KR20230137377A - 다중 단백질 전달을 위한 혈소판 알파-과립 - Google Patents

다중 단백질 전달을 위한 혈소판 알파-과립 Download PDF

Info

Publication number
KR20230137377A
KR20230137377A KR1020237028462A KR20237028462A KR20230137377A KR 20230137377 A KR20230137377 A KR 20230137377A KR 1020237028462 A KR1020237028462 A KR 1020237028462A KR 20237028462 A KR20237028462 A KR 20237028462A KR 20230137377 A KR20230137377 A KR 20230137377A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gag
binding peptide
platelets
agent
polypeptide
Prior art date
Application number
KR1020237028462A
Other languages
English (en)
Inventor
지안노울라 라까 클레멘트
치앤 리우
Original Assignee
씨에스티에스 헬스 케어 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 씨에스티에스 헬스 케어 인크. filed Critical 씨에스티에스 헬스 케어 인크.
Publication of KR20230137377A publication Critical patent/KR20230137377A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4545—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pipamperone, anabasine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/19—Platelets; Megacaryocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/7056—Lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C07K14/70564—Selectins, e.g. CD62
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0644—Platelets; Megakaryocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 개시내용은 적어도 2개의 제제가 로딩된 혈소판을 포함하는 조성물 및 방법을 제공하며, 각각의 제제는 별개의α-과립형의 혈소판에 로딩된다. 혈소판에 로딩된 약제는 일반적으로 분해로부터 보호되고, 대상체는 존재하는 경우 약제로부터 유래한 독성으로부터 보호된다. 상해, 염증 및/또는 혈관신생 부위에 대한 혈소판의 자연적 능력과 결합된 이러한 이점은 치료 유효량의 약제가 표적 부위에 전달되도록 하는 데 도움을 준다.

Description

다중 단백질 전달을 위한 혈소판 알파-과립
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 1월 27일자로 제출된 US 63/142,402에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전문은 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-웹을 통하여 ASCII 형식으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이의 전문은 참조로 본원에 포함된다. 2022년 1월 26일자로 생성된 상기 ASCII 복제의 명칭은 58533-702.601_ST25.txt이며 크기는 3,155 바이트이다.
전신에 투여되는 치료 화합물(therapeutic compound)은 표적 부위에 도달하기 전에 분해될 수 있으며; 이에 따라, 화합물이 조금이라도 도달한다면 치료 효과를 달성하기에 그 복용량은 너무 낮을 수 있다. 혈소판은 자연적으로 부상, 염증 및/또는 혈관신생 부위의 본거지이며 천연 화물을 이들 부위로 수송하는 것으로 알려져 있다. 외인성 치료제가 혈소판에 로딩될 수 있는 경우, 약제의 전신 투여 후에 발생할 분해로부터 약제를 보호해야 한다. 그러나, 외인성 치료제를 혈소판의 알파 과립에 로딩하는 어떠한 메커니즘도 설명되지 않았다. 따라서, 외인성 치료제를 상해, 염증 및/또는 혈관신생 부위에 전달할 수 있는 로딩된 혈소판에 대한 충족되지 않은 필요성이 존재한다.
본 개시내용의 일 양태는, 예를 들어, 질병 또는 장애를 치료하기 위한, 키트이다. 조성물은 제1 약제 및 제1 폴리펩티드를 포함하는 제1 화합물로서, 제1 폴리펩티드는 혈소판의 제1 알파 과립형에서 GAG(글리코사미노글리칸)에 결합할 수 있는 제1 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하는, 화합물; 및 제2 약제 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 제2 화합물로서, 제2 폴리펩티드는 혈소판의 제2 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제2 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하는, 화합물을 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드는 콘드로이틴 설페이트(CS)에 우선적으로 결합하고 제2 GAG-결합 펩티드는 헤파란 설페이트(HS)에 우선적으로 결합한다.
다양한 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드는 콘드로이틴 설페이트 A(CSA)에 우선적으로 결합하고 바람직하게는 헤파란 설페이트(HS)에 결합하지 않는다.
일부 실시형태에서, 제1 알파 과립형은 P-셀렉틴 회합 과립이고 제2 알파 과립형은 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor, VWF) 회합 과립이다.
실시형태에서, 제1 알파 과립형의 내용물은 고친화성 트롬빈 수용체 PAR1를 통해 방출되고 제2 알파 과립형의 내용물은 저친화성 트롬빈 수용체 PAR4를 통해 방출되고, 선택적으로, 알파 과립의 내용물은 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 퍼옥시다제, 포스포히드롤라제, 플라스민, 또는 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)와 같은 플라스민 유도체와의 접촉에 대한 반응으로 방출될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 제1 알파 과립형의 내용물은 제2 알파 과립형의 내용물의 방출을 제공하기 위해 필요한 트롬빈 농도보다 더 낮은 트롬빈 농도에서 방출된다.
일부 실시형태에서, 제1 알파 과립형의 내용물은 제2 알파 과립형의 내용물이 방출되기 전에 방출된다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드의 길이는 각각 약 8개 아미노산 내지 약 14개 아미노산이다.
다양한 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드 중 하나 또는 모두는 적어도 하나의 하전된 아미노산을 포함한다. 일부 경우, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드 중 모두는 적어도 하나의 하전된 아미노산을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드 중 하나 또는 모두는 적어도 하나의 프롤린, 아르기닌, 및/또는 이소류신을 포함한다. 일부 경우, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 적어도 적어도 하나의 프롤린, 아르기닌, 및/또는 이소류신을 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나와 적어도 약 70% 동일한 아미노산 서열을 독립적으로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나와 적어도 약 80% 동일한 아미노산 서열을 독립적으로 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 독립적으로 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 임의의 하나에 대해 위치 1, 위치 4, 위치 7, 또는 위치 9에 하전된 아미노산을 독립적으로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 임의의 하나에 대해 위치 1, 위치 4, 위치 7, 및/또는 위치 9에 프롤린, 아르기닌, 및/또는 이소류신을 독립적으로 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 적어도 10개의 아미노산을 독립적으로 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및/또는 제2 GAG-결합 펩티드는 적어도 11개의 아미노산을 독립적으로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 11개의 아미노산으로 독립적으로 구성된다.
일부 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 2와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우, 제1 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함한다. 제1 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 제1 폴리펩티드는 제1 GAG-결합 펩티드로 구성되고, 제2 폴리펩티드는 제2 GAG-결합 펩티드로 구성된다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드의 N-말단은 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고/되거나 제2 폴리펩티드의 N-말단은 제2 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다.
실시형태에서, 제1 폴리펩티드의 C-말단은 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고/되거나 제2 폴리펩티드의 C-말단은 제2 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다.
다양한 실시형태에서, 제1 약제는 제1 링커를 통해 제1 폴리펩티드에 간접적으로 연결되고/되거나 제2 약제는 제2 링커를 통해 제2 폴리펩티드에 간접적으로 연결된다. 일부 경우, 제1 링커 및/또는 제2 링커는 각각 하나 이상의 원자를 포함한다. 제1 링커 및/또는 제2 링커는 각각 반복 단위의 중합체를 포함할 수 있다. 제1 링커 및/또는 제2 링커는 각각 아미노산 사슬을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 약제는 제1 폴리펩티드에 직접적으로 연결되고/되거나 제2 약제는 제2 폴리펩티드에 직접적으로 연결된다.
실시형태에서, 말레이미드 반응, 숙신이미딜 에스테르 반응, 효소 반응, 또는 단백질 구조 또는 활성에 영향을 미치지 않는 다른 접합 시스템을 사용하여 제1 약제는 제1 폴리펩티드에 직접적으로 연결되고/되거나 제2 약제는 제2 폴리펩티드에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다.
다양한 실시형태에서, 제1 약제 및/또는 제2 약제는 항체, 화학요법제, 세포독성 화합물, 소분자, 형광성 모이어티, 방사성 요소, 면역 관문 억제제, 성장 인자, 성장 억제제, 프로테아제/프로테이나제, 응고 인자, 지질 또는 인지질, 세포외 기질 단백질, 호르몬, 효소, 케모카인/화학유인물질, 뉴로트로핀, 티로신 키나제(작용제 또는 억제제), 또는 세포 증식, 혈관신생, 염증, 면역 또는 혈소판에 의해 매개되거나 혈소판과 연관되는 다른 생리적 과정을 억제하는 인자를 포함한다. 일부 경우, 제1 약제 및/또는 제2 약제는 항체 또는 형광성 모이어티를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 약제 및/또는 제2 약제는 포유류 세포에 유해하고/하거나 대상체에 독성이고/이거나 제1 약제 및/또는 제2 약제는 대상체의 혈류에 직접적으로 투여되는 경우 분해되기 쉽다.
실시형태에서, 제1 화합물 및/또는 제2 화합물은 형광성 모이어티를 추가로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및/또는 제2 GAG-결합 펩티드는 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 및/또는 GPIIb/IIIa에 또한 우선적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 제3 약제 및 제3 폴리펩티드를 포함하는 제3 화합물을 추가로 포함하며, 제3 폴리펩티드는 혈소판의 제3 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제3 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하고; 제3 GAG-결합 펩티드는 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 및/또는 GPIIb/IIIa에 우선적으로 결합한다.
본 개시내용의 다른 양태는 단리된 혈소판이다. 단리된 혈소판은 제1 약제 및 제1 폴리펩티드를 포함하는 제1 화합물의 적어도 1 카피로서, 제1 폴리펩티드는 혈소판의 제1 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제1 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하는, 화합물; 및 제2 약제 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 제2 화합물의 적어도 1카피로서, 제2 폴리펩티드는 혈소판의 제2 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제2 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하는, 화합물을 포함한다.
실시형태에서, 혈소판은 합성, 동종이계, 자가 또는 변형된 이종 혈소판이다.
다양한 실시형태에서, 혈소판은 자가 혈소판이다.
일부 실시형태에서, 혈소판은 동종이계 혈소판이다.
실시형태에서, 혈소판은 혈소판 풍부 혈장으로부터 수득된다.
다양한 실시형태에서, 혈소판은 제1 화합물의 적어도 1 내지 1000 카피 및 제2 화합물의 적어도 1 내지 1000 카피를 포함한다. 일부 경우, 제1 화합물의 1 내지 1000 카피는 혈소판의 제1 알파 과립형에 로딩되고, 제2 화합물의 적어도 1카피는 1 내지 1000 카피는 혈소판의 제2 알파 과립형에 로딩된다. 제1 화합물의 적어도 1 카피는 혈소판의 제2 알파 과립형에 로딩될 수 있고, 제2 화합물은 혈소판의 제1 알파 과립형에 로딩될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드는 콘드로이틴 설페이트(CS)에 우선적으로 결합하고 제2 GAG-결합 펩티드는 헤파란 설페이트(HS)에 우선적으로 결합한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드는 콘드로이틴 설페이트 A(CSA)에 우선적으로 결합한다. 다양한 실시형태에서, 제1 알파 과립형은 P-셀렉틴 회합 과립이고 제2 알파 과립형은 폰 빌레브란트 인자(VWF) 회합 과립이다.
일부 실시형태에서, 제1 알파 과립형의 내용물은 고친화성 트롬빈 수용체 PAR1를 통해 방출되고 제2 알파 과립형의 내용물은 저친화성 트롬빈 수용체 PAR4를 통해 방출되고, 선택적으로, 알파 과립의 내용물은 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 퍼옥시다제, 포스포히드롤라제, 플라스민, 또는 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)와 같은 플라스민과의 접촉에 대한 반응으로 방출될 수 있다.
실시형태에서, 제1 알파 과립형의 내용물은 제2 알파 과립형의 내용물의 방출을 제공하기 위해 필요한 트롬빈 농도보다 더 낮은 트롬빈 농도에서 방출된다.
다양한 실시형태에서, 제1 알파 과립형의 내용물은 제2 알파 과립형의 내용물이 방출되기 전에 방출된다.
일부 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드의 길이는 각각 약 8개 아미노산 내지 약 14개 아미노산이다. 일부 경우, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드 중 하나 또는 모두는 적어도 하나의 하전된 아미노산을 포함한다. 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드 중 모두는 적어도 하나의 하전된 아미노산을 포함할 수 있다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드 중 하나 또는 모두는 적어도 하나의 프롤린, 아르기닌, 및/또는 이소류신을 포함한다. 일부 경우, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 적어도 적어도 하나의 프롤린, 아르기닌, 및/또는 이소류신을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나와 적어도 약 70% 동일한 아미노산 서열을 독립적으로 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나와 적어도 약 80% 동일한 아미노산 서열을 독립적으로 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 독립적으로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 임의의 하나에 대해 위치 1, 위치 4, 위치 7, 또는 위치 9에 하전된 아미노산을 독립적으로 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 임의의 하나에 대해 위치 1, 위치 4, 위치 7, 및/또는 위치 9에 프롤린, 아르기닌, 및/또는 이소류신을 독립적으로 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 적어도 10개의 아미노산을 독립적으로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 적어도 11개의 아미노산을 독립적으로 포함한다.
6 일부 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 11개의 아미노산으로 독립적으로 구성된다.
실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나의 아미노산 서열로 구성된다.
다양한 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 2와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 구성되고, 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 구성된다.
다양한 실시형태에서, 제1 폴리펩티드는 제1 GAG-결합 펩티드로 구성되고, 제2 폴리펩티드는 제2 GAG-결합 펩티드로 구성된다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드의 N-말단은 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고/되거나 제2 폴리펩티드의 N-말단은 제2 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다.
실시형태에서, 제1 폴리펩티드의 C-말단은 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고/되거나 제2 폴리펩티드의 C-말단은 제2 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다.
다양한 실시형태에서, 제1 약제는 제1 링커를 통해 제1 폴리펩티드에 간접적으로 연결되고/되거나 제2 약제는 제2 링커를 통해 제2 폴리펩티드에 간접적으로 연결된다. 일부 경우, 제1 링커 및/또는 제2 링커는 각각 하나 이상의 원자를 포함한다. 제1 링커 및/또는 제2 링커는 각각 반복 단위의 중합체를 포함할 수 있다. 제1 링커 및/또는 제2 링커는 각각 아미노산 사슬을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 약제는 제1 폴리펩티드에 직접적으로 연결되고/되거나 제2 약제는 제2 폴리펩티드에 직접적으로 연결된다.
실시형태에서, 말레이미드 반응, 숙신이미딜 에스테르 반응, 효소 반응, 또는 단백질 구조 또는 활성에 영향을 미치지 않는 다른 접합 시스템을 사용하여 제1 약제는 제1 폴리펩티드에 직접적으로 연결되고/되거나 제2 약제는 제2 폴리펩티드에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다.
다양한 실시형태에서, 제1 약제 및/또는 제2 약제는 항체, 화학요법제, 세포독성 화합물, 소분자, 형광성 모이어티, 방사성 요소, 면역 관문 억제제, 성장 인자, 성장 억제제, 프로테아제/프로테이나제, 응고 인자, 지질 또는 인지질, 세포외 기질 단백질, 호르몬, 효소, 케모카인/화학유인물질, 뉴로트로핀, 티로신 키나제(작용제 또는 억제제), 또는 세포 증식, 혈관신생, 염증, 면역 또는 혈소판에 의해 매개되거나 혈소판과 연관되는 다른 생리적 과정을 억제하는 인자를 포함한다. 일부 경우, 제1 약제 및/또는 제2 약제는 항체를 포함하고/하거나 형광성 모이어티를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 약제 및/또는 제2 약제는 포유류 세포에 유해하고/하거나 대상체에 독성이고/이거나 제1 약제 및/또는 제2 약제는 대상체의 혈류에 직접적으로 투여되는 경우 분해되기 쉽다.
실시형태에서, 제1 화합물 및/또는 제2 화합물은 형광성 모이어티를 추가로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및/또는 제2 GAG-결합 펩티드는 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 및/또는 GPIIb/IIIa에 또한 우선적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 제3 약제 및 제3 폴리펩티드를 포함하는 제3 화합물의 적어도 1카피를 추가로 포함하며, 제3 폴리펩티드는 혈소판의 제3 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제3 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하고; 제3 GAG-결합 펩티드는 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 및/또는 GPIIb/IIIa에 우선적으로 결합한다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 임의의 본원에 개시된 양태 또는 실시형태의 단리된 혈소판 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이다.
실시형태에서, 제3 약제 및 제3 폴리펩티드를 포함하는 제3 화합물의 적어도 1카피를 포함하는 제2 단리된 혈소판을 추가로 포함하며, 제3 폴리펩티드는 혈소판의 제3 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제3 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하고; 제3 GAG-결합 펩티드는 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 및/또는 GPIIb/IIIa에 우선적으로 결합한다.
다양한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 제1 화합물의 적어도 1카피를 포함하는 제2 단리된 혈소판을 추가로 포함하거나 제2 화합물의 적어도 1카피를 포함하는 제3 단리된 혈소판을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 제1 화합물의 적어도 1카피를 포함하는 제2 단리된 혈소판을 추가로 포함하고 제2 화합물의 적어도 1카피를 포함하는 제3 단리된 혈소판을 추가로 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 질환 또는 장애를 치료하기 위한 임의의 본원에 개시된 약제학적 조성물의 용도이다. 실시형태에서, 질환 또는 장애는 암이다.
다른 양태에서 본 개시내용은 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 임의의 본원에 개시된 단리된 혈소판 또는 임의의 본원에 개시된 약제학적 조성물의 용도이다. 다양한 실시형태에서, 질환 또는 장애는 암이다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 대상체에게 임의의 본원에 개시된 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 일 양태는 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 대상체에게 임의의 본원에 개시된 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
위의 방법의 일부 실시형태에서, 제1 알파 과립형의 내용물은 제2 알파 과립형의 내용물이 방출되기 전에 표적 부위에서 방출된다.
위의 방법의 실시형태에서, 방법은 대상체에게 헤파라나제, 트롬빈 및 이의 단편 펩티드, 프로테아제-활성화 수용체 1(PAR1) 작용제 또는 길항제 펩티드, 프로테아제-활성화 수용체 4(PAR4) 작용제 또는 길항제 펩티드, 플라스민 및 이의 단편, 메탈로프로테이나제, 퍼옥시다제 및/또는 포스포히드롤라제 중 하나 이상을, 독립적으로, 포함하는 제2 약제학적 조성물 및/또는 제3 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우, 제2 약제학적 조성물은 제1 알파 과립형으로부터의 제1 화합물의 방출을 촉진하고 제3 약제학적 조성물은 제2 알파 과립형으로부터의 제2 화합물의 방출을 촉진한다. 제2 약제학적 조성물 및/또는 제3 약제학적 조성물은 약제학적 조성물이 투여된 후 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 제2 약제학적 조성물 및/또는 제3 약제학적 조성물이 투여되기 전에 적어도 2회 투여될 수 있다.
위의 방법의 다양한 실시형태에서, 질환 또는 장애는 암이다.
위의 방법의 일부 실시형태에서, 장애의 질환은 염증이다.
위의 방법의 다양한 실시형태에서, 장애의 질환은 임플란트, 이식편, 스텐트 또는 보철물의 부작용이다.
위의 방법의 실시형태에서, 장애의 질환은 결함이 있는 유전자에 의해 유발된다.
위의 방법의 일부 실시형태에서, 장애의 질환은 상해이다.
본 개시내용의 다른 양태는 로딩된 혈소판을 제조하기 위한 방법이다. 방법은 시험관내(in vitro)에서 또는 생체외(ex vivo)에서 혈소판을 임의의 본원에 개시된 조성물과 접촉하게 하는 단계 및 제1 화합물이 혈소판의 제1 알파 과립형에 의해 내재화되고 제2 화합물이 혈소판의 제2 알파 과립형에 의해 내재화될 때까지 혈소판과 화합물 사이의 접촉이 진행되도록 하여 로딩된 혈소판을 생성하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 다른 양태는 로딩된 혈소판을 제조하기 위한 방법이다. 혈소판을 수득하는 단계; 제1 약제 및 제1 폴리펩티드를 포함하는 제1 화합물을 시험관내(in vitro)에서 또는 생체외(ex vivo)에서 혈소판과 접촉하게 하며 제1 폴리펩티드는 혈소판의 제1 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제1 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하는 단계; 및 제2 약제 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 제2 화합물을 시험관내(in vitro)에서 또는 생체외(ex vivo)에서 혈소판과 접촉하게 하며 제2 폴리펩티드는 혈소판의 제2 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제2 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하는 단계를 포함한다.
실시형태에서, 제1 화합물을 혈소판과 접촉하게 하는 단계 및 제2 화합물을 혈소판과 접촉하게 하는 단계는 동시에 발생한다.
다양한 실시형태에서, 제1 화합물을 혈소판과 접촉하게 하는 단계 및 제2 화합물을 혈소판과 접촉하게 하는 단계는 순차적이다.
일부 실시형태에서, 제3 약제 및 제3 폴리펩티드를 포함하는 제3 화합물을 시험관내(in vitro)에서 또는 생체외(ex vivo)에서 혈소판과 접촉하게 하는 단계를 추가로 포함하며, 제3 폴리펩티드는 혈소판의 제3 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제3 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하고; 제3 GAG-결합 펩티드는 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 및/또는 GPIIb/IIIa에 우선적으로 결합한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 질환 또는 장애를 치료하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 임의의 본원에 개시된 단리된 혈소판 및 사용 설명서를 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 질환 또는 장애를 치료하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 임의의 본원에 개시된 약제학적 조성물 및 사용 설명서를 포함한다.
실시형태에서, 키트는 헤파라나제, 트롬빈 및 이의 단편 펩티드, 프로테아제-활성화 수용체 1(PAR1) 작용제 또는 길항제 펩티드, 프로테아제-활성화 수용체 4(PAR4) 작용제 또는 길항제 펩티드, 플라스민 및 이의 단편, 메탈로프로테이나제, 퍼옥시다제 및/또는 포스포히드롤라제 중 하나 이상을, 독립적으로, 포함하는 제2 약제학적 조성물 및/또는 제3 약제학적 조성물을 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 로딩된 혈소판을 제조하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 임의의 본원에 개시된 화합물 및 사용 설명서를 포함한다.
본원에 개시된 임의의 양태 또는 실시형태는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 다른 양태 또는 실시형태와 조합될 수 있다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구항에 구체적으로 설명되어 있다. 본 개시내용의 특징 및 이점의 더 나은 이해는 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 실시형태들을 설명하는 다음의 상세한 설명 및 첨부 도면들(이하 "도면"및 "도면들"이라고도 함)을 참조하여 얻어질 수 있다:
도 1a 및 도 1b는 부착된 카고를 혈소판으로 격리하는 예시적인 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드의 능력을 보여주는 그래프이다.
도 2a는 면역형광 이미지이고, 도 2b는 혈소판의 알파 과립 내로 부착된 카고를 격리하는 예시적인 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드의 능력을 입증하는 그래프이다.
도 3a는 등온 적정 열량계(ITC; isothermal titration calorimetry) 실험을 도시하는 개략도이다. 예시적인 GAG-결합 펩티드를 보유하지 않는 세포 내로 적정된 콘드로이틴 설페이트 A(CSA)에 대한 ITC 해리 동역학의 그래픽 표현이 도 3b(SEQ ID NO: 1의 GAG-결합 펩티드에 대해), 도 3c (SEQ ID NO: 2의 GAG-결합 펩티드에 대해), 그리고 도 3d(무전하 리간드에 대해)에 도시된다. 도 3b의 데이터는 도 3e에 도표화되어 있으며, 도 3c의 데이터는 도 3f에 도표화되어 있다.
도 4a는 대조군 펩티드(CFL; EGGIWFPYGGF; SEQ ID NO: 14) 및 2개의 PAL(PAL1; ERRIWFPYRRF; SEQ ID NO: 1 및 PAL2; RFRWPYRIREF; SEQ ID NO: 2)을 포함하는 펩티드 아미노산 서열을 나타낸다. 도 4b 및 도 4c는 헤파란 설페이트(HS)에 결합할 때에도 이전 도면의 3개의 예시적인 GAG-결합 펩티드에 대한 친화도 크로마토그래피 데이터를 나타낸다. 도 4d는 Fam-PAL-루시타닙에 대한 접합 다이어그램을 나타낸다. 도 4e는 다양한 접합체에 대한 % FGFR 활성을 나타낸다. 접합된 루시타닙은 Promega의 ADP-Glo 키트를 사용하여 테스트된 바와 같이 FGFR1 억제 기능을 유지한다. 약간의 EC50 감소는 접합체의 용해도 감소로 인한 것일 수 있다. 본 도면과 다른 부분에서 포함되는 약어는 다음과 같다: A-PAL1 -- Alexa647-표지된-PAL1; A-PAL2 -- Alexa647-표지된-PAL2; Fam-PAL1 -- Fam-표지된-PAL1; Fam-PAL2 -- Fam-표지된-PAL2; Fam-PAL1-Luci -- Fam-PAL1-접합된 루시타닙; Fam-PAL2-Luci -- Fam-PAL2-접합된 루시타닙; Fam-CFL-Luci -- Fam-CFL-접합된 루시타닙; 및 Fam-L-Luci -- Fam-링커-접합된 루시타닙.
도 5는 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드 및 약제를 포함하는 예시적인 화합물의 혈소판 내로의 로딩을 나타내는 그래프이다.
도 6a는 면역형광 이미지이고, 도 6b는 혈소판의 알파 과립 내로 로딩하기 위한 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드 및 약제를 포함하는 예시적인 화합물의 능력을 나타내는 그래프이다.
도 7a 내지 도 7c는 PAL1(도 7a)을 포함하는 예시적인 화합물, PAL2(도 7b)를 포함하는 예시적인 화합물, 및 CFL(도 7c)을 포함하는 대조군 화합물을 포함하는 예시적인 화합물을 보류하는 세포 내로 적정된 콘드로이틴 설페이트 A(CSA)에 대한 ITC 해리 동역학의 그래프 표현을 포함한다. 도 7a의 데이터는 도 7d에 도표화되어 있고, 도 7b의 데이터는 도 7e에 도표화되어 있으며, 도 7c의 데이터는 도 7f에 도표화되어 있다.
도 8은 헤파란 설페이트(HS)에 결합할 때에도 이전 도면의 3개의 예시적인 화합물에 대한 친화성 크로마토그래피 데이터를 나타낸다.
도 9a는 추가의 예시적인 화합물을 보유하지 않는 세포 내로 적정된 콘드로이틴 설페이트 A(CSA)에 대한 ITC 해리 동역학의 그래프 표현을 포함한다. 이들 추가의 예시적인 화합물은 PAL1A 내지 PAL11A로 확인되고, 각각 SEQ ID NO: 3 내지 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 갖는 GAG-결합 펩티드를 포함한다. 도 9a의 데이터는 도 9b 내지 도 9l에 도표화되어 있다. 도 9m은 추가의 예시적인 화합물 및 음성 대조군 화합물에 대한 평균 해리 상수를 나타내는 그래프이다.
도 10a는 본 개시내용의 화합물을 형성할 때 약제에 GAG-결합 펩티드를 접합시키는 예시적인 단계들을 나타내는 도면이다. 도 10b는 면역형광 이미지이고, 도 10c는 혈소판의 알파 과립 내로 로딩하기 위한 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드 및 약제를 포함하는 예시적인 화합물의 능력을 입증하는 그래프이다.
도 11은 bFGF, VEGF, PDGF 및 엔도스타틴의 혈소판 수준이 종양 성장 자극제 쪽으로 균형을 유지하면서 종양이 휴면 상태에서 벗어나기 직전에 변화한다는 것을 보여주는 다이어그램이다.
도 12는 혈소판이 암 특이적 단백질을 능동적으로 격리하고 알부민과 같은 비특이적 단백질을 능동적으로 격리하지 않음을 나타내는 MS 발현 지도이다.
도 13은 혈소판이 혈관신생 자극제(VEGF, bFGF, PDGF) 및 억제제(PF4, 엔도스타틴) 모두를 함유한다는 것을 나타내는 표이다.
도 14는 긍정적인 생활방식 개입을 받고 있는 국부 전립선암이 있는 대상체(청색) 및 개입 후 6개월차에 생활방식의 변화 없이 감시대기 요법을 받고 있는 대상으로부터 유래한 혈소판의 SELDI-ToF 분석을 나타낸다.
도 15a 및 도 15b는 각각의 수용체의 억제가 혈소판 격리를 억제하지 않지만(도 15a), 서펜에 의한 헤파린 결합의 억제는 혈소판 α 과립에 의한 단백질 격리의 유의한 억제를 초래함(도 15b)을 나타내는 그래프이다.
도 16은 VEGF 및 엔도스타틴이 별도의 혈소판 α-과립에 존재하는 것을 나타내는 면역형광 이미지이다.
도 17은 혈관신생 자극제(예를 들어, VEGF)가 α-과립에서 P-셀렉틴으로 국소화되는 것을 나타내는 면역형광 이미지이다.
도 18은 엔도스타틴이 별도의 구별되는 α-과립 구획에 있고 P-셀렉틴보다는 폰 빌레브란트 인자(VWF)와 함께 국소화되는 것을 나타내는 면역형광 이미지이다.
도 19는 상처 치유에서 단백질의 순차적 방출 및 프로테이나제 활성화 수용체 1(PAR1) 및 PAR4의 국소 농도 구배를 요약한 개략도를 포함한다.
도 20은 혈관내피종 세포(EOMA)의 표면에서 GAG에 의한 성장 인자의 격리를 나타내는 그래프로서, 이는 격리가 헤파린 의존적이고 트롬빈 존재에 따라 증가함을 확인해 준다.
도 21은 혈소판 형성 임시 기질로부터 방출된 성장 인자에 대한 반응으로 쥐 혈관내피종 세포(EOMA)가 증식한다는 것을 나타내는 그래프이다.
도 22는 혈소판이 종양 활성화 시 내피 세포와 단백질을 교환할 수 있는 임시 기질을 형성한다는 것을 나타내는 면역형광 이미지이다.
도 23a는 PAL1 또는 PAL2 접합체가 혈소판에 로딩된다는 것을 나타내는 면역형광 이미지이다. 도 23b는 혈소판으로의 Fam-PAL1 또는 Fam-PAL2(상단) 및 Fam-PAL1-루시타닙 또는 Fam-PAL2-루시타닙(하단)의 용량 반응 로딩을 나타내는 그래프이다. 로딩된 혈소판은 휴지 중인 완전한 기능을 하는 혈소판의 형태를 유지한 것으로 보인다.
도 24는 PAL1 및 PAL2가 상이한 세포하 국소화를 갖는다는 것을, 즉, 구별되는 알파 과립에 대한 선호도를 갖는다는 것을 나타내는 면역형광 이미지이다.
도 25a 및 도 25b는 PAL1(도면에서 자색) 및 PAL2(도면에서 미청색)가 콘드로이틴 설페이트 A(CSA; 도 25a) 및 헤파란 설페이트(HS; 도 25b)에 상이하게 결합할 수 있다는 것을 나타내는 구조도이다.
도 26a 및 도 26b는 PAL1이 소분자에 접합될 때 PAL1이 각각의 분자를 혈소판 α-과립으로 안내할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 27a는 혈소판 과립을 분획화하는 단계를 예시하는 흐름도이다. 도 27b는 혈소판 과립을 분리하기 위한 수크로스 구배(상단은 도면) 및 (하단은 사진)을 나타내는 이미지이다. 도 27c는 과립 분획의 웨스턴 블롯이다. 도 27d는 FAM, PF4, MRP4 또는 VEGF에 대해 표지된 과립 분획의 면역형광 이미지를 포함한다. 도 27e는 각각의 과립 분획에서 마커 PF4, VEGF 및 MRP4를 정량화한 그래프이다. 도 27f는 특정 과립 분획에서 PAL 접합체의 국소화를 나타내는 그래프이다. 도 27g는 도 27e에 나타낸 이미지의 피어슨 상관 분석(Pearson Correlation Analysis; PCA)을 나타낸다.
본 개시내용은 하나보다 많은 화합물이 로딩된 단리된 혈소판에 관한 것이다. 제1 화합물은 제1 약제 및 제1 폴리펩티드를 포함하며, 제1 폴리펩티드는 혈소판의 제1 알파 과립형에서 GAG(글리코사미노글리칸)에 결합할 수 있는 제1 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함한다. 제2 화합물은 제2 약제 및 제2 폴리펩티드를 포함하며, 제2 폴리펩티드는 혈소판의 제2 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제2 GAG-결합 펩티드를 포함한다. 제1 알파 과립형 및 제2 알파 과립형은 상이한 GAG의 우세를 특징으로 한다.
특히, 제1 GAG-결합 펩티드는 바람직하게는 제1 알파 과립 유형(즉, P-셀렉틴 유형 과립)에서 우세하게 발견되는 GAG 유형에 결합하고, 제2 GAG-결합 펩티드는 바람직하게는 제2 알파 과립형(즉, vWF 유형 과립)에서 우세하게 발견되는 GAG 유형에 결합한다. 제1 GAG 결합 펩티드로 제1 화합물을 조작하고 제2 GAG 결합 펩티드로 제2 화합물을 조작하여 혈소판이 2개의 활성제를 사용하여 2개의 별개의 과립형에 로딩될 수 있다. 중요한 점은 각 과립형이 과립형과 연관되는 트롬빈 수용체(즉, 프로테이나제 활성화 수용체 1(PAR1) 및 PAR4)의 동일성에 부분적으로 기초한 별도의 방출 프로파일을 갖는다는 것이다. PAR1은 (낮은 트롬빈 조건에서) 먼저 촉발되고 P-셀렉틴 유형 α-과립(본원에서 제1 α-과립형이라고 지칭된)을 방출하는 고친화성 트롬빈 수용체인 반면, PAR4는 충분한 양의 트롬빈이 축적되어 vWF α-과립(본원에서 제2 α-과립형이라고 지칭됨)을 방출하는 경우에만 촉발되는 저친화도 수용체이다. 선택적으로, 알파 과립의 내용물의 방출은 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 퍼옥시다제, 포스포히드롤라제, 플라스민, 또는 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)와 같은 플라스민 유도체와의 접촉에 대한 반응으로 유도될 수 있으며, 이러한 방출 유도제는 치료 반응을 촉진하기 위해 필요에 따라 약제의 방출을 촉진하는 시간에 약제학적 조성물로 대상체에게 투여될 수 있다.
