心10分钟以使血小板与上清液分离(在图中标记为“负载的”)。
如图1A所示，在完整测量值与负载测量值之间存在PAL1和PAL2的吸光度的降低。这种来自上清液的吸光度降低表明这些肽已经从上清液中被螯合并且被负载至血小板中。相比之下，Alexa647标记的CFL条件的吸光度在与血小板共同孵育后没有变化。因此，CFL肽保留在上清液中并且没有负载至血小板中。
图1B表示针对每个肽实验归一化的图1A中的数据，即将负载条件以其完整条件作归一化。图1B示出说明性GAG结合肽PAL1和PAL2有助于将附接的货物负载至血小板中，而附接至无电荷配体的货物不能直接将货物负载至血小板中。
为了确认Alexa647标记的GAG结合肽被负载至血小板的α颗粒中，使用了共聚焦显微术。将在图1A和图1B的实验中离心的血小板固定在2％多聚甲醛中并沉降到玻璃盖玻片上。透化后，针对PF4进行免疫荧光染色，PF4是血小板α颗粒的标志物。将血小板用Alexa568-第二抗体染色。通过配备有60x油物镜的Nikon-A1激光扫描显微镜收集图像。
图2A是以红色示出的PF4染色(左柱)和以紫色示出的Alexa647信号(来自游离Alexa647、Alexa647标记的GAG结合肽或Alexa647标记的CFL；中间柱)的代表性图像。将图像仅针对显示的亮度和对比度进行了调整。每个实验采集n>5个图像，并根据PF4强度选择感兴趣区域(ROI)。
合并后的图像(右柱)展示只有当Alexa647是GAG结合肽的货物时α颗粒标志物PF4和Alexa647信号的共定位。对于游离Alexa647或当Alexa647是CFL的货物时，未观察到共定位。
使用ImageJ测量每个ROI的Alexa647强度，并使用Prism 8在盒须图中绘制。图2B示出说明性GAG结合肽PAL1和PAL2有助于将附接的货物负载至血小板的α颗粒中，而附接至无电荷配体的货物不负载至血小板中，更不用说负载至血小板的α颗粒中。
这些数据证明本公开的GAG结合肽有助于将任何附接的货物负载至血小板的α颗粒中。
实施例2：糖胺聚糖(GAG)结合肽以高亲和力结合糖胺聚糖
在此实施例中，测定了说明性糖胺聚糖(GAG)结合肽与各种糖胺聚糖的结合亲和力。
图3A是描绘在此实施例中进行的等温滴定量热法(ITC)实验的示意图。在此，硫酸软骨素A(CSA)用于测试说明性GAG结合肽对糖胺聚糖的亲和力。将3mM CSA负载至注射器中，并将CSA滴定至样品池中，所述样品池含有0.25mM的GAG结合肽或充当阴性对照的无电荷配体(CFL)的溶液。温度设定为22℃，缓冲液是5mM Tris-HCl(pH 7.35)和1％ DMSO。进行了26次CSA注射，第一次的体积为0.1μl，并且随后的25次每次体积为1.5μl。在这些实验中，说明性GAG结合肽是分别具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列的PAL1和PAL2，并且CFL具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
图3B至图3D示出滴定至含有PAL1(图3B)、PAL2(图3C)和CFL(图3D)的池中的CSA的ITC解离动力学的图形表示。
在图3B和图3C的实验期间获得的数据用于确定CSA和GAG结合肽相互作用的解离常数；这些是通过使用顺序结合模型的滴定曲线拟合确定的。这些数据示于图3E(对于PAL1)和图3F(对于PAL2)中。这些数据表明，两种说明性GAG结合肽对糖胺聚糖硫酸软骨素A具有高亲和力。
此外，使用亲和色谱测定了两种说明性GAG结合肽PAL1和PAL2对硫酸乙酰肝素(HS)和硫酸软骨素(CSA)的结合亲和力。如图4B所示，PAL1被显示比PAL2更紧密地结合CSA。使用ITC测量解离常数，解离常数越高，结合越松散。在图4C中，PAL2被显示比PAL1更紧密地结合HS。通过附接到FPLC系统的Hi-Trap肝素柱上的洗脱体积来测量结合。峰出现得越晚，结合越紧密。在图4A中，示出了包括对照肽(CFL)和两个PAL(PAL1和PAL2)的肽氨基酸序列。
这些数据表明，本公开的两个PAL序列对血小板的α颗粒中存在的糖胺聚糖具有高亲和力，并且它们对两种主要糖胺聚糖显示出不同的结合偏好，其中PAL1比PAL1更紧密地与CSA结合并且PAL2比PAL1更紧密地与HS结合。
实施例3：负载至血小板的α颗粒中的包含糖胺聚糖(GAG)结合肽和剂的化合物
在此实施例中，测定了包含糖胺聚糖(GAG)结合肽和剂的说明性化合物负载至血小板的α颗粒中的能力。
构建了本公开的两种说明性化合物和两种对照化合物。说明性化合物包括间接连接(通过九个氨基酸的接头)至糖胺聚糖(GAG)结合肽的剂(例如，mNeonGreen)。在这些实验中，说明性GAG结合肽是分别具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列的PAL1和PAL2。阴性对照化合物包括与mNeonGreen间接连接(通过九个氨基酸的接头)的具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的无电荷配体(CFL)。阳性对照化合物包括与mNeonGreen间接连接(通过九个氨基酸的接头)的PF4(天然血小板因子)。在使用之前，这些化合物还包括用于纯化目的的His标签，以及TEV蛋白酶切割位点，所述切割位点有助于除去His标签。这些化合物被标识为mCFL(对于mNeon-L9-CFL)、mPAL1(对于mNeon-L9-PAL1)、mPAL2(对于mNeon-L9-PAL2)和PF4m(对于PF4-L9-mNeon)。
将血小板与四种化合物中的一种在37℃下共孵育一小时。孵育期后，将血小板以800g离心10分钟。然后，测量“负载”上清液(在505nm处)的荧光吸光度，并与“完整”负载对照进行比较，所述对照是血小板与化合物混合、然后立即离心而没有孵育期的每种条件的上清液。数据被进一步归一化并且将每组实验的负载百分比如图5中所示绘制。
图5示出两种说明性化合物具有比阴性对照更大的血小板负载能力和比阳性对照PF4稍大的负载能力。
为了确认包含GAG结合肽的化合物被负载至血小板的α颗粒中，使用了共聚焦显微术。将在图5的实验中离心的血小板固定在2％多聚甲醛中并沉降到玻璃盖玻片上。透化后，针对PF4进行免疫荧光染色，PF4是血小板α颗粒的标志物。将血小板用Alexa568-第二抗体染色。通过配备有60x油物镜的Nikon-A1激光扫描显微镜收集图像。
图6A是以红色示出的PF4染色(左柱)和以绿色标记的mNeon信号(中间柱)的代表性图像。将图像仅针对显示的亮度和对比度进行了调整。每个实验采集n>5个图像，并根据PF4强度选择感兴趣区域(ROI)。
合并后的图像(右柱)展示α颗粒标志物PF4和包含GAG结合肽的两种说明性化合物的mNeon信号的共定位。对于包含CFL的化合物，没有观察到共定位。
使用ImageJ测量每个ROI的mNeon强度并使用Prism 8在盒须图中绘制。图6B示出包含GAG结合肽的说明性化合物负载至血小板的α颗粒中，而包含无电荷配体的化合物不负载至血小板中，更不用说负载至血小板的α颗粒中。
这些数据证明包含GAG结合肽和剂的本公开的化合物负载至血小板的α颗粒中。
实施例4：包含糖胺聚糖(GAG)结合肽和剂的化合物以高亲和力结合糖胺聚糖
在此实施例中，测定了本公开的说明性化合物(其包含糖胺聚糖(GAG)结合肽和剂)对各种糖胺聚糖的结合亲和力。
在此实施例中进行如图3A中描绘的和如实施例2中所述的等温滴定量热法(ITC)实验，但使用本公开的说明性化合物与阴性对照化合物。与实施例2的实验一样，此处滴定缓冲液是5mM Tris-HCl(pH7.35)，并且温度设定为22℃；然而，与实施例2的实验不同，缓冲液不含DMSO。
图7A至图7C示出滴定至池中的CSA的ITC解离动力学的图形表示，所述池含有包含PAL1的说明性化合物(图7A)、包含PAL2的说明性化合物(图7B)和包含CFL的阴性对照化合物(图7C)。这些化合物包含mNeonGreen作为其剂。
在图7B和图7C的实验期间获得的数据用于确定CSA和化合物相互作用的解离常数；这些是通过使用顺序结合模型的滴定曲线拟合确定的。这些数据示于图7C(对于包含PAL1的说明性化合物)、图7D(对于包含PAL2的说明性化合物)和图7E(对于包含CFL的阴性对照化合物)中。这些数据表明，两种说明性GAG结合肽对糖胺聚糖硫酸软骨素A具有高亲和力。
