CN111187735B

CN111187735B - 一株伪枝藻203及其培养方法与应用

Info

Publication number: CN111187735B
Application number: CN201911411270.0A
Authority: CN
Inventors: 吴丽; 林思萌; 张祖麟; 杨列; 柯柏明; 钱隆; 叶兴旺
Original assignee: Wuhan University of Technology WUT
Current assignee: Wuhan University of Technology WUT
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN111187735A

Abstract

本发明提供了一株伪枝藻203，该菌株的保藏编号为CCTCC NO.M2019801。本发明还提供了所述伪枝藻203在固沙中的应用，其能够耐受高盐胁迫，固氮能力极强。此外，本发明还提供了一种利用城市生活污水培养伪枝藻203的方法，包括(1)藻种制备；(2)污水预处理；(3)藻种的污水培养驯化(4)污水培养伪枝藻203；(5)伪枝藻203的收集与储存；该方法不仅能够降低所述伪枝藻203的培养成本，还能够实现废水的资源化利用，适用于大规模藻类培养。将城市生活污水的资源化利用与荒漠化治理相结合，达到环境、经济“双赢”目的。

Description

一株伪枝藻203及其培养方法与应用

技术领域

本发明涉及藻种领域，尤其涉及一株伪枝藻203及其培养方法与应用。

背景技术

荒漠化被称为“地球的癌症”，是影响人类生存和发展的全球重大生态问题，其扩展趋势已经严重威胁到人类社会的可持续发展。目前已采取了多种预防和治理措施来遏制荒漠化的扩展，如生物固沙，化学固沙，机械固沙等。其中，生物固沙是最有希望从根本上解决荒漠化问题的途径。生物固沙，主要包括人工造林、构造生物结皮等。其中，构造人工生物结皮是一种新型荒漠化治理措施，其独特的生理生态特性可起到有效防风固沙的效果。近年来，研究者利用培养基大量培养荒漠藻种，将藻液直接喷洒于流沙表面，以构建人工生物结皮从而进行荒漠化治理。结果表明，在流沙表面形成的人工生物结皮能够有效的起到固定沙表、改善土壤理化性质及促进当地生态系统的修复的作用。然而，利用培养基进行大规模固沙蓝藻培养，需要往清洁水中加入大量的氮、磷等营养物质，需要的成本较大；且常规的蓝藻固沙效果有待改进。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一株伪枝藻203及其培养方法与应用。

本发明的目的之一在于提供一株伪枝藻203，该菌株的分类学命名为：伪枝藻203(Scytonema hyalinum 203)，其保藏编号为：CCTCC NO：M2019801。本发明人从采集的野外生物土壤结皮中筛选到一株藻种，发现该菌株能够耐受高盐胁迫，固氮能力极强；该细菌经菌落形态、生化及16S rDNA测序分析鉴定为伪枝藻(Scytonema hyalinum 203)，命名为伪枝藻203。

本发明的目的之二在于提供所述的伪枝藻203在固沙中的应用。将所述伪枝藻203制备的藻液喷洒于沙土表层，通过固化作用得以固定沙土表层，阻止表层沙土迁移。

本发明的目的之三在于提供一种利用城市生活污水培养伪枝藻203的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1、藻种制备：取保藏编号为CCTCC NO：M2019801的伪枝藻203在培养基上扩大培养一段时间后静置沉淀；

步骤2、污水预处理：将污水采集经预处理后备用；

步骤3、藻种的污水培养驯化：用城市生活污水逐步替换所述培养基以逐步驯化，驯化完成后静置沉淀、移去上清液，收集浓缩藻液以备用；

步骤4、污水培养伪枝藻203：将所述浓缩藻液接种到装有城市生活污水的培养装置中通气培养；

步骤5、伪枝藻203的收集与储存。

优选地，所述步骤1中的培养条件为：光照40～60μmol·m^-2·s^-1，温度20～ 30℃，光暗比12h∶12h，按1L污水量计算通气量为0.5L/min。