본 개시내용의 로딩된 혈소판은 구별되는 α-과립형을 통해 시간적 및 공간적으로 제어된 방식으로 그 내용물을 방출할 수 있다. 트롬빈 및 이의 유도체의 효소 활성에 더해, 퍼옥시다제, 포스포히드롤라제, 플라스민, 또는 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)와 같은 플라스민 유도체와 같은 다른 조직 상주 프로테아제도 일시적 및 공간적으로 제어된 방식으로 혈소판 알파 과립 내용물을 선택적으로 방출한다.
따라서, 혈소판은 적어도 조기 방출 프로파일을 갖는 제1 α-과립형의 제1 약물 및 후기 방출 프로파일을 갖는 제2 α-과립 유형의 제2 약물로 로딩된다. 결과적으로, 치료제를 치료의 초기 단계 동안 필요한 제1 작용제를 방출하고 치료의 후기 단계 동안 필요한 제2 작용제를 방출하도록 설계할 수 있다. 또한, 구별되는 α-과립형의 방출 시기는 대상체에 방출을 자극하는 약제학적 조성물(예를 들어, 트롬빈, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 퍼옥시다제, 포스포히드롤라제, 플라스민, 또는 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)와 같은 플라스민 유도체)을 투여하여 제어할 수 있다.
본 발명은 부분적으로 다수의 약제를 사용하여 구별되는 α-과립형에 로딩된 혈소판의 생성에 기초한다. 로딩된 혈소판은 상해, 병리학적 염증 및/또는 혈관신생 부위에 대한 치료제를 제공한다. 혈소판 내에 격리된 이러한 약제, 예를 들어, 혈소판 알파 과립은 전신 투여 시 발생할 수 있는 분해로부터 일반적으로 보호된다. 상해, 염증 및/또는 혈관신생 부위에 대한 혈소판의 자연적 능력과 결합된 이러한 이점은 치료 유효량의 약제가 표적 부위에 전달되도록 하는 데 도움을 준다. 또한, 본 발명에서 유용한 혈소판은 복수의 상이한 약제를 사용하여 구별되는 α-과립형에 로딩되고; 상이한 약제는 공간적으로 그리고 시간적으로 제어되는 방식으로 알파 과립으로부터 방출된다. 따라서, 본 발명은 상해(예를 들어, 만성 상처를 치료하기 위해), 병리학적 염증(예를 들어, 관절 또는 폐 상해를 치료하기 위해) 및/또는 혈관신생(예를 들어, 암을 치료하기 위해) 부위에 대한 지시되고 조절된 치료제를 제공한다.
본 발명 이전에는 상이한 화합물을 사용하여 구별되는 α-과립형을 특이적으로 로딩하는 것은 고사하고 약제가 알파 과립의 특정 글리코사미노글리칸(GAG)에 고정되어 혈소판 내로 내재화될 수 있고 특정 GAG-결합 펩티드를 사용하여 내재화 과정을 촉진할 수 있다는 것은 직관에 반하는 것이었다. 실제로, 이전에는, 약제를 혈소판 알파 과립에 로딩하는 알려진 방법이 없었고, 알파 과립형의 소집단이 상이한 약제로 로딩될 수 있고, 이로써 상이한 약제의 공간적 및/또는 시간적으로 제어된 방출을 허용할 수 있다는 것은 알려져 있지 않았다. 이러한 제어 방출은 상이한 약제의 순차적 전달을 허용하며, 이는 상이한 약제가 동시에 투여될 때 관찰되지 않을 수 있는 시너지 치료 효과를 초래할 수 있다.
본 발명은 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는 수많은 이점을 제공한다:
(1) 1차 종양 또는 전이성 성장 부위로의 약제의 표적 전달은 고용량 약제의 전신 투여 필요성을 방지하며; 이에 따라, 표적 부위에서 약제의 치료학적 유효 농도를 달성하기 위해 더 낮은 용량의 약제를 필요로 한다;
(2) 혈소판 알파 과립에 격리된 약제는 표적 외 수용체에 결합할 수 없으며; 이에 따라, 약제 단독의 전신 투여와 연관된 부작용(예를 들어, 독성)을 방지할 수 있다;
(3) 혈소판 알파 과립에 격리된 약제는 자연적 과정(예를 들어, 조직 프로테아제)에 의한 분해로부터 보호되며; 이에 따라, 약제의 반감기는 단독으로 전신 투여될 때의 약제에 비해 연장된다;
(4) 구별되는 약제를 α-과립형에 선택적으로 로딩하고, 각각은 별도의 방출 프로파일을 가지며, 이로써 상이한 약제를 공간적 및/또는 시간적으로 제어된 방식으로 혈소판으로부터 방출하도록 할 수 있다; 그리고
(5) 알파 과립의 로딩된 혈소판 내용물의 방출은 치료 반응을 촉진하기 위해 필요에 따라 약제의 방출을 촉진하는 시간에 약제학적 조성물로 대상체에게 투여될 수 있는 방출 유도제와의 접촉에 대한 반응으로 유도될 수 있다.
특히, 본 개시내용의 로딩된 혈소판은 혈소판을 응혈 촉진제로 제조하는 로딩 과정에 의해 활성화되기보다는 휴지 중인 완전한 기능을 하는 혈소판으로 남아 있다.
혈소판, 혈소판 과립 및 글리코사미노글리칸
본 발명은, 혈소판이 자연적으로 최초 반응자이고 혈소판이 적어도 질병, 장애 또는 상해의 초기 증상을 개선하는 질병, 장애 또는 상해를 치료하기 위한 화합물, 약제학적 조성물, 및 방법을 제공한다. 예시적인 질병, 장애 또는 상해에는 암, 류마티스 관절염, 당뇨병성 망막병증, 비만, 죽상동맥경화증, 허혈성 심장 및 사지 질환, 궤양성 대장염, 뇌졸중, 화상 및 기타 상처가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 생리학적 조건하에서, 순환하는 혈소판은 조직의 건강과 안정성을 유지한다.
상처 및 종양 미세 환경에서 혈소판의 역할에 관한 새로운 정보가 나타났다; 예를 들어, Klement et al., “Platelets actively sequester angiogenesis regulators”, Blood. 2009; 113: 2835-42 and Klement et al., “The Role of Platelets in Angiogenesis. In: Michelson A, . Platelets. Third ed. Philadelphia, PA: Mosby Elsevier; 2013. p. 487-503 참조. 그러나, 혈소판/조직 상호작용의 복잡성과 조직 성장 및 혈관신생을 조절하는 혈소판의 역할에 대한 이해는 더디게 나타났다. 혈소판은 알파 과립, 조밀 과립 및 리소좀을 포함하여 다양한 기능을 수행하는 다양한 유형의 과립을 포함하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 성장 인자를 포함하는 알파 과립은 가장 일반적인 유형의 과립이다. Blair 및 Flaumenhaft의 "Platelet alpha-granules: basic biology and clinical correlates"의. 혈액 리뷰. 2009, 23(4): 177-89 및 Harrison 및 Cramer, "Platelet alpha-granules". 혈액 리뷰. 1993, 7(1): 52-62 참조. 일반적으로 알파 과립의 카고는 주로 혈관신생 억제제를 포함한다; 예를 들어, Peterson et al., “Normal ranges of angiogenesis regulatory proteins in human plate-lets”의 미국 혈액학 저널. 2010년; 85: 487-93 참조. 그러나, 피험자가 암에 걸리면 혈소판 카고가 변하고 알파 과립이 주로 자극제로 로딩된다; Peterson et al., American Journal of Hematology. 2010년; 85: 487-93 및 Peterson et al., “VEGF, PF4 and PDGF are elevated in platelets of colorectal cancer patients”의 Angiogenesis. 2012년; 15:265-73. 참조.
본 발명은 부분적으로 카고가 구별되는 알파 과립형에 로딩될 수 있고 이 로딩이 수용체 매개가 아니라는 발견에 기초한다. 대신, 혈소판에, 특히 이들의 알파 과립에 로딩되는 카고는 혈소판의 알파 과립에서 글리코사미노글리칸(GAG)에 대한 결합에 의존하며 한 유형의 알파 과립은 하나의 GAG 및 다른 마커를 특징으로 하며 다른 유형의 알파 과립은 제2 GAG 및 다른 마커를 특징으로 한다. 혈소판이 비특이적 GAG 억제제(즉, 서펜)와 접촉하면, 감소된 양의 카고가 혈소판에 로딩된다.
또한, 본 발명은 부분적으로 혈소판의 카고가 혈소판 알파 과립의 구별되는 서브세트로 흡수되는 혈관신생 자극제 및 억제제와 함께 기능별로 조직화된다는 발견에 기초하며; 이 구별은 적어도 콘드로이틴 설페이트 또는 헤파란 설페이트 및 또한 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트 및/또는 GPIIb/IIIa에 대한 카고의 결합 친화도에 기초한다. 또한, 알파 과립의 P 셀렉틴 정의 서브세트는 GAG에 대해 더 약한 친화도(즉, 더 높은 Kd)를 갖는 GAG 결합 화합물을 끌어들이고, 알파 과립의 폰 빌레브란트 인자(VWF) 정의 서브세트는 콘드로이틴 설페이트와의 강한 친화도(즉, 더 높은 Kd) 상호작용을 갖는 단백질을 수용한다.
또한, 본 발명은 부분적으로 알파 과립의 카고가 응집 및 응고 시에 대량으로 방출되지 않는다는 놀라운 발견에 기초한다. 대신에, 혈관신생 성장 자극제 또는 억제제는 트롬빈(및/또는 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 퍼옥시다제, 포스포히드롤라제, 플라스민, 또는 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)와 같은 플라스민 유도체)의 국소 수준과 같은 특정 자극에 대한 반응으로 공간적 및 시간적으로 제어되는 방식으로 방출된다. 예로서 트롬빈을 사용하여, P-셀렉틴으로 표지된 알파 과립의 초기 반응 서브세트는 혈관 상해(예를 들어, 낮은 트롬빈 상태) 및 PAR1(고 친화성 트롬빈 수용체)이 관여할 때 즉시 내용물을 방출하며; 대조적으로, vWF 인자로 표지된 알파 과립의 후기 반응 서브세트는 PAR4(즉, 저 친화성 트롬빈 수용체)이 관여할 때 내용물을 방출한다.
따라서, 본 발명은 혈관 내피층의 틈을 표적으로 하는 혈소판의 자연적 능력을 이용한다. 암과 관련하여, 이것은 혈소판의 카고가 종양 부위로 전달되도록 한다. 중요하게도, 본 개시내용에 따르면, 혈소판의 구별된 알파 과립은 2개 이상의 약제를 사용하여 미리 로딩되고 이 약제는 특이적으로 종양 부위에 형성된 임시 기질에 전달된다. 중요하게도, 본 발명은 세심하게 - 시간적으로 및 공간적으로 제어되는 - 효소 작용으로 조직 프로테아제에 의해 임시 기질로부터 방출되는 구별되는 알파 과립형에 로딩되는 혈소판 관련 약제를 제공한다.
혈소판에는 2개의 주요 GAG인 헤파란 설페이트와 콘드로이틴 설페이트가 있다.
헤파란 설페이트(HS)는 글루코사민에 링크된 우론산 1→4의 선형 공중합체이지만 구조가 매우 다양하다. 상당한 양의 l-이두론산이 존재할 수 있지만, d-글루쿠론산은 HS에서 우세하다. 헤파린과 비교하여, HS는 설포기에서 훨씬 덜 치환된다.
헤파린은 1→4-링크된 피라노실루론산 및 2-아미노-2-데옥시글루코피라노스(글루코사민) 잔기의 반복 단위로 구성된 매우 이질적인 선형, 다분산 다당류이다. 우론산 잔기는 일반적으로 90% l-이도피라노실루론산(l-이두론산) 및 10% d-글루코피라노실루론산(d-글루쿠론산)으로 구성된다. 글루코사민 잔기의 아미노기는 아세틸기 또는 설포기로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 글루코사민 잔기의 3 및 6 위치는 O-설포기로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. l-이두론산 또는 d-글루쿠론산일 수 있는 우론산은 2-O-설포기도 또한 포함할 수 있다.
대부분의 헤파린 결합 단백질은 헤파린과 헤파란 설페이트 모두에 결합한다. 이들은 둘 다 다수의 단백질을 광범위한 가능한 결합 부위에 결합하는 이질적인 사카라이드 서열을 갖는 다분산 폴리사카라이드이다. 헤파린이 주로 세포 내인 반면, HS 프로테오글리칸(HSPG)은 많은 세포 표면에 국한되어 있으며, 예를 들어, 성장 인자 및 단백질 리간드를 안정화함으로써 세포외 기질(ECM)의 기능에 기여한다.
콘드로이틴 설페이트(CS)는: 2-아세틸아미노-2-데옥시-4-0-설페이트-3-0-~-D-글루코피라누로실-D-갈락토스; 2-아세틸아미노-2-데옥시-6-0-설페이트-3-0-~-D-글루코피라누로실-D-갈락토스; 2-아세틸아미노-2-데옥시-4,6-0-디설페이트-3-0-~-D-글루코피라누로실-D-갈락토스; 및 2-아세틸 라미노-2-데옥시-6-0-설페이트-3-0-~-2'-0-설페이트-D-글루코피라누로실-D-갈락토스의 반복되는 이당류 단위의 무작위 서열의 선형 중합체이다. 각 모노설페이트화된 이당류 단위는 500-600 g/mol의 분자량을 가지며, 총 중량은 5-50 kDa이다. 콘드로이틴 설페이트 분자의 부피는 많은 수의 음전하를 갖기 때문에 탈수된 고체보다 용액에서 훨씬 크며; 용액에서, 가변 가지의 음전하는 서로 밀어내고 분자를 확장된 형태로 강제한다. 이와 같이, CS 분자에는 수많은 리간드 결합 부위가 존재한다.
신규한 비천연 GAG-결합 펩티드는, 카고를 혈소판의 알파 과립에 로딩하기 위해 필수적이기 때문에, 본 개시내용의 화합물 및 방법에서 유용하다. 본 개시내용의 GAG-결합 펩티드는 약제에 화학적으로 또는 효소적으로 (직접적으로 또는 간접적으로) 링크되거나, 약제 및 -결합 펩티드를 함유하는 융합 단백질을 생성하기 위해 유전적으로 발현된다. GAG-결합 펩티드 및 결합된 약제는 새로운 화합물 또는 융합 생성물에서 그 기능을 유지한다. 따라서, 새로운 화합물 또는 융합 생성물은 혈소판의 특정 알파 과립에 선택적으로 로딩될 수 있다.
특히, 본 개시내용의 로딩된 혈소판은 혈소판을 응혈 촉진제로 제조하는 로딩 과정에 의해 활성화되기보다는 휴지 중인 완전한 기능을 하는 혈소판으로 남아 있다.
글리코사미노글리칸(GAG) 결합 펩티드
본 개시내용의 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드는, GAG 사슬 상의 공간적으로 정의된 음으로 하전된 설포기 또는 카르복실기와 이온 쌍을 형성하는, 양으로 하전된 염기성 아미노산의 존재를 특징으로 한다. 예를 들어, 헤파란 설페이트(HS)는 설포기 및 카르복실기에 의해 제공되는 이당류당 평균 2개의 음전하를 가지며; 이에 따라, HS와 단백질 사이의 가장 일반적인 유형의 상호 작용은 이온성이지만, 수소 결합 및 소수성 상호 작용과 같은 다른 비 정전기 상호작용도 또한 복합체의 안정성에 기여할 수 있다. GAG의 높은 음이온성 특성은 비특이적 결합을 유도하는 것으로 믿어져 왔다. 그러나, 혈소판의 알파 과립에서, 특정 알파 과립 서브세트의 HS 또는 콘드로이틴 설페이트(CS)에 대한 GAG 결합 펩티드의 결합은 높은 특이도로 발생한다. 이 상호작용은 GAG 결합 친화도와 GAG 결합 펩티드를 일치시킴으로써 촉진된다. GAG-펩티드 상호작용은, 복합체의 적절한 친화도 및 특이성을 보장하기 위해 중합체의 다당류 서열에 따른 설포기 및 카르복실기의 정의된 패턴 및 배향, 및 GAG-결합 펩티드에서 염기성 아미노산의 정확한 패턴에 따라 부분적으로 다르다.
정전기적 상호작용은 GAG-펩티드 상호작용에서 중요한 역할을 하며, GAG-결합 펩티드의 결합 서열 내에서 아르기닌 및 라이신과 같은 염기성 아미노산의 위치는 관련이 있다. GAG-결합 부위에 특정한 방식으로 배열된 염기성 아미노산의 공통 서열이 존재하는지 여부를 결정하기 위해 수많은 연구가 수행되었다. 예를 들어, 아포리포단백 B, 아포리포단백 E, 비트로넥틴 및 혈소판 인자 4의 4가지 단백질에서 헤파린 결합 부위를 비교한 결과 이러한 영역들은 두 개의 공통 아미노산 서열인 XBBXBX 및 XBBBXXBX를 특징으로 하는 것으로 나타났으며, 여기서 B는 염기성 잔기이고 X는 소수성 잔기이다. 분자 모델링 연구는 β-가닥 형태로 모델링된 서열 XBBXBX가 β-가닥의 한 면에 있는 염기성 아미노산과 단백질 코어를 다시 가리키는 소수성 잔기의 방향을 지정한다는 것을 보여주었다. 유사하게, XBBBXXBX 서열이 α-나선으로 접힐 때, 염기성 아미노산은 나선의 한 면에 표시된다. 일부 헤파린 결합 단백질에는 이 공통 서열이 포함되지만 그렇지 않은 것도 있다. 이와 같이, 염기성 잔기가 공간적으로는 가깝지만 1차 아미노산 서열에서 반드시 근접할 필요는 없는 구조적 모티프도 또한 헤파린에 결합할 수 있다.
헤파린 결합 부위는 종종 1, 2 또는 3개의 염기성 아미노산(XBnX, 여기서 n=1, 2 또는 3)의 클러스터를 포함한다. 하나 또는 두 개의 비염기성 잔기(BXmB, 여기서 m=1 또는 2)가 있는 이러한 클러스터의 간격은 천연 단백질에서 관찰되는데; 이것은 헤파린 결합 단백질이 일반적으로 생물학적 시스템에서 HS에 결합한다는 관찰과 일치한다. HS의 전하 밀도가 더 낮기 때문에, 최적의 단백질 결합은 염기성 아미노산의 이격된 클러스터를 포함할 수 있다. 아르기닌과 라이신은 헤파린-결합 단백질 및 HS-결합 단백질에서 가장 흔한 잔기이다. 두 아미노산 모두 생리학적 pH에서 양전하를 갖지만, 아르기닌은 헤파린에 ~2.5배 더 단단하게 결합한다. 아르기닌은 더 안정적인 수소 결합을 형성할 뿐만 아니라 설포기와 더 강한 정전기적 상호작용을 형성한다. 비염기성 잔기도 또한 헤파린-단백질 상호작용에서 중요한 역할을 할 수 있다. 그 중, 세린과 글리신은 헤파린 결합 펩티드에서 가장 흔한 비염기성 잔기로 밝혀졌다. 둘 다 작은 측쇄를 가지고 있어, 최소한의 입체적 제약과 GAG와의 펩티드 상호작용을 위한 우수한 유연성을 제공한다.
본 발명은 신규한 비천연 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드에 부분적으로 기초한다. 본 개시내용의 GAG-결합 펩티드는 혈소판의 알파 과립에서 GAG에 결합할 수 있다. 실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 정전기적 상호작용을 통해 GAG에 결합한다.
실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 콘드로이틴 설페이트(CS) 및/또는 헤파란 설페이트(HS)에 결합한다. 실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 CS에 우선적으로 결합한다. 실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 콘드로이틴 설페이트 A(CSA)에 우선적으로 결합한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드는 콘드로이틴 설페이트(CS)에 우선적으로 결합하고 제2 GAG-결합 펩티드는 헤파란 설페이트(HS)에 우선적으로 결합한다. 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드는 콘드로이틴 설페이트 A(CSA)에 우선적으로 결합하고 바람직하게는 헤파란 설페이트(HS)에 결합하지 않는다.
실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 헤파란 설페이트(HS), 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트 및/또는 GPIIb/IIIa에 결합한다. 실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 헤파란 설페이트(HS), 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트 및/또는 GPIIb/IIIa에 결합하지 않는다. 실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 HS, 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트 및/또는 GPIIb/IIIa에 결합하지 않거나, 검출 가능하게 결합하지 않거나, 실질적으로 결합하지 않거나, 낮은 친화도로 결합한다.
실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 약 1N NaCl에 노출될 때 CS 함유 컬럼에 결합된 상태로 유지된다. 실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 약 2N NaCl에 노출될 때 CS 함유 컬럼에 결합된 상태로 유지된다. 실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 약 3N NaCl에 노출될 때 CS 함유 컬럼에 결합되지 않는다.
실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 약 0.001N와 약 0.01N 사이의 NaCl에 노출될 때 HS 함유 컬럼, 세르글리신 함유 컬럼, 퍼레칸 함유 컬럼, 더마탄 설페이트 함유 컬럼, 케라탄 설페이트 함유 컬럼 및/또는 GPIIb/IIIa 함유 컬럼에 결합되지 않는다. 실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 적어도 약 0.1N의 NaCl에 노출될 때 HS 함유 컬럼, 세르글리신 함유 컬럼, 퍼레칸 함유 컬럼, 더마탄 설페이트 함유 컬럼, 케라탄 설페이트 함유 컬럼 및/또는 GPIIb/IIIa 함유 컬럼에 결합되지 않는다. 실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 적어도 약 1N의 NaCl에 노출될 때 HS 함유 컬럼, 세르글리신 함유 컬럼, 퍼레칸 함유 컬럼, 더마탄 설페이트 함유 컬럼, 케라탄 설페이트 함유 컬럼 및/또는 GPIIb/IIIa 함유 컬럼에 결합되지 않는다.
실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 길이가 약 8개 아미노산 내지 약 14개 아미노산이다.
실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 적어도 하나의 하전된 아미노산을 포함한다.
실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 적어도 하나의 프롤린, 아르기닌 및/또는 이소류신을 포함한다.
예시적인 GAG-결합 펩티드는 하기 아미노산 서열 중 하나를 포함한다: ERRIWFPYRRF (SEQ ID NO: 1); RFRWPYRIREF (SEQ ID NO: 2); ARRIWFPYRRF (SEQ ID NO: 3); EARIWFPYRRF (SEQ ID NO: 4); ERAIWFPYRRF (SEQ ID NO: 5); ERRAWFPYRRF (SEQ ID NO: 6); ERRIAFPYRRF (SEQ ID NO: 7); ERRIWAPYRRF (SEQ ID NO: 8); ERRIWFAYRRF (SEQ ID NO: 9); ERRIWFPARRF (SEQ ID NO: 10); ERRIWFPYARF (SEQ ID NO: 11); ERRIWFPYRAF (SEQ ID NO: 12); 및 ERRIWFPYRRA (SEQ ID NO: 13).
실시형태에서, GAG-결합 펩티드는, SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나와 적어도 약 70% 동일한, SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나와 적어도 약 80% 동일한, 또는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
이론에 얽매이지 않고, 염기성 잔기(예를 들어, 아르기닌)는 GAG-결합 펩티드의 특성을 정의하는 데 중요하고 소수성 잔기는 안정화를 제공하는 것으로 보인다.
실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 임의의 하나에 대해 위치 1, 위치 4, 위치 7, 또는 위치 9에 하전된 아미노산을 독립적으로 포함할 수 있다.
실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 어느 하나에 대해 위치 1, 위치 4, 위치 7, 및/또는 위치 9에 프롤린, 아르기닌, 및/또는 이소류신을 포함한다. 예로서, GAG-결합 펩티드는 위치 1, 위치 4, 위치 7 및 위치 9에 프롤린, 아르기닌 및/또는 이소류신을 포함하고; GAG-결합 펩티드는 위치 1에 프롤린, 아르기닌 및/또는 이소류신을 포함하고; GAG-결합 펩티드는 위치 1 및 위치 4에 프롤린, 아르기닌 및/또는 이소류신을 포함하고; GAG-결합 펩티드는 위치 1, 위치 4, 및 위치 7 및/또는 위치 9에 프롤린, 아르기닌 및/또는 이소류신을 포함하고; GAG-결합 펩티드는 위치 1, 위치 4, 위치 7 및 위치 9에 프롤린, 아르기닌 및/또는 이소류신을 포함하고; GAG-결합 펩티드는 위치 1 및 위치 7에 프롤린, 아르기닌 및/또는 이소류신을 포함하고; GAG-결합 펩티드는 위치 1 및 위치 4 및 위치 9에 프롤린, 아르기닌 및/또는 이소류신을 포함하고; GAG-결합 펩티드는 위치 1 및 위치 9에 프롤린, 아르기닌 및/또는 이소류신을 포함하며; 그리고 이들 사이의 임의의 조합일 수 있다. GAG-결합 펩티드는 위치 1, 위치 4, 위치 7 및 위치 9에 프롤린을 포함할 수 있고; GAG-결합 펩티드는 위치 1, 위치 4, 위치 7 및 위치 9에 아르기닌을 포함할 수 있고; GAG-결합 펩티드는 위치 1, 위치 4, 위치 7 및 위치 9에 이소류신을 포함할 수 있고; GAG-결합 펩티드는 위치 1에 프롤린, 그리고 위치 4, 위치 7, 및 위치 9에 아르기닌을 포함할 수 있고; GAG-결합 펩티드는 위치 1에 프롤린, 위치 4 및 위치 7에 아르기닌, 및 위치 9에 이소류신을 포함할 수 있고; GAG-결합 펩티드는 위치 1에 프롤린, 위치 4에 아르기닌, 및 위치 9에 이소류신을 포함할 수 있고; 또는 GAG-결합 펩티드는 위치 4에 아르기닌을 포함할 수 있고 위치 9에 프롤린을 포함할 수 있다. 프롤린, 아르기닌 및/또는 이소류신의 위치 1, 위치 4, 위치 7 및/또는 위치 9에의 임의의 조합이 본 개시내용에 포함된다.
실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 적어도 10개의 아미노산을 포함한다. 실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 11개의 아미노산을 포함한다. 실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 11개의 아미노산으로 구성된다.
실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO:2와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO:2.의 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나의 아미노산 서열로 구성된다.
본 발명은, 변이체 GAG-결합 펩티드를 생성함으로써, 예를 들어, 본원에 개시된 GAG-결합 펩티드의 아미노산 서열에 결실(deletion), 돌연변이(mutation), 삽입(insertion) 또는 번역후 변형(post-translational modification)을 포함함으로써 GAG-결합 펩티드를 최적화하는 방법을 제공한다.
변이체 GAG-결합 펩티드가 그 기능을 유지하는 한, 변이체는 하나의 아미노산 위치에서 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13의 GAG-결합 펩티드와 상이할 수 있다.
변이체 GAG-결합 펩티드가 그 기능을 유지하는 한, 변이체는 2개의 아미노산 위치에서 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13의 GAG-결합 펩티드와 상이할 수 있다.
변이체 GAG-결합 펩티드가 그 기능을 유지하는 한, 변이체는 3개의 아미노산 위치에서 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13의 GAG-결합 펩티드와 상이할 수 있다.
변이체 GAG-결합 펩티드가 그 기능을 유지하는 한, 변이체는 4개의 아미노산 위치에서 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13의 GAG-결합 펩티드와 상이할 수 있다.
변이체 GAG-결합 펩티드가 그 기능을 유지하는 한, 변이체는 5개의 아미노산 위치에서 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13의 GAG-결합 펩티드와 상이할 수 있다.
변이체 GAG-결합 펩티드가 그 기능을 유지하는 한, 변이체는 5개 이상의 아미노산 위치에서 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13의 GAG-결합 펩티드와 상이할 수 있다.
실시형태에서, 아미노산 차이는 보존적 및/또는 비보존적 치환을 포함할 수 있다. "보존적 치환(conservative substitution)"은 예를 들어 극성, 전하, 크기, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 관련 아미노산 잔기의 양친매성 성질의 유사성을 기반으로 할 수 있습니다. 20개의 자연 발생 아미노산은, 다음의 6개의 표준 아미노산 그룹: (1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr; Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및 (6) 방향족 : Trp, Tyr, Phe로 그룹화될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "보존적 치환"은 상기 나타낸 6개의 표준 아미노산 그룹의 동일한 그룹 내에 나열된 또 다른 아미노산에 의한 아미노산의 교환으로 정의된다. 예를 들어, Glu에 의한 Asp의 교환은 그렇게 변형된 폴리펩티드에서 하나의 음전하를 유지한다. 또한, 글리신과 프롤린은 α-나선을 파괴하는 능력에 따라 서로 대체될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "비보존적 치환"은 앞서 나타낸 6개의 표준 아미노산 그룹 (1) 내지 (6)의 상이한 그룹 내에 나열된 또 다른 아미노산에 의한 아미노산의 교환으로 정의된다. GAG-결합 펩티드는 아세틸화, 카르복실화, 인산화 또는 글리코실화와 같은 화학적 변경을 포함함으로써 변형될 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 다양한 글리코사미노글리칸에 대해 지시된 GAG-결합 펩티드를 특징화하고 최적화하는(예를 들어, 친화도를 증가시키는) 방법을 제공한다. 본 개시내용에 의해 제공되는 최적화된 GAG-결합 펩티드는 혈소판의 알파 과립에 존재하는 글리코사미노글리칸에 관한 것일 수 있다. 혈소판의 알파 과립에 존재하는 예시적인 글리코사미노글리칸은 콘드로이틴 설페이트, 헤파란 설페이트, 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 및 GPIIb/IIIa를 포함한다. 임의의 최적화된 GAG-결합 펩티드가 본 개시내용의 조성물에 포함될 수 있고; 임의의 조성물은, 예를 들어, 약제학적 조성물에 포함시키기 위해 및/또는 질환 또는 장애를 치료하기 위해 혈소판에 로딩될 수 있다.
화합물 및 약제
본원에 개시된 바와 같이, 혈소판의 구별되는 알파 과립형은 선택적으로 그리고 능동적으로(즉, 농도 구배에 대해) 혈관신생, 성장 및 염증 조절 단백질을 격리할 수 있다. 본 개시내용은, 단백질이 혈소판에 의해 흡수되고 글리코사미노글리칸(GAG): 주로 헤파란 설페이트(HS) 및 콘드로이틴 설페이트(CS)에 대한 친화도에 기초하여 알파 과립의 서브세트로 분리된다는 발견에 기초한다. 이러한 GAG의 길고 선형이며 음으로 하전된 사슬은 알파 과립에 대한 구조적 지지를 제공할 뿐만 아니라 알파 과립의 기능적 서브세트를 설명한다. 혈소판에 존재하는 두 가지 주요 GAG(즉, HS 및 CS)는 주로 개별 사슬에서 발견되는 이당류의 수가 다르다. 헤파란 설페이트는 작은(15-30 이당류/측쇄) 반면, 콘드로이틴 설페이트는 많은 결합 부위를 가지며 최대 250 이당류/측쇄를 갖는다. 이들은 둘 다, 연골과 뼈의 구조와 완전성을 유지하는 기능을 하는 히알루로네이트(최대 50,000개의 이당류/GAG 측쇄)와 같은 크고 뻣뻣한 GAG와는 다르다. 혈소판에 있는 GAG의 다양성은 헤파란 설페이트의 더 짧은 측쇄와 P-셀렉틴 과립의 조기 방출을 허용하는 더 약한 결합으로 인해 기능에 매우 중요한 반면; 더 단단하고 더 긴 사슬 결합은 vWF 과립의 늦은 방출을 허용한다. 이러한 특징은 본 발명에서 화합물의 순차적 방출을 위해 활용된다.
본 발명은 CS에 적어도 매우 높은 친화도로 결합하고, HS에 적어도 적당한 친화도로 결합하는 신규한 비-천연 발생 혈소판 고정 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함한다. 본 개시내용의 화합물에서 약제에 링크될 때, GAG-결합 펩티드는 약제가 혈소판의 알파 과립으로 "로딩"되는 것을 촉진한다. 혈소판은 지속적으로 순환하면서 비정상적인 내피 부위에 부착되기 때문에, 본 개시내용의 화합물은 다양한 병리학적 상태들에 광범위하게 적용될 수 있다.
본 개시내용의 일 양태는, 예를 들어, 질병 또는 장애를 치료하기 위한, 키트이다. 조성물은 제1 약제 및 제1 폴리펩티드를 포함하는 제 1 화합물로서, 제1 폴리펩티드는 혈소판의 제1 알파 과립형에서 GAG(글리코사미노글리칸) 에 결합할 수 있는 제1 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하는, 화합물; 및 제2 약제 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 제2 화합물로서, 제2 폴리펩티드는 혈소판의 제2 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제2 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하는, 화합물을 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드는 콘드로이틴 설페이트(CS)에 우선적으로 결합하고 제2 GAG-결합 펩티드는 헤파란 설페이트(HS)에 우선적으로 결합한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드는 콘드로이틴 설페이트 A(CSA)에 우선적으로 결합하고 바람직하게는 헤파란 설페이트(HS)에 결합하지 않는다.