此外，使用亲和色谱测定了两种说明性含GAG结合肽的化合物和CFL对硫酸乙酰肝素(HS)的结合亲和力。如图8所示，包含任一GAG结合肽的化合物以高亲和力结合HS。值得注意的是，两种说明性GAG结合肽与HS的相对结合亲和力与先前实验中观察到的相似，在于mPAL2与HS的结合比mPAL1更紧密，PAL2与HS的结合比PAL1更紧密。包含对照肽(mCFL)的化合物具有一些残留的结合能力，并保留在HS柱上，将所述柱在相对低浓度的盐下洗脱，可能是由于化合物的剂(例如mNeonGreen)的带电特性。
这些数据证明，包含糖胺聚糖(GAG)结合肽和剂的本公开的说明性化合物对位于血小板的α颗粒中的糖胺聚糖具有高亲和力。
实施例5：鉴定对糖胺聚糖(GAG)结合肽结合糖胺聚糖的能力重要的序列特异性
在此实施例中，测定了包含糖胺聚糖(GAG)结合肽的另外说明性化合物与各种糖胺聚糖的结合亲和力。更具体地，GAG结合肽(SEQ ID NO:1)的丙氨酸扫描诱变产生了相差一个氨基酸的另外的说明性GAG结合肽，所述肽然后间接连接至剂(例如，mNeonGreen)，如实施例3中所描述。
在此实施例中进行如图3A中描绘的和如实施例4中所述的等温滴定量热法(ITC)实验，但使用本公开的说明性化合物。
在图9A中，化合物被标识为PAL1A至PAL11A。这些说明性化合物具有GAG结合肽，所述GAG结合肽具有SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:13的氨基酸序列。具体地，PAL1A的GAG结合肽与SEQ ID NO:1的不同之处在于在位置1具有丙氨酸；PAL2A的GAG结合肽与SEQ ID NO:1的不同之处在于在位置2具有丙氨酸；并且PAL3A的GAG结合肽与SEQ ID NO:1的不同之处在于在位置3具有丙氨酸。
图9A示出滴定至池中的CSA的ITC解离动力学的图形表示，所述池含有标识为PAL1A至PAL11A的说明性化合物之一。如通过CSA滴定至含有每种所列化合物的样品池中生成的代表性ITC曲线中可看出，电荷和序列对于与硫酸软骨素A的相互作用都很重要。
在图9A的实验期间获得的数据用于确定CSA和另外的说明性化合物相互作用的解离常数；这些是通过使用顺序结合模型的滴定曲线拟合确定的。这些数据示于图9B至图9L(分别对于PAL1A至PAL11A)中。这些数据表明，另外的说明性化合物对糖胺聚糖硫酸软骨素A具有可变亲和力。
图9M是描绘说明性化合物和对照化合物的平均解离常数的图。此图示出化合物之间不同程度的CSA结合亲和力。在图中，标识为“1A”的数据代表“PAL1A”化合物，标识为“2A”的数据代表“PAL2A”化合物，依此类推。
值得注意的是，在其位置1、4、7或9具有丙氨酸的那些说明性化合物具有最低、最差的亲和力。从而证明当GAG结合肽在这些位置具有脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸时结合能力的提高。
位置中的关键氨基酸如脯氨酸、精氨酸和异亮氨酸影响结合的亲和力。令人感兴趣地，这些氨基酸包括预期的带正电荷的精氨酸以及还有可通过维持特殊构象起作用的不带电荷的脯氨酸和异亮氨酸。
这些数据表明，具有在带电荷氨基酸的位置中不同的GAG结合肽的另外化合物对糖胺聚糖具有可变亲和力。并且，关键残基(相对于SEQ ID NO:1的位置1、4、7和9)和特定氨基酸(如脯氨酸、精氨酸和异亮氨酸)影响GAG结合肽与糖胺聚糖例如在血小板的α颗粒中的结合亲和力。
实施例6：当形成本公开的化合物时用于将糖胺聚糖(GAG)结合肽与剂缀合的说明性方法
在此实施例中，将剂与糖胺聚糖(GAG)结合肽缀合以形成本公开的说明性化合物。
如图10A所示，使用马来酰亚胺反应将剂与GAG结合肽缀合，从而形成本公开的化合物。可使用本领域已知的其他缀合反应，例如琥珀酰亚胺酯反应或酶促反应。在图10A中，GAG结合肽(在图10A中示出为“GAG-pep”)包含荧光部分；在本公开的某些实施方案中，荧光部分不包含于化合物中。
为了进一步证明本公开的化合物将其货物负载至血小板中的能力(如以上实施例中所述)，在此，产生了包含GAG结合肽和治疗性抗体(DC101，VEGFR2抑制剂)的说明性化合物。使用类似的方法，可使用除抗体以外的剂来产生本公开的化合物。作为实例，剂可以是化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。
测定了(包含作为剂的抗体)并且还包含荧光部分的说明性化合物被负载至血小板的α颗粒中的能力。
制备了四种化合物：作为阴性对照的Alexa647标记的DC101(在图10B中标识为A-DC101)、包含SEQ ID NO:14的无电荷配体(CFL)和DC101抗体的Alexa647标记的化合物(在图10B中标识为A-CLF-DC101)、包含SEQ ID NO:1的GAG结合肽和DC101抗体的Alexa647标记的化合物(在图10B中标识为A-PAL1-DC101)以及包含SEQ ID NO:2的GAG结合肽和DC101抗体的Alexa647标记的化合物(在图10B中标识为A-PAL2-DC101)。
将血小板与每种化合物在37℃下共孵育1小时。然后将血小板以800g离心10分钟，固定在2％多聚甲醛中，然后沉降到玻璃盖玻片上。透化后，针对血小板中的PF4进行免疫荧光染色，并用Alexa568-第二抗体进一步染色。通过配备有60x油物镜的Nikon-A1激光扫描显微镜收集这些图像。
在图10B的代表性图像中，PF4染色显示为红色(左柱)，并且Alexa647信号显示为紫色(中间柱)。将图像仅针对显示的亮度和对比度进行了调整。每个实验采集n>5个图像，并根据PF4强度选择感兴趣区域(ROI)。
合并后的图像(右柱)仅在Alexa647与GAG结合肽缔合时显示α颗粒标志物PF4和Alexa647信号的共定位，但当Alexa647与CFL缔合或仅与DC101抗体缔合时则不。不幸的是，对于与A-PAL2-DC101化合物共孵育的血小板，PF4免疫染色反应失败。因此，根据此组的Alexa647强度选择ROI。
使用ImageJ测量每个ROI的Alexa647强度，并使用Prism 8在盒须图中绘制。如图10C所示，本公开的两种说明性化合物负载至血小板的α颗粒中，而包含无电荷配体的化合物或包含抗体(没有GAG结合肽)的化合物不负载至血小板中，更不用说负载至血小板的α颗粒中。
这些数据证明包含GAG结合肽和剂的本公开的化合物负载至血小板的α颗粒中。
实施例7：疾病相关的蛋白质逆着浓度梯度被主动摄入到血小板α颗粒中
在本实施例中，分析了血小板对蛋白质的螯合，发现疾病相关的蛋白质逆着浓度梯度被主动地摄入到血小板α颗粒中，而与肿瘤无关的蛋白质(例如白蛋白)则不能如此。
血小板在血栓形成、伤口愈合和动脉粥样硬化中的作用已得到充分证实，但血小板在肿瘤生长和转移中的作用尚不清楚。追溯到20世纪60年代的出版物表明，血小板在肿瘤中聚集，支持肿瘤和内皮细胞生长，增强肿瘤转移，并且螯合癌症特异性蛋白质。
在人脂肪肉瘤小鼠模型中使用表面增强激光解吸/电离-飞行时间质谱(SELDI-ToF MS)来评估血小板和血浆蛋白谱。发现来自荷有非血管生成性(休眠)和血管生成性(快速生长)人肿瘤异种移植物的小鼠的血小板具有比正常假手术小鼠高得多的肿瘤特异性蛋白(即VEGF、bFGF、PDGF)水平(参见，图11)。
图11是显示bFGF、VEGF、PDGF和内皮抑素的血小板水平恰好在肿瘤逃离休眠之前发生变化的图，其中平衡朝向肿瘤生长刺激剂。使用表面增强激光解吸/电离(SELDI)飞行时间(ToF)质谱(MS)分析来自荷有休眠(蓝色，中间柱)或血管生成性(红色，右柱)人脂肪肉瘤异种移植物的小鼠的血小板。将荷瘤小鼠的平均MS峰值强度与健康假手术小鼠(黑色，左柱)的血小板的平均MS峰值强度进行比较。显而易见，休眠肿瘤和血管生成性肿瘤的癌症相关bFGF、VEGF和PDGF显著升高，但癌症抑制剂内皮抑素随着癌症进展而减少。另一方面，逃离休眠(血管生成性生长，红色)与抑制剂(内皮抑素)的减少相关联。
此外，还发现血小板主动螯合选定的癌症特异性蛋白质，而诸如白蛋白的非特异性蛋白质则没有被螯合。(见图12)
图12是显示血小板主动螯合癌症特异性蛋白质，并且不主动螯合非特异性蛋白质如白蛋白的MS表达图。使用SELDI ToF MS分析来自荷有人脂肪肉瘤的休眠异种移植物的小鼠(标记为蓝色，中间行)和荷有人脂肪肉瘤的血管生成性异种移植物(红色，底部行)的小鼠的血小板。如图所示，在左侧图中，血管内皮生长因子(VEGF)被螯合在荷瘤小鼠的血小板中，但在正常、健康的小鼠血小板/血浆中则不是如此(标记为灰色，对照，顶行)。相比之下，右侧图表明非特异性蛋白质(如白蛋白)未被螯合。