优选地，所述步骤1中所述培养基为BG110培养基，所述BG110培养基的配方为：

表1

优选地，所述步骤2中采集的污水通过静置静止或粗纱布过滤预处理，以除去大颗粒悬浮物。

优选地，所述步骤3中所述的逐步驯化的培养条件为：温度20～30℃，光照强度40～60μmol·m^-2·s^-1，光暗比12h：12h，通气量为0.5L/min；所述的逐步驯化的具体步骤为：所述藻种在培养基上扩大培养一段时间后静置沉淀后，移去1/2体积培养基，接入等体积城市生活污水在一定的培养条件下培养9～ 11d，重复所述操作3次逐步驯化。

优选地，所述步骤4中培养条件为：初始接种量0.4～0.8mg/L，在温度20～ 30℃，光照强度40～60μmol·m^-2·s^-1，光暗比12h∶12h条件下通气培养30～35 天。

本发明的目的之五在于提供一种菌剂，包括液体菌剂或干粉菌剂，所述液体菌剂为将伪枝藻203通过所述的方法获得的浓缩藻泥，所述干粉菌剂为浓缩藻泥经干燥获得。

本发明的有益效果是：

1、本发明提供的一株伪枝藻203，为从采集的野外生物土壤结皮中筛选得到的一株藻种，能够耐受高盐胁迫，固氮能力极强。

2、本发明提供的一种利用城市生活污水培养伪枝藻203的方法，该方法不仅能够降低所述伪枝藻203的培养成本，还能够实现废水的资源化利用，适用于大规模藻类培养。将城市生活污水的资源化利用与荒漠化治理相结合，达到环境、经济“双赢”目的。

其中，本发明的菌株的保藏日期为2019年10月10日，保藏编号为CCTCC NO：M2019801。其分类命名为伪枝藻203(Scytonema hyalinum 203)，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武汉大学，邮编： 430072。

附图说明

图1为本发明实施例3的逐级扩大培养方法；

图2为本发明实施例3的藻类生物量随时间变化曲线；

图3为本发明实施例3的TN去除率随藻类处理时间变化曲线；

图4为本发明实施例3的NH₄ ⁺-N去除率随藻类处理时间变化曲线；

图5为本发明实施例3的TP去除率随藻类处理时间变化曲线；

图6为本发明实施例3的COD去除率随藻类处理时间变化曲线。

具体实施方式

实施例1伪枝藻203的分离与鉴定

1、固沙蓝藻分离及纯化

首先是采集野外生物土壤结皮，研磨后过0.5mm的筛，其中筛子要用酒精消毒，过筛后的每克土壤使用20ml的无菌水浸泡12～24小时，浸泡过程中搅拌12～24次得到土壤悬液，土壤悬液按10^-1～10^-8稀释，无菌吸管吸取水溶液接种到固体平板上，每一平皿滴加土壤悬液0.04～0.06ml进行培养，21～28 天后得到藻落；其次是在无菌培养液中清洗3～4次，接种到琼脂平板培养皿中进行单独培养，单独培养的藻种，8～10次重复平板划线接种培养获得纯化培养的单藻落；最后是将通过分离纯化步骤获得的藻种接种到BG110液体培养基中扩大培养，在光照40μmol·m^-2·s^-1，温度25℃，光暗比12h∶12h，通气量为0.5L/min条件下培养，在15～20天内获得所需要的生物量。筛选得到一株编号为203的藻种。

2、藻种的鉴定

藻种203进一步提取菌株的总DNA，以菌株的总DNA为模板，PCR扩增 16SrRNA基因，扩增产物进行测序，测序结果通过NCBI在线进行BLAST比对构建系统发育树。藻种203的16SrDNA序列长度为426bp(如序列表SEQ ID NO.1所示)。序列同源性分析表明，藻种203与伪枝藻(Scytonema hyalinum) 多个的菌株同源性均在99％以上，结合生理生化特性，初步确定藻种203为伪枝属，并命名为伪枝藻203。

实施2伪枝藻203的性能测定

1、固氮能力测定

分别取5ml活化后的伪枝藻203和爪哇伪枝藻(取自中国科学院水生生物研究所藻种库)菌悬液到含有100ml无氮液体培养基的250mL锥形瓶中，于 30℃下180r/min振荡培养30d，重复15瓶。在接种后30d取整瓶发酵液加入浓硫酸和30％H₂O₂在电炉上进行高温消解测定含氮量。结果伪枝藻203在30d 的固氮量为28.45mg/L。爪哇伪枝藻在30d的固氮量为4.91mg/L。