실시형태에서, 제1 알파 과립형은 P-셀렉틴 회합 과립이고 제2 알파 과립형은 폰 빌레브란트 인자(VWF) 회합 과립이다.
실시형태에서, 제1 알파 과립형의 내용물은 고친화성 트롬빈 수용체 PAR1를 통해 방출되고 제2 알파 과립형의 내용물은 저친화성 트롬빈 수용체 PAR4를 통해 방출되고, 선택적으로, 알파 과립의 내용물은 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 퍼옥시다제, 포스포히드롤라제, 플라스민, 또는 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)와 같은 플라스민 유도체와의 접촉에 대한 반응으로 방출될 수 있다.
실시형태에서, 제1 알파 과립형의 내용물은 제2 알파 과립형의 내용물의 방출을 제공하기 위해 필요한 트롬빈 농도보다 더 낮은 트롬빈 농도에서 방출된다.
실시형태에서, 제1 알파 과립형의 내용물은 제2 알파 과립형의 내용물이 방출되기 전에 방출된다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드의 길이는 각각 약 8개 아미노산 내지 약 14개 아미노산이다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드 중 하나 또는 모두는 적어도 하나의 하전된 아미노산을 포함한다. 일부 경우, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드 중 모두는 적어도 하나의 하전된 아미노산을 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드 중 하나 또는 모두는 적어도 하나의 프롤린, 아르기닌, 및/또는 이소류신을 포함한다. 일부 경우, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 적어도 적어도 하나의 프롤린, 아르기닌, 및/또는 이소류신을 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나와 적어도 약 70% 동일한 아미노산 서열을 독립적으로 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나와 적어도 약 80% 동일한 아미노산 서열을 독립적으로 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 독립적으로 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 임의의 하나에 대해 위치 1, 위치 4, 위치 7, 또는 위치 9에 하전된 아미노산을 독립적으로 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 어느 하나에 대해 위치 1, 위치 4, 위치 7, 및/또는 위치 9에 프롤린, 아르기닌, 및/또는 이소류신을 독립적으로 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 적어도 10개의 아미노산을 독립적으로 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및/또는 제2 GAG-결합 펩티드는 적어도 11개의 아미노산을 독립적으로 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 11개의 아미노산으로 독립적으로 구성된다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 2와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우, 제1 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함한다. 제1 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
실시형태에서, 제1 폴리펩티드는 제1 GAG-결합 펩티드로 구성되고, 제2 폴리펩티드는 제2 GAG-결합 펩티드로 구성된다.
실시형태에서, 제1 폴리펩티드의 N-말단은 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고/되거나 제2 폴리펩티드의 N-말단은 제2 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다.
실시형태에서, 제1 폴리펩티드의 C-말단은 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고/되거나 제2 폴리펩티드의 C-말단은 제2 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다.
본원에 개시된 임의의 양태 또는 실시형태에서, 약제(제1, 제2, 또는 제3) 및 GAG-결합 펩티드(제1, 제2, 또는 제3)는 직접 연결될 수 있거나 링커로 지칭되는 모이어티를 통해 연결될 수 있다. 링커는 약제를 GAG-결합 펩티드에 공유적으로 부착하는 원자의 사슬 또는 공유 결합을 포함하는 화학적 모이어티를 지칭한다. 링커는, 알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌과 같은 2가 라디칼, -(CR2)nO(CR2)n-, 알킬옥시(예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리메틸렌옥시) 및 알킬아미노 (예를 들어, 폴리에틸렌아미노, 제파민™)의 반복 단위 중합체; 및 숙시네이트, 숙신아미드, 디글라이콜레이트, 말로네이트, 및 카프로아미드를 포함하는 이산 에스테르 및 아미드를 포함한다. 실시형태에서, 링커는 아미노산 사슬을 포함한다. 실시형태에서, 아미노산 사슬 링커는 약 500개 아미노산 길이, 약 450개 아미노산 길이, 약 400개 아미노산 길이, 약 350개 아미노산 길이, 약 300개 아미노산 길이, 약 250개 아미노산 길이, 약 200개 아미노산 길이, 약 150개 아미노산 길이 또는 약 100개 아미노산 길이 미만이다. 예를 들어, 아미노산 사슬 링커는 약 100, 약 95, 약 90, 약 85, 약 80, 약 75, 약 70, 약 65, 약 60, 약 55, 약 50, 약 45, 약 40, 약 35, 약 30, 약 25, 약 20, 약 19, 약 18, 약 17, 약 16, 약 15, 약 14, 약 13, 약 12, 약 11, 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 또는 약 2개의 아미노산 길이 미만이다. 실시형태에서, 아미노산 사슬 링커는 약 15개 아미노산 내지 약 3개 아미노산, 예를 들어, 약 10개 내지 5개 아미노산이다.
실시형태에서, 제1 약제는 제1 링커를 통해 제1 폴리펩티드에 간접적으로 연결되고/되거나 제2 약제는 제2 링커를 통해 제2 폴리펩티드에 간접적으로 연결된다. 일부 경우, 제1 링커 및/또는 제2 링커는 각각 하나 이상의 원자를 포함한다. 제1 링커 및/또는 제2 링커는 각각 반복 단위의 중합체를 포함할 수 있다. 제1 링커 및/또는 제2 링커는 각각 아미노산 사슬을 포함할 수 있다.
실시형태에서, 제1 약제는 제1 폴리펩티드에 직접적으로 연결되고/되거나 제2 약제는 제2 폴리펩티드에 직접적으로 연결된다.
실시형태에서, 말레이미드 반응, 숙신이미딜 에스테르 반응, 효소 반응, 또는 단백질 구조 또는 활성에 영향을 미치지 않는 다른 접합 시스템을 사용하여 제1 약제는 제1 폴리펩티드에 직접적으로 연결되고/되거나 제2 약제는 제2 폴리펩티드에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다.
실시형태에서, 제1 약제 및/또는 제2 약제는 항체, 화학요법제, 세포독성 화합물, 소분자, 형광성 모이어티, 방사성 요소, 면역 관문 억제제, 성장 인자, 성장 억제제, 프로테아제/프로테이나제, 응고 인자, 지질 또는 인지질, 세포외 기질 단백질, 호르몬, 효소, 케모카인/화학유인물질, 뉴로트로핀, 티로신 키나제(작용제 또는 억제제), 또는 세포 증식, 혈관신생, 염증, 면역 또는 혈소판에 의해 매개되거나 혈소판과 연관되는 다른 생리적 과정을 억제하는 인자를 포함한다. 일부 경우, 제1 약제 및/또는 제2 약제는 항체 또는 형광성 모이어티를 포함한다.
본 발명에서 유용한 예시적인 항체(또는 이의 단편)는, 3F8, 8H9, 아바고보맙, 압식시맙, 아비투주맙, 아브레제키맙, 아브릴루맙, 악톡수맙, 아달리무맙, 아데카투무맙, 아두카누맙, 아파세비쿠맙, 아펠리모맙, 알라시주맙 페골, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 알투모맙 펜테테이트, 아마툭시맙, 아나투모맙 마페나톡스, 안데칼릭시맙, 아네투맙 라브탄신, 아니프롤루맙, 안루킨주맙(IMA-638), 아폴리주맙, 아푸투맙 익사도틴, 아르시투모맙, 아스크린바쿠맙, 아셀리주맙, 아테조리주맙, 아티도르토주맙, 아티누맙, 아토로리무맙, 아베루맙, 아진툭시주맙 베도틴, 바피뉴주맙, 바실릭시맙, 바비툭시맙, BCD-100, 베투모맙, 베겔로맙, 벨란타맙 마포도틴, 벨리무맙, 베마리투주맙, 벤랄리주맙, 벨리마톡수맙, 버메키맙, 베르산리맙, 베르틸리무맙, 베실레소맙, 베바시주맙, 베즐로톡수맙, 비시로맙, 비마그루맙, 비메키주맙, 비르타미맙, 비바투주맙 메르탄신, 블레셀루맙, 블리나투모맙, 블론투베트맙, 블로소주맙, BMS 936559, 보코시주맙, 브라지쿠맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브리아키누맙, 브로달루맙, 브롤루시주맙, 브론틱투주맙, 부로수맙, 카비랄리주맙, 카미단루맙 테시린, 캄렐리주맙, 카나키누맙, 칸투주맙 메르탄신, 칸투주맙 라브탄신, 카플라시주맙, 카프로맙 펜데티드, 칼루맙, 카로툭시맙, 카투막소맙, cBR96-독소루비신 면역접합체, 세델리주맙, 세미플리맙, 세르구투주맙 아뮤날류킨, 세르톨리주맙 페골, 세트렐리맙, 세툭시맙, 시비사타맙, 시름투주맙, 시타투주맙 보가톡스, 시수투무맙, 클라자키주맙, 클레놀릭시맙, 클리바투주맙 테트락세탄, 코드리투주맙, 코페투주맙 펠리도틴, 콜툭시맙 라브탄신, 코나투무맙, 콘시주맙, 코스프로비시맙, CR6261, 크레네주맙, 크리잔리주맙, 크로테두맙, 쿠사투주맙, 다세투주맙, 다클리주맙, 달로투주맙, 다피로리주맙 페골, 다라투무맙, 덱트레쿠맙, 뎀시주맙, 데닌투주맙 마포도틴, 데노수맙, 데파툭시주맙 마포도틴, 데를로툭시맙 비오틴, 데투모맙, 데자미주맙, 디누툭시맙, 디리다부맙, 도마그로주맙, 돌리모맙 아리톡스, 도스타리맙, 드로지투맙, DS-8201, 둘리고투주맙, 두필루맙, 더발루맙, 두시기투맙, 두보르툭시주맙, 에크로멕시맙, 에쿨리주맙, 에도바코맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에푼구맙, 엘델루맙, 엘레자누맙, 엘젬투맙, 엘로투주맙, 엘실리모맙, 에막투주맙, 에마팔루맙, 에미베투주맙, 에미시주맙, 에나포타맙 베도틴, 에나바투주맙, 엔포르투맙 베도틴, 엔리모맙 페골, 에노블리투주맙, 에노키주맙, 에노티쿠맙, 엔시툭시맙, 에피투모맙 시툭세탄, 에프라투주맙, 엡티네주맙, 에레누맙, 에를리주맙, 에르투막소맙, 에타라시주맙, 에티길리맙, 에트롤리주맙, 에비나쿠맙, 에볼로쿠맙, 엑스비비루맙, 파놀레소맙, 파라리모맙, 파리시맙, 팔레투주맙, 파시누맙, FBTA05, 펠비주맙, 페자키누맙, 피바투주맙, 피클라투주맙, 피기투무맙, 피리주맙, 플란보투맙, 플레티쿠맙, 플로테투주맙, 폰톨리주맙, 포랄루맙, 포라비루맙, 프레마네주맙, 프레솔리무맙, 프로보시맙, 프루네벳맙, 플라누맙, 프툭시맙, 갈라네주맙, 갈릭시맙, 간코타맙, 가니투맙, 간테네루맙, 가티포투주맙, 가빌리모맙, 게디부맙, 젬투주맙 오조가미신, 게보키주맙, 길벳맙, 김실루맙, 지렌툭시맙, 글렘바투무맙 베도틴, 골리무맙, 고밀릭시맙, 고수라네맙, 구셀쿠맙, 이아날루맙, 이발리주맙, IBI308, 이브리투모맙 티욱세탄 및 90Y-이브리투모맙 티욱세탄, 이크루쿠맙, 이다루시주맙, 이파보투주맙, 이고보맙, 일라다투주맙 베도틴, IMAB362, 이말루맙, 이마프렐리맙, 임시로맙, 임가투주맙, 인클라쿠맙, 인다툭시맙 라브탄신, 인두사투맙 베도틴, 이네빌리주맙, 인플릭시맙, 이놀리모맙, 이노투주맙 오조가미신, 인테투무맙, 이오맙-B, 이필리무맙, 이라투무맙, 이사툭시맙, 이스칼리맙, 이스티라투맙, 이톨리주맙, 익세키주맙, 켈릭시맙, 라베투주맙, 락노투주맙, 라디라투주맙 베도틴, 람팔리주맙, 라나델루맙, 란도그로주맙, 라프리툭시맙 엠탄신, 라르카빅시맙, 레브리키주맙, 레말레소맙, 렌달리주맙, 렌베르비맙, 렌질루맙, 레르델리무맙, 레론리맙, 레소파무맙, 레톨리주맙, 렉사투무맙, 리비비루맙, 리파투주맙 베도틴, 리겔리주맙, 릴로토맙 사테트라크세탄, 린투주맙, 리릴루맙, 로델시주맙, 로키벳맙, 론카툭시맙 테시린, 로보투주맙 메르탄신, 로사툭시주맙 베도틴, 루카툼무맙, 룰리주맙 페골, 루밀릭시맙, 룸레투주맙, 루파투맙 아마도틴, 룩티키주맙, 마파투무맙, 마르게툭시맙, 마르스타시맙, 마슬리모맙, 마투주맙, 마브릴리무맙, 메폴리주맙, 메텔리무맙, 밀라투주맙, 민레투모맙, 미리키주맙, 미르베툭시맙 소라브탄신, 미투모맙, MK-3475, 모도툭시맙, 모가물리주맙, 모날리주맙, 모로리무맙, 모수네투주맙, 모타비주맙, 목세투모맙 파수도톡스, MPDL328OA, 무로모납-CD3, 나콜로맙 타페나톡스, 나밀루맙, 나프투모맙 에스타페나톡스, 나라툭시맙 엠탄신, 나르나투맙, 나탈리주맙, 나비식시주맙, 나비부맙, 낙시타맙, 네바쿠맙, 네시투무맙, 네몰리주맙, NEOD001, 네렐리모맙, 네스바쿠맙, 네타키맙, 니모투주맙, 니르세비맙, 니볼루맙, 노페투모맙 메르펜탄, 오빌톡시맙, 오비누투주맙, 오카라투주맙, 오크렐리주맙, 오둘리모맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 올레클루맙, 올렌달리주맙, 올로키주맙, 오말리주맙, 옴부르타맙, OMS721, 오나르투주맙, 온툭시주맙, 온바틸리맙, 오피시누맙, 오포르투주맙 모나톡스, 오레고보맙, 오르티쿠맙, 오텔릭시주맙, 오틸리맙, 오틀레투주맙, 옥셀루맙, 오자네주맙, 오조랄리주맙, 파기박시맙, 팔리비주맙, 팜레브루맙, 파니투무맙, 판코맙, 파노바쿠맙, 파르사투주맙, 파스콜리주맙, 파소툭시주맙, 파테클리주맙, 파트리주맙, PDR001, 펨브롤리주맙, 펨투모맙, 페라키주맙, 페르투주맙, 펙셀리주맙, 피딜리주맙, 피나투주맙 베도틴, 핀투모맙, 플라쿨루맙, 플로잘리주맙, 포갈리주맙, 폴라투주맙 베도틴, 포네주맙, 포르가빅시맙, 프라시네주맙, 프레잘리주맙, 프릴릭시맙, 프리톡사시맙, 프리투무맙, PRO 140, 퀼리주맙, 라코투모맙, 라드레투맙, 라피비루맙, 랄판시주맙, 라무시루맙, 라네벳맙, 라니비주맙, 라바갈리맙, 라불리주맙, 락시바쿠맙, 레파네주맙, 레가비루맙, 렐라틀리맙, 렘톨루맙, 레슬리주맙, 리로투무맙, 리누쿠맙, 리산키주맙, 리툭시맙, 리바바주맙 페골, 르맙, 로바투무맙, 롤레두맙, 로밀키맙, 로모소주맙, 론탈리주맙, 로스만투주맙, 로발피투주맙 테시린, 로벨리주맙, 로자놀릭시주맙, 루플리주맙, SA237, 사시투주맙 고비테칸, 사말리주맙, 삼로타맙 베도틴, 사릴루맙, 사트랄리주맙, 사투모맙 펜데티드, 세쿠키누맙, 셀리크렐루맙, 세리반투맙, 세톡악시맙, 세트루수맙, 세비루맙, SGN-CD19A, SHP647, 시브로투주맙, 시팔리무맙, 실툭시맙, 심투주맙, 시플리주맙, 시르트라투맙 베도틴, 시루쿠맙, 소피투주맙 베도틴, 솔라네주맙, 솔리토맙, 손피주맙, 손투주맙, 스파르탈리주맙, 스타물루맙, 술레소맙, 수프타무맙, 수팀리맙, 수비주맙, 수브라톡수맙, 타발루맙, 타카투주맙 테트라세탄, 타도시주맙, 탈라코투주맙, 탈리주맙, 탐투베트맙, 타네주맙, 타플리투모맙 팝톡스, 타렉스투맙, 타볼리맙, 테피바주맙, 텔리모맙 아리톡스, 텔리소투주맙 베도틴, 테나투모맙, 테네릭시맙, 테플리주맙, 테포디타맙, 테프로투무맙, 테시돌루맙, 테툴로맙, 테제펠루맙, TGN1412, 티불리주맙, 티가투주맙, 틸드라키주맙, 티미구투주맙, 티몰루맙, 티라고투맙, 티슬레리주맙, 티소투맙 베도틴, TNX-650, 토실리주맙, 토무조툭시맙, 토랄리주맙, 토사톡수맙, 토시투모맙 및 131I-토시투모맙, 토베투맙, 트랄로키누맙, 트라스투주맙, 트라스투주맙 엠탄신, TRBS07, 트레갈리주맙, 트레멜리무맙, 트레보그루맙, 투코투주맙 셀몰류킨, 투비루맙, 유블리툭시맙, 울로쿠플루맙, 우렐루맙, 우르톡사주맙, 우스테키누맙, 우토밀루맙, 바다툭시맙 탈리린, 바날리맙, 반도르투주맙 베도틴, 반틱투맙, 바누시주맙, 바팔릭시맙, 바리사쿠맙, 바르릴루맙, 바텔리주맙, 베돌리주맙, 벨투주맙, 베팔리모맙, 베센쿠맙, 비실리주맙, 보바릴리주맙, 볼로식시맙, 본레로리주맙, 보프라틀리맙, 보르세투주맙 마포도틴, 보투무맙, 부나키주맙, 젠투주맙, XMAB-5574, 잘루투무맙, 자놀리무맙, 자툭시맙, 제노쿠투주맙, 지랄리무맙, 졸베툭시맙(IMAB362, 클라우디시맙), 및 졸리모맙 아리톡스를 포함한다.
규제 승인을 충족했거나 보류 중인 본 발명에 유용한 예시적인 항체(또는 이의 단편)는, 무로모납-CD3(ORTHOCLONE OKT3), 에팔리주맙(RAPTIVA), 토시투모맙-I131(BEXXAR), 네바쿠맙(CENTOXIN), 에드레콜로맙(PANOREX), 카투막소맙(REMOVAB), 다클리주맙(ZINBRYTA; ZENAPAX), 압시맙(REOPRO), 리툭시맙(MABTERA, RITUXAN), 바실릭시맙(SIMULECT), 팔리비주맙(SYNAGIS), 인플릭시맙(REMICADE), 트라스투주맙(HERCEPTIN), 아달리무맙(HUMIRA), 이브리투모맙 티욱세탄(ZEVALIN), 오말리주맙(XOLAIR), 세툭시맙(ERBITUX), 베바시주맙(AVASTIN), 나탈리주맙(TYSABRI), 파니투무맙(VECTIBIX), 라니비주맙(LUCENTIS), 에쿨리주맙(SOLIRIS), 세르톨리주맙 페골(CIMZIA), 우스테키누맙(STELARA), 카나키누맙(ILARIS), 골리무맙(SIMPONI), 오파투무맙(ARZERRA), 토실리주맙(ROACTEMRA, ACTEMRA), 데노수맙(PROLIA), 벨리무맙(BENLYSTA), 이필리무맙(YERVOY), 브렌툭시맙 베도틴(ADCETRIS), 페르투주맙(PERJETA), 아도트라스투주맙 엠탄신(KADCYLA), 락시바쿠맙), 오비누투주맙(GAZYVA, GAZYVARO), 실툭시맙(SYLVANT), 라무시루맙(CYRAMZA), 베돌리주맙(ENTYVIO), 니볼루맙(OPDIVO), 펨브롤리주맙(KEYTRUDA), 블리나투모맙(BLINCYTO), 알렘투주맙(LEMTRADA, MABCAMPATH, CAMPATH-1H), 에볼로쿠맙(REPATHA), 이다루시주맙(PRAXBIND), 네시투무맙(PORTRAZZA), 디누툭시맙(UNITUXIN), 세쿠키누맙(COSENTYX), 메폴리주맙(NUCALA), 알리로쿠맙(PRALUENT), 다라투무맙(DARZALEX), 엘로투주맙(EMPLICITI), 익세키주맙(TALTZ), 레슬리주맙(CINQAERO, CINQAIR), 올라라투맙(LARTRUVO), 베즐로톡수맙(ZINPLAVA), 아테졸리주맙(TECENTRIQ), 오빌톡시맙(ANTHIM), 브로달루맙(SILIQ, LUMICEF), 두필루맙(DUPIXENT), 이노투주맙 오조가미신(BESPONSA), 구셀쿠맙(TREMFYA), 사릴루맙(KEVZARA), 아벨루맙(BAVENCIO), 에미시주맙(HEMLIBRA), 오크렐리주맙(OCREVUS), 벤랄리주맙(FASENRA), 더발루맙(IMFINZI), 젬투주맙 오조가미신(MYLOTARG), 에레누맙, 에레누맙-아오에(AIMOVIG), 갈카네주맙, 갈카네주맙-gnlm(EMGALITY), 부로수맙, 부로수맙-트자(CRYSVITA), 라나델루맙, 라나델루맙-플라이(TAKHZYRO), 모가물리주맙, 모가물리주맙-kpkc(POTELIGEO), 틸드라키주맙; 틸드라키주맙-asmn(ILUMYA), 프레마네주맙, 프레마네주맙-vfrm(AJOVY), 라불리주맙, 라불리주맙-cwvz(ULTOMIRIS), 세미플리맙, 세미플리맙-rwlc(LIBTAYO), 이발리주맙, 이발리주맙-uiyk(TROGARZO), 에마팔루맙, 에마팔루맙-lzsg(GAMIFANT), 목세투모맙 파수독스, 목세투모맙 파수도톡스-tdfk (LUMOXITI), 카플라시주맙, 카플라시주맙-yhdp(CABLIVI), 리산키주맙, 리산키주맙-rzaa(SKYRIZI), 폴라투주맙 베도틴, 폴라투주맙 베도틴-piiq(POLIVY), 로모소주맙, 로모소주맙-aqqg(EVENITY), 브롤루시주맙, 브롤루시주맙-dbll(BEOVU), 크리잔리주맙; 크리잔리주맙-tmca(ADAKVEO), 엔포르투맙 베도틴, 엔포르투맙 베도틴-ejfv(PADCEV), [fam-]트라스투주맙 데룩스테칸, 팸-트라스투주맙 데룩스테칸-nxki(ENHERTU), 테프로투무맙, 테프로투무맙-trbw (TEPEZZA), 엡티네주맙, 엡티네주맙-jjmr(VYEPTI), 이사툭시맙, 이사툭시맙-irfc(SACLISA), 사시투주맙 고비테칸; 사시투주맙 고비테칸-hziy(TRODELVY), 이네빌리주맙; 이네빌리주맙-cdon(UPLIZNA), 사트랄리주맙(ENSPRYNG), 도스타리맙(TSR-042), 수팀리맙(BIVV009), 레론리맙, 나르소플리맙, 타파시타맙, REGNEB3, 낙시타맙, 오포르투주맙 모나톡스, 벨란타맙 마포도틴, 마르게툭시맙, 타네주맙, 테플리주맙, 아두카누맙, 에비나쿠맙, 트랄로키누맙 및 옴부르타맙을 포함한다.
항체의 단편은 적어도 상기 언급된 항체의 항원 결합 도메인을 포함할 것이다. 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 항체, 항체 단편, scFv, Fv, Fab, (Fab')2, 단일 도메인 항체(SDAB), VH 또는 VL 도메인, 또는 낙타과 VHH 도메인, 예를 들어, 인간 scFv, 인간 Fv, 인간 Fab, 인간(Fab')2, 인간 단일 도메인 항체(SDAB), 또는 인간 VH 또는 VL 도메인 또는 인간화 scFv, 인간화 Fv, 인간화 Fab, 인간화(Fab' )2, 인간화 단일 도메인 항체(SDAB), 또는 인간화 VH 또는 VL 도메인이다.
본 발명에 유용한 예시적인 화학요법제는, 2,3,4,5,6-펜타플루오로-N-(3-플루오로-4-메톡시페닐)벤젠 술폰아미드, 3',4'-디데히드로-4'-데옥시-8'-노르빈-칼류코블라스틴, 5-FU(플루오로우라실), 아베마시클립, 아비라테론 아세테이트, 아비트렉세이트(메토트렉세이트), 아브락산(파클리탁셀 알부민 안정화 나노입자 제형), ABVD, ABVE, ABVE-PC, AC, 아칼라브루티닙, AC-T, ADE, 아드리아미신(독소루비신), 아파티닙 디말레아테, 아피니토르(에볼리무스), 아피니토르 디프페레스(에볼리무스), 아킨제오(네투피탄트 및 팔로노세트론), 알다라(이미퀴모드), 알데스류킨, 알레센자(알렉티닙), 알렉티닙, 알림타(PEMETREXED), 알리코파(코판리시브 염산염), 알케란(멜팔란), 알록시(팔로노세트론 염산염), 알트레타민, 알룬브리그(브리가티닙), 암보클로린(클로람부실), 암보클로린(클로람부실), 아미포스틴, 아미노레불린산, 아나스트로졸, 안하이드로빈블라스틴, 아프레피탄트, 아레디아(파미드로네이트), 아리미덱스(아나스트로졸), 아로마신(엑세메스탄), 아라논(넬라라빈), 삼산화비소, 아스파라기나제 에르위니아 크리산테미, 아우리스타틴, 악시캅타진 실로류셀, 악시티닙, 아자시티딘, BEACOPP, 베세눔(카르무스틴), 벨레오닥(벨리노스타트), 벨리노스타트, 벤다무스틴염산염, BEP, 벡사로텐, 비칼루타미드, BiCNU(카르무스틴), 블레녹산(블레오마이신), BMS184476, 보르테조밉, 보술리프(보수티닙), 보수티닙, 브리가티닙, 부멜, 부설판, 부설펙스(부설판), 카바지탁셀, 카보메틱스(카보잔티닙), 카보잔티닙-S-말레이트, CAF, 칼퀀스(아칼라브루티닙), 캄토사(이리노테칸 염산염), 카페시타빈, CAPOX, 카프렐사(반데타닙), 카라크(플루오로라실--국소), 카보플라틴, 카보플라틴-택솔, 카르필조미브, 카르무브리스(카무스틴), 카르무스틴, 카소덱스(비칼루타미드), 카셍틴, CeeNU(로무스틴), CEM, 세마도틴, 세리티닙, 세루비딘(다우노루비신), 서바릭스(재조합 HPV 2가 백신), CEV, 클로람부실, 클로람부실-프레드니손, CHOP, 시스플라틴, 클라드리빈, 클라펜(시클로포스파미드), 클로파라빈, 클로파렉스(클로파라빈), 클로라(클로파라빈), CMF, 코비메티닙, 코메트리크(카보잔티닙), 코판리시브 염산염, COPDAC, COPP, COPP-ABV, 코스메젠(닥티노마이신), 코텔릭(코비메티닙), 크립토피신, 크리조티닙, CVP, 시클로포스파미드, 시포스(이포스파미드), 시타라빈, 시타라빈 리포좀, 시토사-U(시타라빈), 시톡산(시클로포스파미드), 시톡산(사이톡산), 다브라페닙, 다카르바진, 다코젠(데시타빈), 닥티노마이신, 다사티닙, 다우노루비신 염산염, 다우노루비신 염산염 및 시타라빈 리포솜, 다우녹솜(다우노루비신 지질 복합체), 데카드론(덱사메타손), 데시타빈, 디피브로타이드 나트륨, 디피텔리오(디피브로타이드 나트륨), 드가렐릭스, 데닐류킨 디피톡스, 데포시트(시타라빈 리포솜), 덱사메타손, 덱사메타손 인텐솔(덱사메타손), 덱스팍 테이퍼팍(덱사메타손), 엑스라족산 염산염, 도세프레즈(도세탁셀), 도세탁셀, 도세탁솔, 돌라스타틴, 독세탁셀, 독실(독소루비신 염산염 리포솜), 독소루비신 염산염, 독소루비신 염산염 리포솜, Dox-SL(독소루비신 염산염 리포솜), 드록시아(하이드록시우레아), DTIC(데카바진), DTIC-돔(다카바진), 에푸덱스(플루오로라실--국소), 엘리가드(류프롤리드), 엘리텍(라스부리카제), 엘렌스(엘렌스(에피루비신)), 엘록사틴(옥살리플라틴), 엘스파(아스파라기나아제), 엘트롬보팍 올라민, 엠시트(에스트라무스틴), 에멘드(아프레피탄트), 에나시데닙 메실레이트, 엔잘루타미드, 에피루비신 염산염, EPOCH, 에리불린 메실레이트, 에리베지(비스모데집), 에를로티닙 염산염, 에르위나제(아스파라기나제 에르위니아 크리산테미), 에스욜(아미포스틴), 에토포포스(에토포사이드 인산염), 에토포사이드, 에토포사이드 인산염, 유렉신(플루타미드), 에바세트(독소루비신 염산염 리포솜), 에베로리무스, 에비스타(랄록시펜 염산염), 에보멜라(멜팔란 염산염), 엑스메스탄, 파레스톤(토레미펜), 파리다크(파노비노스타트), 파슬로덱스(풀베스트란트), FEC, 페마라(레트로졸), 필그라스팀, 퍼마곤(데가렐릭스), 피나스테리드, 플로프레드(프레드니솔론), 플루다라(플루다라빈), 플루다라빈 인산염, 플루오로플렉스(플루오로우라실), 플루오로우라실, 플루타미드, 폴렉스(메토트렉세이트), 폴렉스 PFS(메토트렉세이트), FOLFIRI, FOLFIRINOX, FOLFOX, 폴로틴(프랄라트렉세이트), FUDR (FUDR (플로수리딘)), FU-LV, 풀베스트란트, 가다실(재조합 HPV 4가 백신), 가다실 9(재조합 HPV 비가 백신), 제피티닙, 젬시타빈 염산염, GEMCITABINE-CISPLATIN, GEMCITABINE-OXALIPLATIN, 젬자르(젬시타빈), 길로트리프(아파티닙 디말레에이트), 길로트리프(아파티닙), 글리벡(이마티닙 메실레이트), 글리아델(카르무스틴), 글루카르피다제, 고세렐린 아세테이트, 할라벤(에리불린 메실레이트), 헤만걸(프로프라놀롤 염산염), 헥살렌(알트레타민), HPV 2가 백신, 재조합, HPV 비가 백신, 재조합형, HPV 4가 백신, 재조합형, 하이캄틴(토포테칸 염산염), 하이캄틴(토포테칸), 하이드레아(하이드록시우레아), 하이드록시우레아, 하이드록시우레아탁산, 하이퍼-CVAD, 입랜스(팔보시클립), 이브루티닙, ICE, 아이클루시그(포나티닙), 이다마이신 PFS(이다루비신), 이다루비신염산염, 이델라리십, 이디파(에나시데닙), 이펙스(이포스파미드), 이포스파미드, 이포스파미덤(이포스파미드), 이마티닙 메실레이트, 임브루비카(이브루티닙), 이미퀴모드, 이밀직(탈리모진 라헤르파렙벡), 인리타(악시티닙), 이레사(제피티닙), 이리노테칸 염산염, 이리노테칸 염산염 리포솜, 이스토닥스(로미뎁신), 익사베필론, 익사조밉 시트레이트, 익셈프라(익사베필론), 자카피(룩소리티닙 인산염), 자카피(룩소리티닙), JEB, 제브타나(카바지탁셀), 케옥시펜(랄록시펜염산염), 케피반스(팔리퍼민), 키스칼리(리보시클립), 키프롤리스(카르필조밉), 란레오타이드 아세테이트, 란비마(렌바티닙), 라파티닙 디토실레이트, 레날리도마이드, 렌바티닙 메실레이트, 렌비마(렌바티닙 메실레이트), 레트로졸, 류코보린 칼슘, 류케란(클람부실), 류카인(사르그램오스팀), 레우프로라이드 아세테이트, 레우스타틴(클래드리빈), 레불란(아미노레불린산), 리아로졸, 린폴리진(클람부실), 립독스(독소루비신 염산염 리포솜), 로무스틴, 로니다민, 론서프(트리플루리딘과 티피라실), 루프론(레오프롤라이드), 린파르사(올라파립), 리소드렌(미토테인), 마르키보(빈크리스틴 황산염 리포솜), 마르키보 키트(빈크리스틴 지질 복합체), 마툴레인(프로카바진), 메클로레타민 염산염, 메가스(메게스트롤), 아세트산 메게스트롤, 메키니스트(트라메티닙), 멜팔란, 멜팔란 염산염, 머캅토퓨린, 메스넥스(메스나), 메타스트론(스트론튬-89 클로라이드), 메타졸라스톤(테모졸로마이드), 메토트렉세이트, 메토트렉세이트 LPF(메토트렉세이트), 메틸날트렉손 브로마이드, 멕사테(메토트렉세이트), 멕사테-AQ(메토트렉세이트), 미도스타우린, 미토마이신C, 미톡산트론 염산염, 미토지트렉스(미토마이신 C), 미보불린 이세티온, MOPP, 모스타리나(프레드니무스틴), 모조빌(플레리사포르), 무스타겐(메클로레타민), 무타마이신(미토마이신), 밀러란(부설판), 밀로사(아자시티딘), 나노입자 파클리탁셀(파클리탁셀 알부민-안정화 나노입자 제형), 나벨빈(비노렐빈), 네라라빈, 네오사르(시클로포스파미드), 네라티닙 말레테, 네라티닙(네라티닙), 네투픽티브 및 팔로노세트론 염산염, 네울라스타(필그라스팀), 네울라스타(페그필라스팀), 네우포겐(필그라스팀), 넥사바르(소라페닙), 닐란드론(닐루타미드), 닐로티닙, 닐루타미드, 닌라로(익사조밉), 니펜트(펜토스타틴), 니라파립 토실레이트 일수화물, N,n-디메틸-1-발릴-1-발릴-n-메틸-1-발릴-1-프롤리-1-프롤린-t-부틸아미드, 노바덱스(타목시펜), 노반트론(미톡산트론), N플레이트(로미플로스팀), 오돔조(소니데지브), OEPA, OFF, 올라파립, 오마세탁신 메페수치네이트, 오나프리스톤, 온카스파르(페가스파르가제), 온코빈(빈크리스틴), 온단세트론 염산염, 오니비데(이리노테칸 염산염 리포좀), 온탁(데닐류킨 디피톡스), 온솔(파클리탁셀), OPPA, 오라프레드(프레드니솔론), 오시메르티닙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파클리탁셀 알부민 안정화 나노입자 제형, PAD, 팔보시클립, 팔리페르민, 팔로노세트론 염산염, 팔로노세트론 염산염 및 네투피탄트, 파미드로네이트 이나트륨, 파노비노스타트, 판레틴(알리트레티노인), 파라플라트(카르보플라틴), 파조파닙 염산염, PCV, PEB, 페디아프레드(프레드니솔론), 페가수파르가제, 페그필그라스템, 페메트렉세드디소듐, 플라티놀(시스플라틴), 플라티놀AQ(시스플라틴), 플레릭사포, 폼촉매(포말리도마이드), 포나티닙 염산염, 프랄라트렉세이트, 프레드니무스틴, 프레드니손, 프로카바진염산염, 프로류킨(알데스류킨), 프로막타(엘트롬보팍 올라민), 프로프라놀롤 염산염, 퓨리네톨(메르캅토퓨린), 퓨리산(메르캅토퓨린), 라듐 223 이염화물, 랄록시펜염산염, 라스부리카제, R-CHOP, R-CVP, 리클라스트(졸레드론산), 재조합 인유두종바이러스(HPV) 2가 백신, 재조합 인유두종바이러스(HPV) 비가 백신, 재조합 인유두종바이러스(HPV) 4가 백신, 레고라페닙, 레리스터(메틸날트렉손 브로마이드), R-EPOCH, 레블리미드(레날리도마이드), 류마트렉스(메토트렉세이트), 리족신, 리보시클립, R-ICE, 롤라퓨티브 염산염, 로미덱신, 로미플로스팀, Rpr109881, 루벡스(독소루비신), 루비도마이신(다우노루비신 염산염), 루브라카(루카파리브), 루카파리브 캠실레이트, 루콜리티닙 인산염, 라이답트(미도스타우린), 산도스타틴(옥트레오타이드), 산도스타틴 LAR 디포(옥트레오타이드), 스클레로솔 내부 에어로졸(탈크), 세르테프, 솔타목스(다목시펜), 소마툴리네 창고(란레오타이드 아세테이트), 소니데깁, 소라페닙 토실레이트, 스프리셀(다사티닙), STANFORD V, 스테라프레드(프레드니손), 스테라프레드 DS(프레드니손), 멸균 탈크 분말(탈크), 스테리탈크(탈크), 스테레시스트(프레드니무스틴), 스티바르가(레고라페닙), 스트라무스틴 인산염, 스트렙토조신, 수니티닙 말레이트, 수프렐린 LA(히스트렐린), 수텐트(수니티닙 말레이트), 수텐트 (수니티닙), 신리보 (오마세탁신 메페수치네이트), 타블로이드 (티오구아나인), TAC,타핀라(다브라페닙), 타그리소(오시머티닙), 탈크, 탈리모진 라헤르파렙벡, 타목시펜 구연산염, 타라빈 PFS(시타라빈), 타세바(에를로티닙), 타그레틴(벡사로텐), 타시그나(데카바진), 타시그나(닐로티닙), 타소네르민, 탁솔(파클리탁셀), 탁소테레(도세탁셀), 테모다르(테모졸로마이드), 테모졸로마이드, 템시롤리무스, 테파디나(티오테파), 탈리도마이드, 탈로미드(Thalidomide), TheraCys BCG(BCG), 티오구아닌, 티오플렉스(티오테파), 티오테파, TICE BCG(BCG), 티사겐클뢰셀, 톨락(플루오로라실--국소), 토포사르(에토포사이드), 토포테칸 염산염, 토레미펜, 토리셀(템시롤리무스), 토텍(덱스라족산 염산염), TPF, 트라벡테인, 트라마티닙, 트란다(벤다무스틴 염산염), 트렐스타(트립토렐린), 트레티노인, 트렉솔(메토렉세이트), 트리플루리딘 및 티피라실염산염, 트리세녹스(삼산화황색), 티커브(라파티닙), 유리딘 트라이아세테이트, VAC, 발루비신, 발스타(발루비신 인트라베시칼), 발스타(발루비신), VAMP, 반데타닙, 반타스(히스트렐린), 바루비(롤라피탄트), VeIP, 벨반(빈블라스틴), 벨케이드(보르테조밉), 벨사르(빈블라스틴 설페이트), 베무라페닙, 벤클렉스타(베네토클락스), 베페시드(에토포사이드), 베르제니오(아베마시클립), 베사노이드(트레티노인), 비아두르(류프롤라이드 아세테이트), 비다자(아자시티딘), 빈블라스틴, 빈카사르 PFS(빈크리스틴), 빈크렉스(빈크리스틴), 빈크리스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트 리포솜, 빈데신 설페이트, 빈플루닌, 비노렐빈 타르트레이트, VIP, 비스모데깁, 비스토가드(우리딘 트리아세테이트), 보락사제(글루카르피다제), 보리노스타트, 보트리엔트(파조파닙), 부몬(테니포사이드), 빅세오스(다우노루비신 염산염 및 시타라빈 리포솜), W, 웰코보린(류코보린 칼슘), 웰코보린 IV(류코보린), 잘코리(크리조티닙), XELIRI, 젤로다(카페시타빈), XELOX, 조피고(라듐 223 디클로라이드), 엑스탄디(엔잘루타마이드), 예스카르타(악시캅타진 실로류셀), 욘델리스(트라벡틴), 잘트랩(지브-애플리버셉트), 자노사르(스트렙토조신), 자르시오(필그라스팀), 제줄라(니라파립), 젤보라프(베무라페닙), 진카드(덱스라족산 염산염), 지브-애플리버셉트, 조프란(온단세트론 염산염), 졸라덱스(고세렐린), 졸레드론산, 졸린자(보리노스타트), 조메타(졸레드론산), 조르트리스(에베롤리무스), 자이델릭(이델라리십), 자이카디아(세리티닙), 자이티가(아비라테론 아세테이트) 및 자이티가(아비라테론)를 포함한다. 화학요법제의 다른 예는 V. T. Devita 및 S. Hellman(편집자)의 Cancer Principles and Practice of Oncology, 6판(2001년 2월 15일), Lippincott Williams & Wilkins Publishers에서 찾을 수 있으며, 그 내용은 그 전체가 본원에 인용되어 통합된다.