接下来，发现健康人个体的血小板主要含有血管生成抑制剂。获取来自50名(年龄26至89岁，中位年龄55±13岁)健康人受试者(29名女性和21名男性)的血小板，并使用商业ELISA测定(R&D Systems,MN,USA)针对特定蛋白质对该血小板进行分析。VEGF(215倍)、PF-4(516倍)、PDGF(914倍)、TSP-1(813倍)、bFGF(17倍)和内皮抑素(0.7倍)与血浆相比显著升高，但更重要的是，刺激剂和抑制剂之间存在平衡。(参见图13，其是显示血小板含有血管生成的刺激剂(VEGF、bFGF、PDGF)和抑制剂(PF4、内皮抑素)的表格)。这种平衡是高度动态的，并且在癌症进展的早期发生变化。例如，患有结直肠癌的人受试者在初次切除时的血小板(n＝35)(其是一种多变量逻辑回归模型)证实PDGF(P＝0.024)、PF4(P<0.0001)和VEGF(P＝0.012)是CRC15的独立预测因子。正常人受试者的血小板显示出占优势的血管生成抑制剂，而癌症患者的血小板则含有占优势的血管生成刺激剂。
发现血小板螯合的刺激剂和抑制剂的平衡对人受试者的生理变化敏感。与癌症有关的蛋白质的血小板螯合可以表明生活方式的改变与更好的结局相关联。在基线时(红色组没有生活方式改变，蓝色组有生活方式改变)和干预6个月后(生活方式改变，如锻炼、健康饮食和规律睡眠)，对局限性前列腺癌患者的血小板螯合的蛋白质进行了表征。
图14示出了在干预后6个月时对接受积极的生活方式干预的患有局限性前列腺癌的受试者以及进行观察等待而不改变生活方式的那些受试者的血小板的SELDI-ToF分析。在基线时，血小板蛋白谱没有差异。接受生活方式干预的受试者(蓝色)显示出诸如VEGF的癌症生长刺激剂的下降(峰值在47kD和29kD)和诸如PF4和CTAPIIII的癌症生长抑制剂的增加(峰值在7.4kD和9.3kD)。生活方式干预组中存在明显的抑制剂上调和刺激剂减少。相比之下，未改变生活方式的患者在6个月时显示出相反的趋势。
实施例8：蛋白质是否被螯合在血小板中的主要决定因素是蛋白质与糖胺聚糖结合的能力
在本实施例中，测定了蛋白质被螯合在血小板中的能力。
在正常生理条件下，血小板表达非常高水平的切割糖胺聚糖(GAG)的酶。例如，内切葡萄糖醛酸酶优先切割硫酸乙酰肝素(HS)和肝素多糖，肝素多糖是乙酰肝素酶，在正常组织中以非常低的水平表达，但在诸如损伤、癌症或炎症的病理状况下变得过度表达。研究最充分的血小板蛋白——血小板因子4(PF4)储存在与丝甘蛋白聚糖的糖胺聚糖(GAG)链结合的血小板α颗粒中。将血小板丝甘蛋白聚糖用PF4所结合至的硫酸软骨素/皮肤素修饰。更重要的是，研究已经表明PF4对特定GAG亚型的亲和力可调节肿瘤相关血管生成的局部调控。由于PF4对内皮细胞来源的串珠蛋白聚糖硫酸乙酰肝素链的亲和力高于对血小板来源的丝甘蛋白聚糖GAG链的亲和力，因此PF4将与内皮细胞GAG结合并且阻止血管生成刺激剂(如FGF2)的结合。先前表明生长因子对GAG的亲和力决定了伤口愈合或肿瘤生长期间细胞间的相互作用。
图15A和图15B是显示对各受体的抑制不会抑制血小板螯合，但苏尔芬对肝素结合的抑制导致对血小板α颗粒的蛋白质螯合的显著抑制的图。图示出FGF、PF4、VEGF和TPO的FACS分析的图15A显示经透化的血小板(黑色，每对的左柱)和暴露于相应受体抑制剂的血小板(灰色，每对的右柱)中的血小板生长因子摄取是相同的。相比之下，如图15B所示，用非特异性糖胺聚糖抑制剂苏尔芬(蓝色，每对的右柱)对富含血小板的血浆的预处理显著抑制了除血小板生成素外的所有生长因子被血小板的摄取，血小板生成素是唯一一种被测试的不结合硫酸乙酰肝素的生长因子。(Inh＝添加的抑制剂，PF4受体，趋化因子受体CXCR3的剪接变体，称为CXCR3B)。
显然，蛋白质是否被螯合在血小板中的主要决定因素是蛋白质与糖胺聚糖(如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、丝甘蛋白聚糖或串珠蛋白聚糖)结合的能力。
由于生长因子和血管生成调控蛋白可以被与GAG结合的血小板α颗粒转运，而无需受体激活或降解，因此开发了新型血小板锚定配体(PAL)。在本公开的其他地方公开了多种PAL。PAL1例如具有序列ERRIWFPYRRF(SEQ ID NO:1)；它已被证明可以与硫酸软骨素(CS)结合，而硫酸软骨素是血小板α颗粒中的主要GAG。
实施例9：血小板具有不同的α颗粒类型，它们以时间和空间调控的方式释放其内容物
在本实施例中，描述了对不同的α颗粒区室的表征。
同时负载有VEGF(血管生成刺激剂)和内皮抑素(血管生成抑制剂)的血小板将占据单独的α颗粒。使用免疫荧光显微术，使血管生成抑制剂和刺激剂在血小板和巨核细胞中的定位可视化。如图16所示，双重免疫荧光显微术揭示血管生成抑制剂内皮抑素(红色，左图和叠加图)和血管生成刺激剂VEGF(绿色，中图和叠加图)定位于单独的α颗粒(如叠加图，右侧图中所示)。
进一步的实验鉴定出这些单独的颗粒与P-选择素相关联(早期由高亲和力凝血酶受体PAR1释放)或与冯维勒布兰德因子(VWF)相关联(由低亲和力凝血酶受体PAR4释放)。图17是显示血管生成刺激剂与P-选择素定位在一起的免疫荧光图像。在确定VEGF和内皮抑素位于单独的细胞器中后，对α颗粒进行了亚型分类。使用识别特定血小板颗粒(如抗P选择素和抗冯维勒布兰德因子)的抗体标记α颗粒，并且使用抗血清素抗体标记致密颗粒。使用针对VEGF的抗体(绿色，左图)和针对α颗粒标志物P-选择素的抗体(红色，中图)的双重免疫荧光显微术证实VEGF定位于P-选择素α颗粒(右图，合并)。
相比之下，内皮抑素并不与P-选择素α颗粒共定位，而是与冯维勒布兰德因子(vWF)α颗粒共定位。图18是显示内皮抑素位于单独且不同的α颗粒区室中，并且与vWF(上行)而不是与P-选择素(下行)共定位的免疫荧光图像。使用针对冯维勒布兰德因子(vWF)(α颗粒中的一种确立已久的蛋白质)的抗体进行的双重免疫荧光染色表明内皮抑素也被包含在α颗粒中，但它不与P-选择素共定位，这证实了它位于明显不同的α颗粒区室中。
两种α颗粒类型的作用可以在伤口愈合的背景下理解。在伤口愈合中，受损伤后立即需要促炎细胞因子和血管生成刺激生长因子。然而，随着组织愈合，会释放更多的血管生成抑制剂。图19包括总结伤口愈合中蛋白质的顺序释放以及蛋白质酶激活受体1(PAR1)和PAR4的局部浓度梯度的示意图。如图所示，紧接在损伤后，用于血管萌芽的初始瞬时信号被VEGF诱导，随后是用于伸长和管形成(由于bFGF)、通过周细胞募集稳定血管(由于PDGF)的初始瞬时信号被诱导，最后是用于血管修剪(由于内皮抑素、肿瘤抑素和其他胶原蛋白和纤溶酶切割产物)的初始瞬时信号被诱导。正常伤口愈合过程大约需要7-10天。值得注意的是，这个过程通过时间和空间受控的顺序蛋白质释放再现了精心策划的血管形成的胚胎序列。
不希望受理论束缚，血小板经由不同的α颗粒类型以时间和空间受控的顺序释放其内容物的能力可以在治疗领域中得到利用，其中第一药物被负载至血小板中的具有早期释放谱的第一α颗粒类型中，并且第二药物被负载至血小板中的具有较晚释放谱的第二α颗粒类型中。为此，必须了解不同的α颗粒类型的特征，并且必须建立相对于另一种α颗粒类型选择性地对一种α颗粒类型进行负载的手段。
显然，血小板和内皮细胞能够内化生长因子(例如VEGF、bFGF和PDGF)，因为生长因子能够结合糖胺聚糖(GAG)，如硫酸肝素(HS)或硫酸软骨素(CS)。
图20是显示鼠血管内皮瘤细胞(EOMA)表面上的糖胺聚糖(GAG)对生长因子的螯合的图。在此，在单层组织培养条件下生长的细胞，无论是在标准培养基条件下还是在使用肿瘤条件培养基的替代肿瘤环境中，都将bFGF螯合到血小板和内皮细胞上的GAG上，从而将它从上清液中去除。肝素和肝素酶进一步增强该现象。然而，在肿瘤微环境(其在这里是通过富集有凝血酶的肿瘤条件培养基(最右侧的数据柱)模拟)中，bFGF及其衍生物从GAG释放到上清液中，并且通过扩散而被释放到肿瘤微环境中。值代表5个孔的平均值和SE。这些数据证实螯合是肝素依赖性的并且在凝血酶存在时增加。
生长因子从由血小板凝块形成的临时基质中释放的证实得到了图21的支持。
图21是示出鼠血管内皮瘤细胞(EOMA)响应于从血小板形成的临时基质释放的生长因子的增殖的图。使用标准培养基或肿瘤条件培养基在单层组织培养中生长的EOMA细胞通过将bFGF和其他硫酸肝素(HS)结合生长因子锚定到EOMA细胞膜和血小板临时基质上的GAG来螯合它们。肝素酶对生长因子的释放增加了内皮细胞的增殖潜力，例如在肿瘤微环境中的增殖潜力。值代表5个孔的平均值和SE。
