CN116836808A - 一株嗜酸性耐镉微藻及其在土壤修复中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株嗜酸性耐镉微藻及其在土壤修复中的应用。该嗜酸性耐镉微藻的名称为小球藻（Chlorella sp.）ZJ2，保藏号为GDMCC No：63653，于2023年7月14日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心。该微藻具有在酸性环境下同时吸附镉及提升环境pH的能力，可用于镉污染修复及其酸性土壤的改良。

Description

一株嗜酸性耐镉微藻及其在土壤修复中的应用

技术领域

本发明属于微藻生物技术领域，特别涉及一株嗜酸性耐镉微藻及其在土壤修复中的应用。

背景技术

水稻田被Cd污染时会导致水稻中Cd含量超标，而长期食用含Cd大米时会引起痛痛病和肾衰竭等疾病。因此水稻田土壤中Cd的钝化及去除对保障水稻食品安全意义重大。土壤中Cd活性与土壤pH、有机质、氧化还原电位及矿物元素等相关，其中pH是影响其生物有效性的主要因素。土壤pH的升高会降低Cd的生物有效性，进而降低作物中的Cd含量。可见，提升水稻田土壤pH将有利于降低土壤Cd的生物有效性。

由于降雨淋溶作用以及氮肥的过度使用，红壤酸化问题日益严重。土壤酸化一方面会导致农作物减产，另一方面又加剧了土壤Cd污染，进一步威胁粮食安全。常用的治理方法（如施用石灰、粉煤灰等）容易导致土壤板结、施加材料容易流失和土壤复酸化等问题，无法从根本上解决土壤酸化问题，因此亟待开发出绿色可持续的酸性红壤改良方法.

微藻具有生长速度快、环境适应性强等特点，其中部分微藻具有较强的Cd吸附能力。近期有较多研究者分别从废水和土壤中筛选获得具有Cd吸附能力的微藻，并且证实其对Cd的吸附率在60.00%以上，这些结果都表明微藻具备Cd污染处理潜力。然而，华南水稻土的酸性环境对微藻在Cd污染土壤修复中的应用提出了新的挑战。酸性环境一方面会抑制微藻的生长，另一方面又会提升Cd活性，加剧其对微藻的毒性作用，这使得普通微藻在酸性Cd污染环境中难以生存。由于目前有关微藻Cd吸附相关研究大多在中性pH条件下进行，且已公开的Cd污染修复微藻大多不具备耐酸能力。因此，筛选出在酸性环境下同时具备Cd吸附能力及pH提升能力的微藻对Cd污染修复具有重要意义。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株嗜酸性耐镉微藻。

本发明的另一目的还在于提供上述嗜酸性耐镉微藻在土壤修复中的应用。

本发明的目的通过下列技术方案实现：

一株嗜酸性耐镉微藻，名称为小球藻（Chlorella sp.）ZJ2，保藏号为GDMCC No：63653，于2023年7月14日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心。

上述嗜酸性耐镉微藻在BG-11培养基中培养，耐受的最低pH为4，耐受Cd的最高浓度为6 mg/L。该嗜酸性耐镉微藻不仅具有在酸性条件下吸附镉的能力，而且在生长过程还具有提升pH的能力，从而更适合用于镉污染的酸性土壤的修复。

上述嗜酸性耐镉微藻在土壤修复中的应用，其中的土壤为镉污染土壤或酸性土壤；更优选为镉污染的酸性土壤；最优选为华南地区稻田土壤。

所述的修复是吸附土壤中的镉和提升土壤的pH值中的至少一种。

上述嗜酸性耐镉微藻在土壤修复中的应用，包括如下步骤：将上述嗜酸性耐镉微藻接种至土壤表面进行培养。

所述的嗜酸性耐镉微藻优选为处于对数生长期的嗜酸性耐镉微藻，从而活力更强。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益结果：

本发明通过合理筛选流程从华南酸性稻田土壤中筛选得到了一株嗜酸性耐Cd微藻。相比于此前报道的Cd吸附微藻，本发明提供的嗜酸性耐Cd微藻具有更强的嗜酸性以及在酸性环境下同时具有吸附Cd和提升环境pH的能力，因此，其可用于镉污染修复及其酸性土壤的改良。