실시형태에서, 예를 들어, 상기 목록으로부터의 화학요법제가 본 개시내용의 화합물에서 약제로서 포함될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 예를 들어, 상기 목록으로부터의 화학요법제는 본 개시내용의 화합물과 함께, 즉, 병용 요법에 사용될 수 있다. 예로서, 피험자는 약제로서 멀티키나제 억제제(예를 들어, 레고라페닙)를 포함하는 화합물 및 약제로서 푸마길린을 포함하는 화합물 중 하나 또는 둘 모두가 로딩된 혈소판을 투여받을 수 있고, 또한 화학요법제를 투여받을 수 있는데; 이 조합은 췌장암, 폐암 또는 결장암 치료에 사용될 수 있다. 피험자는 약제로서 EGFR 억제제(예를 들어, 세툭시맙)를 포함하는 화합물 및 활성제로서 멀티키나제 억제제(예를 들어, 레고라페닙)를 포함하는 화합물 중 하나 또는 둘 모두가 로딩된 혈소판을 투여받을 수 있고, 또한 화학요법제를 투여받을 수 있는데; 이것은 폐암 치료에 사용될 수 있다. 또한, 피험자는 약제로서 EGFR 억제제(예를 들어, 세툭시맙)를 포함하는 화합물, 약제로서 멀티키나제 억제제(예를 들어, 레고라페닙)를 포함하는 화합물 및 약제로서 ALK/ROS1/NTRK 억제제(예를 들어, 크리조티닙)를 포함하는 화합물 중 하나 또는 모두가 로딩된 혈소판을 투여받을 수 있고, 또한 화학요법제를 투여받을 수 있는데; 이것은 비소세포폐암 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에 유용한 예시적인 면역 체크포인트 억제제는 A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD122, CD137, CD27, CD28, CD28, CD40, CTLA-4, GITR, ICOS, ICOS, IDO, KIR, KIR., LAG3, NOX2, OX40, PD-1, SIGLEC7, SIGLEC9, TIM-3, 및 VISTA에 대한 리간드 또는 수용체의 전장 또는 단편을 포함한다.
이러한 성장 인자, 사이토카인 또는 인터류킨은, 예를 들어, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 간세포 성장 인자(HGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 또는 안지오포에틴을 포함할 수 있다.
본 발명에 유용한 예시적인 성장 억제제는 안지오스타틴, 엔도스타틴, 툼스타틴, 트롬보스폰딘-1(TSP1), 혈소판 인자 4(PF4, CXCL4), 및 금속단백분해효소의 조직 억제제(TIMP)를 포함한다.
본 발명에서 유용한 예시적인 프로테아제/프로테이나제는 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 트롬빈, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA), 유로키나제 및 스트렙토키나제를 포함한다.
본 발명에 유용한 예시적인 응고 인자는 인자 II(트롬빈), 안티트롬빈 III(ATIII), 칼리크레인, 조직 인자(TF), 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI 및 인자 XII, 인자 XIII, 피브리노겐, 단백질 S, 단백질 C, 트롬보모듈린, 플라스미노겐 및 조직 인자 경로 억제제(TFPI)를 포함한다.
본 발명에 유용한 예시적인 지질 또는 인지질은 아포지단백질 E(ApoE), 혈소판 인지질, 및 스핑고신-1-포스페이트(SIP)를 포함한다.
본 발명에 유용한 예시적인 세포외 기질 단백질은 인테그린, 피브로넥틴, 라미닌, 초점 접착 단백질(FAK), 빈쿨린, 탈린, 액틴 필라멘트 및 콜라겐을 포함한다.
본 발명에 유용한 예시적인 호르몬은 인슐린, 스테로이드(예를 들어, 에스트로겐, 프로게스테론, 테스토스테론, 및 이들의 변이체), 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 및 갑상선 호르몬을 포함한다.
본 발명에 유용한 예시적인 효소는 헤파라나제 또는 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)를 포함한다.
본 발명에 유용한 예시적인 케모카인/화학유인물질은 결합 조직 성장 인자(CTGF), 간질 세포 유래 인자-1(SDF-1)(CXCL12), 인터루킨(IL1, 2, 6, 8) 및 CD40 리간드(CD40L, CD154)를 포함한다.
본 발명에 유용한 예시적인 뉴로트로핀은 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3(NT-3) 및 뉴로트로핀 4/5(NT-4/5)를 포함한다.
실시형태에서, 약제는 다양한 분류의 유용한 약제를 포함하는 다음의 비제한적 목록으로부터 선택된다: 3-4-(1-포르밀피페라진-4-일)-벤질리데닐-2-인돌리논, 아바타셉트, ABT-869, 아칼라브루티닙, 아파티닙, 아플리베르셉트, 알렉티닙, 알레파셉트, AMG 108, 항림프구 면역글로불린(말), 항흉선구 면역글로불린(토끼), 아포맙, 아스포타제 알파, 아수네르셉트, AVE9633, 악시티닙, 벨라타셉트, 베바시주맙 지르코늄 Zr-89, BIIB015, 비바투주맙, 보수티닙, 브리가티닙, 카보잔티닙, 카네르티닙, 캡마티닙, 세디라닙, 세리티닙, CR002, 크레놀라닙, 크리조티닙, CT-011, 다코미티닙, 다사티닙, 데파툭시주맙, 도비티닙, 에드라티드, 엔트렉티닙, 에르다피티닙, 에를로티닙, 에타너셉트, 파미티닙, 페드라티닙, 피라테그라스트, 플루마티닙, 포레티닙, 포스타마티닙, 제피티닙, 젤다나마이신, 제니스테인, 길테리티닙, 글레사티닙, GMA-161, 그레무바맙, GS-5745, 인간사이토메갈로바이러스 면역글로불린, 인간 면역 글로불린 G, 인간 수두-대상포진 면역 글로불린, 이브리투모맙 티우세탄, 이브루티닙, 이코티닙, IGN311, 이마티닙, 인듐 In-111 사투모맙 펜데티드, IPH 2101, 라베투주맙 고비테칸, 라파티닙, 라로트렉티닙, 레카네맙, 렌바티닙, 레스타우르티닙, 로루카푸스프 알파, 미도스타우린, 미르베툭시맙 소라브탄신, 미타잘리맙, 모테사닙, 무로모납, 나프투모맙 에스타페나톡스, NAV 1800, 네라티닙, 닐로티닙, 닌테다닙, 오시머티닙, 파크리티닙, 파조파닙, PD173955, 펙시다르티닙, 피세아탄놀, 포나티닙, 라디시콜, 라도티닙, 레고라페닙, RI 624, 로발피투주맙 테시린, 로즈롤리무파브, 룩소리티닙, 사라카티닙, 사볼리티닙, SB-1578, 셀퍼카티닙, 셀루메티닙, 소라페닙, 수니티닙, 타파시타맙, 탄두티닙, TB-402, 테크네튬 Tc-99m 아르시투모맙, 테세바티닙, TNX-901, 토말리맙, 토시투모맙, 트라스투주맙 데룩스테칸, 투카티닙, 바다툭시맙 탈리린, 발라나푸스프 알파, 반데타닙, 바탈라닙, 베무라페닙, VS-4718, XmAb 2513, XTL-001 및 졸베툭시맙.
실시형태에서, 약제는 EGFR 억제제(예를 들어, 세툭시맙)이다.
실시형태에서, 약제는 VEGF 억제제(예를 들어, 베바시주맙)이다.
실시형태에서, 약제는 PDL1 억제제(예를 들어, 펨브롤리주맙)이다.
실시형태에서, 약제는 FN1 억제제(예를 들어, 오크리플라스민)이다.
실시형태에서, 약제는 멀티키나제 억제제(예를 들어, 레고라페닙)이다.
실시형태에서, 약제는 FGFR2 길항제(예를 들어, 탈리도마이드)이다.
실시형태에서, 약제는 트롬빈 및 이의 유사체이다.
실시형태에서, 약제는 CSF3R 작용제(예를 들어, 필그라스팀)이다.
실시형태에서, 약제는 PSMB5 억제제(예를 들어, 보르테조밉)이다.
실시형태에서, 약제는 푸마길린이다.
실시형태에서, 약제는 ALK/ROS1/NTRK 억제제(예를 들어, 크리조티닙)이다.
실시형태에서, 제1 약제 및/또는 제2 약제는 포유류 세포에 유해하고/하거나 대상체에 독성이고/이거나 제1 약제 및/또는 제2 약제는 대상체의 혈류에 직접적으로 투여되는 경우 분해되기 쉽다.
실시형태에서, 제1 화합물 및/또는 제2 화합물은 형광성 모이어티를 추가로 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및/또는 제2 GAG-결합 펩티드는 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 및/또는 GPIIb/IIIa에 또한 우선적으로 결합한다.
실시형태에서, 조성물은 제3 약제 및 제3 폴리펩티드를 포함하는 제3 화합물을 추가로 포함하며, 제3 폴리펩티드는 혈소판의 제3 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제3 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하고; 제3 GAG-결합 펩티드는 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 및/또는 GPIIb/IIIa에 우선적으로 결합한다.
단리된 혈소판
종종 질병 또는 장애를 치료하는 데 유용한 약제는 인간 세포에 해로울 수 있고/있거나 피험자에게 독성이 있는데, 특히, 피험자 전신에 투여되는 경우에 그렇다. 유해 약제를 포함하는 화합물로 혈소판을 로딩하는 것은 피험자의 의도하지 않은 바람직하지 않은 세포, 조직 및/또는 장기 손상을 방지한다. 추가로, 특정 약제는 피험자의 혈류에 직접 투여될 때 분해되기 쉽다. 분해성 약제를 포함하는 화합물로 혈소판을 로딩하는 것은 피험자의 혈류에 직접 투여될 때 발생하는 약제 농도 감소를 방지하고; 따라서, 로딩된 혈소판은 피험자에게 투여될 때 용량 감소(예를 들어, 유효 용량 미만으로의)를 방지한다. 함께, 로딩된 혈소판은 표적 부위에 국소화된 약제를 바람직한 용량으로 그리고 더 적은 부작용으로 농축시킨다.
혈소판 촉진 약제 전달 기술은 다른 표적 전달 시스템에 비해 많은 장점을 갖는다. 나노입자-촉진 전달과는 달리, 피험자에게 이물질이 제공되지 않는다. 유사하게, 리포솜 제제는 세망내피계(RES; reticulo-endothelial system)에 의한 식세포작용으로 인해 짧은 저장 수명, 불량한 안정성 및 짧은 생체내 반감기를 갖지만, 본 개시내용의 혈소판 전달 시스템은 생체내 반감기를 연장하고 원래 화합물의 안정성과 준비를 변경하지 않는다. 또한, 비정상적인 혈관구조를 표적으로 하는 RGD 펩티드와 같은 대부분의 합성 귀소 메커니즘은 천연 혈소판의 특이성을 달성하지 못했다. 마지막으로, 본 발명에서 자가 혈소판의 사용은 다른 사람의 감염원의 위험을 제거하고; 이는 기증 및 보관된 혈소판을 해동 및/또는 준비할 필요 없이 절차의 안전성과 혈소판 로딩 속도(수 초에서 몇 분)를 증가시킨다. 함께, 본 개시내용의 약제의 혈소판 촉진 전달은 진료로 용이하고 쉽게 옮겨질 수 있다.
본 개시내용의 다른 양태는 단리된 혈소판이다. 단리된 혈소판은 제1 약제 및 제1 폴리펩티드를 포함하는 제1 화합물의 적어도 1 카피로서, 제1 폴리펩티드는 혈소판의 제1 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제1 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하는, 화합물; 및 제2 약제 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 제2 화합물의 적어도 1카피로서, 제2 폴리펩티드는 혈소판의 제2 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제2 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하는, 화합물을 포함한다.
실시형태에서, 혈소판은 합성, 동종이계, 자가 또는 변형된 이종 혈소판이다.
실시형태에서, 혈소판은 자가 혈소판이다.
실시형태에서, 혈소판은 동종이계 혈소판이다.
실시형태에서, 혈소판은 혈소판 풍부 혈장으로부터 수득된다.
실시형태에서, 혈소판은 제1 화합물의 적어도 1 내지 1000 카피 및 제2 화합물의 적어도 1 내지 1000 카피를 포함한다. 일부 경우, 제1 화합물의 1 내지 1000 카피는 혈소판의 제1 알파 과립형에 로딩되고, 제2 화합물의 적어도 1 카피는 1 내지 1000 카피는 혈소판의 제2 알파 과립형에 로딩된다. 제1 화합물의 적어도 1 카피는 혈소판의 제2 알파 과립형에 로딩될 수 있고, 제2 화합물은 혈소판의 제1 알파 과립형에 로딩될 수 있다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드는 콘드로이틴 설페이트(CS)에 우선적으로 결합하고 제2 GAG-결합 펩티드는 헤파란 설페이트(HS)에 우선적으로 결합한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드는 콘드로이틴 설페이트 A(CSA)에 우선적으로 결합한다. 실시형태에서, 제1 알파 과립형은 P-셀렉틴 회합 과립이고 제2 알파 과립형은 폰 빌레브란트 인자(VWF) 회합 과립이다.
실시형태에서, 제1 알파 과립형의 내용물은 고친화성 트롬빈 수용체 PAR1를 통해 방출되고 제2 알파 과립형의 내용물은 저친화성 트롬빈 수용체 PAR4를 통해 방출되고, 선택적으로, 알파 과립의 내용물은 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 퍼옥시다제, 포스포히드롤라제, 플라스민, 또는 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)와 같은 플라스민과의 접촉에 대한 반응으로 방출될 수 있다.
실시형태에서, 제1 알파 과립형의 내용물은 제2 알파 과립형의 내용물의 방출을 제공하기 위해 필요한 트롬빈 농도보다 더 낮은 트롬빈 농도에서 방출된다.
실시형태에서, 제1 알파 과립형의 내용물은 제2 알파 과립형의 내용물이 방출되기 전에 방출된다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드의 길이는 각각 약 8개 아미노산 내지 약 14개 아미노산이다. 일부 경우, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드 중 하나 또는 모두는 적어도 하나의 하전된 아미노산을 포함한다. 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드 중 모두는 적어도 하나의 하전된 아미노산을 포함할 수 있다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드 중 하나 또는 모두는 적어도 하나의 프롤린, 아르기닌, 및/또는 이소류신을 포함한다. 일부 경우, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 적어도 적어도 하나의 프롤린, 아르기닌, 및/또는 이소류신을 포함한다.
실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 어느 하나에 대해 위치 1, 위치 4, 위치 7, 및/또는 위치 9에 프롤린, 아르기닌, 및/또는 이소류신을 포함한다. 예로서, GAG-결합 펩티드는 위치 1, 위치 4, 위치 7 및 위치 9에 프롤린, 아르기닌 및/또는 이소류신을 포함하고; GAG-결합 펩티드는 위치 1에 프롤린, 아르기닌 및/또는 이소류신을 포함하고; GAG-결합 펩티드는 위치 1 및 위치 4에 프롤린, 아르기닌 및/또는 이소류신을 포함하고; GAG-결합 펩티드는 위치 1, 위치 4, 및 위치 7 및/또는 위치 9에 프롤린, 아르기닌 및/또는 이소류신을 포함하고; GAG-결합 펩티드는 위치 1, 위치 4, 위치 7 및 위치 9에 프롤린, 아르기닌 및/또는 이소류신을 포함하고; GAG-결합 펩티드는 위치 1 및 위치 7에 프롤린, 아르기닌 및/또는 이소류신을 포함하고; GAG-결합 펩티드는 위치 1 및 위치 4 및 위치 9에 프롤린, 아르기닌 및/또는 이소류신을 포함하고; GAG-결합 펩티드는 위치 1 및 위치 9에 프롤린, 아르기닌 및/또는 이소류신을 포함하며; 그리고 이들 사이의 임의의 조합일 수 있다. GAG-결합 펩티드는 위치 1, 위치 4, 위치 7 및 위치 9에 프롤린을 포함할 수 있고; GAG-결합 펩티드는 위치 1, 위치 4, 위치 7 및 위치 9에 아르기닌을 포함할 수 있고; GAG-결합 펩티드는 위치 1, 위치 4, 위치 7 및 위치 9에 이소류신을 포함할 수 있고; GAG-결합 펩티드는 위치 1에 프롤린, 그리고 위치 4, 위치 7, 및 위치 9에 아르기닌을 포함할 수 있고; GAG-결합 펩티드는 위치 1에 프롤린, 위치 4 및 위치 7에 아르기닌, 및 위치 9에 이소류신을 포함할 수 있고; GAG-결합 펩티드는 위치 1에 프롤린, 위치 4에 아르기닌, 및 위치 9에 이소류신을 포함할 수 있고; 또는 GAG-결합 펩티드는 위치 4에 아르기닌을 포함할 수 있고 위치 9에 프롤린을 포함할 수 있다. 프롤린, 아르기닌 및/또는 이소류신의 위치 1, 위치 4, 위치 7 및/또는 위치 9에의 임의의 조합이 본 개시내용에 포함된다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나와 적어도 약 70% 동일한 아미노산 서열을 독립적으로 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나와 적어도 약 80% 동일한 아미노산 서열을 독립적으로 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 독립적으로 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 임의의 하나에 대해 위치 1, 위치 4, 위치 7, 또는 위치 9에 하전된 아미노산을 독립적으로 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 어느 하나에 대해 위치 1, 위치 4, 위치 7, 및/또는 위치 9에 프롤린, 아르기닌, 및/또는 이소류신을 독립적으로 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 적어도 10개의 아미노산을 독립적으로 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 적어도 11개의 아미노산을 독립적으로 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및 제2 GAG-결합 펩티드는 11개의 아미노산으로 독립적으로 구성된다.
실시형태에서, GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나의 아미노산 서열로 구성된다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 2와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 구성되고, 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 구성된다.
실시형태에서, 제1 폴리펩티드는 제1 GAG-결합 펩티드로 구성되고, 제2 폴리펩티드는 제2 GAG-결합 펩티드로 구성된다.
실시형태에서, 제1 폴리펩티드의 N-말단은 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고/되거나 제2 폴리펩티드의 N-말단은 제2 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다.
실시형태에서, 제1 폴리펩티드의 C-말단은 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고/되거나 제2 폴리펩티드의 C-말단은 제2 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다.
실시형태에서, 제1 약제는 제1 링커를 통해 제1 폴리펩티드에 간접적으로 연결되고/되거나 제2 약제는 제2 링커를 통해 제2 폴리펩티드에 간접적으로 연결된다. 일부 경우, 제1 링커 및/또는 제2 링커는 각각 하나 이상의 원자를 포함한다. 제1 링커 및/또는 제2 링커는 각각 반복 단위의 중합체를 포함할 수 있다. 제1 링커 및/또는 제2 링커는 각각 아미노산 사슬을 포함한다.
실시형태에서, 제1 약제는 제1 폴리펩티드에 직접적으로 연결되고/되거나 제2 약제는 제2 폴리펩티드에 직접적으로 연결된다.
실시형태에서, 말레이미드 반응, 숙신이미딜 에스테르 반응, 효소 반응, 또는 단백질 구조 또는 활성에 영향을 미치지 않는 다른 접합 시스템을 사용하여 제1 약제는 제1 폴리펩티드에 직접적으로 연결되고/되거나 제2 약제는 제2 폴리펩티드에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다.
실시형태에서, 제1 약제 및/또는 제2 약제는 항체, 화학요법제, 세포독성 화합물, 소분자, 형광성 모이어티, 방사성 요소, 면역 관문 억제제, 성장 인자, 성장 억제제, 프로테아제/프로테이나제, 응고 인자, 지질 또는 인지질, 세포외 기질 단백질, 호르몬, 효소, 케모카인/화학유인물질, 뉴로트로핀, 티로신 키나제(작용제 또는 억제제), 또는 세포 증식, 혈관신생, 염증, 면역 또는 혈소판에 의해 매개되거나 혈소판과 연관되는 다른 생리적 과정을 억제하는 인자를 포함한다. 일부 경우, 제1 약제 및/또는 제2 약제는 항체를 포함하고/하거나 형광성 모이어티를 포함한다.
실시형태에서, 제1 약제 및/또는 제2 약제는 포유류 세포에 유해하고/하거나 대상체에 독성이고/이거나 제1 약제 및/또는 제2 약제는 대상체의 혈류에 직접적으로 투여되는 경우 분해되기 쉽다.
실시형태에서, 제1 화합물 및/또는 제2 화합물은 형광성 모이어티를 추가로 포함한다.
실시형태에서, 제1 GAG-결합 펩티드 및/또는 제2 GAG-결합 펩티드는 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 및/또는 GPIIb/IIIa에 또한 우선적으로 결합한다.
실시형태에서, 제3 약제 및 제3 폴리펩티드를 포함하는 제3 화합물의 적어도 1카피를 추가로 포함하며, 제3 폴리펩티드는 혈소판의 제3 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제3 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하고; 제3 GAG-결합 펩티드는 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 및/또는 GPIIb/IIIa에 우선적으로 결합한다.
특히, 본 개시내용의 로딩된 혈소판은 혈소판을 응혈 촉진제로 제조하는 로딩 과정에 의해 활성화되기보다는 휴지 중인 완전한 기능을 하는 혈소판으로 남아 있다.
약제학적 조성물
본 개시내용의 로딩된 혈소판은 적어도 일단 피험자에게 투여되면 혈소판의 안정성 및 유효성을 향상시키는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 더욱이, 이러한 약제학적 조성물은 대상체에게 투여하기 전에 혈소판의 안정성을 향상시킨다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 임의의 본원에 개시된 양태 또는 실시형태의 단리된 혈소판 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이다.
실시형태에서, 제3 약제 및 제3 폴리펩티드를 포함하는 제3 화합물의 적어도 1카피를 포함하는 제2 단리된 혈소판을 추가로 포함하며, 제3 폴리펩티드는 혈소판의 제3 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제3 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하고; 제3 GAG-결합 펩티드는 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 및/또는 GPIIb/IIIa에 우선적으로 결합한다.
실시형태에서, 약제학적 조성물은 제1 화합물의 적어도 1카피를 포함하는 제2 단리된 혈소판을 추가로 포함하거나 제2 화합물의 적어도 1카피를 포함하는 제3 단리된 혈소판을 추가로 포함한다.
실시형태에서, 약제학적 조성물은 제1 화합물의 적어도 1카피를 포함하는 제2 단리된 혈소판을 추가로 포함하고 제2 화합물의 적어도 1카피를 포함하는 제3 단리된 혈소판을 추가로 포함한다.
약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클을 포함한다. 이러한 약제학적 조성물은 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 약제학적으로 허용되는 부형제의 적합한 양을 선택적으로 포함할 수 있다. 약제학적 부형제는 석유, 동물, 야채, 또는 합성 기원, 예를 들어, 땅콩 오일, 대두 오일, 광유, 참깨 오일, 및 기타 동종의 것의 것들을 포함하여 액체, 예를 들어, 물 또는 오일일 수 있다. 약제학적 부형제는, 예를 들어, 식염수, 아카시아 검, 젤라틴, 전분 페이스트, 탈크, 케라틴, 콜로이드성 실리카, 유레아 등일 수 있다. 또한, 보조제, 안정화제, 증점제, 윤활제, 및 착색제가 사용될 수 있다. 실시형태에서, 약제학적으로 허용되는 부형제는 피험자에게 투여될 때 무균이다. 물은 본원에 개시된 임의의 약제가 정맥내 투여될 때 유용한 부형제이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로오스 및 글리세롤 용액은 또한 구체적으로는 주사가능 용액에 대한 액체 부형제로서 이용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 또한 전분, 글루코오스(즉, 포도당), 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 가루, 백악, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 본원에 개시된 임의의 약제는, 원하는 경우, 또한 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 부형제의 예는, 본 명세서에서 참고문헌으로 포함된 Remington's Pharmaceutical Sciences 1447-1676 (Alfonso R. Gennaro eds., 19th ed. 1995)에 기술되어 있다.
본원에 개시된 약제학적 조성물은 식염수 완충제(NaCl 용액, TBS, PBS, Ringer 용액 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않음)를 포함할 수 있다.
실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 7.3 내지 7.5의 pH(즉, 혈액의 pH)를 갖는 혈액에 대략 등장성인 멸균 주사에 적합한 형태로 본원에 개시된다.
실시형태에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 본원에 개시된 투여 방식에 적합한 약제학적 조성물로서 일상적인 절차에 따라 제형화된다.
일 양태에서, 본 개시내용은 질환 또는 장애를 치료하기 위한 임의의 본원에 개시된 약제학적 조성물의 용도이다. 실시형태에서, 질환 또는 장애는 암이다.
다른 양태에서 본 개시내용은 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 임의의 본원에 개시된 단리된 혈소판 또는 임의의 본원에 개시된 약제학적 조성물의 용도이다. 실시형태에서, 질환 또는 장애는 암이다.
치료 방법
이전에 개시된 바와 같이, 2개 이상의 약제를 포함하는 2개 이상의 화합물로 로딩된 혈소판은 약제가 혈소판에 로딩되지 않고 피험자에게 투여될 때 발생하는 (예를 들어, 유효 용량 미만으로의) 약제 농도의 감소를 방지한다. 또한, 유해(예를 들어, 독성) 약제를 포함하는 화합물로 로딩된 혈소판은 대상체에서 의도하지 않고 바람직하지 않은 세포, 조직 및/또는 장기 손상을 방지한다. 마지막으로, 혈소판은 자연적으로 상해, 염증 및/또는 혈관신생 부위의 본거지이다. 본 개시내용의 혈소판은 2개 이상의 약제를 구별되는 α-과립형에 선택적으로 로딩하고, 각각은 별도의 방출 프로파일을 가지며, 이로써 상이한 약제를 공간적 및/또는 시간적으로 제어된 방식으로 혈소판에서 방출하도록 할 수 있다. 최종적으로, 알파 과립의 로딩된 혈소판 내용물의 방출은 치료 반응을 촉진하기 위해 필요에 따라 약제의 방출을 촉진하는 시간에 약제학적 조성물로 대상체에게 투여될 수 있는 방출 유도제와의 접촉에 대한 반응으로 유도될 수 있다. 함께, 로딩된 혈소판은 치료 유효량의 2개 이상의 약제가 표적 부위에 적은 부작용으로 전달되도록 돕는다.