血小板因子4(PF4)具有对自然界中存在的HS的最高亲和力之一，并且可以占据GAG位点并取代其他HS结合生长因子。因此，PF4充当肿瘤生长的抑制剂。图22是显示血小板形成可在肿瘤激活时与内皮细胞交换蛋白质的临时基质的免疫荧光图像。使小鼠血管内皮瘤细胞(EOMA)在标准培养基(DMEM+10％ FBS)中生长，并且添加正常血小板。在正常条件(顶行)下，随着血小板沿着细胞膜聚集，PF4(血小板α颗粒的主要内容物；绿色左柱)在EOMA细胞的外围(即沿着EOMA细胞膜)被观察到。硫酸乙酰肝素(红色，左数第二个柱)分布于整个内皮细胞的膜表面，并且DAPI(蓝色，右数第二个柱)是核复染物。在没有肿瘤条件培养基、凝血酶或其他内皮细胞激活剂的情况下，血小板不会结块和聚集。大部分PF4保留在血小板中，并且不与内皮细胞GAG共定位(参见顶行最右侧图)。然而，在存在肿瘤条件培养基(第二行)的情况下孵育EOMA细胞和血小板后，HS的表达增加，并且形成厚的血小板临时基质，如由PF4在富含HS的表面EOMA细胞上的聚集所证明的；EOMA细胞使用这种血小板临时基质进行生长。血小板PF4在细胞内的聚集以及随后对内皮细胞生长的刺激受到软骨素酶和肝素酶(heparitinase)(第三行)以及肝素(第四行)的抑制。另一方面，血小板PF4在富含HS的表面EOMA细胞上的聚集由凝血酶再现(底行)。
可以利用临时基质内α颗粒的积累将不同的药物负载至α颗粒的不同隔室中；这些药物被捕获在肿瘤部位处的血小板形成的临时基质中，并且以时间和空间受控的方式局部被释放，例如被肿瘤部位处存在的凝血酶及其片段释放。
实施例10：PAL缀合物向血小板中的负载
在本实施例中，将各种缀合物(其具有单独荧光标记物或具有荧光标记物和说明性活性剂，此处为lucitanib)负载至血小板中。
如图23A所示，Fam-PAL1、Fam-PAL2、Fam-PAL1-Lucitanib和Fam-PAL2-Lucitanib中的每一者均被负载至血小板中并且没有明显损害负载的血小板。与DMSO对照相比，Fam-PAL1、Fam-PAL2、Fam-PAL1-Lucitanib和Fam-PAL2-Lucitanib被内化到血小板中(绿色通道)，同时保持血小板形态完整并且处于静息的、功能齐全的状态(紫色)，而不是被负载过程激活，这种激活将使血小板成为促凝剂。
图23B显示Fam-PAL1或Fam-PAL2(顶部)以及Fam-PAL1-Lucit anib和Fam-PAL2-Lucitanib(底部)向血小板中的剂量响应性负载。如图所示，缀合物的剂量范围为0.004mM至0.22mM。
在本实施例中，将PBS中的新鲜血小板悬浮液与不同浓度的所指示化合物在37℃下共孵育1小时，并然后通过在800g下旋转10分钟来分离。然后将负载的血小板在2％多聚甲醛中室温下固定30分钟，在含0.2％ Triton-X 1％ BSA的PBS中室温透化30分钟，并在含1％ BSA的PBS中室温封闭30分钟，其中在每个步骤之间进行3次PBS洗涤。最后，将血小板接种到聚赖氨酸包被的玻璃底384孔板上，并用兔抗人微管蛋白和A647驴抗兔进行免疫染色。使用配备有60倍油浸物镜的Nikon-A1共焦显微镜采集图像，将该图像用ImageJ进行处理，并用CellProfiler进行分析。图23B的图是使用R对每组分析的>1,500个血小板绘制的。
实施例11：不同的α颗粒类型可以被选择性地负载
在本实施例中，特定血小板锚定序列(PAL)的差异和亲和力用于特异性地负载α颗粒的不同亚区室。
图24是免疫荧光图像，其显示PAL1和PAL2具有不同的亚细胞定位，即对不同的α颗粒具有偏好。使用VEGF作为一个α颗粒集合(绿色)的标志物并且使用PF4作为第二α颗粒集合(红色)的标志物，在Nikon-A1共聚焦显微镜上记录Alexa647标记的PAL1和PAL2(蓝色)的亚细胞定位。PAL1和PAL2被负载至α颗粒的这两个子集中。然而，PAL1更多地共定位于VEGF子集(由VEGF/PAL合并柱中的青色指示)，而PAL2更多地共定位于PF4通道(由PF4/PAL合并柱中的紫色表示)。这些数据与图4B(其显示PAL1比PAL2更紧密地结合CSA)所示的数据及图4C(其显示PAL2比PAL1更紧密地结合HS)所示的数据一起揭示了这两种α颗粒类型的特征在于不同的GAG类型占优势。
不希望受理论束缚，似乎PAL-缀合物首先在血小板内内化，并且然后基于特定的PAL序列定位到优选的颗粒类型中。
图24的图像是使用配备有60倍油浸物镜的Nikon-A1共焦显微镜采集的。PAL1和PAL2与α颗粒的这两个子集部分共定位，如合并图像中的青色和紫色像素所指示。为了量化PAL1和PAL2之间的差异，对负载的血小板进行了分级。
为了进一步理解导致Fam-PAL1(图25A和图25B中的紫色)和Fam-PAL2(图25A和图25B中的浅蓝色)之间的不同亚细胞定位的机制，将这两种肽单独地对接至CSA(图25A中的绿色)或HS(图25B中的黄色)结构上。虚线指示对于相互作用来说关键的分子间接触。总体而言，PAL1和PAL2都使用它们的精氨酸与GAG进行接触。当与CSA结合时，PAL1和PAL2均保持结合在该分子的一侧，并且与该分子形成盐桥和氢键，这与它们的与CSA的相当的结合亲和力一致。如图25B中所示，PAL2位于HS的侧面，而PAL1则沿着HS的凹槽；这些不同的缔合可能导致这两个PAL对HS的不同亲和力。这些结构模型与由包括等温量热法、FPLC和显微术在内的台式实验得出的观察结果一致。鉴于实验数据，这些模型还揭示了利用PAL1和PAL2的不同特征将多种治疗试剂负载至血小板中的能力。
α颗粒类型的特征在于不同的GAG类型占优势的这一知识可被用于选择性地将药物负载至特定类型的α颗粒中。
图26A和图26B显示当PAL1(SEQ ID NO:1)与小分子缀合时，PAL1可以将相应的分子引导到血小板α颗粒中。将血小板与Alexa647标记的Lucitanib一起或与Alexa647-PAL1缀合的Lucitaib一起在37℃共孵育1小时。然后将血小板以800g离心10分钟，固定在2％多聚甲醛中，并且沉降到玻璃盖玻片上。透化后，针对血小板中的PF4进行免疫荧光染色，并用Alexa568-第二抗体进一步染色。通过配备有60x油物镜的Nikon-A1激光扫描显微镜收集这些图像。图26A包括代表性图像，其中PF4的免疫荧光显示为红色并且Alexa647的免疫荧光显示为蓝色。合并的PF4/Alexa647通道显示出PF4和Alexa647标记的PAL1缀合的Lucitanib的共定位。图26B是显示使用ImageJ分析每组中>800个ROI的Alexa647通道的平均强度的图，并且误差条是平均值的标准偏差。
这些数据表明PAL1-药物产品可以负载至α颗粒中，特别是负载至CS、P-选择素型颗粒中。
图27A至图27C展示了用于分级分离血小板颗粒的方法并且表明可以用蛋白质标志物来区分不同的颗粒。图27A是说明在分级分离血小板颗粒过程中的步骤的流程图。最后一步是具有图27B中所示的分离的血小板颗粒的分层蔗糖梯度，该图的顶部图像是示出量化梯度的卡通图，底部图像示出单独地负载至图27C中描绘的凝胶上的不同梯度。图27C是使用DMSO作为对照负载的血小板的颗粒级分的蛋白质印迹。PF4和VEGF是α颗粒的标志物，并且MRP4和LAMP2是包括溶酶体和致密颗粒在内的其他储存颗粒的标志物。结果表明，这些颗粒中的大多数颗粒富集在级分B、C和D中。
为了进一步研究PAL1和PAL2以及它们的缀合物的亚细胞定位，将来自负载有不同化合物的血小板的颗粒级分固定并且接种在聚赖氨酸包被的玻璃底384孔板中。如图27D所示，分两个集合进行免疫染色：一个集合使用PF4(黄色)和MRP4(红色)，另一个集合使用PF4(黄色)和VEGF(红色)。使用配备有60倍水浸物镜的高通量共焦显微镜Phenix采集图像。该元图示出来自如所指示的不同孔和不同通道的代表性图像。如图27E所示，对在从经DMSO处理的血小板收集的所有级分上采集的图像(示于图27D中)的颗粒分析证实了蛋白质印迹的观察结果，即标志物PF4、VEGF和MRP4富集在级分B、C和D中。另外，如图27F所示，图像绿色通道的颗粒分析(其展示了在从负载有不同的化合物(如图所示)的血小板收集的所有级分上获取的Fam-PAL1和Fam-PAL1-Lucitanib缀合物或Fam-PAL2Fam-PAL2-Lucitanib缀合物的定位)证明Fam-PAL1和Fam-PAL2以及它们的缀合物还富集在组分B、C和D中。最后，为了量化Fam-PAL1或Fam-PLA2以及它们的缀合物的亚细胞定位，使用CellProfiler对级分B、C和D的所有图像进行皮尔逊相关分析(PCA)。参见图27G。简而言之，对于每个比较对，将来自两个通道的图像合并，并且分割出单个颗粒。然后对所选的所关注区域(ROI)进行PCA分析。使用R绘制箱线图，并且每组含有>5,000个ROI。正如之前所观察到的，级分C给出了最多的定位信息。小面箱线图表明Fam-PAL1和Fam-PAL2以及它们的缀合物主要靶向α颗粒的富集了PF4的子集。Fam-PAL2及其缀合物还靶向富集有VEGF或MRP4的其他颗粒。值得注意的是，Fam-PAL2可能已使Fam的激发和发射发生移位；因此，为了避免从绿色通道到红色通道的潜在渗漏，采用无抗PF4条件(白框)作为阴性对照。