2、溶磷能力测定

接种5ml已活化的伪枝藻203和爪哇伪枝藻(取自中国科学院水生生物研究所藻种库)菌悬液到含有100ml无机磷液体培养基的250mL锥形瓶中，于 30℃下180r/min振荡培养10d，重复3瓶。在接种后1、3、5、7d取发酵液 5ml，5000r/min离心10min，采用钼锑抗比色法测定上清液中可溶性磷的含量。结果所述伪枝藻203的最高溶磷量为152.14mg/L，解磷率为20.4％。爪哇伪枝藻的的最高溶磷量为76.42mg/L，解磷率为8.31％。

3、高盐胁迫

对照：添加有1％NaCl(145mM NaCl)BG110培养基；实验组：添加有4％NaCl(高盐胁迫，680mM NaCl)BG110培养基；藻浆按照OD680＝0.3分别接种入所述BG110培养基中进行自然培养，即采用自然光照进行开放式培养，培养过程中每隔16～24小时进行一次搅拌，使固氮蓝藻不会因自然沉降而影响生长。培养过程中每隔2天测量一次叶绿素a浓度以绘制伪枝藻203和爪哇伪枝藻生长情况。伪枝藻203在培养14d天相比与第0天叶绿素a浓度增加了348％；伪枝藻203在培养14d天相比与第0天叶绿素a浓度增加了147％；表明本发明伪枝藻203的更加能够耐受高盐胁迫。

实施例3利用城市生活污水培养伪枝藻203的方法

一、藻种扩大培养

(1)1级扩大培养：

将保种培养的藻种停止通气培养，静止沉淀5h，弃掉上清液，收集适量浓缩藻液。于无菌玻璃匀浆器研磨，将研磨后的藻种匀浆转接入1L无菌锥形瓶，并加入750ml灭菌后的BG110培养基，于光照40μmol·m^-2·s^-1，温度30℃，光暗比12h∶12h，通气量为0.5L/min(按1L污水量计算)条件下培养15天。

(2)2级扩大培养：

1级扩大培养15天后停止通气，静止沉淀5h，弃掉上清液，收集浓缩藻液。于无菌玻璃匀浆器研磨，将研磨后的藻种匀浆转接入5L无菌血清瓶中，并加入4L灭菌后的BG110培养基，培养条件与1级扩大培养相同。

(3)3级扩大培养：

2级扩大培养15天后停止通气，静止沉淀5h，弃掉上清液，收集浓缩藻液。于无菌玻璃匀浆器研磨，将研磨后的藻种匀浆转接入10L血清瓶中，并加入9L 灭菌后的BG110培养基，直到获得足够的藻种生物量，培养条件与1级扩大培养相同。

二、污水的采集与预处理

于城市生活污水厂采集进水口处的污水，并将采集的污水置于塑料桶中经过静止沉淀5h或粗纱布过滤预处理，以除去大颗粒悬浮物。去除颗粒物后的城市生活污水用以后续藻类培养。

三、藻种的污水培养驯化

将固沙蓝藻伪枝藻203经过污水驯化培养后，停止通气，静止沉淀5h。移去上清液，玻璃匀浆器简单研磨，收集匀浆藻类，然后接种到光生物反应器，反应器中注入经过预处理的城市生活污水，初始接种量0.4mg/L(叶绿素a浓度)，调节光照装置使得人工光源LED灯的光照强度为40μmol·m^-2·s^-1，光暗比12h∶12h，曝气量应控制为使得反应器中的全部藻液悬浮于液体中，底部无藻体堆积。结果显示，调节温度控制系统将温度设置为25℃，在30～35天的培养周期内，微藻的最大生物量(干重)为1.27g/L，最大生长速率为4.23×10^-2 g·L^-1·d^-1，对废水中的化学需氧量(COD)、总氮(TN)、氨氮(NH₄ ⁺-N)、总磷(TP)的最大去除率分别达到89.61％、92.92％、94.72％、97.22％。