조직 염증 또는 조직 손상을 특징으로 하고 혈소판이 최초 반응자인 것을 특징으로 하는 질환 및 장애는 모두 개시된 방법에 따라 치료될 수 있다. 이러한 질병 및 장애는, 종양, 혈액 악성종양, 류마티스 관절염, 궤양성 대장염, 뇌졸중, 허혈성 심장 질환, 죽상동맥경화증, 화상 및 이식편 상피화를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 의해 제공되는 이점은 혈류에 직접 투여되는 약제에 비해 혈소판에 로딩될 때 (피험자의 혈류에서) 약제의 연장된 반감기이다. 본 발명은 약제의 자연적 제거를 느리게 하여 현저히 감소시킨다. 일반적으로, 약제는 신장 여과, 효소 분해, 세망내피계(RES)에 의한 흡수, 표적이 아닌 장기 및 조직에 축적에 의해 순환계에서 제거된다. 그러나, 본 발명에서, 약제는 혈소판의 수명(통상적으로, 4-7일) 동안 또는 표적 부위에 전달될 때까지 혈소판 내에서 보호된다. 또한, 본 발명은 비표적 부위(예를 들어, 조직 및 장기)에 대한 약제의 광범위한 분포를 방지함으로써 약제의 전신 노출을 제한한다. 이점은 약제의 (혈소판에 로딩되지 않는 약제의 투여에 비해) 더 낮은 투여량을 사용하도록 허용한다. 이러한 저용량의 사용은 최소한 원치 않는 부작용을 줄이고 경제적 비용을 줄이는 데 도움이 된다.
또한, 본 발명에 유용한 혈소판은 복수의 상이한 약제로 로딩되고; 다양한 약제는 공간적으로 그리고 시간적으로 제어되는 방식으로 구별되는 알파 과립형에서 방출될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상해(예를 들어, 만성 상처를 치료하기 위해), 병리학적 염증(예를 들어, 관절 또는 폐 상해를 치료하기 위해) 및/또는 혈관신생(예를 들어, 암을 치료하기 위해) 부위에 대한 지시되고 조절된 치료제를 제공한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 대상체에게 임의의 본원에 개시된 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 일 양태는 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 대상체에게 임의의 본원에 개시된 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
위의 방법의 실시형태에서, 제1 알파 과립형의 내용물은 제2 알파 과립형의 내용물이 방출되기 전에 표적 부위에서 방출된다.
위의 방법의 실시형태에서, 방법은 대상체에게 헤파라나제, 트롬빈 및 이의 단편 펩티드, 프로테아제-활성화 수용체 1(PAR1) 작용제 또는 길항제 펩티드, 프로테아제-활성화 수용체 4(PAR4) 작용제 또는 길항제 펩티드, 플라스민 및 이의 단편, 메탈로프로테이나제, 퍼옥시다제 및/또는 포스포히드롤라제 중 하나 이상을, 독립적으로, 포함하는 제2 약제학적 조성물 및/또는 제3 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우, 제2 약제학적 조성물은 제1 알파 과립형으로부터의 제1 화합물의 방출을 촉진하고 제3 약제학적 조성물은 제2 알파 과립형으로부터의 제2 화합물의 방출을 촉진한다. 제2 약제학적 조성물 및/또는 제3 약제학적 조성물은 약제학적 조성물이 투여된 후 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 제2 약제학적 조성물 및/또는 제3 약제학적 조성물이 투여되기 전에 적어도 2회 투여될 수 있다.
실시형태에서, 질환 또는 장애는 암이다. 암은 일반적으로 부적절하게 높은 증식율 및/또는 부적절하게 낮은 세포자연사 비율로 인해 발생하는 질환이다.
실시형태에서, 암은, 청각 신경종; 급성 적혈구 백혈병; 급성 백혈병; 급성 림프구성 백혈병; 급성 림프구성 백혈병; 급성 단핵구 백혈병; 급성 골수아구성 백혈병; 급성 골수성 백혈병; 급성 골수단구성 백혈병; 급성 전골수구성 백혈병; 선암종; AIDS 관련 림프종; 혈관육종; 성상세포종; 기저 세포 암; B 세포 림프종(저등급/여포성 비호지킨 림프종 포함); 담도암; 방광암; 골암; 뇌 및 중추신경계 암; 유방암; 기관지암종; 부피가 큰 질병 비호지킨 림프종; 소화 시스템의 암; 두경부암; 복막암; 호흡기 암; 비뇨기계 암; 자궁 경부암; 연골육종; 척색종; 융모막암종; 만성 백혈병; 만성 림프구성 백혈병; 만성 골수성 백혈병; 만성 골수성 백혈병; 결장 및 직장암; 결합 조직 암; 두개인두종; 낭선암종; 배아 암종; 자궁내막암; 내피육종; 뇌실막종; 상피 암종; 식도암; 유잉의 종양; 안구암; 섬유육종; 위암(위장암 포함); 교모세포종; 신경교종; 모세포 백혈병; 중쇄 질환; 혈관모세포종; 간암; 고급 면역모세포성 비호지킨 림프종; 고급 림프모구성 비호지킨 림프종; 고급 소형 비절단 세포 비호지킨 림프종; 호지킨 및 비호지킨 림프종; 중간 등급 미만성 비호지킨 림프종; 중간 등급/여포성 비호지킨 림프종; 상피내 신생물; 신장 또는 신장암; 후두암; 평활근육종; 지방육종; 간 암; 폐암(예를 들어, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 및 폐 편평상피암); 폐암; 림프관내피육종; 림프관육종; 림프종(호지킨병, 비호지킨병); 외투 세포 림프종; 수질암; 수모세포종; 메이그 증후군.; 흑색종; 수막종; 중피종; 골수종; 점액육종; 신경 모세포종; 담관 암종; 희소돌기아교종; 구강암(입술, 혀, 입 및 인두); 골형성 육종; 난소 암; 췌장암; 유두 선암종; 유두암; 송과종; 진성적혈구증가증; 이식 후 림프증식성 장애(PTLD) 뿐만 아니라 식세포종과 관련된 비정상적인 혈관 증식, 부종(예컨대, 뇌종양과 관련된 것); 전립선암; 직장암; 망막모세포종; 횡문근육종; 침샘 암종; 육종; 신경초종; 피지선 암종; 정액종; 피부암; 소림프구성(SL) 비호지킨 림프종; 편평 세포암; 위암; 땀샘 암종; 활액종; 고환암; 갑상선 암; 자궁 또는 자궁내막암; 외음부암; 발덴스트롬의 거대글로불린혈증; 그리고 윌름의 종양으로부터 선택된다.
실시형태에서, 암의 질환 또는 장애는 증식성 장애, 예를 들어, 림프증식성 질환이다.
실시형태에서, 장애의 질병은 상해, 예를 들어, 화상, 척추 상해, 정형외과적 상해 및 상처이다.
실시형태에서, 장애의 질병은 혈우병 관절염이다.
실시형태에서, 장애의 질병은 염증, 예를 들어, 관절 염증 및 폐 염증을 포함하는 급성 또는 만성 염증이다.
실시형태에서, 장애의 질병은 당뇨병성 궤양이다.
실시형태에서, 장애의 질병은 임플란트, 이식편, 스텐트 또는 보철물의 부작용이다.
실시형태에서, 본 개시내용의 방법에 의해 치료되는 장애 질환은 결함 유전자에 의해 유발된다. 이러한 실시형태에서, 약제는 결손 또는 기능장애 단백질을 대체하는 재조합 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 재조합 단백질은 본원에 개시된 폴리펩티드-기반 약제, 즉, 항체(또는 그의 항원 결합 단편), 화학요법제, 면역 관문 억제제, 성장 인자, 성장 억제제, 프로테아제/프로테이나제, 응고 인자, 세포외 기질 단백질, 호르몬, 효소, 케모카인/화학유인물질, 또는 뉴로트로핀 중 임의의 하나일 수 있다.
유전자 결함으로 인한 일부 질환은 GAG 합성에 영향을 미칠 수 있다. 예로서, 3번 염색체의 긴 아암(arm)에 있는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 5(CSPG5)의 결함은 뇌의 기형 형성을 유발할 수 있고, DBQD1 유전자의 결함은 "손 기형을 동반한 데스부쿼이스 이형성증(Desbuquois dysplasia with hand anomalies)"이라고도 하는 미세소체 왜소증을 야기하며, 유전자 이상은 혈소판에서 GAG의 합성에 영향을 미칠 수 있다.
본원에 개시된 약제학적 조성물의 투여는 로딩된 혈소판을 정맥내 또는 동맥내 주사 또는 주입을 통해 혈류로 전달하게 한다. 대안적으로, 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 활성 질병 부위에 직접 재투여된다. 다른 경로의 투여는, 예를 들어, 피하, 복강내, 근육내 또는 피내 주사를 포함한다.
본 명세서에 개시된 로딩된 혈소판을 포함하는 약제학적 조성물의 투여량뿐만 아니라 투여 스케줄은, 치료되는 질병, 피험자의 일반적인 건강 및 투여하는 의사의 재량을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 매개변수에 의존할 수 있다.
복용량은 상태의 중증도, 상태가 치료되어야 하는지 또는 예방되어야 하는지 여부, 치료할 피험자의 연령, 체중 및 건강을 포함하는 여러 요인에 따라 달라질 수 있다. 추가적으로, 특정 피험자에 관한 약물 유전체(치료제의 약동학적, 약력학적 또는 효능 프로파일에 대한 유전자형의 효과) 정보는 사용되는 투약량에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 정확한 개별 투여량은 투여되는 약제의 특정 조합, 투여 시간, 투여 경로, 제제의 성질, 배출 속도, 치료중인 질병, 장애의 중증도, 장애의 해부학적 위치를 포함하는 다양한 요인에 따라 다소 조정될 수 있다. 복용량에 있어서 약간의 변동이 있을 수 있다.
일반적으로, 혈소판에 로딩되는 특정 양의 약제를 포함하는 약제학적 조성물의 투여량은 약제가 혈소판에 로딩되지 않고 투여되는 경우의 범위일 것이다. 실시형태에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물에서 약제의 투여량은 혈소판에 로딩되지 않은 약제의 투여량보다 낮을 것이며, 이는 본 발명이 피험자에서 증가된 표적 특이성 및 약제의 분해에 대한 내성을 제공하기 때문이다.
본원에 개시된 로딩된 혈소판을 포함하는 임의의 약제학적 조성물은 단회 1 일 용량으로 투여될 수 있거나, 또는 총 1 일 투여량이 매일 2, 3 또는 4 회 분할 용량으로 투여될 수 있다. 또한, 본원에 개시된 로딩된 혈소판을 포함하는 임의의 약제학적 조성물은 투여 요법 전반에 걸쳐 간헐적으로보다는 연속적으로 투여될 수 있다.
로딩된 혈소판은 혈소판의 반감기가 4일 내지 7일이기 때문에, 예를 들어, 매주 1회 환자에게 주입될 수 있다.
재조합 폴리펩티드 발현
본 발명은 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하는 폴리펩티드에 (직접적으로 또는 간접적으로) 커플링된 재조합 폴리펩티드 약제의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 추가로 제공한다.
GAG-결합 펩티드를 포함하는 재조합 폴리펩티드는 별개의 펩티드로 발현될 수 있고 함께 결찰될 수 있다. 대안적으로, GAG-결합 펩티드를 포함하는 재조합 폴리펩티드는 GAG-결합 펩티드에 작동가능하게 링크된 폴리펩티드 약제를 포함하는 단일 융합 단백질로서 발현된다.
본 발명의 재조합 폴리펩티드는 통상의 기술자에게 알려진 거의 모든 방법을 사용하여 생산된다. 통상적으로, 재조합 폴리펩티드는 적합한 발현 비히클에서 폴리펩티드-인코딩 핵산 분자 또는 이의 단편의 전부 또는 일부를 갖는 적합한 숙주 세포의 형질전환에 의해 생산된다.
분자 생물학 분야의 숙련자는 다양한 발현 시스템 중 임의의 것이 재조합 폴리펩티드를 발현하는데 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 사용된 정확한 숙주 세포는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명의 재조합 폴리펩티드는 원핵 숙주(예를 들어, 대장균) 또는 진핵 숙주(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애, 곤충 세포, 예를 들어 Sf21 세포, 또는 포유동물 세포, 예를 들어 NIH 3T3, HeLa, 또는 바람직하게는 COS 세포)에서 생산될 수 있다. 이러한 세포는 광범위한 출처로부터 입수가능하다(예를 들어, American Type Culture Collection, Rockland, Md.; 또한, 예를 들어 Ausubel et al., Current Protocol in Molecular Biology, New York: John Wiley and Sons, 1997 참조). 형질전환 또는 형질감염 방법 및 발현 비히클의 선택은 선택된 숙주 시스템에 따라 달라질 것이다. 형질전환 및 형질감염 방법은 예를 들어, Ausubel et al.에 기재되어 있으며, 발현 비히클은 예를 들어, Cloning Vector: A Laboratory Manual (P.H. Pouwels et al., 1985, Supp. 1987)에 제공된 비히클로부터 선택될 수 있다.
일단 본 발명의 재조합 폴리펩티드가 발현되면, 이는 단리, 농축 및/또는 정제될 수 있다.
예로서, 재조합 폴리펩티드는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 단리될 수 있다. 일 예에서, 재조합 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는 컬럼에 부착되어 재조합 폴리펩티드를 분리하는데 사용될 수 있다. 친화성 크로마토그래피 이전에 폴리펩티드-보유 세포의 용해 및 분획화는 표준 방법에 의해 수행될 수 있다(예를 들어, Ausubel et al.,참조). 대안적으로, 재조합 폴리펩티드는 니켈 컬럼에 결합하는 헥사히스티딘 태그와 같은 서열 태그를 사용하여 단리된다.
일단 단리되면, 재조합 단백질은 원하는 경우, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다(예를 들어, Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry and Molecular Biology, eds., Work and Burdon, Elsevier, 1980 참조).
본 발명의 폴리펩티드, 특히 짧은 펩티드 단편은 또한 화학적 합성에 의해(예를 들어, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.에서 설명된 방법에 의해) 생성될 수 있다.
폴리펩티드 발현 및 정제의 이러한 일반적인 기술은 또한 유용한 펩티드 단편 또는 유사체(본원에 기술됨)를 생성 및 단리하는데 사용될 수 있다.
병용 요법
실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 약제학적 조성물 또는 치료 방법은 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드에 연결되지 않고/않거나 혈소판에 로딩되지 않은 추가 약제를 추가로 포함할 수 있다. 병용 요법의 한 예에서, 약제학적 조성물은 로딩된 혈소판 및 추가 약제를 포함한다. 병용 요법의 다른 예에서, 피험자는 로딩된 혈소판을 포함하는 제1 약제학적 조성물 및 추가 약제를 포함하는 제2 약제학적 조성물을 투여받는다. 병용 요법은 또한 로딩된 혈소판 및 제1 추가 약제를 포함하는 제1 약제학적 조성물 및 제2 추가 약제를 포함하는 제2 약제학적 조성물을 포함할 수 있으며; 여기서, 제1 및 제2 추가 약제는 동일하거나 상이한 약제일 수 있다. 본원에 개시된 임의의 약제는 추가 약제로서의 역할을 할 수 있다.
하나 이상의 약제학적 조성물을 포함하는 병용 요법의 실시형태에서, 제1 약제학적 조성물은 제2 약제학적 조성물 전에 투여될 수 있고, 제1 약제학적 조성물은 제2 약제학적 조성물 후에 투여될 수 있거나, 제1 약제학적 조성물은 제2 약제학적 조성물과 동시에 투여될 수 있다.
또한, 병용 요법은 본 개시내용의 약제학적 조성물을 다른 치료 요법과 조합할 수 있다. 다른 치료 요법의 예는 방사선 요법, 호르몬 요법, 수술 및 냉동 수술을 포함한다. 치료 요법은 본원에 기재된 임의의 약제를 포함할 수 있다.
실시형태에서, 병용 요법의 화학요법제가 본 개시내용의 화합물과 함께 사용된다. 예로서, 병용 요법은 약제로서 멀티키나제 억제제(예를 들어, 레고라페닙)를 포함하는 화합물, 약제로서 푸마길린을 포함하는 화합물, 및 화학요법제 중 하나 또는 둘이 로딩된 혈소판을 포함할 수 있는데; 이 조합은 췌장암, 폐암 또는 결장암 치료에 사용될 수 있다. 병용 요법은, 약제로서 EGFR 억제제(예를 들어, 세툭시맙)를 포함하는 화합물, 활성제로서 멀티키나제 억제제(예를 들어, 레고라페닙)를 포함하는 화합물, 및 화학요법제 중 하나 또는 둘이 로딩된 혈소판을 포함할 수 있는데; 이것은 폐암 치료에 사용될 수 있다. 병용 요법은, 약제로서 EGFR 억제제(예를 들어, 세툭시맙)를 포함하는 화합물, 약제로서 멀티키나제 억제제(예를 들어, 레고라페닙)를 포함하는 화합물, 약제로서 ALK/ROS1/NTRK 억제제(예를 들어, 크리조티닙)를 포함하는 화합물, 및 화학요법제 중 하나 또는 둘 또는 셋 모두가 로딩된 혈소판을 포함할 수 있는데; 이것은 비소세포폐암 치료에 사용될 수 있다.
추가 실시형태에서, 병용 요법은 VEGF 억제제(예를 들어, 베바시주맙) 및 약물 렘데시비르가 로딩된 혈소판을 포함하며; 이것은 아마도 COVID와 관련된 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)을 치료하는 데 사용될 수 있다.
병용 요법의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 또 다른 치료 요법 전에 투여될 수 있고, 약제학적 조성물은 또 다른 치료 요법 후에 투여될 수 있거나, 또는 약제학적 조성물은 다른 치료 요법과 동시에 투여될 수 있다.
제조 방법
본 개시내용의 다른 양태는 로딩된 혈소판을 제조하기 위한 방법이다. 방법은 시험관내(in vitro)에서 또는 생체외(ex vivo)에서 혈소판을 임의의 본원에 개시된 조성물과 접촉하게 하는 단계 및 제1 화합물이 혈소판의 제1 알파 과립형에 의해 내재화되고 제2 화합물이 혈소판의 제2 알파 과립형에 의해 내재화될 때까지 혈소판과 화합물 사이의 접촉이 진행되도록 하여 로딩된 혈소판을 생성하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 다른 양태는 로딩된 혈소판을 제조하기 위한 방법이다. 혈소판을 수득하는 단계; 제1 약제 및 제1 폴리펩티드를 포함하는 제1 화합물을 시험관내(in vitro)에서 또는 생체외(ex vivo)에서 혈소판과 접촉하게 하며 제1 폴리펩티드는 혈소판의 제1 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제1 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하는 단계; 및 제2 약제 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 제2 화합물을 시험관내(in vitro)에서 또는 생체외(ex vivo)에서 혈소판과 접촉하게 하며 제2 폴리펩티드는 혈소판의 제2 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제2 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하는 단계를 포함한다.
실시형태에서, 제1 화합물을 혈소판과 접촉하게 하는 단계 및 제2 화합물을 혈소판과 접촉하게 하는 단계는 동시에 발생한다.
실시형태에서, 제1 화합물을 혈소판과 접촉하게 하는 단계 및 제2 화합물을 혈소판과 접촉하게 하는 단계는 순차적이다.
실시형태에서, 제3 약제 및 제3 폴리펩티드를 포함하는 제3 화합물을 시험관내(in vitro)에서 또는 생체외(ex vivo)에서 혈소판과 접촉하게 하는 단계를 추가로 포함하며, 제3 폴리펩티드는 혈소판의 제3 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제3 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하고; 제3 GAG-결합 펩티드는 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 및/또는 GPIIb/IIIa에 우선적으로 결합한다.
혈소판과 조성물(또는 제1 화합물과 제2 화합물) 사이의 접촉은 적어도 약 15분 동안 및/또는 제1 화합물이 혈소판의 제1 알파 과립형에 의해 내재화되고 제2 화합물이 혈소판의 제2 알파 과립형에 의해 내재화될 때까지 37℃에서 발생할 수 있다. 약제가 상당한 전신 독성을 갖는 경우, 혈소판에 로딩되지 않았던 약제의 주입을 방지하기 위해 적절한 완충액을 사용하여 혈소판을 세척한다.
키트
일 양태에서, 본 개시내용은 질환 또는 장애를 치료하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 임의의 본원에 개시된 단리된 혈소판 및 사용 설명서를 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 질환 또는 장애를 치료하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 임의의 본원에 개시된 약제학적 조성물 및 사용 설명서를 포함한다.
실시형태에서, 키트는 헤파라나제, 트롬빈 및 이의 단편 펩티드, 프로테아제-활성화 수용체 1(PAR1) 작용제 또는 길항제 펩티드, 프로테아제-활성화 수용체 4(PAR4) 작용제 또는 길항제 펩티드, 플라스민 및 이의 단편, 메탈로프로테이나제, 퍼옥시다제 및/또는 포스포히드롤라제 중 하나 이상을, 독립적으로, 포함하는 제2 약제학적 조성물 및/또는 제3 약제학적 조성물을 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 로딩된 혈소판을 제조하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 임의의 본원에 개시된 화합물 및 사용 설명서를 포함한다. 본 발명은 상해, 염증 또는 종양 혈관신생 부위를 포함하는 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 키트를 제공한다. 일 실시형태에서, 키트는 단위 투여 형태의 2개 이상의 약제가 로딩된 유효량의 혈소판을 함유하는 치료 또는 예방 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 치료적 또는 예방적 조성물을 함유하는 무균 용기를 포함하며; 이러한 용기는 상자, 앰풀, 병, 바이알, 튜브, 가방, 파우치, 물집-팩, 또는 당업계에서 공지된 다른 적합한 용기 형태일 수 있다. 이러한 용기는 플라스틱, 유리, 적층형 종이, 금속 호일 또는 의약품을 담기에 적합한 기타 재료로 형성될 수 있다.
원하는 경우, 본 개시내용의 단리된 혈소판을 포함하는 약제학적 조성물이 질환 또는 장애를 갖거나 발병할 위험이 있는 피험자에게 이를 투여하기 위한 지침서와 함께 제공된다. 지침서는 질병의 치료 또는 예방을 위한 또는 이를 필요로 하는 조직에 단리된 혈소판의 전달을 위한 약제학적 조성물의 사용에 관한 정보를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 지침서는 다음 중 적어도 하나를 포함한다: 약제의 설명; 질병 또는 이의 증상의 치료 또는 예방을 위한 투여 스케줄 및 투여; 지침; 경고; 표시; 반대 표시; 과다 복용 정보; 이상 반응; 동물약리학; 임상 연구; 및/또는 참조. 지침서는 용기에 직접 인쇄되거나(존재하는 경우), 용기에 부착된 라벨로, 또는 용기 내부 또는 용기와 함께 제공되는 별도의 시트, 팜플렛, 카드 또는 폴더로 인쇄될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 양태 또는 실시형태는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 다른 양태 또는 실시형태와 조합될 수 있다.
균등물
본 발명이 특정 실시형태와 관련하여 설명되었지만, 추가의 변형이 가능하고 본 출원이 일반적으로 본 발명의 원리에 이어서 본 발명이 속하는 기술 분야 이내에서 통상적으로 실시되거나 공지된 범위 내에 들어가고 앞서 기술된 필수 특징에 적용될 수 있으며 첨부된 청구범위의 범주에 따르는 바와 같은 본 개시내용으로부터의 벗어남을 비롯하여 본 발명의 임의의 변화, 용도 또는 개작을 커버하도록 의도된 것임을 이해할 것이다.
당업자라면, 단지 통상적인 실험에 지나지 않는 것을 이용해서, 본 명세서에 구체적으로 기재된 특정 실시형태에 대한 다수의 등가물을 인식할 것이거나 또는 확인할 수 있다. 이러한 등가물은 이하의 청구범위의 범주에 포함되는 것으로 의도된다.
정의
본 출원에서 사용되는 용어는 단지 특정한 예들을 설명하기 위함이고 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서에서 사용될 때, 달리 명시되지 않는 한, 정관사 및 부정관사는 문맥이 명확하게 그렇지 않은 것으로 나타내지 않는 한 단수 형태뿐만 아니라 복수 형태도 포함하는 것으로 의도된다.
본 개시내용 및/또는 청구범위에서 사용되는 것과 같은 용어“포함하다”, “포함”, “함유하다”, “함유”, “포함하다”, “포함”, “구비하다”, “구비”, “갖다” 또는 이들의 변형은, "포함하다"라는 용어와 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.
용어 “약” 또는 “대략”은 값이 측정되거나 또는 결정되는 방법에 부분적으로 의존할 당업자에 의해 결정되는 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위, 예를 들어, 측정 시스템의 제한 내에 있음을 의미한다. 예를 들어, "약(about)"은 명시된 값보다 10% 크거나 작음을 의미할 수 있다. 다른 예에서, “약”은 주어진 값에서의 관행에 따라 1 이내 또는 1 초과의 표준 편차를 의미할 수 있다. 특정 값이 본 출원 및 청구범위에서 기재되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 “약”은 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위를 의미하는 것으로 추정되어야 한다.
용어 "실질적으로"는 대부분; 또는 본질적으로 상당한 정도를 의미한다. 즉, 용어 실질적으로는 원하는 속성과 거의 정확하게 일치하거나 정확한 속성과 약간 다르다는 것을 의미할 수 있다. 실질적으로는 원하는 속성과 구별가능하지 않을 수 있다. 실질적으로는 원하는 속성과 구별가능할 수 있지만 그 차이는 중요하지 않거나 무시할 수 있다.
"적어도 제2"라는 용어는 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제20, 제30, 제14, 제50, 제60, 제70, 제80, 제90, 제100 또는 이상 및 그 사이의 모든 반복을 의미한다. "하나 이상"이라는 용어는 일, 이, 삼, 사, 오, 육, 칠, 팔, 구, 십, 이십, 삼십, 사십, 오십, 육십, 칠십, 팔십, 구십, 백 또는 그 이상 그리고 그 사이의 임의의 숫자를 포함한다.
용어 "카고(cargo)"는 혈소판, 예를 들어 혈소판의 알파 과립에 로딩될 수 있는 화합물 또는 약제를 의미한다. 이러한 로딩은 화합물의 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 통해 발생한다. 일부 실시형태에서, 용어 "약제" 및 "카고"는 동의어일 수 있다.
참조문헌
이러한 참고문헌 각각의 내용은 전문이 본원에 참조로 인용된다.
Gasic GJ, Gasic TB, Galanti N, Johnson T, Murphy S. Platelet-tumor-cell interactions in mice. The role of platelets in the spread of malignant disease. International journal of cancer Journal international du cancer 1973; 11(3): 704-18.
Gasic GJ, Gasic TB, Stewart CC. Antimetastatic effects associated with platelet reduction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1968; 61(1): 46-52.
Gimbrone MA, Jr., Aster RH, Cotran RS, Corkery J, Jandl JH, Folkman J. Preservation of vascular integrity in organs perfused in vitro with a platelet-rich medium. Nature 1969; 222(5188): 33-6.
Rybak ME, Gimbrone MA, Jr., Davies PF, Handin RI. Interaction of platelet factor four with cultured vascular endothelial cells. Blood 1989; 73(6): 1534-9.
Hilgard P, Heller H, Schmidt CG. The influence of platelet aggregation inhibitors on metastasis formation in mice (3LL). Z Krebsforsch Klin Onkol Cancer Res Clin Oncol 1976; 86(3): 243-50.
Gasic GJ. Role of plasma, platelets, and endothelial cells in tumor metastasis. Cancer metastasis reviews 1984; 3(2): 99-114.
Karpatkin S, Pearlstein E, Ambrogio C, Coller BS. Role of adhesive proteins in platelet tumor interaction in vitro and metastasis formation in vivo. The Journal of clinical investigation 1988; 81(4): 1012-9.
Karpatkin S, Ambrogio C, Pearlstein E. The role of tumor-induced platelet aggregation, platelet adhesion and adhesive proteins in tumor metastasis. Prog Clin Biol Res 1988; 283: 585-606.
Karpatkin S, Pearlstein E. Role of platelets in tumor cell metastases. Annals of internal medicine 1981; 95(5): 636-41.
Klement GL, Yip TT, Cassiola F, et al. Platelets actively sequester angiogenesis regulators. Blood 2009; 113(12): 2835-42.
Cervi D, Yip TT, Bhattacharya N, et al. Platelet-associated PF-4 as a biomarker of early tumor growth. Blood 2008; 111(3): 1201-7.
Klement G, Shai E, Varon D. The Role of Platelets in Angiogenesis. In: Michelson A, ed. Platelets. Third ed. Philadelphia, PA: Mosby Elsevier; 2013: 487-503.
Klement GL. Platelet Biomarkers in Tumor Growth. Current Proteomics 2011; 8(3): 169-80.
Peterson JE, Zurakowski D, Italiano JE, Jr., et al. Normal ranges of angiogenesis regulatory proteins in human platelets. American journal of hematology 2010; 85(7): 487-93.
Peterson JE, Zurakowski D, Italiano JE, Jr., et al. VEGF, PF4 and PDGF are elevated in platelets of colorectal cancer patients. Angiogenesis 2012; 15(2): 265-73.
Savore C, Zhang C, Muir C, et al. Perlecan knockdown in metastatic prostate cancer cells reduces heparin-binding growth factor responses in vitro and tumor growth in vivo. Clinical & experimental metastasis 2005; 22(5): 377-90.
Kareva I, Abou-Slaybi A, Dodd O, Dashevsky O, Klement GL. Normal Wound Healing and Tumor Angiogenesis as a Game of Competitive Inhibition. PloS one 2016; 11(12): e0166655.
Italiano JE, Jr., Richardson JL, Patel-Hett S, et al. Angiogenesis is regulated by a novel mechanism: pro- and antiangiogenic proteins are organized into separate platelet alpha granules and differentially released. Blood 2008; 111(3): 1227-33.
Ma L, Hollenberg MD, Wallace JL. Thrombin-induced platelet endostatin release is blocked by a proteinase activated receptor-4 (PAR4) antagonist. Br J Pharmacol 2001; 134(4): 701-4.
Ma L, Perini R, McKnight W, et al. Proteinase-activated receptors 1 and 4 counter-regulate endostatin and VEGF release from human platelets. PNAS 2005; 102(1): 216-20.
참고문헌에 의한 포함
본원에서 인용된 모든 특허 및 간행물은 본원에서 전체적으로 완전히 참조로서 편입된다.
본원에서 논의된 공보는 본원의 출원일 전에 이들의 기재에 대해 단독으로 제공된다. 본원에서 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 상기 공보를 보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되지 말아야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 모든 제목은 단지 조직적 목적을 위한 것이며, 본 개시내용을 임의의 방식으로 제한하도록 의도되지 않는다. 임의의 개별 섹션의 내용이 모든 섹션에 동일하게 적용될 수 있다.
실시예
실시예 1: 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드는 부착된 카고를 혈소판의 알파 과립으로 격리함
이 예에서, 혈소판의 알파 과립으로 카고를 직접 로딩하는 예시적인 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드의 능력이 결정되었다.
도 1a 및 도 1b에서 PAL1 및 PAL2로서 식별된 Alexa647-표지된 GAG-결합 펩티드, 및 Alexa647-표지된 대조군 펩티드(음성 대조군 역할을 하는 무전하 리간드(CFL))는 콘드로이틴 설페이트와 같은 글리코사미노글리칸에 대한 결합 친화도 및 혈소판으로 들어가는 능력에 대해 테스트되었다. PAL1은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고, PAL2는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖고, CFL은 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 갖는다.
Alexa647-표지된 펩티드(또는 음성 대조군으로서 Alexa647 단독)의 용량 반응 곡선이 도 1a에 도시된다. Alexa647-표지된 펩티드 또는 Alexa647 단독은 혈소판 로딩을 허용하기 위해 37°C에서 1시간 동안 단리된 혈소판과 함께 공동배양되었다. 각각의 혈소판 로딩 능력은 인큐베이션 후 상청액(supernatant)의 형광 감소로 표시되었다. 대조군의 경우, 인큐베이션 기간 없이 동일한 실험이 수행되었다(도면에서 "완료"로 표시됨). 그 후, 공동배양 후 혈소판을 800 g에서 10분 동안 원심분리하여 상청액으로부터 혈소판을 분리하였다(도면에서 "로딩됨"으로 표시됨).
도 1a에 도시된 바와 같이, 완료 측정과 로딩된 측정 사이에 PAL1 및 PAL2에 대한 흡광도가 감소했다. 상청액으로부터의 이러한 흡광도 감소는 이들 펩티드가 상청액으로부터 격리되어 혈소판에 로딩되었음을 나타낸다. 대조적으로, Alexa647-표지된 CFL 조건의 흡광도는 혈소판과 공동배양한 후에도 변하지 않았으며; 이에 따라, CFL 펩티드는 상청액에 남아있었으며 혈소판에 로딩되지 않았다.
도 1b는 각 펩티드 실험에 대해 정규화된, 즉, 로딩된 조건을 완료 조건으로 정규화한, 도 1a의 데이터를 나타낸다. 도 1b는, 예시적인 GAG-결합 펩티드, PAL1 및 PAL2가 부착된 카고를 혈소판 내로 로딩하는 것을 용이하게 하는 반면, 무전하 리간드에 부착된 카고는 카고를 혈소판으로 직접 로딩할 수 없음을 보여준다.