这些结果表明使用PAL1和PAL2同时将多种试剂负载至血小板中的潜力。
实施例12：用于制造负载有两种化合物(其中每种化合物被负载至不同的α颗粒类型中)的分离的血小板的说明性方法
在本实施例中，分离的血小板负载有两种本公开的化合物，其中每种化合物被负载至不同的α颗粒类型中。
获得分离的血小板。所述血小板可以是合成血小板、同种异体血小板、自体血小板或经修饰的异源血小板。在实施方案中，所述血小板从富含血小板的血浆获得。
使所述血小板在体外或离体与本公开的第一化合物接触。所述第一化合物包含第一剂和第一多肽。所述第一多肽包含PAL1(SEQ ID NO:1)糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述GAG结合肽可结合血小板的α颗粒中的GAG。PAL1至少优先结合至第一类型的α颗粒(例如P-选择素类型的α颗粒)上的硫酸软骨素(CS)。
还使所述血小板在体外或离体与本公开的第二化合物接触。所述第二化合物包含第二剂和第二多肽。所述第二多肽包含PAL2(SEQ ID NO:2)糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述GAG结合肽可结合血小板的α颗粒中的GAG。PAL2至少优先结合至第二类型的α颗粒(例如冯维勒布兰德因子(VWF)类型的α颗粒)上的硫酸肝素(HS)。
在实施方案中，所述第一化合物和所述第二化合物依序负载。在替代实施方案中，所述第一化合物和所述第二化合物同时负载。
在合适的温度、培养基组成(包括盐浓度、pH、营养物质)和时间长度下继续接触，直到化合物被血小板的相应α颗粒类型内化。如此，获得了负载的血小板。通常，温度是血小板所获自的或血小板待被施用于的体温，例如37℃。类似地，组合物的pH接近于血小板所获自的或血小板待被施用于的血液/血浆的pH，例如约7.4的pH。
本公开中列出的或本领域中已知的任何剂都可用于此实施例中。所述剂可以是抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白质酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。
在一些实施方案中，所述第一剂和所述第二剂可以独立地是EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)、VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗)、PDL1抑制剂(例如，派姆单抗)、FN1抑制剂(例如，奥克纤溶酶)、多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)、FGFR2拮抗剂(例如，沙利度胺)、凝血酶及其类似物、CSF3R激动剂(例如，非格司亭)、PSMB5抑制剂(例如，硼替佐米)、烟曲霉素或ALK/ROS1/NTRK抑制剂(例如，克唑替尼)中的一种。
所述第一剂和所述第二剂可以相同或可以不同。
例如，所述第一剂和第二剂可以是：VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗)和PDL1抑制剂(例如，派姆单抗)；或EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)和多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)；或烟曲霉素和多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)。
优选地，分离的血小板包含1至1000个拷贝的第一化合物并且包含1至1000个拷贝的第二化合物。
如此制造的负载的血小板可与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合以产生药物组合物。
在一些实施方案中，可组合包含第三多肽和第三剂的第三化合物，所述第三剂是例如EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)和多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)以及ALK/ROS1/NTRK抑制剂(例如，克唑替尼)。
另外，可以通过将各自包含不同的第一和第二化合物的多个血小板与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合来产生药物组合物。可使用上述任何第一剂和/或第二剂及其任何组合。
实施例13：通过向受试者施用负载有两种或更多种化合物(其中每种化合物被负载至不同的α颗粒类型中)的分离的血小板来治疗疾病或病症的说明性方法
在本实施例中，将负载有两种或更多种本公开的化合物(其中每种化合物被负载至不同的α颗粒类型中)的分离的血小板施用给有需要的受试者，例如患有疾病或病症的受试者。
在此，向有需要的受试者施用(例如，通过输注或注射)治疗有效量的一种或多种药物组合物，每种药物组合物均包含负载有两种或更多种本公开化合物(其中每种化合物被负载至不同的α颗粒类型中)的血小板。
组合物中的血小板至少包含本公开的第一化合物和第二化合物。所述第一化合物包含第一剂和第一多肽。所述第一多肽包含PAL1(SEQ ID NO:1)糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述GAG结合肽可结合血小板的α颗粒中的GAG。PAL1至少优先结合至第一类型的α颗粒(例如P-选择素类型的α颗粒)上的硫酸软骨素(CS)。所述第二化合物包含第二剂和第二多肽。所述第二多肽包含PAL2(SEQ ID NO:2)糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述GAG结合肽可结合血小板的α颗粒中的GAG。PAL2至少优先结合至第二类型的α颗粒(例如冯维勒布兰德因子(VWF)类型的α颗粒)上的硫酸肝素(HS)。
在一些实施方案中，组合物中的血小板包含第三化合物。第三化合物包含第三剂和第三多肽，其中第三多肽包含第三糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述第三GAG结合肽能够结合血小板的第三α颗粒类型中的GAG。所述第三GAG结合肽优先结合丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
本公开中列出的或本领域中已知的任何剂都可用于此实施例中。所述第一、第二或第三剂可以独立地是抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白质酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。
在一些实施方案中，所述两种化合物可独立地包含选自以下的剂：EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)、VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗)、PDL1抑制剂(例如，派姆单抗)、FN1抑制剂(例如，奥克纤溶酶)、多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)、FGFR2拮抗剂(例如，沙利度胺)、凝血酶及其类似物、CSF3R激动剂(例如，非格司亭)、PSMB5抑制剂(例如，硼替佐米)、烟曲霉素和ALK/ROS1/NTRK抑制剂(例如，克唑替尼)。在实施例中，对于第三化合物，第三剂可以再次选自该列表。
在实施方案中，当使用至少三种化合物时，第一剂、第二剂和第三剂可以是EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)和多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)，以及ALK/ROS1/NTRK抑制剂(例如，克唑替尼)；这可用于治疗非小细胞肺癌。