附图说明

图1 是小球藻ZJ2的SEM表征图及基于18S rRNA基因序列的系统发育树图。

图2 是不同条件下小球藻ZJ2的生长情况图；其中，a为不同初始pH，b为不同初始Cd浓度。

图3是pH为6时小球藻ZJ2在含Cd培养基中培养的不同指标检测结果图；其中，a为培养基残余Cd浓度，b为pH值变化，c为生长情况。

图4 是小球藻ZJ2在初始Cd浓度为3 mg/L、不同pH的培养基中培养的不同指标检测结果图；其中，a为培养基残余Cd浓度，b为pH值变化，c为生长情况。

图5为不同小球藻在不同pH条件下培养9天后的生物量检测结果图；其中，a为小球藻FACHB-4，b为小球藻ZJ1。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：微藻的采集分离纯化过程

样品采集于春季华南酸性稻田土壤（113°52′51″E、23°03′43″N），用取样器采集深度为0～40 cm的稻田土，用聚乙烯样品袋盛放样品。

将10.00 g新鲜土壤样品置于50 mL灭菌BG-11液体培养基，培养基初始pH为5，加入CdCl₂母液，使培养基Cd浓度为5 mg/L，置于30 ℃光照培养箱中4 000 lx持续光照培养5d；转接上清液至新鲜BG-11培养基在相同条件下培养5 d，转接量为2% (v/v)，重复转接两次。

用稀释涂布法分离微藻，将富集物用无菌蒸馏水稀释至浓度为10^-4～10^-6，吸取一定的稀释液（10 µL）置于BG-11固体培养基平板上，用涂布棒将稀释液均匀涂在整个平板上。将平板置于30 ℃光照培养箱中，4 000 lx持续光照培养5 d，挑取单个藻落划线于BG-11固体平板中培养基中，4 000 lx持续光照培养待长出单菌落后，重复平板划线过程直至获得纯藻。

BG-11液体培养基的组成如下：NaNO₃1.00 g/L、K₂HPO₄0.04 g/L、MgSO₄·7H₂O0.075 g/L、CaCl₂·2H₂O 0.036 g/L、柠檬酸0.006 g/L、柠檬酸铁铵0.006 g/L、EDTA0.001g/L、Na₂CO₃0.02 g/L、H₃BO₄0.00286 g/L、MnCl₂·H₂O 0.00181 g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.000222g/L、CuSO₄·5H₂O 0.000079 g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.00039 g/L、Co(NO₃)₂·6H₂O 0.000049g/L；溶剂为去离子水。

BG-11固体培养基与BG-11液体培养基的区别在于：还含有琼脂粉18 g/L。

实施例2：微藻的鉴定

将实施例1分离得到的纯藻接种于灭菌BG-11液体培养基中，于30 ℃光照培养箱中4 000 lx持续光照培养至对数生长期，即OD₆₈₀=1.2。

取2 mL对数生长期的微藻培养液于离心管中，6000 r/min下离心5 min，用2 mLPBS（浓度为0.1 mmol/L，pH=7.4）重悬浮后离心弃上清，加入2.5%（v/v）戊二醛磷酸缓冲液重悬浮后于4℃下过夜固定，用0.15%戊二醛磷酸缓冲液冲洗后，依次用30%、50%、70%、90%和100%浓度的乙醇进行梯度脱水，每次脱水15 min，再用叔丁醇置换乙醇，静置15min，8 000r/min下离心5 min，将得到的藻体冷冻干燥2 h后进行喷金镀膜，将制备好的样品于扫描电镜（Phenom Pro X，复纳科学仪器有限公司，荷兰）下观察，结果如图1所示，所筛选的微藻藻细胞的直径约为3～5 μm，呈圆球型。

取2 mL对数期生长的藻液于离心管中，8 000 r/min下离心5 min，收集藻体转移至研钵中，加入液氮研磨，用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA（上海生物工程股份有限公司），进行18S rRNA基因扩增。PCR扩增体系：2×Tap mix 12.5 μL，18S rRNA基因通用引物为NS1和NS6，购买于上海生物工程股份有限公司。PCR程序：预热95 ℃5 min；裂解95 ℃30 s、退火55 ℃30 s、延伸72 ℃30 s，循环30次；72 ℃延伸10 min。将产物进行琼脂糖凝胶电泳判断是否成功获得目标条带，并将产物送至生物工程(上海)股份有限公司测序，并将测序结果（如下所示）进行Blast比对并构建系统发育树，结果如图1所示，所筛选的微藻属于小球藻属，命名为Chlorella sp. ZJ2，于2023年7月14日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：63653。