四、污水培养伪枝藻203

将固沙蓝藻经过污水驯化培养后，停止通气，静止沉淀5h。移去上清液，玻璃匀浆器简单研磨，收集匀浆藻类，然后接种到光生物反应器，反应器中注入经过预处理的城市生活污水，初始接种量0.4mg/L(叶绿素a浓度)，调节温度控制系统将温度设置为25℃，光暗比12h∶12h，曝气量应控制为使得反应器中的全部藻液悬浮于液体中，底部无藻体堆积。

在反应器中注入经过预处理的城市生活污水培养固沙蓝藻，初始接种量0.4 mg/L(叶绿素a浓度)，温度为25℃，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1，光暗比12 h∶12h，曝气量应控制为使得反应器中的全部藻液悬浮于液体中，底部无藻体堆积。在培养35天期间，每隔5天收集藻液测定藻类叶绿素a含量及干重，监测城市生活污水中的TN、NH₄ ⁺-N、TP、COD去除率随藻类处理时间的变化。

结果显示，调节光照装置使得人工光源LED灯的光照强度为 40μmol·m^-2·s^-1，在30-35天的培养周期内，微藻的最大生物量(干重)为1.53g/L 对废水中的化学需氧量(COD)、总氮(TN)、氨氮(NH₄ ⁺-N)、总磷(TP) 的最大去除率分别达到92.45％、93.12％、97.36％、97.65％。

实施例4

该实施例提供的一种利用城市生活污水培养伪枝藻203的方法，除藻种的污水培养驯化的培养温度改为20℃外，其余均同实施例3。调节温度控制系统将温度设置为20℃，在30～35天的培养周期内，微藻的最大生物量(干重) 为1.27g/L，最大生长速率为4.23×10^-2g·L^-1·d^-1，对废水中的化学需氧量(COD)、总氮(TN)、氨氮(NH₄ ⁺-N)、总磷(TP)的最大去除率分别达到93.75％、 92.75％、97.36％、97.80％。

实施例5

该实施例提供的一种利用城市生活污水培养伪枝藻203的方法，除步骤3 中藻种的污水培养驯化的培养温度改为30℃外，其余均同实施例3。

结果显示，调节温度控制系统将温度设置为30℃，在30～35天的培养周期内，微藻的最大生物量(干重)为1.68g/L，最大生长速率为5.56×10^-2g·L^-1·d^-1，对废水中的化学需氧量(COD)、总氮(TN)、氨氮(NH₄ ⁺-N)、总磷(TP) 的最大去除率分别达到92.77％、93.61％、97.36％、98.60％。

实施例6

该实施例提供的一种利用城市生活污水培养伪枝藻203的方法，除步骤4 中污水培养伪枝藻203的调节光照装置使得人工光源LED灯的光照强度改为 50μmol·m^-2·s^-1，外，其余均同实施例5。

调节光照装置使得人工光源LED灯的光照强度为40μmol·m^-2·s^-1，在30～ 35天的培养周期内，微藻的最大生物量(干重)为1.41g/L，最大生长速率为 4.67×10^-2g·L^-1·d^-1，对废水中的化学需氧量(COD)、总氮(TN)、氨氮(NH₄ ⁺-N)、总磷(TP)的最大去除率分别达到90.09％、91.37％、96.23％、98.85％。

实施例7

该实施例提供的一种利用城市生活污水培养伪枝藻203的方法，除步骤4 中污水培养伪枝藻203的调节光照装置使得人工光源LED灯的光照强度改为 60μmol·m^-2·s^-1外，其余均同实施例5。

调节光照装置使得人工光源LED灯的光照强度为50μmol·m^-2·s^-1，在30～ 35天的培养周期内，微藻的最大生物量(干重)为1.41g/L，最大生长速率为 4.67×10^-2g·L^-1·d^-1，对废水中的化学需氧量(COD)、总氮(TN)、氨氮(NH₄ ⁺-N)、总磷(TP)的最大去除率分别达到94.59％、90.84％、96.53％、98.66％。