血小板可负载有本公开的组合化合物。作为实例，第一剂和第二剂可以是VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗)和PDL1抑制剂(例如，派姆单抗)；这可用于治疗胰腺癌。此外，第一剂和第二剂可以是EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)和多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)；这可用于治疗肺癌。第一剂和第二剂可以是多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)和烟曲霉素；这可用于治疗胰腺癌、肺癌或结肠癌。
可进一步向受试者施用包含以下中的一种或多种的第二药物组合物：乙酰肝素酶、凝血酶及其片段肽、蛋白酶激活受体1(PAR1)激动剂或拮抗剂肽、蛋白酶激活受体4(PAR4)激动剂或拮抗剂肽、纤溶酶及其片段、和/或金属蛋白质酶、过氧化物酶和/或磷酸水解酶。第二药物组合物促进化合物从血小板中释放。可在施用药物组合物之后施用第二药物组合物，例如在施用第二药物组合物之前施用至少两次。
替代地，可向受试者施用各自包含以下中的一种或多种的第二药物组合物和/或第三组合物：乙酰肝素酶、凝血酶及其片段肽、蛋白酶激活受体1(PAR1)激动剂或拮抗剂肽、蛋白酶激活受体4(PAR4)激动剂或拮抗剂肽、纤溶酶及其片段，和/或金属蛋白质酶、过氧化物酶和/或磷酸水解酶。第二药物组合物促进第一化合物从第一类型的α颗粒中释放，并且第三药物组合物促进第二化合物从第二类型的α颗粒中释放。可在施用药物组合物之后施用第二和第三药物组合物，例如在施用第二药物组合物之前施用至少两次。所述第二组合物可以在施用第三药物组合物之后施用，或反之亦然。
可向受试者施用另外的治疗剂联合包含负载的血小板的药物组合物。例如，可向受试者施用负载有VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗)的血小板，并且还可施用瑞德西韦；这可用于治疗可能与COVID相关的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。可向受试者施用负载有多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)和烟曲霉素中的一种或两种的血小板，并且还施用低剂量化学疗法；这可用于治疗胰腺癌、肺癌或结肠癌。可向受试者施用负载有EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)和多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)中的一种或两种的血小板并且还施用低剂量化学疗法；这可用于治疗肺癌。可向受试者施用负载有EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)、多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)和ALK/ROS1/NTRK抑制剂(例如，克唑替尼)中的一种或两种或全部三种的血小板，并且还施用低剂量化学疗法；这可用于治疗非小细胞肺癌。
有需要的受试者可能患有选自癌症或损伤的疾病或病症。炎症可能是疾病或病症的症状。疾病或病症可以是植入物、移植物、支架或假体的副作用。疾病或病症可由缺陷型基因引起。
实施例14：通过向受试者施用两种或更多种本公开的化合物来治疗疾病或病症的说明性方法
在本实施例中，将两种或更多种本公开的化合物施用给有需要的受试者，例如患有疾病或病症的受试者。
在此，向有需要的受试者施用(例如，通过输注或注射)治疗有效量的包含两种或更多种本公开的化合物的药物组合物。在这种方法中，将两种或更多种化合物在体内负载至血小板中。
所述第一化合物包含第一剂和第一多肽。所述第一多肽包含PAL1(SEQ ID NO:1)糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述GAG结合肽可结合血小板的α颗粒中的GAG。PAL1至少优先结合至第一类型的α颗粒(例如P-选择素类型的α颗粒)上的硫酸软骨素(CS)。所述第二化合物包含第二剂和第二多肽。所述第二多肽包含PAL2(SEQ ID NO:2)糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述GAG结合肽可结合血小板的α颗粒中的GAG。PAL2至少优先结合至第二类型的α颗粒(例如冯维勒布兰德因子(VWF)类型的α颗粒)上的硫酸肝素(HS)。
在一些实施方案中，将第三化合物负载至血小板中。第三化合物包含第三剂和第三多肽，其中第三多肽包含第三糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述第三GAG结合肽能够结合血小板的第三α颗粒类型中的GAG。所述第三GAG结合肽优先结合丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
本公开中列出的或本领域中已知的任何剂都可用于此实施例中。所述第一、第二或第三剂可以独立地是抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白质酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。
在一些实施方案中，所述两种化合物可独立地包含选自以下的剂：EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)、VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗)、PDL1抑制剂(例如，派姆单抗)、FN1抑制剂(例如，奥克纤溶酶)、多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)、FGFR2拮抗剂(例如，沙利度胺)、凝血酶及其类似物、CSF3R激动剂(例如，非格司亭)、PSMB5抑制剂(例如，硼替佐米)、烟曲霉素或ALK/ROS1/NTRK抑制剂(例如，克唑替尼)。
可向受试者施用多于两种化合物；另外的化合物可具有选自以上列表或本领域已知的任何剂的剂，例如抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白质酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。
在实施方案中，当使用至少三种化合物时，第一剂、第二剂和第三剂可以是EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)和多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)，以及ALK/ROS1/NTRK抑制剂(例如，克唑替尼)；这可用于治疗非小细胞肺癌。
可进一步向受试者施用包含以下中的一种或多种的第二药物组合物：乙酰肝素酶、凝血酶及其片段肽、蛋白酶激活受体1(PAR1)激动剂或拮抗剂肽、蛋白酶激活受体4(PAR4)激动剂或拮抗剂肽、纤溶酶及其片段、和/或金属蛋白质酶、过氧化物酶和/或磷酸水解酶。第二药物组合物促进化合物从血小板中释放。可在施用药物组合物之后施用第二药物组合物，例如在施用第二药物组合物之前施用至少两次。
替代地，可向受试者施用各自包含以下中的一种或多种的第二药物组合物和/或第三组合物：乙酰肝素酶、凝血酶及其片段肽、蛋白酶激活受体1(PAR1)激动剂或拮抗剂肽、蛋白酶激活受体4(PAR4)激动剂或拮抗剂肽、纤溶酶及其片段，和/或金属蛋白质酶、过氧化物酶和/或磷酸水解酶。第二药物组合物促进第一化合物从第一类型的α颗粒中释放，并且第三药物组合物促进第二化合物从第二类型的α颗粒中释放。可在施用药物组合物之后施用第二和第三药物组合物，例如在施用第二药物组合物之前施用至少两次。所述第二组合物可以在施用第三药物组合物之后施用，或反之亦然。
可向受试者施用另外的治疗剂联合包含本公开化合物的药物组合物。另外的治疗剂可以是瑞德西韦和/或低剂量化学疗法。
有需要的受试者可能患有选自癌症或损伤的疾病或病症。炎症可能是疾病或病症的症状。疾病或病症可以是植入物、移植物、支架或假体的副作用。疾病或病症可由缺陷型基因引起。
序列表
<110> 希思特思医疗保健公司(CSTS Health Care Inc.)