NS1引物：5’- GTATCATATGCTTGTCTC-3’；

NS6引物：5’- GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3’。

18S rDNA序列：

ACGCTTTGGGCTGGTCGCCAATAGTCCCTCTAAGAAGTCCGCCGGCTGGAGAACCAACCGTGACTATTTAGCAGGCTGAGGTCTCGTTCGTTACCGGAATCAACCTGACAAGGCAACCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCACCCATAGAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTCACTATGTCTGGACCTGGTAAGTTTTCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACGCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCGGAACCCAAAAACTTTGATTTCTCATAAGGTGCCGGCGGAGTCATCGAAGAAACATCCGCCGATCCCTAGTCGGCATCGTTTATGGTTGAGACTAGGACGGTATCTAATCGTCTTCGAGCCCCCAACTTTCGTTCTTGATTAATGAAAACATCCTTGGCAAATGCTTTCGCAGTAGTTCGTCTTTCATAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAATGAAATACGAATGCCCCCCGACTGTCCCTCTTAATCATTACTCCGGTCCTACAGACCAACAGGATAGGCCAGAGTCCTATCGTGTTATTCCATGCTAATGTATTCAGAGCGTAGGCCTGCTTTGAACACTCTAATTTACTCAAAGTAACAGCGCCGACTCCGAGTCCCGGACAGTGAAGCCCAGGAGCCCGTCCCCGGCAACAAGGTGGGCCCTGCCAGTGCACACCGAAACGGCGGACCGGCAGGCCCCACCCGAAATCCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAGCAACTTAAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGATCCTCGTTAAGGGGTTTAGATTGTACTCATTCCAATTACCAGACCTGAAAAGGCCCAGTATTGTTATTTATTGTCACTACCTCCCTGTGTCAGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATCCTCCGTCACCCGTTACCACCATGGTAGGCCTCTATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAAACATCGCCGGCACAAGGCCATGCGATTCGTGAAGTTATCATGATTCACCGCGAGTCGGGCAGAGCCCGGTCGGCCTTTTATCTAATAAATACGTCCCTTCCAGAAGTCGGGATTTACGCACGTATTAGCTCTAGATTTACTACGGGTATCCGAGTAGTAGGTACCATCAAATAAACTATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACAGTATAAAGCAGTTTATACTTAGACCT。

实施例3：小球藻ZJ2耐酸耐镉能力测试

首先用BG-11液体培养基进行小球藻ZJ2种子液的培养，培养条件为于30 ℃光照培养箱中4 000 lx持续光照培养5 d，当小球藻ZJ2的细胞密度达到1×10⁷～1×10⁸个/mL时，获得小球藻ZJ2种子液。

配置初始pH分别为3.00、3.50、4.00、5.00、6.00、7.00的BG-11培养基，分别接种对数生长期小球藻ZJ2，接种量为体积百分比2%，于30 ℃光照培养箱中培养，4 000 lx持续光照培养，每3 d测一次OD₆₈₀，共培养15 d。

以pH为6.00的BG-11培养基为基础培养基，加入CdCl₂母液，使Cd浓度分别为0.00、1.00、2.00、3.00、6.00 mg/L，接种对数生长期的微藻，接种量为体积百分比2%，于30 ℃光照培养箱中培养，4 000 lx持续光照培养，每3 d测一次OD₆₈₀，共培养12 d。

结果表明：小球藻ZJ2能够在pH＝4的培养基中生长（如图2中的a所示），说明小球藻ZJ2具备耐酸能力，且小球藻ZJ2在pH＝4条件下培养15 d的最终生物量比pH=7条件下增加了15.9%，说明小球藻ZJ2是一株嗜酸性微藻，适合在酸性环境中生长；小球藻ZJ2能够在Cd浓度为6.00 mg/L的培养基中生长（如图2中的b所示），说明小球藻ZJ2具备一定的耐Cd能力。

实施例4：小球藻ZJ2的Cd吸附能力及pH提升能力测试

首先用BG-11液体培养基进行小球藻ZJ2种子液的培养，培养条件同实施例2，当小球藻ZJ2培养液OD₆₈₀=1.2时，获得小球藻ZJ2种子液。

以pH为6的BG-11培养基为基础培养基，加入CdCl₂母液使BG-11培养基中Cd浓度分别为0.00、1.50、3.00、5.00 mg/L。离心收集小球藻ZJ2种子液中藻体，转移至等种子液体积的含不同Cd浓度的BG-11培养基中，使初始OD₆₈₀≈1.2，于30℃光照培养箱中培养，4 000 lx持续光照培养48 h，每12 h取一次样监测OD₆₈₀和体系pH。收集滤液（0.22 μm滤头脱氯）用于Cd浓度检测。使用电感合等离子发射光谱仪（ICP-OES，Perkin Elmer Optima 8000，美国）测定溶液中Cd的含量。