Alexa647-표지된 GAG 결합 펩티드가 혈소판의 알파 과립에 로딩되었는지 확인하기 위해, 공초점 현미경이 사용되었다. 도 1a 및 도 1b의 실험에서 원심분리된 혈소판은, 2% 파라포름알데히드에 고정하고 유리 커버슬립에 정착시켰다. 투과화 후, 혈소판의 알파 과립에 대한 마커인 PF4에 대해 면역형광 염색을 수행하였다. 혈소판은 Alexa568-2차 항체로 염색되었다. 60x 오일 대물렌즈가 장착된 Nikon-A1 레이저 스캐닝 현미경을 통해 이미지를 수집했다.
도 2a는 빨간색으로 표시된 PF4 염색(좌측 열)과 보라색으로 표시된 Alexa647 신호(프리 Alexa647, Alexa647-표지된 GAG 결합 펩티드 또는 Alexa647-표지된 CFL으로부터; 중간 열)를 갖는 대표적인 이미지이다. 이미지는 디스플레이를 위해 밝기와 대비만 조정되었다. 각 실험에 대해 n>5개의 이미지를 획득하였고 PF4 강도에 기반하여 관심 영역(ROI)을 선택하였다.
병합된 이미지(우측 열)는 Alexa647이 GAG-결합 펩티드의 카고인 경우에만 알파 과립 마커 PF4 및 Alexa647 신호의 공동국소화(colocalization)를 나타낸다. 공동국소화는 프리 Alexa647에 대해 또는 Alexa647이 CFL의 카고인 경우 관찰되지 않았다.
각 ROI에 대한 Alexa647 강도는 ImageJ를 사용하여 측정되었고 Prism 8을 사용하여 상자 및 위스커 그래프에 플로팅되었다. 도 2b는 예시적인 GAG-결합 펩티드, PAL1 및 PAL2가 혈소판의 알파 과립으로 부착된 카고를 로딩하는 것을 용이하게 하는 반면, 무전하 리간드에 부착된 카고는 혈소판의 알파 과립 내로는 물론이고 혈소판 내로도 로딩되지 않음을 보여준다.
이들 데이터는, 본 개시내용의 GAG-결합 펩티드가 임의의 부착된 카고를 혈소판의 알파 과립 내로 로딩하는 것을 용이하게 한다는 것을 입증한다.
실시예 2: 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드는 글리코사미노글리칸에 높은 친화도로 결합함
이 실시예에서, 다양한 글리코사미노글리칸에 대한 예시적인 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드의 결합 친화도가 결정되었다.
도 3a는 이 실시예에서 수행된 등온 적정 열량계(ITC) 실험을 도시하는 개략도이다. 여기서, 콘드로이틴 설페이트 A(CSA)는 글리코사미노글리칸에 대한 예시적인 GAG-결합 펩티드의 친화성을 테스트하는 데 사용되었다. 3mM CSA가 주사기에 넣어지고 CSA가 0.25mM GAG-결합 펩티드 용액 또는 음성 대조군으로 작용하는 무전하 리간드(CFL)를 함유한 샘플 셀에 적정되었다. 온도는 22°C로 설정되었고, 버퍼는 5mM Tris-HCl(pH 7.35) 및 1% DMSO였다. 26회의 CSA 주사가 행해졌으며, 첫 번째는 0.1 μl의 용량을 가졌고, 이후 25 번은각각 1.5 μl의 용량을 가졌다. 이들 실험에서, 예시적인 GAG-결합 펩티드는 각각 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 PAL1 및 PAL2이고, CFL은 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 가졌다.
도 3b 내지 도 3d는 PAL1(도 3b), PAL2(도 3c) 및 CFL(도 3d)을 보유하는 세포로 적정된 CSA에 대한 ITC 해리 동역학의 그래프 표현을 보여준다.
도 3b 및 도 3c의 실험 동안 얻은 데이터를 사용하여 CSA 및 GAG-결합 펩티드 상호작용에 대한 해리 상수를 결정하였으며; 이들은 순차 결합 모델을 사용하여 적정 곡선 피팅을 통해 결정되었다. 이들 데이터는 도 3e(PAL1의 경우) 그리고 도 3f(PAL2의 경우)에 도시되어 있다. 이러한 데이터는, 2개의 예시적인 GAG-결합 펩티드가 글리코사미노글리칸 콘드로이틴 설페이트 A에 대해 높은 친화성을 갖는다는 것을 보여준다.
또한, 2개의 예시적인 GAG-결합 펩티드 PAL1 및 PAL2의 헤파란 설페이트(HS) 및 콘드로이틴 설페이트(CSA)에 대한 결합 친화성은 친화성 크로마토그래피를 사용하여 결정되었다. 도 4b에서 나타낸 바와 같이, PAL1은 PAL2보다 CSA에 더 단단하게 결합하는 것으로 나타난다. 해리 상수는 ITC를 사용하여 측정하였으며, 높을수록 결합이 느슨한 것을 의미한다. 도 4c에서, PAL2는 PAL1보다 HS에 더 단단히 결합하는 것으로 나타난다. 결합은 FPLC 시스템에 부착된 Hi-Trap Heparin 컬럼의 용출 부피로 측정되었다. 피크가 늦게 나타날수록 결합이 더 단단해진다. 도 4a에서, 대조군 펩티드(CFL) 및 2개의 PAL(PAL1 및 PAL2)을 포함하는 펩티드 아미노산 서열을 나타내었다.
이러한 데이터는 본 개시내용의 2개의 PAL 서열이 혈소판의 알파 과립에 존재하는 글리코사미노글리칸에 대해 높은 친화력을 가진다는 것과 PAL1은 PAL1보다 CSA에 더 단단하게 결합하고 PAL2는 PAL1보다 HS에 더 단단하게 결합한다는 2개의 주요 글리코사미노글리칸에 대한 다른 결합 선호도를 나타낸다는 것을 실증한다.
실시예 3: 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드 및 약제를 포함하는 화합물은 혈소판의 알파 과립에 로딩됨
이 실시예에서, 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드 및 약제를 포함하는 예시적인 화합물이 혈소판의 알파 과립에 로딩되는 능력이 결정되었다.
본 개시내용의 2개의 예시적인 화합물 및 2개의 대조군 화합물이 구성되었다. 예시적인 화합물은 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드에 (9개의 아미노산 링커를 통해) 간접적으로 링크된 약제(예를 들어, mNeonGreen)를 포함했다. 이들 실험에서, 예시적인 GAG-결합 펩티드는 각각 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 PAL1 및 PAL2였다. 음성 대조군 화합물은 무전하 리간드(CFL)를 포함했고, mNeonGreen에 (9개의 아미노산 링커를 통해) 간접적으로 링크된 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 가졌다. 양성 대조군 화합물은 mNeonGreen에 (9개의 아미노산 링커를 통해) 간접적으로 링크된 PF4(천연 혈소판 인자)를 포함되어 있다. 사용 전에, 이 화합물은 또한 정제 목적을 위한 His-태그뿐만 아니라 His-태그의 제거를 용이하게 하는 TEV-프로테아제 절단 부위도 포함되어 있었다. 화합물은 mCFL(mNeon-L9-CFL용), mPAL1(mNeon-L9-PAL1용), mPAL2(mNeon-L9-PAL2용) 및 PF4m(PF4-L9-mNeon용)으로 식별되었다.
혈소판은 4가지 화합물 중 하나와 함께 1시간 동안 37oC에서 공동배양되었다. 인큐베이션 기간 후, 혈소판은 800g에서 10분 동안 원심분리되었다. 그 후, "로딩된" 상청액(505nm에서)의 형광 흡광도가 측정되었고 인큐베이션 기간 없이 혈소판이 화합물과 혼합된 후 즉시 원심분리되는 각 조건에 대해 상청액인 "완료" 로딩 대조군과 비교되었다. 데이터는 추가로 정규화되었고, 실험의 각 그룹에 대한 로딩 퍼센티지는 도 5에 도시된 바와 같이 플롯팅되었다.
도 5는 2개의 예시적인 화합물이 음성 대조군보다 혈소판 내로 더 큰 로딩 능력 및 양성 대조군 PF4보다 약간 더 큰 로딩 능력을 갖는다는 것을 보여준다.
GAG-결합 펩티드를 포함하는 화합물이 혈소판의 알파 과립에 로딩되었음을 확인하기 위해, 공초점 현미경이 사용되었다. 도 5의 실험에서 원심분리되었던 혈소판은, 2% 파라포름알데히드에 고정되어 유리 커버슬립에 정착되었다. 투과화 후, 혈소판의 알파 과립에 대한 마커인 PF4에 대해 면역형광 염색을 수행하였다. 혈소판은 Alexa568-2차 항체로 염색되었다. 60x 오일 대물렌즈가 장착된 Nikon-A1 레이저 스캐닝 현미경을 통해 이미지를 수집했다.
도 6a는 빨간색(좌측 열)으로 표시된 PF4 염색과 녹색(중간 열)으로 표시된 mNeon 신호가 있는 대표적인 이미지이다. 이미지는 디스플레이를 위해 밝기와 대비만 조정되었다. 각 실험에 대해 n>5개의 이미지가 획득되었고 PF4 강도에 기반하여 관심 영역(ROI)이 선택되었다.
병합된 이미지(우측 열)는 GAG-결합 펩티드를 포함하는 두 가지 예시적인 화합물에 대한 알파 과립 마커 PF4 및 mNeon 신호의 공동국소화를 나타낸다. CFL을 포함하는 화합물에 대해서는 공동국소화가 관찰되지 않았다.
각 ROI에 대한 mNeon 강도는 ImageJ를 사용하여 측정되었고 Prism 8을 사용하여 상자 및 위스커 그래프에 플로팅되었다. 도 6b는 GAG-결합 펩티드를 포함하는 예시적인 화합물이 혈소판의 알파 과립 내로 로딩되는 반면, 무전하 리간드를 포함하는 화합물은 혈소판의 알파 과립 내는 물론이고 혈소판 내로도 로딩되지 않음을 보여준다.
이들 데이터는, GAG-결합 펩티드 및 약제를 포함하는 본 개시내용의 화합물이 혈소판의 알파 과립 내로 로딩함을 입증한다.
실시예 4: 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드 및 약제를 포함하는 화합물은 글리코사미노글리칸에 높은 친화도로 결합함
이 실시예에서, 다양한 글리코사미노글리칸에 대한 본 개시내용의 예시적인 화합물(글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드 및 약제를 포함함)의 결합 친화도가 결정되었다.
도 3a에 도시된 바와 같이 그리고 실시예 2에 설명된 바와 같이 등온 적정 열량계(ITC) 실험은 음성 대조군 화합물과 함께 그리고 또한 본 개시내용의 예시적인 화합물과 함께 이 실시예에서 수행되었다. 실시예 2의 실험과 마찬가지로, 여기서 적정 완충액은 5mM Tris-HCl(pH 7.35)이었고 온도는 22°C로 설정되었지만; 실시예 2의 실험과는 달리 완충액에는 DMSO가 없었다.
도 7a 내지 도 7c는 PAL1(도 7a)을 포함하는 예시적인 화합물, PAL2(도 7b)를 포함하는 예시적인 화합물, 및 CFL(도 7c)을 포함하는 음성 대조군 화합물을 보류하는 세포 내로 적정된 CSA에 대한 ITC 해리 동역학의 그래프 표현을 나타낸다. 이러한 화합물은 이의 약제로 mNeonGreen을 포함하였다.
도 7b 내지 도 7c의 실험 동안 얻은 데이터를 사용하여 CSA 및 화합물 상호작용에 대한 해리 상수를 결정하였으며; 이들은 순차 결합 모델을 사용하여 적정 곡선 피팅을 통해 결정되었다. 이들 데이터는 (PAL1을 포함하는 예시적인 화합물에 대해) 도 7c, (PAL2를 포함하는 예시적인 화합물에 대해) 도 7d, 및 (CFL을 포함하는 음성 대조군 화합물에 대해) 도 7e에 도시되어 있다. 이러한 데이터는, 2개의 예시적인 GAG-결합 펩티드가 글리코사미노글리칸 콘드로이틴 설페이트 A에 대해 높은 친화성을 갖는다는 것을 보여준다.
추가로, 2개의 예시적인 GAG-결합 펩티드 함유 화합물 및 헤파란 설페이트(HS)에 대한 CFL에 대한 결합 친화성은 친화성 크로마토그래피를 사용하여 결정되었다. 도 8에 도시된 바와 같이, GAG-결합 펩티드를 포함하는 화합물은 HS에 높은 친화도로 결합한다. 특히, 2개의 예시적인 GAG-결합 펩티드의 HS에 대한 상대적인 결합 친화도는, PAL2가 PAL1보다 HS에 더 단단히 결합함에 따라 mPAL2가 mPAL1보다 HS에 더 단단히 결합한다는 점에서 이전 실험에서 관찰된 것과 유사하였다. 대조군 펩티드(mCFL)를 포함하는 화합물은 약간의 잔류 결합 능력을 갖고 비교적 낮은 농도의 염에서 용출된 HS 컬럼에 남아 있는데, 이는 아마도 화합물의 약제(예를 들어, mNeonGreen)의 하전 특성 때문일 수 있다.
이들 데이터는 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드 및 약제를 포함하는 본 개시내용의 예시적인 화합물이 혈소판의 알파 과립에 있는 글리코사미노글리칸에 대해 높은 친화성을 갖는다는 것을 입증한다.
실시예 5: 글리코사미노글리칸(GAG) 결합 펩티드가 글리코사미노글리칸에 결합하는 능력에 중요한 서열 특이성의 확인
이 실시예에서, 다양한 글리코사미노글리칸에 대한 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하는 추가 예시적인 화합물의 결합 친화도가 결정되었다. 보다 구체적으로, (SEQ ID NO: 1의)GAG-결합 펩티드의 알라닌-스캐닝 돌연변이유발은 하나의 아미노산이 다른 추가의 예시적인 GAG-결합 펩티드를 생성하였고, 그 후, 이는 실시예 3에 설명된 바와 같이 약제(예를 들어, mNeonGreen)에 간접적으로 링크되었다.
도 3a에 도시된 바와 같이 그리고 실시예 4에 설명된 바와 같이 등온 적정 열량계(ITC) 실험은 또한 본 개시내용의 추가 예시적인 화합물과 함께 이 실시예에서 수행되었다.
도 9a에서, 화합물은 PAL1A 내지 PAL11A로 식별된다. 이들 예시적인 화합물은 SEQ ID NO: 3 내지 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 갖는 GAG-결합 펩티드를 갖는다. 특히, PAL1A의 GAG-결합 펩티드는 위치 1에 알라닌이 있다는 점에서 SEQ ID NO: 1과 상이했고; PAL2A의 GAG-결합 펩티드는 위치 2에 알라닌이 있다는 점에서 SEQ ID NO: 1과 상이했고; PAL3A의 GAG-결합 펩티드는 위치 3에 알라닌이 있다는 점에서 SEQ ID NO: 1과 상이했다.
도 9a는 PAL1A 내지 PAL11A로 확인된 예시적인 화합물 중 하나를 보류하는 세포로 적정된 CSA에 대한 ITC 해리 동역학의 그래프 표현을 나타낸다. 나열된 각 화합물을 포함하는 샘플 셀에 대한 CSA 적정에 의해 생성된 각각의 ITC 곡선에서 볼 수 있듯이, 콘드로이틴 설페이트 A와 상호작용하는 데 있어서는 전하와 서열이 모두 중요하다.
도 9a의 실험 동안 얻은 데이터를 사용하여 CSA 및 추가 예시적인 화합물 상호작용에 대한 해리 상수를 결정하였으며; 이들은 순차 결합 모델을 사용하여 적정 곡선 피팅을 통해 결정되었다. 이들 데이터는 (PAL1A 내지 PAL11A에 대해 각각) 도 9b 내지 도 9l에 도시된다. 이들 데이터는, 추가 예시적인 화합물이 글리코사미노글리칸 콘드로이틴 설페이트 A에 대해 다양한 친화성을 갖는다는 것을 나타낸다.
도 9m은 예시 화합물 및 대조군 화합물에 대한 평균 해리 상수를 도시하는 그래프이다. 이 그래프는 화합물 간의 다양한 크기의 CSA-결합 친화도를 나타낸다. 그래프에서 "1A"로 식별된 데이터는 "PAL1A" 화합물을 나타내고, "2A"로 식별된 데이터는 "PAL2A" 화합물을 나타내는 식이다.
특히, 위치 1, 4, 7 또는 9에 알라닌을 갖는 이들 예시적인 화합물은 가장 낮고 가장 열악한 친화도를 가졌다. 따라서, GAG-결합 펩티드가 해당 위치에 프롤린, 아르기닌 및/또는 이소류신을 가질 때 결합 능력의 개선을 입증한다.
제 위치에 있는 프롤린, 아르기닌 및 이소류신과 같은 중요 아미노산은 결합의 친화도에 영향을 미친다. 흥미롭게도, 이러한 아미노산은 예상대로 양전하를 띠는 아르기닌과 특수한 형태를 유지함으로써 기여할 수 있는 비전하 프롤린 및 이소류신을 또한 포함한다.
이들 데이터는, 하전된 아미노산의 위치가 상이한 GAG-결합 펩티드를 갖는 추가 화합물이 글리코사미노글리칸에 대해 가변 친화성을 갖는다는 것을 입증한다. 그리고, 중요한 잔기(SEQ ID NO: 1에 대한 위치 1, 4, 7 및 9)와 특정 아미노산(예컨대, 프롤린, 아르기닌 및 이소류신)은, 예를 들어, 혈소판의 알파 과립에서 글리코사미노글리칸에 대한 GAG-결합 펩티드의 결합 친화도에 영향을 미친다.
실시예 6: 본 개시내용의 화합물을 형성할 때 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 약제에 접합시키는 예시적인 방법
이 실시예에서, 약제는 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드에 접합되어 본 개시내용의 예시적인 화합물을 형성한다.
도 10a에 도시된 바와 같이, 약제는 말레이미드 반응을 사용하여 GAG-결합 펩티드에 접합되어 본 개시내용의 화합물을 형성한다. 당업계에 공지된 다른 접합 반응, 예를 들어, 숙신이미딜 에스테르 반응 또는 효소 반응이 사용될 수 있다. 도 10a에서, GAG-결합 펩티드(도 10a 에서 "GAG-pep"로 나타냄)는 형광성 모이어티를 포함하고; 본 개시내용의 특정 실시형태에서, 형광성 모이어티는 화합물에 포함되지 않는다.
자체 카고를 혈소판에 로딩하는 본 개시내용의 화합물의 능력을 추가로 입증하기 위해(상기 실시예에서 설명된 바와 같음), 여기서 GAG-결합 펩티드 및 치료 항체(DC101, VEGFR2 억제제)를 포함하는 예시적인 화합물이 생산되었다. 유사한 방법을 사용하여, 항체 이외의 약제가 사용되어 본 개시내용의 화합물을 생성할 수 있다. 예로서, 약제는 화학요법제, 세포독성 화합물, 소분자, 형광성 모이어티, 방사성 요소, 또는 세포 증식, 혈관신생, 염증, 면역, 또는 혈소판에 의해 매개되거나 이와 관련된 다른 생리학적 과정을 억제하는 인자일 수 있다.
혈소판의 알파 과립 내로 로딩되는 형광성 모이어티를 추가로 포함하는 예시적인 화합물(약제로서 항체를 포함함)의 능력이 결정되었다.
4개의 화합물이 제조되었다: 음성 대조군으로서 Alexa647-표지된 DC101(도 10b에서 A-DC101로 확인됨), SEQ ID NO: 14의 무전하 리간드(CFL) 및 DC101 항체를 포함하는 Alexa647-표지된 화합물(도 10b에서 A-CLF-DC101로 확인됨), SEQ ID NO: 1의 GAG-결합 펩티드 및 DC101 항체를 포함하는 Alexa647-표지된 화합물(도 10b에서 A-PAL1-DC101로 확인됨), 및 SEQ ID NO: 2의 GAG-결합 펩티드 및 DC101 항체를 포함하는 Alexa647-표지된 화합물(도 10b에서 A-PAL2-DC101로 확인됨).
혈소판은 37oC에서 1시간 동안 각 화합물과 함께 공동배양되었다. 그 후, 혈소판은 800 g에서 10분 동안 원심분리되었고, 2% 파라포름알데히드에 고정되었으며, 유리 커버슬립에 정착되었다. 투과화 후, 혈소판의 PF4에 대해 면역형광 염색이 수행되었고 Alexa568-2차 항체로 추가로 염색되었다. 60x 오일 대물렌즈가 장착된 Nikon-A1 레이저 스캐닝 현미경을 통해 이미지가 수집되었다.
도 10b의 대표적인 이미지에서, PF4 염색은 빨간색(좌측 열)으로 디스플레이되었고, Alexa647 신호는 보라색(중간 열)으로 도시되었다. 이미지는 디스플레이를 위해 밝기와 대비만 조정되었다. 각 실험에 대해 n>5개의 이미지가 획득되었고 PF4 강도에 기반하여 관심 영역(ROI)이 선택되었다.
병합된 이미지(우측 열)는 Alexa647이 GAG-결합 펩티드와 연관되었을 때만 알파 과립 마커 PF4 및 Alexa647 신호의 공동국소화를 보여주지만, Alexa647이 CFL 또는 DC101 항체와 단독으로 연관되었을 때는 그렇지 않다. 불행히도, PF4 면역염색 반응은 A-PAL2-DC101 화합물과 함께 공동배양된 혈소판에 대해 실패했다. 따라서, 이 그룹에 대한 Alexa647 강도에 기반하여 ROI가 선택되었다.
각 ROI에 대한 Alexa647 강도는 ImageJ를 사용하여 측정되었고 Prism 8을 사용하여 상자 및 위스커 그래프에 플로팅되었다 도 10c에 도시된 바와 같이, 본 개시내용의 2개의 예시적인 화합물은 혈소판의 알파 과립에 로딩되는 반면, 무전하 리간드를 포함하는 화합물 또는 항체를 포함하는 화합물 (GAG-결합 펩티드 없음)은 혈소판의 알파 과립은 물론이고 혈소판에도 로딩되지 않는다.
이러한 데이터는, GAG-결합 펩티드 및 약제를 포함하는 본 개시내용의 화합물이 혈소판의 알파 과립에 로딩됨을 입증한다.
실시예 7: 질병 관련 단백질은 혈소판 알파 과립에 능동적으로 그리고 농도 구배에 반하여 흡수됨
이 실시예에서, 혈소판에 의한 단백질 격리를 분석한 결과 질환 관련 단백질은 농도 구배에 반하여 혈소판 알파 과립에 능동적으로 흡수되는 반면 알부민과 같은 종양 관련 단백질은 그렇지 않음을 발견하였다.
혈전증, 상처 치유 및 죽상 동맥 경화증에서 혈소판의 역할은 잘 확립되어 있지만 종양 성장 및 전이에서 혈소판의 역할은 명확하지 않다. 1960년대로 거슬러 올라가는 간행물은 혈소판이 종양에서 응집하고, 종양 및 내피 세포 성장을 지원하며, 종양 전이를 강화하고, 암 특이적 단백질을 격리한다는 점을 시사한다.
표면 강화 레이저 탈착/이온화 - 비행 시간형 질량 분석기(SELDI-ToF MS)가 혈소판 및 혈장 단백질 프로파일을 평가하기 위해 인간 지방육종의 쥐 모델에서 사용되었다. 비혈관신생(휴면 상태) 및 혈관신생(급속 성장) 인간 종양 이종이식체 보유 마우스로부터 유래한 혈소판은 정상 모의수술된 마우스보다 훨씬 더 높은 수준의 종양 특이적 단백질(즉, VEGF, bFGF, PDGF)을 갖는 것으로 밝혀졌다(도 11 참조).
도 11은 bFGF, VEGF, PDGF 및 엔도스타틴의 혈소판 수준이 종양 성장 자극제 쪽으로 균형을 유지하면서 종양이 휴면 상태에서 벗어나기 직전에 변화한다는 것을 보여주는 다이어그램이다. 인간 지방육종의 휴면 상태에 있는 마우스(청색, 중간 열) 또는 혈관신생 이종이식체 보유 마우스(빨간색, 우측 컬럼)의 혈소판을 표면 강화 레이저 탈착/이온화(SELDI) 비행 시간형(ToF) 질량분석법(MS)을 사용하여 분석하였다. 종양 보유 마우스의 평균 MS 피크 강도를 건강한 모의수술된 동물 마우스의 혈소판과 비교하였다(흑색, 좌측 열). 명백한 바와 같이, 휴면 상태 및 혈관신생 종양은 암 관련 bFGF, VEGF 및 PDGF의 유의한 증가를 나타내지만, 암 억제제인 엔도스타틴은 암 진행에 따라 감소한다. 반면, 휴면 상태(혈관신생 성장, 적색)에서 벗어나는 것은 억제제(엔도스타틴)의 감소와 연관이 있다.
또한, 혈소판은 선택된 암 특이적 단백질을 능동적으로 격리하는 반면, 알부민과 같은 비특이적 단백질은 격리하지 않는 것으로 밝혀졌다. (도 12 참조)
도 12는 혈소판이 암 특이적 단백질을 능동적으로 격리하고 알부민과 같은 비특이적 단백질을 능동적으로 격리하지 않는다는 것을 나타내는 MS 발현 지도이다. SELDI ToF MS를 사용하여 인간 지방육종의 휴면 상태에 있는 마우스(청색, 중간 행) 및 혈관신생 이종이식체 보유 마우스(적색, 하단 행)의 혈소판을 분석하였다. 표시된 바와 같이, 좌측 패널에서, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 종양 보유 마우스의 혈소판에 격리되나 정상적이고 건강한 마우스 혈소판/혈장(회색, 대조군, 상단 행)의 혈소판에는 격리되지 않는다. 대조적으로, 우측 패널은 알부민과 같은 비특이적 단백질이 격리되지 않았다는 것을 표시한다.
다음으로, 건강한 인간 개체의 혈소판은 주로 혈관신생 억제제를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 50명의 건강한 인간 대상체(여성 29명 및 남성 21명) 연령(26세 내지 89세, 중앙값 55±13세)의 혈소판을 수득하여 특이적 단백질에 대한 상용 ELISA 분석(R&D Systems, MN, USA)을 사용하여 분석하였다. 혈장과 비교하여 VEGF(215배), PF-4(516배), PDGF(914배), TSP-1(813배), bFGF(17배) 및 엔도스타틴(0.7배)의 유의한 상승이 있었으나, 더 중요하게도, 자극제와 억제제의 균형이 있었다. (도 13 참조, 이는 혈소판이 혈관신생 자극제(VEGF, bFGF, PDGF) 및 억제제(PF4, 엔도스타틴) 모두를 함유한다는 것을 나타내는 표임). 이 균형은 매우 역동적이었고 암 진행 초기에 변경되었다. 예를 들어, 1차 절제 당시 결장직장 암종이 있었던 인간 대상체(n = 35)의 혈소판은 PDGF(P = 0.024), PF4(P < 0.0001) 및 VEGF(P = 0.012)를 확인하였던 다변량 로지스틱 회귀 모델링에서 CRC15의 독립적인 예측변수였다. 정상적인 인간 대상체의 혈소판은 혈관신생 억제제의 우세를 보이는 반면, 암 환자의 혈소판은 혈관신생 촉진제의 우세를 포함한다.
혈소판 격리 자극제 및 억제제의 균형은 대상체의 생리 변화에 민감한 것으로 밝혀졌다. 암 관련 단백질의 혈소판 격리는 더 나은 결과와 연관된 생활방식 변화를 표시할 수 있다. 혈소판 격리 단백질은 기준선(적색군은 생활방식 변화 없음, 청색군은 생활방식 변화) 및 6개월 간의 개입(운동, 건강한 음식 및 규칙적인 수면과 같은 생활방식 변화) 후 국소 전립선암 환자에서 특징적이었다.
도 14는 긍정적인 생활방식 개입을 받고 있는 국부 전립선암이 있는 대상체 및 개입 후 6개월차에 생활방식의 변화 없이 감시대기 요법을 받고 있는 대상체로부터 유래한 혈소판의 SELDI-ToF 분석을 나타낸다. 기준선에서, 혈소판 단백질 프로파일은 차이가 없었다. 생활방식 개입을 받고 있었던 대상체(청색)는 VEGF(47 및 29kD에서 피크)와 같은 암 성장 촉진제가 감소하고 PF4 및 CTAPIII(7.4 및 9.3kD에서 피크)와 같은 암 성장 억제제가 증가하는 것으로 나타났다. 생활방식 개입군에서 억제제의 명확한 상향 조절과 자극제의 감소가 있었다. 대조적으로, 생활방식에 변화를 주지 않은 환자는 6개월차에 반대 경향을 나타내었다.
실시예 8: 단백질이 혈소판에 격리되는지 여부를 결정하는 주요 요인은 글리코사미노글리칸에 결합하는 단백질의 능력임
이 실시예에서, 혈소판에서 격리되는 단백질의 능력이 결정되었다.
정상적인 생리학적 조건에서 혈소판은 글리코사미노글리칸(GAG)을 절단하는 매우 높은 수준의 효소를 발현한다. 예를 들어, 엔도-글루쿠로니다제는 우선적으로 헤파란 설페이트(HS)를 절단하고 헤파린 다당류(헤파라나제)는 정상 조직에서 매우 낮은 수준으로 발현되지만 상해, 암 또는 염증과 같은 병리학적 조건에서 과도하게 발현된다. 가장 잘 연구된 혈소판 단백질인 혈소판 인자 4(PF4)는 세르글리신의 글리코사미노글리칸(GAG) 사슬에 결합되는 혈소판 α-과립에 보관된다. 혈소판 세르글리신은 PF4가 결합하는 콘드로이틴/더마탄 설페이트로 장식된다. 더 중요하게도, 특정 GAG 아형에 대한 PF4의 친화도가 종양 연관 혈관신생의 국소 조절을 조절한다는 것이 밝혀졌다. PF4는 혈소판 유래 세르글리신 GAG 사슬보다 내피 세포 유래 퍼레칸 헤파란 설페이트 사슬에 대한 친화력이 더 높기 때문에 내피 세포 GAG에 결합하고 FGF2와 같은 혈관신생 자극제의 결합을 방지할 것이다. 이전에는, 상처 치유 또는 종양 성장 동안 세포-세포 상호작용을 결정하는 것이 GAG에 대한 성장 인자 친화도라는 것이 밝혀졌다.
도 15a 및 도 15b는 각각의 수용체의 억제가 혈소판 격리를 억제하지 않지만, 서펜에 의한 헤파린 결합의 억제는 혈소판 α 과립에 의한 단백질 격리의 유의한 억제를 초래한다는 것을 나타내는 그래프이다. FGF, PF4, VEGF 및 TPO에 대한 FACS 분석을 예시하는 도 15a는 투과성 혈소판(흑색 , 각 쌍의 좌측 열)에서 그리고 각각의 수용체 억제제에 노출된 혈소판(회색, 우측 열)에서 성장 인자의 동일한 혈소판 흡수를 나타낸다. 서펜에 의한 혈소판 풍부 혈장의 전처리(청색, 각 쌍의 우측 열)와 대조적으로, 도 15b에서 나타낸 바와 같이, 비특이적 글리코사미노글리칸 억제제는 헤파란 설페이트와 결합하지 않는 유일한 성장 인자인 트롬보포이에틴을 제외한 모든 혈소판에 의한 성장 인자 흡수를 유의하게 억제한다. (Inh = 첨가된 억제제, PF4 수용체, CXCR3B로 알려진 케모카인 수용체 CXCR3의 스플라이스 변이체).
명백하게도, 단백질이 혈소판에 격리되는지 여부를 결정하는 주요 요인은 단백질이 헤파란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 세르글리신 또는 퍼레칸과 같은 글리코사미노글리칸에 결합하는 능력이다.
성장 인자 및 혈관신생 조절 단백질은 수용체 활성화 또는 분해 없이 GAG에 결합된 혈소판 α-과립에 의해 수송될 수 있기 때문에 신규 혈소판 고정 리간드(PAL)가 개발되었다. 본 개시의 다른 부분에서, 다양한 PAL이 개시된다. 예를 들어, PAL1은 ERRIWFPYRRF(SEQ ID NO: 1)의 서열을 갖고; 이는 콘드로이틴 설페이트(CS)에 결합하는 것으로 나타났으며, 혈소판 α-과립의 주요 GAG가 개발되었다.
실시예 9: 혈소판은 일시적 및 공간적으로 조절된 방식으로 내용물을 방출하는 구별되는 α-과립형을 가짐
이 실시예에서, 구별되는 α-과립 구획의 특성화가 설명된다.
VEGF(혈관신생 자극제) 및 엔도스타틴(혈관신생 억제제)이 동시에 로딩된 혈소판은 별도의 α-과립을 점유한다. 면역형광 현미경을 사용하여 혈소판과 거핵구에서 혈관신생 억제제 및 자극제 모두의 위치를 시각화하였다. 도 16에서, 이중 면역형광 현미경은 혈관신생 억제제인 엔도스타틴(적색, 좌측 패널 및 오버레이) 및 혈관신생 촉진제인 VEGF(녹색, 중간 패널 및 오버레이)가 별도의 α-과립에 국소화된다는 것을 나타내었다(오버레이에서 나타낸 바와 같음, 우측 패널).