<120> 用于递送多种蛋白质的血小板α颗粒
<130> 58533-702.601
<150> US 63/142,402
<151> 2021-01-27
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 1
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<212> PRT
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<223> 合成肽
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<223> 合成肽
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<223> 合成肽
<400> 14
Glu Gly Gly Ile Trp Phe Pro Tyr Gly Gly Phe
1 5 10

Claims (114)

1.一种组合物，其包含：
第一化合物，所述第一化合物包含第一剂和第一多肽，其中所述第一多肽包含第一糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述第一GAG结合肽能够结合血小板的第一α颗粒类型中的GAG；和
第二化合物，所述第二化合物包含第二剂和第二多肽，其中所述第二多肽包含第二糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述第二GAG结合肽能够结合血小板的第二α颗粒类型中的GAG。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述第一GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素(CS)，并且所述第二GAG结合肽优先结合至硫酸乙酰肝素(HS)。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述第一GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素A(CSA)，而不优先结合至硫酸乙酰肝素(HS)。
4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述第一α颗粒类型是P-选择素相关颗粒，并且所述第二α颗粒类型是冯维勒布兰德因子相关颗粒。
5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述第一α颗粒类型的内容物经由高亲和力凝血酶受体PAR1释放，并且所述第二α颗粒类型的内容物经由低亲和力凝血酶受体PAR4释放，任选地，α颗粒的内容物能够响应于与基质金属蛋白质酶(MMP)、过氧化物酶、磷酸水解酶、纤溶酶或纤溶酶衍生物如组织纤溶酶原激活剂(tPA)的接触而释放。
6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述第一α颗粒类型的内容物在比提供所述第二α颗粒类型的内容物的释放所需的凝血酶浓度更低的凝血酶浓度下释放。
7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述第一α颗粒类型的内容物在所述第二α颗粒类型的内容物释放之前释放。
8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽的长度各自介于约8个氨基酸与约14个氨基酸之间。
9.如权利要求1至权利要求8中任一项所述的组合物，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽中的一者或两者包含至少一个带电氨基酸。
10.如权利要求1至权利要求9中任一项所述的组合物，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽两者包含至少一个带电氨基酸。
11.如权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽中的一者或两者包含至少一个脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽两者都包含至少至少一个脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
13.如权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一者具有至少约70％同一性的氨基酸序列。
14.如权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列。
15.如权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一者具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
16.如权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一者包含在位置1、位置4、位置7或位置9处的带电荷氨基酸。
17.如权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一者包含在位置1、位置4、位置7和/或位置9处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
18.如权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含至少10个氨基酸。
19.如权利要求1至18中任一项所述的组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述第二GAG结合肽独立地包含11个氨基酸。
20.如权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地由11个氨基酸组成。
21.如权利要求1至20中任一项所述的组合物，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一者的氨基酸序列。
22.如权利要求1至20中任一项所述的组合物，其中所述第一GAG结合肽包含与SEQ IDNO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述第二GAG结合肽包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述第一GAG结合肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述第二GAG结合肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
24.如权利要求22或权利要求23所述的组合物，其中所述第一GAG结合肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成，并且所述第二GAG结合肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
25.如权利要求1至24中任一项所述的组合物，其中所述第一多肽由第一GAG结合肽组成并且所述第二多肽由第二GAG结合肽组成。
26.如权利要求1至25中任一项所述的组合物，其中所述第一多肽的N端直接或间接连接至所述第一剂并且/或者所述第二多肽的N端直接或间接连接至第二第一剂。
27.如权利要求1至26中任一项所述的组合物，其中所述第一多肽的C端直接或间接连接至所述第一剂并且/或者所述第二多肽的C端直接或间接连接至第二第一剂。
28.如权利要求1至27中任一项所述的组合物，其中所述第一剂经由第一接头间接连接至所述第一多肽并且/或者所述第二剂经由第二接头间接连接至所述第二多肽。
29.如权利要求28所述的组合物，其中所述第一接头和/或所述第二接头各自包含一个或多个原子。
30.如权利要求28或29所述的组合物，其中所述第一接头和/或所述第二接头各自包含重复单元的聚合物。
31.如权利要求28至30中任一项所述的组合物，其中所述第一接头和/或所述第二接头各自包含氨基酸链。
32.如权利要求1至31中任一项所述的组合物，其中所述第一剂直接连接至所述第一多肽并且/或者所述第二剂直接连接至所述第二多肽。
33.如权利要求1至31中任一项所述的组合物，其中所述第一剂直接连接至所述第一多肽或使用马来酰亚胺反应、琥珀酰亚胺酯反应、酶促反应或不影响蛋白质结构或活性的另外缀合系统间接地连接至所述第一多肽，并且/或者所述第二剂直接连接至所述第二多肽或使用马来酰亚胺反应、琥珀酰亚胺酯反应、酶促反应或不影响蛋白质结构或活性的另外缀合系统间接地连接至所述第二多肽。
34.如权利要求1至33中任一项所述的组合物，其中所述第一剂和/或所述第二剂独立地包含抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白质酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。
35.如权利要求34所述的组合物，其中所述第一剂和/或所述第二剂包含抗体或荧光部分。
36.如权利要求1至35中任一项所述的组合物，其中所述第一剂和/或所述第二剂对哺乳动物细胞有害并且/或者对受试者有毒，并且/或者所述第一剂和/或所述第二剂在直接施用到受试者的血流中时易于降解。
37.如权利要求1至36中任一项所述的组合物，其中所述第一化合物和/或所述第二化合物还包含荧光部分。
38.如权利要求1至37中任一项所述的组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述第二GAG结合肽还优先结合丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
39.如权利要求1至38中任一项所述的组合物，其还包含第三化合物，所述第三化合物包含第三剂和第三多肽，其中所述第三多肽包含能够结合血小板的第三α颗粒类型中的GAG的第三糖胺聚糖(GAG)结合肽；并且其中所述第三GAG结合肽优先结合丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
40.一种分离的血小板，其包含：
至少一个拷贝的第一化合物，所述第一化合物包含第一剂和第一多肽，其中所述第一多肽包含第一糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述第一GAG结合肽能够结合血小板的第一α颗粒类型中的GAG；和
至少一个拷贝的第二化合物，所述第二化合物包含第二剂和第二多肽，其中所述第二多肽包含第二糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述第二GAG结合肽能够结合血小板的第二α颗粒类型中的GAG。
41.如权利要求40所述的分离的血小板，其中所述血小板是合成的、同种异体的、自体的或经修饰的异源血小板。
42.如权利要求41所述的分离的血小板，其中所述血小板是自体血小板。
43.如权利要求41所述的分离的血小板，其中所述血小板是同种异体血小板。
44.如权利要求42或权利要求43所述的分离的血小板，其中所述血小板从富含血小板的血浆获得。
45.如权利要求40至44中任一项所述的分离的血小板，其中所述血小板包含1至1000个拷贝的所述第一化合物和1至1000个拷贝的所述第二化合物。
46.如权利要求45所述的分离的血小板，其中所述1至1000个拷贝的所述第一化合物被负载至血小板的第一α颗粒类型中，并且所述1至1000个拷贝的所述第二化合物被负载至所述血小板的第二α颗粒类型中。
47.如权利要求46所述的分离的血小板，其中至少一个拷贝的所述第一化合物被负载至血小板的第二α颗粒类型中，并且至少一个拷贝的所述第二化合物被负载至所述血小板的第一α颗粒类型中。
48.如权利要求40至47中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素(CS)，并且所述第二GAG结合肽优先结合至硫酸乙酰肝素(HS)。
49.如权利要求40至48中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素A(CSA)，而不优先结合至硫酸乙酰肝素(HS)。
50.如权利要求40至49中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一α颗粒类型是P-选择素相关颗粒，并且所述第二α颗粒类型是冯维勒布兰德因子相关颗粒。
51.如权利要求40至50中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一α颗粒类型的内容物经由高亲和力凝血酶受体PAR1释放，并且所述第二α颗粒类型的内容物经由低亲和力凝血酶受体PAR4释放，任选地，α颗粒的内容物能够响应于与基质金属蛋白质酶(MMP)、过氧化物酶、磷酸水解酶、纤溶酶或纤溶酶如组织纤溶酶原激活剂(tPA)的接触而释放。
52.如权利要求40至51中任一项所述的分离的血小板物，其中所述第一α颗粒类型的内容物在比提供所述第二α颗粒类型的内容物的释放所需的凝血酶浓度更低的凝血酶浓度下释放。
53.如权利要求40至52中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一α颗粒类型的内容物在所述第二α颗粒类型的内容物释放之前释放。
54.如权利要求40至53中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽的长度各自介于约8个氨基酸与约14个氨基酸之间。
55.如权利要求54所述的分离的血小板，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽中的一者或两者包含至少一个带电氨基酸。
56.如权利要求55所述的分离的血小板，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽两者都包含至少一个带电氨基酸。
57.如权利要求54至56中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽中的一者或两者包含至少一个脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