结果如图3所示，藻株ZJ2在初始Cd浓度分别为1.50、3.00和5.00 mg/L的体系中培养36 h后达到Cd吸附平衡，3种浓度下的Cd吸附率分别为84.36%、78.03%和68.43%。同时，初始Cd浓度为1.50、3.00和5.00 mg/L体系中的OD₆₈₀由1.17分别增至1.57、1.52和1.53，pH由6.00分别提升至7.54、7.34和7.16，说明藻株ZJ2在生长的过程中具有提升体系pH的能力。

以上结果说明小球藻ZJ2在生长过程中可以同时发挥Cd吸附作用及pH提升作用。

实施例5：小球藻ZJ2在酸性pH下的Cd吸附能力及pH提升能力测试

首先用BG-11液体培养基进行小球藻ZJ2种子液的培养，培养条件同实施例2，当小球藻ZJ2培养液OD₆₈₀=1.2时，获得小球藻ZJ2种子液。

配置pH分别为4.00、5.00、6.00的BG-11培养基，加入CdCl₂母液使培养基中Cd浓度为3.00 mg/L。离心收集小球藻ZJ2种子液中藻体，并加入等种子液体积的含不同Cd浓度的BG-11培养基，于30℃光照培养箱中培养，4 000 lx持续光照培养48 h，每12 h取一次样监测OD₆₈₀和体系pH。收集滤液(0.22 μm滤头脱氯)用于Cd浓度检测。使用电感合等离子发射光谱仪(ICP-OES，Perkin Elmer Optima 8000，美国)测定溶液中Cd的含量。

结果如图4所示，藻株ZJ2在Cd浓度为3.00 mg/L以及初始pH分别为4.00、5.00和6.00的BG-11培养基中48 h，Cd的吸附率分别为64.91%、66.10%和72.72%。藻株ZJ2在吸附Cd的过程中，生物量和pH都有一定的提升，培养48 h后，初始pH为4.00、5.00和6.00体系中的pH也从4.50、5.50和6.40分别增至6.91、7.32和7.65，初始pH为4.00、5.00和6.00体系中的OD₆₈₀从1.15分别增至2.39、2.23和2.52。

研究表明，微藻表面基团对重金属的吸附会受到其他阳离子的影响，而且当环境中的H⁺浓度较高时会与Cd竞争吸附位点，影响微藻对Cd的吸附，因此低pH条件下，微藻对Cd的吸附率较低。但小球藻ZJ2在pH=4的条件下仍具有良好的Cd吸附能力，并且在吸附Cd的同时能够提升环境pH，这使得藻株ZJ2在Cd污染修复及酸性土壤的改良中具有应用前景。

实施例6：其他小球藻的耐酸能力测试

首先用BG-11液体培养基进行小球藻FACHB-4（来源于中国科学院淡水藻种库）及小球藻ZJ1（从广东地区土壤中筛选获得的一株藻）种子液的培养，培养条件同实施例2，当微藻的细胞密度达到1×10⁷～1×10⁸个/mL时，获得微藻种子液。

配置初始pH分别为4.00、5.00、6.00、7.00的BG-11培养基，分别接种对数生长期小球藻FACHB-4及小球藻ZJ1，接种量为体积百分比2%，于30 ℃光照培养箱中培养，4 000 lx持续光照培养9 d，测量培养液OD₆₈₀。结果如图5所示，小球藻FACHB-4（见图5中的a）及小球藻ZJ1（见图5中的b）都不具备酸性pH下的生长能力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一株嗜酸性耐镉微藻，其特征在于：所述的嗜酸性耐镉微藻的名称为小球藻（Chlorella sp.）ZJ2，保藏号为GDMCC No：63653，于2023年7月14日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心。

2.权利要求1所述的嗜酸性耐镉微藻在土壤修复中的应用，其特征在于：所述的土壤为镉污染土壤或酸性土壤。

3.根据权利要求2所述的嗜酸性耐镉微藻在土壤修复中的应用，其特征在于：所述的土壤为镉污染的酸性土壤。

4.根据权利要求2所述的嗜酸性耐镉微藻在土壤修复中的应用，其特征在于：所述的土壤为华南地区稻田土壤。

5.根据权利要求2所述的嗜酸性耐镉微藻在土壤修复中的应用，其特征在于：所述的修复是吸附土壤中的镉和提升土壤的pH值中的至少一种。

6.根据权利要求2所述的嗜酸性耐镉微藻在土壤修复中的应用，其特征在于：将权利要求1所述的嗜酸性耐镉微藻接种至土壤表面进行培养。

7.根据权利要求6所述的嗜酸性耐镉微藻在土壤修复中的应用，其特征在于：所述的嗜酸性耐镉微藻为处于对数生长期的嗜酸性耐镉微藻。