추가 실험에서 이러한 분리된 과립이 (고친화도 트롬빈 수용체 PAR1에 의해 초기에 방출되는) P-셀렉틴 연관 또는 (저친화도 트롬빈 수용체 PAR4에 의해 방출되는) 폰 빌레브란트 인자(VWF) 연관 중 하나로 확인되었다. 도 17은 혈관신생 자극제가 P-셀렉틴으로 국소화되는 것을 나타내는 면역형광 이미지이다. VEGF 및 엔도스타틴이 별도의 소기관에 있다는 것을 확립한 후 α-과립을 아형으로 분류하였다. 항-P 셀렉틴 및 항-폰 빌레브란트 인자와 같은 특정 혈소판 과립을 인식하는 항체는 α-과립을 표지하는 데 사용되었고 항세로토닌 항체는 조밀한 과립을 표지하는 데 사용되었다. VEGF에 대한 항체(녹색, 좌측 패널) 및 α-과립 마커 P-셀렉틴에 대한 항체(적색, 중간 패널)를 사용한 이중 면역형광 현미경 검사는 VEGF가 P-셀렉틴 α-과립(우측 패널, 병합)에 국소화되어 있다는 것을 확인한다.
대조적으로, 엔도스타틴은 P-셀렉틴 α-과립에 공동국소화되지 않았고 오히려 폰 빌레브란트 인자(vWF) α-과립과 공동 국소화되었다. 도 18은 엔도스타틴이 별도의 구별되는 α-과립 구획에 있고 P-셀렉틴(하단 행)보다는 vWF(상단 행)와 함께 국소화됨을 나타내는 면역형광 이미지이다. α-과립에 확립된 단백질인 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 항체를 사용한 이중 면역형광 염색은 엔도스타틴이 α-과립에도 포함되어 있으나 구별되는 상이한 α-입자 구획에 있다는 것을 확인하는 P-셀렉틴과 공존하지 아니한다는 것을 실증한다.
2개의 α-과립형의 역할을 상처 치유의 맥락에서 이해할 수 있다. 상처 치유에서, 손상 직후 전염증성 사이토카인 및 혈관신생 자극 성장 인자가 필요하다. 그러나, 조직이 치유됨에 따라 더 많은 혈관신생 억제제가 방출된다. 도 19는 상처 치유에서 단백질의 순차적 방출 및 프로테이나제 활성화 수용체 1(PAR1) 및 PAR4의 국소 농도 구배를 요약한 개략도를 포함한다. 표시된 바와 같이, 부상 직후 혈관 발아(sprout)에 대한 초기 과도 신호는 VEGF 후, (bFGF로 인한) 신장 및 튜브 형성, (PDGF로 인한) 주피세포 모집을 통한 혈관 안정화 및 마지막으로 (엔도스타틴, 툼스타틴 및 다른 콜라겐 및 플라스민 절단 생성물로 인한) 혈관 전지(pruning)에 의해 유도된다. 정상적인 상처 치유 과정은 대략 7일 내지 10일이 소요된다. 특히, 이 과정은 시간적 및 공간적으로 제어된 순차적 단백질 방출을 통해 신중하게 조정된 혈관 형성의 배아 순서를 재현한다.
이론에 구속되지 않고, 구별되는 α-과립형을 통해 시간적 및 공간적으로 제어된 순차로 내용물을 방출하는 혈소판의 능력은 혈소판이 제1 약물을 초기 방출 프로파일 갖는 제 1 α-과립형으로 그리고 제2 약물을 후기 방출 프로파일 갖는 제2 α-과립형에 로딩하는 치료 분야에서 이용될 수 있다. 이를 위해, 구별되는 α-과립형의 특징을 알아야 하고 하나의 α-과립형과 다른 α-과립형을 선택적으로 로딩하는 수단을 확립해야 한다.
명백하게도, 혈소판 및 내피 세포는 헤파린 설페이트(HS) 또는 콘드로이틴 설페이트(CS)와 같은 글리코사미노글리칸(GAG)에 결합하는 성장 인자의 능력으로 인해 (VEGF, bFGF 및 PDGF와 같은) 성장 인자를 내부화할 수 있다.
도 20은 쥐 혈관내피종 세포(EOMA)의 표면에서 글리코사미노글리칸(GAG)에 의한 성장 인자의 격리를 나타내는 그래프이다. 여기서, 표준 배지 조건 하에서 대리 종양 환경에서 또는 종양 조건화 배지를 사용하는 단층 조직 배양 조건에서 성장하는 세포는 bFGF를 혈소판 및 내피 세포 상의 GAG로 격리시키고, 따라서, 이를 상청액으로부터 제거한다. 헤파린 및 헤파리나제는 현상을 더 강화한다. 그러나, 여기에서 트롬빈이 풍부한 종양 조건화 배지에 의해 시뮬레이션된 종양 미세환경(가장 우측 데이터 열)에서, bFGF 및 이의 파생물은 GAG로부터 상청액으로 그리고 확장에 의해 종양 미세환경으로 방출된다. 값은 5개 웰의 평균 및 SE를 나타낸다. 이러한 데이터는 격리가 헤파린 의존적이며 트롬빈 존재 시 증가한다는 것을 확인한다.
혈소판 응고에 의해 형성된 임시 기질로부터 성장 인자가 방출된다는 확인은 도 21에 의해 뒷받침된다.
도 21은 혈소판 형성 임시 기질로부터 방출된 성장 인자에 대한 반응으로 쥐 혈관내피종 세포(EOMA)가 증식한다는 것을 나타내는 그래프이다. 표준 배지 또는 종양 조건화 배지를 사용하여 단층 조직 배양물에서 성장하는 EOMA 세포는 bFGF 및 다른 헤파린 설페이트(HS) 결합 성장 인자를 EOMA 세포의 막 및 혈소판 임시 기질 상의 GAG에 고정하여 격리한다. 헤파리나제에 의한 성장 인자의 유리는, 예를 들어, 종양 미세환경에서, 내피 세포의 증식 잠재력을 증가시킨다. 값은 5개 웰의 평균 및 SE를 나타낸다.
혈소판 인자 4(PF4)는 자연에서 발생하는 HS에 대해 가장 높은 친화도 중 하나를 가지며 GAG 부위를 점유하고 다른 HS 결합 성장 인자를 대체할 수 있다. 이와 같이, PF4는 종양 성장의 억제제로 작용한다. 도 22는 혈소판이 종양 활성화 시 내피 세포와 단백질을 교환할 수 있는 임시 기질을 형성한다는 것을 나타내는 면역형광 이미지이다. 쥐 혈관내피종 세포(EOMA) 세포를 표준 배지(DMEM + 10% FBS)에서 성장시켰고 정상 혈소판을 첨가하였다. 정상 조건(상단 행) 하에서, PF4(혈소판 α-과립의 주요 함량, 녹색 및 좌측 열)는 혈소판이 세포막을 따라 응집함에 따라 EOMA 세포의 주변부(즉, 막을 따라)에서 볼 수 있다. 헤파란 설페이트(적색, 좌측 제2 열)은 내피 세포의 막 표면 전체에 분포되어 있으며 DAPI(청색, 우측 제2열)는 핵 대조염색이다. 종양 조건화 배지, 트롬빈 또는 내피 세포의 다른 활성제가 없으면 혈소판의 군집 및 응집이 없다. 대부분의 PF4는 혈소판에서 남아 있으며 내피 세포 GAG와 함께 공동국소화되지 않는다(상단 행의 최우측 이미지 참조). 그러나, EOMA 세포 및 혈소판을 종양 조건화 배지(제2 행)의 존재 하에 배양하면, HS 발현이 증가하고, HS 풍부 표면 EOMA 세포 상의 PF4 응집에 의해 나타난 바와 같이 두꺼운 혈소판 임시 기질이 형성되며; 이 혈소판 임시 기질은 성장을 위해 EOMA 세포에 의해 사용된다. 세포 내 혈소판 PF4의 이러한 응집과 내피 세포 성장의 후속 자극은 콘드로이티나제 및 헤파리티나제(제3 행), 헤파린(제4 행)에 의해 억제된다. 한편, HS 풍부 표면 EOMA 세포 상의 혈소판 PF4의 응집은 트롬빈에 의해 재생산된다(하단 행).
임시 기질 내의 α-과립의 축적은 α-과립의 상이한 구획으로 상이한 약물을 로딩하기 위해 이용될 수 있으며; 이들은 종양 부위에서 형성된 혈소판 임시 기질에 포획되고, 예를 들어, 종양 부위에 존재하는 트롬빈 및 이의 단편에 의해, 일시적 및 공간적으로 제어되는 방식으로 국소적으로 방출된다.
실시예 10: PAL 접합체가 혈소판에 로딩됨
이 실시예에서, (형광 마커 단독 또는 형광 마커 및 예시적 활성제, 여기서는 루시타닙을 갖는) 다양한 접합체를 혈소판에 로딩하였다.
도 23a에서 나타낸 바와 같이, 각각의 Fam-PAL1, Fam-PAL2, Fam-PAL1-루시타닙 및 Fam-PAL2-루시타닙은 혈소판에 로딩되며 로딩된 혈소판을 가시적으로 손상시키지 않는다. DMSO 대조군과 비교하는 경우, Fam-PAL1, Fam-PAL2, Fam-PAL1-루시타닙 및 Fam-PAL2-루시타닙은 혈소판을 응혈촉진성으로 만드는 로딩 과정 의해 (녹색 채널) 활성화되는 대신 혈소판의 형태를 그대로 그리고 휴지 중인 완전한 기능 상태(자색)으로 유지하면서 내부화되었다.
도 23b는 혈소판으로의 Fam-PAL1 또는 Fam-PAL2(상단) 및 Fam-PAL1-루시타닙 및 Fam-PAL2-루시타닙(하단)의 용량 반응 로딩을 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 접합체의 용량은 0.004 mM 내지 0.22 mM 범위였다.
이 실시예에서, PBS의 신선한 혈소판 현탁액은 1시간 동안 37°C에서 표시된 화합물의 다른 농도와 공동배양된 후 10분 동안 800g에서 회전하여 분리되었다. 그 후, 로드된 혈소판을 실온에서 30분 동안 2% 파라포름알데히드에 고정하였고, 실온에서 30분 동안 PBS 중 0.2% Triton-X 1% BSA로 투과성화하였으며, 실온에서 30분 동안 PBS 중 1% BSA로 차단하였고, 각 단계 사이에서 3회의 PBS 세척이 있었다. 마지막으로, 혈소판을 폴리-라이신 코팅 유리 바닥 384-웰 플레이트에 시딩하였고 토끼-항-인간 튜불린 및 A647-당나귀-항-토끼로 면역염색하였다. 이미지는 60x 오일 침지 대물렌즈가 장착된 Nikon-A1 공초점 현미경을 사용하여 획득되었고, ImageJ를 사용하여 처리하였으며, CellProfiler를 사용하여 분석하였다. 도 23b의 그래프는 각 군에 대해 분석된 1,500개보다 많은 혈소판과 함께 R을 사용하여 플롯팅되었다.
실시예 11: 구별되는 α-과립형을 선택적으로 로딩할 수 있음
이 실시예에서, α-과립의 상이한 하위 구획을 특이적으로 로딩하기 위한 특이적 혈소판 고정 서열(PAL)의 차이 및 친화도를 나타낸다.
도 24는 PAL1 및 PAL2가 상이한 세포하 국소화를 갖는다는 것을, 즉, 구별되는 알파 과립에 대한 선호도를 갖는다는 것을 나타내는 면역형광 이미지이다. VEGF를 하나의 알파 과립 세트(녹색)의 마커로 사용하고 PF4를 제2 알파 과립 세트(적색)의 마커로 사용하여, Alexa647-표지된 PAL1 및 PAL2(청색)의 세포하 국소화를 Nikon-A1 공초점 현미경에 기록하였다. PAL1 및 PAL2는 알파-과립의 서브세트 모두에 로딩되었다. 그러나, PAL1은 VEGF/PAL 병합 컬럼에서 청록색으로 표시된 VEGF 서브세트로 더 공동국소화되었던 반면 PAL2는 PF4/PAL 병합 컬럼에서 자색으로 나타낸 PF4 채널로 더 공동국소화되었다. 이들 데이터는 도 4b(PAL1이 PAL2보다 CSA에 더 단단하게 결합한다는 것을 나타냄)에서 및 도 4c(PAL2가 PAL1보다 HS에 더 단단히 결합한다는 것을 나타냄)에서 나타낸 데이터와 함께 2개의 α-과립형이 상이한 GAG 유형의 우세를 특징으로 한다는 것을 시사한다.
이론에 구속되지 않고, PAL-접합체는 먼저 혈소판 내로 내재화한 후 특정 PAL 서열에 기초하여 바람직한 과립형으로 국소화하는 것으로 보인다.
이미지 도 24는 60x 오일 침지 대물렌즈가 장착된 Nikon-A1 공초점 현미경을 사용하여 획득되었다. PAL1 및 PAL2는 병합된 이미지에서 청록색 및 자색 픽셀로 표시된 바와 같이 알파 과립의 두 서브세트와 부분적으로 공동국소화된다. PAL1과 PAL2의 차이를 정량화하기 위해, 로딩된 혈소판의 분획화를 수행하였다.
Fam-PAL1(도 25a 및 도 25b에서 자색) 및 Fam-PAL2(도 25a 및 도 25b에서 연청색) 사이의 상이한 세포하 국소화를 유도하는 메커니즘을 더욱 이해하기 위해, 이러한 2개의 펩티드를 별도로 CSA(도 25a에서 녹색) 또는 HS(도 25b에서 황색) 구조에 도킹하였다. 점선은 상호작용의 핵심인 분자간 접촉을 표시한다. 전반적으로, PAL1 및 PAL2는 모두 아르기닌을 사용하여 GAG와 접촉한다. CSA에 결합할 때, PAL1 및 PAL2는 모두 분자의 한 측에 결합된 상태를 유지하고 염 다리(salt bridge)와 수소 결합을 하며, 이는 CSA에 대한 유사한 결합 친화도와 일치한다. 도 25b에서 나타낸 바와 같이, PAL2는 HS의 측면에 놓이는 반면 PAL1은 HS의 그루브를 따르며; 이러한 구별되는 연관성은 HS에 대한 2개의 PAL의 서로 다른 친화도로 이어질 수 있다. 이러한 구조 모델은 등온 열량측정, FPLC 및 현미경을 포함한 벤치탑 실험에서 관찰한 결과와 일치한다. 실험 데이터의 관점에서, 이러한 모델은 PAL1 및 PAL2의 상이한 기능을 활용하여 여러 치료 시약을 혈소판에 로딩할 수 있는 능력을 나타낸다.
α-과립형이 상이한 GAG 유형의 우세를 특징으로 한다는 지식은 약물을 특정 α-과립형에 선택적으로 로딩하는 데 사용할 수 있다.
도 26a 및 도 26b는 PAL1(SEQ ID NO: 1)이 소분자에 접합될 때 PAL1이 각각의 분자를 혈소판 α-과립으로 안내할 수 있다는 것을 나타낸다. 혈소판은 37oC에서 1시간 동안 Alexa647-표지된 루시타닙 또는 Alexa647-PAL1 접합된 루시타닙과 함께 공동배양되었다. 그 후, 혈소판은 800g에서 10분 동안 원심분리되었고, 2% 파라포름알데히드에 고정되었으며, 유리 커버슬립에 정착되었다. 투과화 후, 혈소판의 PF4에 대해 면역형광 염색이 수행되었고 Alexa568-2차 항체로 추가로 염색되었다. 60x 오일 대물렌즈가 장착된 Nikon-A1 레이저 스캐닝 현미경을 통해 이미지가 수집되었다. 도 26a는 PF4에 대한 면역형광을 적색으로 나타내고 Alexa647을 청색으로 나타낸 대표적인 이미지를 포함한다. 병합된 PF4/Alexa647 채널은 PF4 및 Alexa647-표지된 PAL1 결합-루시타닙의 공동국소화를 나타내었다. 도 26b는 ImageJ를 사용하여 분석된 각 군에서 800보다 많은 ROI에 대한 Alexa647 채널의 평균 강도를 나타내는 그래프이고 오차 막대는 평균의 표준 편차이다.
이러한 데이터는 PAL1-약물 생성물이 α-과립 및, 특히, CS, P-셀렉틴 유형 과립에 로딩될 수 있다는 것을 나타낸다.
도 27a 내지 도 27c는 혈소판 과립을 분획화하는 방법을 실증하고 상이한 과립이 단백질 마커에 의해 구별될 수 있음을 나타낸다. 도 27a는 혈소판 과립을 분획화하는 단계를 예시하는 흐름도이다. 최종 단계는 분리된 혈소판 과립을 갖는 층상 수크로스 구배이고, 이는 도 27b에서 나타나 있으며, 상단 이미지는 정량화된 구배를 나타내는 도면이고, 하단 이미지는 도 27c에서 나타낸 겔에 개별적으로 로딩된 상이한 구배를 나타낸다. 도 27c는 대조군으로서 DMSO를 사용하여 로딩된 혈소판으로부터 유래한 과립 분획의 웨스턴 블롯이다. PF4 및 VEGF는 알파-과립에 대한 마커이고 MRP4 및 LAMP2는 리소좀 및 고밀도 과립을 포함하는 다른 보관 과립에 대한 마커이다. 결과는 대부분의 과립이 분획 B, C 및 D에서 농축되었음을 나타낸다.
PAL1 및 PAL2 및 이들의 접합체의 세포하 국소화를 추가로 조사하기 위해, 상이한 화합물이 로딩된 혈소판의 과립 분획을 고정하고 폴리-라이신 코팅 유리 바닥 384-웰 플레이트에 시딩하였다. 도 27d에서 나타낸 바와 같이, 면역염색을 하나는 PF4(황색) 및 MRP4(적색)이고 다른 하나는 PF4(황색) 및 VEGF(적색)인 2개의 세트로 수행하였다. 이미지는 60x 웰에 침지된 대물렌즈가 장착된 고처리량 공초점 현미경 Phenix를 사용하여 획득되었다. 이 메타 그래프는 표시된 대로 상이한 웰 및 상이한 채널의 대표적인 이미지를 나타낸다. 도 27e에서 나타낸 바와 같이, DMSO 처리 혈소판에서 수집된 모든 분획에 대해 획득한 이미지(도 27d에서 나타냄)에 대한 입자 분석을 통해 마커 PF4, VEGF 및 MRP4가 분수 B, C 및 D에서 풍부하다는 웨스턴 블롯의 관찰을 확인하였다. 또한, 도 27f에서 나타낸 바와 같이, ((표시된 바와 같이) 상이한 화합물로 로딩된 혈소판에서 수집된 모든 분획에서 획득한 Fam-PAL1 및 Fam-PAL1-루시타닙 결합체 또는 Fam-PAL2 및 Fam-PAL2-루시타닙 결합체의 국소화를 실증하는) 영상의 녹색 채널에 대한 입자 분석은 Fam-PAL1 및 Fam-PAL2와 이들의 접합체가 또한 분수 B, C, D에서 풍부해졌다는 것을 실증하였다. 최종적으로, Fam-PAL1 또는 Fam-PAL2와 이들의 접합체의 세포하 국소화를 정량화하기 위해, CellProfiler를 사용하여 분획 B, C, D의 모든 이미지에 대해 피어슨 상관 분석(PCA)을 수행하였다. 도 27g 참조. 간단히 말해서, 각 비교 쌍에 대해, 두 채널의 이미지를 병합하고 개별 과립을 분할하였다. 그 후, 선택된 관심 영역(ROI)에 대해 PCA 분석을 수행하였다. 박스플롯은 R을 사용하여 그래프로 작성되었으며 각 군에는 5,000보다 많은 ROI가 포함된다. 이전에 관찰한 바와 같이 분획 C는 가장 많은 국소화 정보를 제공한다. 파셋 박스플롯은 Fam-PAL1 및 Fam-PAL2와 이들의 접합체가 주로 PF4가 풍부한 알파 과립의 서브세트를 표적으로 한다는 점을 시사한다. 또한, Fam-PAL2 및 이의 접합체는 VEGF 또는 MRP4가 풍부한 다른 과립을 표적으로 한다. 참고로, Fam-PAL2는 Fam의 여기 및 방출을 변경하였을 수 있다. 따라서, 녹색 채널에서 적색 채널로의 잠재적인 출혈을 방지하기 위해 항-PF4가 없는 조건(백색 상자)을 음성 대조군으로 사용하였다.
이러한 결과는 PAL1과 PAL2를 동시에 사용하여 여러 시약을 혈소판에 로딩할 수 있는 가능성을 나타낸다.
실시예 12: 각각의 화합물은 별개의 α-과립형에 로딩되는 2개의 화합물이 로딩된 단리된 혈소판을 제조하기 위한 예시적인 방법
이 예에서, 단리된 혈소판은 본 발명의 2개의 화합물로 로딩되며, 각각의 화합물은 별개의 α-과립형에 로딩된다.
단리된 혈소판이 수득된다. 혈소판은 합성 혈소판, 동종 혈소판, 자가 혈소판, 또는 변형된 이종 혈소판일 수 있다. 실시형태에서, 혈소판은 혈소판 풍부 혈장으로부터 수득된다.
혈소판은 시험관내에서 또는 생체 외에서 본 개시내용의 제1 화합물과 접촉된다. 제1 화합물은 제1 약제 및 제1 폴리펩티드를 포함한다. 제1 폴리펩티드는 혈소판의 α-과립에서 GAG에 결합할 수 있는 PAL1(SEQ ID NO: 1) 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함한다. PAL1은 적어도 제1 α-과립형, 예를 들어 α-과립의 P-셀렉틴 유형 상의 콘드로이틴 설페이트(CS)에 우선적으로 결합한다.
또한, 혈소판은 시험관내에서 또는 생체 외에서 본 개시내용의 제2 화합물과 접촉된다. 제2 화합물은 제2 약제 및 제2 폴리펩티드를 포함한다. 제2 폴리펩티드는 혈소판의 α-과립에서 GAG에 결합할 수 있는 PAL2(SEQ ID NO: 2) 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함한다. PAL2은 적어도 제2 α-과립형, 예를 들어, α-과립의 폰 빌레브란트 인자(VWF) 유형 상의 헤파린 설페이트(HS)에 우선적으로 결합한다.
실시형태에서, 제1 화합물 및 제2 화합물은 순차적으로 로딩된다. 대안적인 실시형태에서, 화합물 및 제2 화합물은 동시에 로딩된다.
접촉은 적합한 온도, 배지 조성(염 농도, pH, 영양소 포함) 및 화합물이 혈소판의 α-과립형에 의해 내재화될 때까지의 시간 길이에서 계속된다. 이와 같이, 로딩된 혈소판이 수득된다. 종종 온도는 혈소판이 수득되거나 투여될 체온, 예를 들어, 37°C이다. 유사하게, 조성물의 pH는 혈소판이 수득되거나 투여될 혈액/혈장의 pH, 예를 들어, 약 7.4의 pH에 가깝다.
본 개시내용에 열거되거나 당업계에 공지된 임의의 약제가 이 실시예에서 사용될 수 있다. 약제는 항체, 화학요법제, 세포독성 화합물, 소분자, 형광성 모이어티, 방사성 요소, 면역 관문 억제제, 성장 인자, 성장 억제제, 프로테아제/프로테이나제, 응고 인자, 지질 또는 인지질, 세포외 기질 단백질, 호르몬, 효소, 케모카인/화학유인물질, 뉴로트로핀, 티로신 키나제(작용제 또는 억제제), 또는 세포 증식, 혈관신생, 염증, 면역 또는 혈소판에 의해 매개되거나 혈소판과 연관되는 다른 생리적 과정을 억제하는 인자를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 약제 및 제2 약제는 독립적으로 EGFR 억제제(예를 들어, 세툭시맙), VEGF 억제제(예를 들어, 베바시주맙), PDL1 억제제(예를 들어, 펨브롤리주맙), FN1 억제제(예를 들어, 오크리플라스민), 멀티키나제 억제제(예를 들어, 레고라페닙), FGFR2 길항제(예를 들어, 탈리도마이드), 트롬빈 및 이의 유사체, CSF3R 작용제(예를 들어, 필그라스팀), PSMB5 억제제(예를 들어, 보르테조밉), 푸마길린, 또는 ALK/ROS1/NTRK 억제제(예를 들어, 크리조티닙) 중 하나일 수 있다.
제1 약제 및 제2 약제는 동일하거나 상이할 수 있다.
예로서, 제1 및 제2 약제는 VEGF 억제제(예를 들어, 베바시주맙) 및 PDL1 억제제(예를 들어, 펨브롤리주맙); 또는 EGFR 억제제(예를 들어, 세툭시맙) 및 멀티키나제 억제제(예를 들어, 레고라페닙); 또는 푸마길린 및 멀티키나제 억제제(예를 들어, 레고라페닙)일 수 있다.
바람직하게는, 단리된 혈소판은 제1 화합물의 1 내지 1000 카피를 포함하고/하거나 제2 화합물의 1 내지 1000 카피를 포함한다.
이렇게 제조된 로딩된 혈소판은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합되어 약제학적 조성물을 생성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제3 폴리펩티드 및 제3 약제, 예를 들어, EGFR 억제제(예를 들어, 세툭시맙) 및 멀티키나제 억제제(예를 들어, 레고라페닙)를 포함하는 제3 화합물과 ALK/ROS1/NTRK 억제제(예를 들어, 크리조티닙)가 조합될 수 있다.
또한, 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 상이한 제1 및 제2 화합물을 각각 포함하는 복수의 혈소판을 조합함으로써 생성될 수 있다. 위에서 언급된 임의의 제1 및/또는 제2 약제 및 이들의 임의의 조합이 사용될 수 있다.
실시예 13: 각각의 화합물이 구별되는 α-과립형에 로딩되는 본 개시내용의 2개 이상의 화합물이 로딩된 단리된 혈소판을 피험자에게 투여함으로써 질환 또는 장애를 치료하는 예시적인 방법
이 예에서, 각각의 화합물이 구별되는 α-과립형에 로딩되는 본 개시내용의 2개 이상의 화합물이 로딩된 단리된 혈소판은, 예를 들어, 질환 또는 장애가 있는, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
여기서, 치료를 필요로 하는 대상체는 본 개시내용의 각각의 화합물이 구별되는 α-과립형에 로딩되는 2개 이상의 화합물을 사용하여 로딩되는 혈소판을 포함하는 하나 이상의 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 (예를 들어, 주입 또는 주사에 의해) 투여받는다.
조성물의 혈소판은 적어도 본 개시내용의 제1 화합물 및 제2 화합물을 포함한다. 제1 화합물은 제1 약제 및 제1 폴리펩티드를 포함한다. 제1 폴리펩티드는 혈소판의 α-과립에서 GAG에 결합할 수 있는 PAL1(SEQ ID NO: 1) 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함한다. PAL1은 적어도 제1 α-과립형, 예를 들어 α-과립의 P-셀렉틴 유형 상의 콘드로이틴 설페이트(CS)에 우선적으로 결합한다. 제2 화합물은 제2 약제 및 제2 폴리펩티드를 포함한다. 제2 폴리펩티드는 혈소판의 α-과립에서 GAG에 결합할 수 있는 PAL2(SEQ ID NO: 2) 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함한다. PAL2은 적어도 제2 α-과립형, 예를 들어, α-과립의 폰 빌레브란트 인자(VWF) 유형 상의 헤파린 설페이트(HS)에 우선적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 조성물의 혈소판은 제3 화합물을 포함한다. 제3 약제 및 제3 폴리펩티드를 포함하는 제3 화합물로서, 제3 폴리펩티드는 혈소판의 제3 알파 과립에서 GAG(글리코사미노글리칸)에 결합할 수 있는 제3 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함한다. 실시형태에서, 제3 GAG-결합 펩티드는 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 및/또는 GPIIb/IIIa에 우선적으로 결합한다.
본 개시내용에 열거되거나 당업계에 공지된 임의의 약제가 이 실시예에서 사용될 수 있다. 제1 약제, 제2 약제, 또는 제3 약제는 항체, 화학요법제, 세포독성 화합물, 소분자, 형광성 모이어티, 방사성 요소, 면역 체크포인트 억제제, 성장 인자, 성장 억제제, 프로테아제/프로테이나제, 응고 인자, 지질 또는 인지질, 세포외 기질 단백질, 호르몬, 효소, 케모카인/화학유인물질, 뉴로트로핀, 티로신 키나제(약제 또는 억제제), 또는 세포 증식, 혈관신생, 염증, 면역 또는 혈소판에 의해 매개되거나 혈소판과 관련된 다른 생리적 과정을 억제하는 인자를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 2개의 화합물은 EGFR 억제제(예를 들어, 세툭시맙), VEGF 억제제(예를 들어, 베바시주맙), PDL1 억제제(예를 들어, 펨브롤리주맙), FN1 억제제(예를 들어, 오크리플라스민), 멀티키나제 억제제(예를 들어, 레고라페닙), FGFR2 길항제(예를 들어, 탈리도마이드), 트롬빈 및 이의 유사체, CSF3R 작용제(예를 들어, 필그라스팀), PSMB5 억제제(예를 들어, 보르테조밉), 푸마길린, 또는 ALK/ROS1/NTRK 억제제(예를 들어, 크리조티닙)으로부터 선택된 약제를 독립적으로 포함할 수 있다. 실시형태에서, 제3 화합물의 경우, 제3 약제를 이 목록으로부터 다시 선택할 수 있다.
일 실시양태에서, 적어도 3개의 화합물이 사용될 수 있으며, 제1, 제2 및 제3 약제는 EGFR 억제제(예를 들어, 세툭시맙) 및 멀티키나제 억제제(예를 들어, 레고라페닙) 및 ALK/ROS1/NTRK 억제제(예를 들어, , 크리조티닙)일 수 있으며; 이는 비소세포폐암 치료에 사용될 수 있다.
혈소판은 본 개시내용의 조합 화합물로 로딩될 수 있다. 예로서, 제1 및 제2 약제는 VEGF 억제제(예를 들어, 베바시주맙) 및 PDL1 억제제(예를 들어, 펨브롤리주맙)일 수 있으며; 이것은 췌장암 치료에 사용될 수 있다. 또한, 제1 및 제2 약제는 EGFR 억제제(예를 들어, 세툭시맙) 및 멀티키나제 억제제(예를 들어, 레고라페닙)일 수 있고; 이것은 폐암 치료에 사용될 수 있다. 제1 약제 및 제2 약제는 멀티키나제 억제제(예를 들어, 레고라페닙) 및 푸마길린일 수 있고; 이는 췌장암, 폐암 또는 결장암 치료에 사용될 수 있다.
대상체는 헤파라나제, 트롬빈 및 이의 단편 펩티드, 프로테아제-활성화 수용체 1(PAR1) 작용제 또는 길항제 펩티드, 프로테아제-활성화 수용체 4(PAR4) 작용제 또는 길항제 펩티드, 플라스민 및 이의 단편, 및/또는 메탈로프로테이나제, 퍼옥시다제 및/또는 포스포히드롤라제 중 하나 이상을 포함하는 제2 약제학적 조성물이 추가로 투여될 수 있다. 제2 약제학적 조성물은 혈소판으로부터 화합물의 방출을 촉진한다. 제2 약제학적 조성물은 약제학적 조성물이 투여된 후, 예를 들어, 제2 약제학적 조성물이 투여되기 전에 적어도 2회 투여될 수 있다.
대상체는 헤파라나제, 트롬빈 및 이의 단편 펩티드, 프로테아제-활성화 수용체 1(PAR1) 작용제 또는 길항제 펩티드, 프로테아제-활성화 수용체 4(PAR4) 작용제 또는 길항제 펩티드, 플라스민 및 이의 단편, 및/또는 메탈로프로테이나제, 퍼옥시다제 및/또는 포스포히드롤라제 중 하나 이상을 포함하는 제2 약제학적 조성물 및/또는 제3 조성물이 추가로 투여될 수 있다. 제2 제약 조성물은 제1 유형의 α-과립으로부터 제1 화합물의 방출을 촉진하고, 제3 제약 조성물은 제2 유형의 α-과립으로부터 제2 화합물의 방출을 촉진한다. 제2 약제학적 조성물 및 제3 약제학적 조성물은 약제학적 조성물이 투여된 후, 예를 들어, 제2 약제학적 조성물이 투여되기 전에 적어도 2회 투여될 수 있다. 제2 조성물은 제3 약제학적 조성물이 투여된 후에 투여될 수 있으며, 그 반대도 가능하다.
대상체는 로딩된 혈소판을 포함하는 약제학적 조성물과 함께 추가 치료제가 투여될 수 있다. 예로서, 대상체는 VEGF 억제제(예를 들어, 베바시주맙)가 로딩된 혈소판이 투여되고 또한 렘데시비르가 투여될 수 있으며; 이는 아마도 COVID와 관련된 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 대상체는 멀티키나제 억제제(예를 들어, 레고라페닙) 및 푸마길린 중 하나 또는 둘 모두가 로딩된 혈소판이 투여될 수 있고, 또한 저용량 화학요법이 투여될 수 있으며; 이는 췌장암, 폐암 또는 결장암 치료에 사용될 수 있다. 피험자는 EGFR 억제제(예를 들어, 세툭시맙) 및 멀티키나제 억제제(예를 들어, 레고라페닙) 중 하나 또는 둘 모두가 로딩된 혈소판을 투여받을 수 있고 또한 저용량 화학요법을 투여받을 수 있고; 이것은 폐암 치료에 사용될 수 있다. 대상체는 EGFR 억제제(예를 들어, 세툭시맙), 멀티키나제 억제제(예를 들어, 레고라페닙) 및 ALK/ROS1/NTRK 억제제 (예를 들어, 크리조티닙) 중 하나 또는 둘 또는 셋 모두가 로딩된 혈소판이 투여될 수 있고 또한 저용량 화학요법이 투여될 수 있으며; 이는 비소세포폐암 치료에 사용될 수 있다.