58.如权利要求57所述的分离的血小板，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽两者都包含至少至少一个脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
59.如权利要求54至58中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一者具有至少约70％同一性的氨基酸序列。
60.如权利要求54至59中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列。
61.如权利要求54至60中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一者具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
62.如权利要求54至61中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一者包含在位置1、位置4、位置7或位置9处的带电荷氨基酸。
63.如权利要求54至62中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一者包含在位置1、位置4、位置7和/或位置9处的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
64.如权利要求54至63中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含至少10个氨基酸。
65.如权利要求54至64中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地包含11个氨基酸。
66.如权利要求54至65中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一GAG结合肽和所述第二GAG结合肽独立地由11个氨基酸组成。
67.如权利要求54至66中任一项所述的分离的血小板，其中所述GAG结合肽由SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13中的一者的氨基酸序列组成。
68.如权利要求54至66中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1具有至少约90％同一的氨基酸序列，并且所述第二GAG结合肽包含与SEQ IDNO:2具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
69.如权利要求68所述的分离的血小板，其中所述第一GAG结合肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述第二GAG结合肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
70.如权利要求68或权利要求69所述的分离的血小板，其中所述第一GAG结合肽由SEQID NO:1的氨基酸序列组成，并且所述第二GAG结合肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
71.如权利要求40至70中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一多肽由第一GAG结合肽组成并且所述第二多肽由第二GAG结合肽组成。
72.如权利要求40至71中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一多肽的N端直接或间接连接至所述第一剂并且/或者所述第二多肽的N端直接或间接连接至第二第一剂。
73.如权利要求40至72中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一多肽的C端直接或间接连接至所述第一剂并且/或者所述第二多肽的C端直接或间接连接至第二第一剂。
74.如权利要求40至73中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一剂经由第一接头间接连接至所述第一多肽并且/或者其中所述第二剂经由第二接头间接连接至所述第二多肽。
75.如权利要求74所述的分离的血小板，其中所述第一接头和/或所述第二接头各自包含一个或多个原子。
76.如权利要求74或75所述的分离的血小板，其中所述第一接头和/或所述第二接头各自包含重复单元的聚合物。
77.如权利要求74至76中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一接头和/或所述第二接头各自包含氨基酸链。
78.如权利要求40至77中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一剂直接连接至所述第一多肽并且/或者所述第二剂直接连接至所述第二多肽。
79.如权利要求40至78中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一剂直接连接至所述第一多肽或使用马来酰亚胺反应、琥珀酰亚胺酯反应、酶促反应或不影响蛋白质结构或活性的另外缀合系统间接地连接至所述第一多肽，并且/或者所述第二剂直接连接至所述第二多肽或使用马来酰亚胺反应、琥珀酰亚胺酯反应、酶促反应或不影响蛋白质结构或活性的另外缀合系统间接地连接至所述第二多肽。
80.如权利要求40至79中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一剂和/或所述第二剂独立地包含抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白质酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。
81.如权利要求80所述的分离的血小板，其中所述第一剂和/或所述第二剂包含抗体并且/或者包含荧光部分。
82.如权利要求40至81中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一剂和/或所述第二剂对哺乳动物细胞有害并且/或者对受试者有毒，并且/或者所述第一剂和/或所述第二剂在直接施用到受试者的血流中时易于降解。
83.如权利要求40至82中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一化合物和/或所述第二化合物还包含荧光部分。
84.如权利要求40至83中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一GAG结合肽和/或所述第二GAG结合肽还优先结合丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa，任选地，所述分离的血小板还包含至少一个拷贝的第三化合物，所述第三化合物包含第三剂和第三多肽，其中所述第三多肽包含能够结合血小板的第三α颗粒类型中的GAG的第三糖胺聚糖(GAG)结合肽；并且其中所述第三GAG结合肽优先结合丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
85.如权利要求40至84中任一项所述的分离的血小板，其中，所述分离的血小板保持为静息的、功能齐全的血小板，而不是被负载过程激活。
86.一种药物组合物，其包含权利要求40至85中任一项所述的分离的血小板和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
87.如权利要求86所述的药物组合物，其还包含第二分离的血小板，所述第二分离的血小板包含至少一个拷贝的第三化合物，所述第三化合物包含第三剂和第三多肽，其中所述第三多肽包含能够结合血小板的第三α颗粒类型中的GAG的第三糖胺聚糖(GAG)结合肽；并且其中所述第三GAG结合肽优先结合丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
88.如权利要求86所述的药物组合物，其还包含第二分离的血小板，所述第二分离的血小板包含至少一个拷贝的所述第一化合物，或者所述药物组合物还包含第三分离的血小板，所述第三分离的血小板包含至少一个拷贝的第二化合物。
89.如权利要求88所述的药物组合物，其还包含第二分离的血小板，所述第二分离的血小板包含至少一个拷贝的所述第一化合物，并且所述药物组合物包含第三分离的血小板，所述第三分离的血小板包含至少一个拷贝的第二化合物。
90.权利要求86至89中任一项所述的药物组合物用于治疗疾病或病症的用途。
91.权利要求40至85中任一项所述的分离的血小板或权利要求86至89中任一项所述的药物组合物在制造用于治疗疾病或病症的药剂中的用途。
92.如权利要求90或权利要求91所述的用途，其中所述疾病或病症是癌症。
93.一种用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求86至89中任一项所述的药物组合物的步骤。
94.一种用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1至39中任一项所述的组合物的步骤。
95.如权利要求93或权利要求94所述的方法，其中所述第一α颗粒类型的内容物在第二α颗粒类型的内容物释放之前在靶位点处释放。
96.如权利要求93至95中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用第二药物组合物和/或第三药物组合物的步骤，所述第二药物组合物和/或第三药物组合物独立地包含乙酰肝素酶、凝血酶及其片段肽、蛋白酶激活受体1(PAR1)激动剂或拮抗剂肽、蛋白酶激活受体4(PAR4)激动剂或拮抗剂肽、纤溶酶及其片段、金属蛋白质酶、过氧化物酶和/或磷酸水解酶中的一种或多种。
97.如权利要求96所述的方法，其中所述第二药物组合物促进第一化合物从第一α颗粒类型释放，并且所述第三药物组合物促进第二化合物从第二α颗粒类型释放。
98.如权利要求96或权利要求97所述的方法，其中所述第二药物组合物和/或所述第三药物组合物在所述药物组合物施用之后施用。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述药物组合物在所述第二药物组合物和/或所述第三药物组合物施用之前施用至少两次。
100.如权利要求93至99中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
101.如权利要求93至99中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是炎症。
102.如权利要求93至99中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是植入物、移植物、支架或假体的副作用。
103.如权利要求93至99中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症由缺陷型基因引起或者所述疾病或病症是损伤。
104.如权利要求93至100中任一项所述的方法，其中所述组合物包含保持为静息的、功能齐全的血小板的分离的血小板。
105.一种用于制造负载的血小板的方法，所述方法包括以下步骤：
获得血小板，
使所述血小板在体外或离体与权利要求1至39中任一项所述的组合物接触，以及
使所述血小板与所述组合物之间的接触进展，直到所述第一化合物被所述血小板的第一α颗粒类型内化并且所述第二化合物被所述血小板的第二α颗粒类型内化，从而产生负载的血小板。
106.一种用于制造负载的血小板的方法，所述方法包括以下步骤：
获得血小板，
使所述血小板在体外或离体与第一化合物接触，所述第一化合物包含第一剂和第一多肽，其中所述第一多肽包含第一糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述第一GAG结合肽能够结合血小板的第一α颗粒类型中的GAG；以及
使所述血小板在体外或离体与第二化合物接触，所述第二化合物包含第二剂和第二多肽，其中所述第二多肽包含第二糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述第二GAG结合肽能够结合所述血小板的第二α颗粒类型中的GAG。
107.如权利要求106所述的方法，其中所述使所述血小板与所述第一化合物接触和所述使所述血小板与所述第二化合物接触同时发生。
108.如权利要求106所述的方法，其中所述使所述血小板与所述第一化合物接触和所述使所述血小板与所述第二化合物接触依序发生。
109.如权利要求106至108中任一项所述的方法，其还包括使所述血小板在体外或离体与第三化合物接触，所述第三化合物包含第三剂和第三多肽，其中所述第三多肽包含能够结合血小板的第三α颗粒类型中的GAG的第三糖胺聚糖(GAG)结合肽；并且其中所述第三GAG结合肽优先结合丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
110.如权利要求106至109中任一项所述的方法，其中使所述血小板与所述第一化合物和/或所述第二化合物接触并不活化所述血小板，而是所述血小板保持为静息的、功能齐全的血小板。
111.一种用于治疗疾病或病症的药盒，所述药盒包括权利要求40至85中任一项所述的分离的血小板和使用说明书。
112.一种用于治疗疾病或病症的药盒，所述药盒包括权利要求86至89中任一项所述的药物组合物和使用说明书。
113.如权利要求111或权利要求112所述的药盒，其还包括第二药物组合物和/或第三药物组合物，所述第二药物组合物和/或第三药物组合物独立地包含乙酰肝素酶、凝血酶及其片段肽、蛋白酶激活受体1(PAR1)激动剂或拮抗剂肽、蛋白酶激活受体4(PAR4)激动剂或拮抗剂肽、纤溶酶及其片段、金属蛋白质酶、过氧化物酶和/或磷酸水解酶中的一种或多种。
114.一种用于制造负载的血小板的药盒，所述药盒包括权利要求1至39中任一项所述的组合物和使用说明书。
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