치료를 필요로 하는 피험자는 암 또는 상해로부터 선택된 질환 또는 장애를 가질 수 있다. 염증은 질병이나 장애의 증상일 수 있다. 질병 또는 장애는 임플란트, 이식편, 스텐트 또는 보철물의 부작용일 수 있다. 질환 또는 장애는 결함이 있는 유전자로 인해 발생할 수 있다.
실시예 14: 본 개시내용의 2개 이상의 화합물을 대상체에게 투여함으로써 질환 또는 장애를 치료하는 예시적인 방법
이 실시예에서, 본 개시내용의 2개 이상의 화합물은, 예를 들어, 질병 또는 장애를 갖는, 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
여기서, 치료를 필요로 하는 대상체는 본 개시내용의 2개 이상의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 (예를 들어, 주입 또는 주사에 의해) 투여받는다. 이 방법에서, 2개 이상의 화합물은 생체 내에서 혈소판에 로딩된다.
제1 화합물은 제1 약제 및 제1 폴리펩티드를 포함한다. 제1 폴리펩티드는 혈소판의 α-과립에서 GAG에 결합할 수 있는 PAL1(SEQ ID NO: 1) 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함한다. PAL1은 적어도 제1 α-과립형, 예를 들어 α-과립의 P-셀렉틴 유형 상의 콘드로이틴 설페이트(CS)에 우선적으로 결합한다. 제2 화합물은 제2 약제 및 제2 폴리펩티드를 포함한다. 제2 폴리펩티드는 혈소판의 α-과립에서 GAG에 결합할 수 있는 PAL2(SEQ ID NO: 2) 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함한다. PAL2은 적어도 제2 α-과립형, 예를 들어, α-과립의 폰 빌레브란트 인자(VWF) 유형 상의 헤파린 설페이트(HS)에 우선적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 제3 화합물이 혈소판에 로딩된다. 제3 약제 및 제3 폴리펩티드를 포함하는 제3 화합물로서, 제3 폴리펩티드는 혈소판의 제3 알파 과립에서 GAG(글리코사미노글리칸)에 결합할 수 있는 제3 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함한다. 실시형태에서, 제3 GAG-결합 펩티드는 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 및/또는 GPIIb/IIIa에 우선적으로 결합한다.
본 개시내용에 열거되거나 당업계에 공지된 임의의 약제가 이 실시예에서 사용될 수 있다. 제1 약제, 제2 약제, 또는 제3 약제는 항체, 화학요법제, 세포독성 화합물, 소분자, 형광성 모이어티, 방사성 요소, 면역 체크포인트 억제제, 성장 인자, 성장 억제제, 프로테아제/프로테이나제, 응고 인자, 지질 또는 인지질, 세포외 기질 단백질, 호르몬, 효소, 케모카인/화학유인물질, 뉴로트로핀, 티로신 키나제(약제 또는 억제제), 또는 세포 증식, 혈관신생, 염증, 면역 또는 혈소판에 의해 매개되거나 혈소판과 관련된 다른 생리적 과정을 억제하는 인자를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 2개의 화합물은, EGFR 억제제(예를 들어, 세툭시맙), VEGF 억제제(예를 들어, 베바시주맙), PDL1 억제제(예를 들어, 펨브롤리주맙), FN1 억제제(예를 들어, 오크리플라스민), 멀티키나제 억제제(예를 들어, 레고라페닙), FGFR2 길항제(예를 들어, 탈리도마이드), 트롬빈 및 이의 유사체, CSF3R 작용제(예를 들어, 필그라스팀), PSMB5 억제제(예를 들어, 보르테조밉), 푸마길린, 또는 ALK/ROS1/NTRK 억제제(예를 들어, 크리조티닙)으로부터 선택된 약제를 포함할 수 있다.
대상체는 2개 이상의 화합물이 투여될 수 있고; 추가 화합물은 바로 위의 목록 또는 당업계에 공지된 임의의 약제로부터 선택된 약제, 예를 들어, 항체, 화학요법제, 세포독성 화합물, 소분자, 형광성 모이어티, 방사성 요소, 면역 관문 억제제, 성장 인자, 성장 억제제, 프로테아제/프로테이나제, 응고 인자, 지질 또는 인지질, 세포외 기질 단백질, 호르몬, 효소, 케모카인/화학유인물질, 뉴로트로핀, 티로신 키나제(작용제 또는 억제제), 또는 세포 증식, 혈관신생, 염증, 면역 또는 혈소판에 의해 매개되거나 혈소판과 연관되는 다른 생리적 과정을 억제하는 인자를 가질 수 있다.
일 실시양태에서, 적어도 3개의 화합물이 사용될 수 있으며, 제1, 제2 및 제3 약제는 EGFR 억제제(예를 들어, 세툭시맙) 및 멀티키나제 억제제(예를 들어, 레고라페닙) 및 ALK/ROS1/NTRK 억제제(예를 들어, , 크리조티닙)일 수 있으며; 이는 비소세포폐암 치료에 사용될 수 있다.
대상체는 헤파라나제, 트롬빈 및 이의 단편 펩티드, 프로테아제-활성화 수용체 1(PAR1) 작용제 또는 길항제 펩티드, 프로테아제-활성화 수용체 4(PAR4) 작용제 또는 길항제 펩티드, 플라스민 및 이의 단편, 및/또는 메탈로프로테이나제, 퍼옥시다제 및/또는 포스포히드롤라제 중 하나 이상을 포함하는 제2 약제학적 조성물이 추가로 투여될 수 있다. 제2 약제학적 조성물은 혈소판으로부터 화합물의 방출을 촉진한다. 제2 약제학적 조성물은 약제학적 조성물이 투여된 후, 예를 들어, 제2 약제학적 조성물이 투여되기 전에 적어도 2회 투여될 수 있다.
대상체는 헤파라나제, 트롬빈 및 이의 단편 펩티드, 프로테아제-활성화 수용체 1(PAR1) 작용제 또는 길항제 펩티드, 프로테아제-활성화 수용체 4(PAR4) 작용제 또는 길항제 펩티드, 플라스민 및 이의 단편, 및/또는 메탈로프로테이나제, 퍼옥시다제 및/또는 포스포히드롤라제 중 하나 이상을 포함하는 제2 약제학적 조성물 및/또는 제3 조성물이 추가로 투여될 수 있다. 제2 제약 조성물은 제1 유형의 α-과립으로부터 제1 화합물의 방출을 촉진하고, 제3 제약 조성물은 제2 유형의 α-과립으로부터 제2 화합물의 방출을 촉진한다. 제2 약제학적 조성물 및 제3 약제학적 조성물은 약제학적 조성물이 투여된 후, 예를 들어, 제2 약제학적 조성물이 투여되기 전에 적어도 2회 투여될 수 있다. 제2 조성물은 제3 약제학적 조성물이 투여된 후에 투여될 수 있으며, 그 반대도 가능하다.
대상체는 본 개시내용의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물과 함께 추가 치료제를 투여받을 수 있다. 추가 치료제는 렘데시비르 및/또는 저용량 화학요법일 수 있다.
치료를 필요로 하는 피험자는 암 또는 상해로부터 선택된 질환 또는 장애를 가질 수 있다. 염증은 질병이나 장애의 증상일 수 있다. 질병 또는 장애는 임플란트, 이식편, 스텐트 또는 보철물의 부작용일 수 있다. 질환 또는 장애는 결함이 있는 유전자로 인해 발생할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> CSTS Health Care Inc. <120> PLATELET ALPHA-GRANULES FOR DELIVERY OF MULTIPLE PROTEINS <130> 58533-702.601 <150> US 63/142,402 <151> 2021-01-27 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 1 Glu Arg Arg Ile Trp Phe Pro Tyr Arg Arg Phe 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 2 Arg Phe Arg Trp Pro Tyr Arg Ile Arg Glu Phe 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 3 Ala Arg Arg Ile Trp Phe Pro Tyr Arg Arg Phe 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 4 Glu Ala Arg Ile Trp Phe Pro Tyr Arg Arg Phe 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 5 Glu Arg Ala Ile Trp Phe Pro Tyr Arg Arg Phe 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 6 Glu Arg Arg Ala Trp Phe Pro Tyr Arg Arg Phe 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 7 Glu Arg Arg Ile Ala Phe Pro Tyr Arg Arg Phe 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 8 Glu Arg Arg Ile Trp Ala Pro Tyr Arg Arg Phe 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 9 Glu Arg Arg Ile Trp Phe Ala Tyr Arg Arg Phe 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 10 Glu Arg Arg Ile Trp Phe Pro Ala Arg Arg Phe 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 11 Glu Arg Arg Ile Trp Phe Pro Tyr Ala Arg Phe 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 12 Glu Arg Arg Ile Trp Phe Pro Tyr Arg Ala Phe 1 5 10 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 13 Glu Arg Arg Ile Trp Phe Pro Tyr Arg Arg Ala 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 14 Glu Gly Gly Ile Trp Phe Pro Tyr Gly Gly Phe 1 5 10

Claims (114)

  1. 조성물로서,
    제1 약제 및 제1 폴리펩티드를 포함하는 제1 화합물로서, 상기 제1 폴리펩티드는 혈소판의 제1 알파 과립형에서 GAG(글리코사미노글리칸)에 결합할 수 있는 제1 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하는, 화합물; 및
    제2 약제 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 제2 화합물로서, 상기 제2 폴리펩티드는 상기 혈소판의 제2 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제2 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하는, 화합물을 포함하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드는 콘드로이틴 설페이트(CS)에 우선적으로 결합하고 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 헤파란 설페이트(HS)에 우선적으로 결합하는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드는 콘드로이틴 설페이트 A(CSA)에 우선적으로 결합하고 바람직하게는 헤파란 설페이트(HS)에 결합하지 않는, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 알파 과립형은 P-셀렉틴 회합 과립이고 상기 제2 알파 과립형은 폰 빌레브란트(von Willebrand) 인자 회합 과립인, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 알파 과립형의 내용물은 고친화성 트롬빈 수용체 PAR1를 통해 방출되고 상기 제2 알파 과립형의 내용물은 저친화성 트롬빈 수용체 PAR4를 통해 방출되고, 선택적으로, 알파 과립의 내용물은 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 퍼옥시다제, 포스포히드롤라제, 플라스민, 또는 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)와 같은 플라스민 유도체와의 접촉에 대한 반응으로 방출될 수 있는, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 알파 과립형의 내용물은 상기 제2 알파 과립형의 내용물의 방출을 제공하기 위해 필요한 트롬빈 농도보다 더 낮은 트롬빈 농도에서 방출되는, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 알파 과립형의 내용물은 상기 제2 알파 과립형의 내용물이 방출되기 전에 방출되는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드의 길이는 각각 약 8개 아미노산 내지 약 14개 아미노산인, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드 중 하나 또는 모두는 적어도 하나의 하전된 아미노산을 포함하는, 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드 중 모두는 적어도 하나의 하전된 아미노산을 포함하는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드 중 하나 또는 모두는 적어도 하나의 프롤린, 아르기닌, 및/또는 이소류신을 포함하는, 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 적어도 적어도 하나의 프롤린, 아르기닌, 및/또는 이소류신을 포함하는, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나와 적어도 약 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나와 적어도 약 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 임의의 하나에 대해 위치 1, 위치 4, 위치 7, 또는 위치 9에 하전된 아미노산을 포함하는, 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 임의의 하나에 대해 위치 1, 위치 4, 위치 7, 및/또는 위치 9에 프롤린, 아르기닌, 및/또는 이소류신을 독립적으로 포함하는, 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 적어도 10개의 아미노산을 독립적으로 포함하는, 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및/또는 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 적어도 11개의 아미노산을 독립적으로 포함하는, 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 11개의 아미노산으로 독립적으로 구성되는, 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 구성되고, 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 구성되는, 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 상기 제1 GAG-결합 펩티드로 구성되고, 상기 제2 폴리펩티드는 상기 제2 GAG-결합 펩티드로 구성되는, 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드의 N-말단은 상기 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고/되거나 상기 제2 폴리펩티드의 N-말단은 제2 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되는, 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단은 상기 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고/되거나 상기 제2 폴리펩티드의 C-말단은 제2 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되는, 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 약제는 제1 링커를 통해 상기 제1 폴리펩티드에 간접적으로 연결되고/되거나 상기 제2 약제는 제2 링커를 통해 상기 제2 폴리펩티드에 간접적으로 연결되는, 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 제1 링커 및/또는 상기 제2 링커는 각각 하나 이상의 원자를 포함하는, 조성물.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 제1 링커 및/또는 상기 제2 링커는 각각 반복 단위의 중합체를 포함하는, 조성물.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 링커 및/또는 상기 제2 링커는 각각 아미노산 사슬을 포함하는, 조성물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 약제는 상기 제1 폴리펩티드에 직접적으로 연결되고/되거나 상기 제2 약제는 상기 제2 폴리펩티드에 직접적으로 연결되는, 조성물.
  33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 말레이미드 반응, 숙신이미딜 에스테르 반응, 효소 반응, 또는 단백질 구조 또는 활성에 영향을 미치지 않는 다른 접합 시스템을 사용하여 상기 제1 약제는 상기 제1 폴리펩티드에 직접적으로 연결되고/되거나 상기 제2 약제는 상기 제2 폴리펩티드에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되는, 조성물.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 약제 및/또는 상기 제2 약제는 항체, 화학요법제, 세포독성 화합물, 소분자, 형광성 모이어티, 방사성 요소, 면역 관문 억제제, 성장 인자, 성장 억제제, 프로테아제/프로테이나제, 응고 인자, 지질 또는 인지질, 세포외 기질 단백질, 호르몬, 효소, 케모카인/화학유인물질, 뉴로트로핀, 티로신 키나제(작용제 또는 억제제), 또는 세포 증식, 혈관신생, 염증, 면역 또는 혈소판에 의해 매개되거나 혈소판과 연관되는 다른 생리적 과정을 억제하는 인자를 포함하는, 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 제1 약제 및/또는 상기 제2 약제는 항체 또는 형광성 모이어티를 포함하는, 조성물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 약제 및/또는 상기 제2 약제는 포유류 세포에 유해하고/하거나 대상체에 독성이고/이거나 상기 제1 약제 및/또는 상기 제2 약제는 대상체의 혈류에 직접적으로 투여되는 경우 분해되기 쉬운, 화합물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 화합물 및/또는 상기 제2 화합물은 형광성 모이어티를 추가로 포함하는, 조성물.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및/또는 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 및/또는 GPIIb/IIIa에 또한 우선적으로 결합하는, 조성물.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 약제 및 제3 폴리펩티드를 포함하는 제3 화합물을 추가로 포함하며, 상기 제3 폴리펩티드는 혈소판의 제3 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제3 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하고; 상기 제3 GAG-결합 펩티드는 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 및/또는 GPIIb/IIIa에 우선적으로 결합하는, 조성물.
  40. 단리된 혈소판으로서,
    제1 약제 및 제1 폴리펩티드를 포함하는 제1 화합물의 적어도 1 카피로서, 상기 제1 폴리펩티드는 혈소판의 제1 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제1 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하는, 화합물; 및
    제2 약제 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 제2 화합물의 적어도 1카피로서, 상기 제2 폴리펩티드는 상기 혈소판의 제2 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제2 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하는, 화합물을 포함하는, 단리된 혈소판.
  41. 제40항에 있어서, 상기 혈소판은 합성, 동종이계, 자가 또는 변형된 이종 혈소판인, 단리된 혈소판.
  42. 제41항에 있어서, 상기 혈소판은 자가 혈소판인, 단리된 혈소판.
  43. 제41항에 있어서, 상기 혈소판은 동종이계 혈소판인, 단리된 혈소판.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 혈소판은 혈소판 풍부 혈장으로부터 수득되는, 단리된 혈소판.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈소판은 상기 제1 화합물의 적어도 1 내지 1000 카피 및 상기 제2 화합물의 적어도 1 내지 1000 카피를 포함하는, 단리된 혈소판.
  46. 제45항에 있어서, 상기 제1 화합물의 1 내지 1000 카피는 혈소판의 제1 알파 과립형에 로딩되고, 상기 제2 화합물의 1 내지 1000 카피는 상기 혈소판의 제2 알파 과립형에 로딩되는, 단리된 혈소판.
  47. 제46항에 있어서, 상기 제1 화합물의 적어도 1 카피는 상기 혈소판의 제2 알파 과립형에 로딩되고, 상기 제2 화합물의 적어도 1 카피는 상기 혈소판의 제1 알파 과립형에 로딩되는, 단리된 혈소판.
  48. 제40항 내지 제47항에 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드는 콘드로이틴 설페이트(CS)에 우선적으로 결합하고 제2 상기 GAG-결합 펩티드는 헤파란 설페이트(HS)에 우선적으로 결합하는, 단리된 혈소판.
  49. 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드는 콘드로이틴 설페이트 A(CSA)에 우선적으로 결합하고 바람직하게는 헤파란 설페이트(HS)에 결합하지 않는, 단리된 혈소판.
  50. 제40항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 알파 과립형은 P-셀렉틴 회합 과립이고 상기 제2 알파 과립형은 폰 빌레브란트 인자 회합 과립인, 단리된 혈소판.
  51. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 알파 과립형의 내용물은 고친화성 트롬빈 수용체 PAR1를 통해 방출되고 상기 제2 알파 과립형의 내용물은 저친화성 트롬빈 수용체 PAR4를 통해 방출되고, 선택적으로, 알파 과립의 내용물은 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 퍼옥시다제, 포스포히드롤라제, 플라스민, 또는 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)와 같은 플라스민과의 접촉에 대한 반응으로 방출될 수 있는, 단리된 혈소판.
  52. 제40항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 알파 과립형의 내용물은 상기 제2 알파 과립형의 내용물의 방출을 제공하기 위해 필요한 트롬빈 농도보다 더 낮은 트롬빈 농도에서 방출되는, 단리된 혈소판.
  53. 제40항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 알파 과립형의 내용물은 상기 제2 알파 과립형의 내용물이 방출되기 전에 방출되는, 단리된 혈소판.
  54. 제40항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드의 길이는 각각 약 8개 아미노산 내지 약 14개 아미노산인, 단리된 혈소판.
  55. 제54항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드 중 하나 또는 모두는 적어도 하나의 하전된 아미노산을 포함하는, 단리된 혈소판.
  56. 제55항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드 중 모두는 적어도 하나의 하전된 아미노산을 포함하는, 단리된 혈소판.
  57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드 중 하나 또는 모두는 적어도 하나의 프롤린, 아르기닌, 및/또는 이소류신을 포함하는, 단리된 혈소판.
  58. 제57항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 적어도 적어도 하나의 프롤린, 아르기닌, 및/또는 이소류신을 포함하는, 단리된 혈소판.
  59. 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나와 적어도 약 70% 동일한 아미노산 서열을 독립적으로 포함하는, 단리된 혈소판.
  60. 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나와 적어도 약 80% 동일한 아미노산 서열을 독립적으로 포함하는, 단리된 혈소판.
  61. 제54항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 독립적으로 포함하는, 단리된 혈소판.
  62. 제54항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 임의의 하나에 대해 위치 1, 위치 4, 위치 7, 또는 위치 9에 하전된 아미노산을 독립적으로 포함하는, 단리된 혈소판.
  63. 제54항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 임의의 하나에 대해 위치 1, 위치 4, 위치 7, 및/또는 위치 9에 프롤린, 아르기닌, 및/또는 이소류신을 독립적으로 포함하는, 단리된 혈소판.
  64. 제54항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 적어도 10개의 아미노산을 독립적으로 포함하는, 단리된 혈소판.
  65. 제54항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 적어도 11개의 아미노산을 독립적으로 포함하는, 단리된 혈소판.
  66. 제54항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 11개의 아미노산으로 독립적으로 구성되는, 단리된 혈소판.
  67. 제54항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 13 중 하나의 아미노산 서열로 구성되는, 단리된 혈소판.
  68. 제54항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 2와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 혈소판.
  69. 제68항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 혈소판.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 구성되고, 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 구성되는, 단리된 혈소판.
  71. 제40항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 상기 제1 GAG-결합 펩티드로 구성되고, 상기 제2 폴리펩티드는 상기 제2 GAG-결합 펩티드로 구성되는, 단리된 혈소판.
  72. 제40항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드의 N-말단은 상기 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고/되거나 상기 제2 폴리펩티드의 N-말단은 제2 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되는, 단리된 혈소판.
  73. 제40항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단은 상기 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고/되거나 상기 제2 폴리펩티드의 C-말단은 제2 제1 약제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되는, 단리된 혈소판.
  74. 제40항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 약제는 제1 링커를 통해 상기 제1 폴리펩티드에 간접적으로 연결되고/되거나 상기 제2 약제는 제2 링커를 통해 상기 제2 폴리펩티드에 간접적으로 연결되는, 단리된 혈소판.
  75. 제74항에 있어서, 상기 제1 링커 및/또는 상기 제2 링커는 각각 하나 이상의 원자를 포함하는, 단리된 혈소판.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, 상기 제1 링커 및/또는 상기 제2 링커는 각각 반복 단위의 중합체를 포함하는, 단리된 혈소판.
  77. 제74항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 링커 및/또는 상기 제2 링커는 각각 아미노산 사슬을 포함하는, 단리된 혈소판.
  78. 제40항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 약제는 상기 제1 폴리펩티드에 직접적으로 연결되고/되거나 상기 제2 약제는 상기 제2 폴리펩티드에 직접적으로 연결되는, 단리된 혈소판.
  79. 제40항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 말레이미드 반응, 숙신이미딜 에스테르 반응, 효소 반응, 또는 단백질 구조 또는 활성에 영향을 미치지 않는 다른 접합 시스템을 사용하여 상기 제1 약제는 상기 제1 폴리펩티드에 직접적으로 연결되고/되거나 상기 제2 약제는 상기 제2 폴리펩티드에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되는, 단리된 혈소판.
  80. 제40항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 약제 및/또는 상기 제2 약제는 항체, 화학요법제, 세포독성 화합물, 소분자, 형광성 모이어티, 방사성 요소, 면역 관문 억제제, 성장 인자, 성장 억제제, 프로테아제/프로테이나제, 응고 인자, 지질 또는 인지질, 세포외 기질 단백질, 호르몬, 효소, 케모카인/화학유인물질, 뉴로트로핀, 티로신 키나제(작용제 또는 억제제), 또는 세포 증식, 혈관신생, 염증, 면역 또는 혈소판에 의해 매개되거나 혈소판과 연관되는 다른 생리적 과정을 억제하는 인자를 독립적으로 포함하는, 단리된 혈소판.
  81. 제80항에 있어서, 상기 제1 약제 및/또는 상기 제2 약제는 항체를 포함하고/하거나 형광성 모이어티를 포함하는, 단리된 혈소판.
  82. 제40항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 약제 및/또는 상기 제2 약제는 포유류 세포에 유해하고/하거나 대상체에 독성이고/이거나 상기 제1 약제 및/또는 상기 제2 약제는 대상체의 혈류에 직접적으로 투여되는 경우 분해되기 쉬운, 단리된 혈소판.
  83. 제40항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 화합물 및/또는 상기 제2 화합물은 형광성 모이어티를 추가로 포함하는, 단리된 혈소판.
  84. 제40항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GAG-결합 펩티드 및/또는 상기 제2 GAG-결합 펩티드는 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 및/또는 GPIIb/IIIa에 또한 우선적으로 결합하고, 선택적으로, 제3 약제 및 제3 폴리펩티드를 포함하는 제3 화합물의 적어도 1카피를 추가로 포함하며, 상기 제3 폴리펩티드는 혈소판의 제3 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제3 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하고; 상기 제3 GAG-결합 펩티드는 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 및/또는 GPIIb/IIIa에 우선적으로 결합하는, 단리된 혈소판.
  85. 제40항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 혈소판은 상기 로딩 과정에 의해 활성화되기보다는 휴지 중인 완전한 기능을 하는 혈소판으로 남아 있는, 단리된 혈소판.
  86. 약제학적 조성물로서, 제40항 내지 제85항 중 어느 한 항의 단리된 혈소판 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  87. 제86항에 있어서, 제3 약제 및 제3 폴리펩티드를 포함하는 제3 화합물의 적어도 1카피를 포함하는 제2 단리된 혈소판을 추가로 포함하며, 상기 제3 폴리펩티드는 혈소판의 제3 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제3 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하고; 상기 제3 GAG-결합 펩티드는 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 및/또는 GPIIb/IIIa에 우선적으로 결합하는, 약제학적 조성물.
  88. 제86항에 있어서, 상기 제1 화합물의 적어도 1카피를 포함하는 제2 단리된 혈소판을 추가로 포함하거나 제2 화합물의 적어도 1카피를 포함하는 제3 단리된 혈소판을 포함하는, 약제학적 조성물.
  89. 제88항에 있어서, 상기 제1 화합물의 적어도 1카피를 포함하는 제2 단리된 혈소판을 추가로 포함하고 제2 화합물의 적어도 1카피를 포함하는 제3 단리된 혈소판을 포함하는, 약제학적 조성물.
  90. 제86항 내지 제89항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 용도로서, 질환 또는 장애를 치료하기 위한, 용도.
  91. 제40항 내지 제85항 중 어느 한 항의 단리된 혈소판 또는 제86항 내지 제89항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 용도로서, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 용도.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 암인, 용도.
  93. 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 제86항 내지 제89항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  94. 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  95. 제93항 또는 제94항에 있어서, 상기 제1 알파 과립형의 내용물은 상기 제2 알파 과립형의 내용물이 방출되기 전에 표적 부위에서 방출되는, 방법.
  96. 제93항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 헤파라나제, 트롬빈 및 이의 단편 펩티드, 프로테아제-활성화 수용체 1(PAR1) 작용제 또는 길항제 펩티드, 프로테아제-활성화 수용체 4(PAR4) 작용제 또는 길항제 펩티드, 플라스민 및 이의 단편, 메탈로프로테이나제, 퍼옥시다제 및/또는 포스포히드롤라제 중 하나 이상을, 독립적으로, 포함하는 제2 약제학적 조성물 및/또는 제3 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 제2 약제학적 조성물은 제1 알파 과립형으로부터의 제1 화합물의 방출을 촉진하고 상기 제3 약제학적 조성물은 제2 알파 과립형으로부터의 제2 화합물의 방출을 촉진하는, 방법.
  98. 제96항 또는 제97항에 있어서, 상기 제2 약제학적 조성물 및/또는 상기 제3 약제학적 조성물은 상기 약제학적 조성물이 투여된 후 투여되는, 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 상기 제2 약제학적 조성물 및/또는 상기 제3 약제학적 조성물이 투여되기 전에 적어도 2회 투여되는, 방법.
  100. 제93항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 암인, 방법.
  101. 제93항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장애의 질환은 염증인, 방법.
  102. 제93항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장애의 질환은 임플란트, 이식편, 스텐트 또는 보철물의 부작용인, 방법.
  103. 제93항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장애의 질환은 결함 유전자에 의해 유발되거나 상기 질환 또는 장애는 상해인, 방법.
  104. 제93항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 휴지 중인 완전한 기능을 하는 혈소판으로 남아 있는 단리된 혈소판을 포함하는, 방법.
  105. 로딩된 혈소판을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    혈소판을 수득하는 단계,
    시험관내(in vitro)에서 또는 생체외(ex vivo)에서 상기 혈소판을 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉하게 하는 단계, 및
    상기 제1 화합물이 상기 혈소판의 제1 알파 과립형에 의해 내재화되고 상기 제2 화합물이 상기 혈소판의 제2 알파 과립형에 의해 내재화될 때까지 상기 혈소판과 상기 화합물 사이의 접촉이 진행되도록 하여 로딩된 혈소판을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  106. 로딩된 혈소판을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    혈소판을 수득하는 단계,
    제1 약제 및 제1 폴리펩티드를 포함하는 제1 화합물을 시험관내(in vitro)에서 또는 생체외(ex vivo)에서 상기 혈소판과 접촉하게 하며 상기 제1 폴리펩티드는 혈소판의 제1 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제1 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하는 단계; 및
    제2 약제 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 제2 화합물을 시험관내(in vitro)에서 또는 생체외(ex vivo)에서 상기 혈소판과 접촉하게 하며 상기 제2 폴리펩티드는 상기 혈소판의 제2 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제2 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하는 단계를 포함하는, 방법.
  107. 제106항에 있어서, 상기 제1 화합물을 상기 혈소판과 접촉하게 하는 단계 및 상기 제2 화합물을 상기 혈소판과 접촉하게 하는 단계는 동시에 발생하는, 방법.
  108. 제106항에 있어서, 상기 제1 화합물을 상기 혈소판과 접촉하게 하는 단계 및 상기 제2 화합물을 상기 혈소판과 접촉하게 하는 단계는 순차적인, 방법.
  109. 106항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 약제 및 제3 폴리펩티드를 포함하는 제3 화합물을 시험관내(in vitro)에서 또는 생체외(ex vivo)에서 상기 혈소판과 접촉하게 하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제3 폴리펩티드는 혈소판의 제3 알파 과립형에서 GAG에 결합할 수 있는 제3 글리코사미노글리칸(GAG)-결합 펩티드를 포함하고; 상기 제3 GAG-결합 펩티드는 세르글리신, 퍼레칸, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 및/또는 GPIIb/IIIa에 우선적으로 결합하는, 방법.
  110. 제106항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 화합물을 상기 혈소판과 접촉하게 하는 단계 및 상기 제2 화합물을 상기 혈소판과 접촉하게 하는 단계는 상기 혈소판을 활성화하지 않고, 대신에, 상기 혈소판이 휴지 중인 완전한 기능을 하는 혈소판으로 남아 있는, 방법.
  111. 제40항 내지 제85항 중 어느 한 항의 단리된 혈소판 및 사용 설명서를 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한, 키트.
  112. 제86항 내지 제89항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물 및 사용 설명서를 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한, 키트.
  113. 제111항 또는 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 헤파라나제, 트롬빈 및 이의 단편 펩티드, 프로테아제-활성화 수용체 1(PAR1) 작용제 또는 길항제 펩티드, 프로테아제-활성화 수용체 4(PAR4) 작용제 또는 길항제 펩티드, 플라스민 및 이의 단편, 메탈로프로테이나제, 퍼옥시다제 및/또는 포스포히드롤라제 중 하나 이상을, 독립적으로, 포함하는 상기 대상체에게 제2 약제학적 조성물 및/또는 제3 약제학적 조성물을 추가로 포함하는, 키트.
  114. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 화합물 및 사용 설명서를 포함하는 로딩된 혈소판을 제조하기 위한, 키트.
KR1020237028462A 2021-01-27 2022-01-27 다중 단백질 전달을 위한 혈소판 알파-과립 KR20230137377A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163142402P 2021-01-27 2021-01-27
US63/142,402 2021-01-27
PCT/US2022/014107 WO2022165043A2 (en) 2021-01-27 2022-01-27 Platelet alpha-granules for delivery of multiple proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230137377A true KR20230137377A (ko) 2023-10-04

Family

ID=82653937

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237028462A KR20230137377A (ko) 2021-01-27 2022-01-27 다중 단백질 전달을 위한 혈소판 알파-과립

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20240052012A1 (ko)
EP (1) EP4284917A2 (ko)
JP (1) JP2024505000A (ko)
KR (1) KR20230137377A (ko)
CN (1) CN116917464A (ko)
AU (1) AU2022214200A1 (ko)
CA (1) CA3205305A1 (ko)
IL (1) IL304493A (ko)
WO (1) WO2022165043A2 (ko)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201322396D0 (en) * 2013-12-18 2014-02-05 Univ Nottingham Transduction
US20220193140A1 (en) * 2019-05-08 2022-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Washed platelet extract

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022165043A2 (en) 2022-08-04
IL304493A (en) 2023-09-01
AU2022214200A1 (en) 2023-08-24
CA3205305A1 (en) 2022-08-04
EP4284917A2 (en) 2023-12-06
WO2022165043A3 (en) 2022-10-06
JP2024505000A (ja) 2024-02-02
US20240052012A1 (en) 2024-02-15
CN116917464A (zh) 2023-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102507853B1 (ko) 인간 히알루로니다제 ph20의 변이체와 약물을 포함하는 피하투여용 약학 조성물
JP2021113226A (ja) ｐ９７のフラグメントおよびその使用
US9161992B2 (en) P97 fragments with transfer activity
CN110121506A (zh) 条件活性多肽及产生它们的方法
US20200222548A1 (en) Synthetic bioconjugates
JP2018510613A (ja) 新規な抗線維芽細胞活性化タンパク質（ｆａｐ）抗体およびその派生使用
CA3152776A1 (en) Pharmaceutical formulations and dosage regimens for multi-specific binding proteins that bind her2, nkg2d, and cd16 for cancer treatment
WO2020109625A1 (en) Combined treatment of primary central nervous system lymphoma
CN104995207B (zh) β整联蛋白-G蛋白α亚基结合相互作用的抑制剂
US20240052012A1 (en) Platelet alpha-granules for delivery of multiple proteins
US20220218833A1 (en) Platelet-facilitated delivery of therapeutic compounds
WO2021187478A1 (ja) 自己組織化ペプチドを含む組成物
CA2991223A1 (en) Pore-forming peptides and uses thereof
US20180009898A1 (en) Antibodies against p97 and conjugates thereof
WO2024050058A2 (en) Ul141 variants, compositions thereof and methods of using the same for cancer immunotherapy
KR20230064559A (ko) 인간 히알루로니다제 ph20과 약물을 포함하는 약학 조성물