对比例1

该对比例提供的一种利用城市生活污水培养伪枝藻203的方法，除步骤3 中藻种的污水培养驯化的培养温度改为35℃外，其余均同实施例3。

结果显示，调节温度控制系统将温度设置为35℃，在30～35天的培养周期内，微藻的最大生物量(干重)为0.55g/L，最大生长速率为1.83×10^-2g·L^-1·d^-1，对废水中的化学需氧量(COD)、总氮(TN)、氨氮(NH₄ ⁺-N)、总磷(TP) 的最大去除率分别达到65.10％、67.96％、93.96％、21.38％。藻细胞呈现变黄、破裂和解体等现象。

对比例2

该对比例提供的一种利用城市生活污水培养伪枝藻203的方法，除步骤4 中污水培养伪枝藻203的调节光照装置使得人工光源LED灯的光照强度改为 20μmol·m^-2·s^-1外，其余均同实施例3。

结果显示，调节光照装置使得人工光源LED灯的光照强度为 20μmol·m^-2·s^-1，在30～35天的培养周期内，微藻的最大生物量(干重)为0.97g/L，最大生长速率为3.23×10^- ²g·L^-1·d^-1，对废水中的化学需氧量(COD)、总氮(TN)、氨氮(NH₄ ⁺-N)、总磷(TP)的最大去除率分别达到74.48％、76.32％、82.93％、76.44％。藻细胞状态较差，藻细胞细胞质发黄，藻细胞部分已解体、空泡化。

对比例3

该对比例提供的一种利用城市生活污水培养伪枝藻203的方法，除步骤4 中污水培养伪枝藻203的调节光照装置使得人工光源LED灯的光照强度改为 80μmol·m^-2·s^-1外，其余均同实施例3。

结果显示，调节光照装置使得人工光源LED灯的光照强度为 80μmol·m^-2·s^-1，在30～35天的培养周期内，微藻的最大生物量(干重)为0.52g/L，最大生长速率为1.73×10^- ²g·L^-1·d^-1，对废水中的化学需氧量(COD)、总氮(TN)、氨氮(NH₄ ⁺-N)、总磷(TP)的最大去除率分别达到83.33％、76.28％、92.51％、 80.45％。藻细胞状态较差，藻细胞细胞质发黄，藻细胞部分已解体、空泡化。

实验例

收集实施例3-7以及对比例1-3的藻液测定藻类叶绿素a含量及干重，监测城市生活污水中的TN、NH₄ ⁺-N、TP、COD去除率随藻类处理时间的变化如表1和表2所示。

由表1可知，对比例1以及实施例3-5的步骤3和步骤4中的光照强度均为40μmol·m^-2·s^-1，仅温度不同，由此可知温度选择20～30℃较好，且温度为 30℃时为最佳温度。

表2

由表2可知，对比例2-3以及实施例5-7的步骤3和步骤4中的温度均为 30℃，仅光照强度不同，由此可知光照强度选择40～60μmol·m^-2·s^-1较好。

以上所述仅为本发明的一个实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉理工大学

<120> 一株伪枝藻203及其培养方法与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 426

<212> DNA

<213> 伪枝藻(Sctonema hyalinum)

<400> 1

gtggggaatt ttccgcaatg ggcgaaagcc tgacggagca ataccgcgtg agggaggaag 60

gctcttgggt tgtaaacctc ttttctcagg gaagaatgat gacggtacct gaggaataag 120

catcggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg taatacggag gatgcaagcg ttatccggaa 180

tgattgggcg taaagcgtcc gcaggtggca atgtaagtct gctgtcaaag cgtctggctc 240

aaccagataa aggcagtgga aactacatag ctagagtaag gtaggggtag agggaattcc 300

tggtgtagcg gtgaaatgcg tagagatcag gaagaacacc ggtggcgaaa gcgctctgct 360

ggaccttaac tgacactgag ggacgaaagc taggggagcg aatgggatta gaaaccccag 420

tagtcc 426

Claims

1.一株伪枝藻Scytonema hyalinum 203，其特征在于，该伪枝藻203的保藏编号为：CCTCC NO.M2019801。

2.如权利要求1所述的伪枝藻Scytonema hyalinum 203在固沙中的应用。

3.一种利用城市生活污水培养伪枝藻Scytonema hyalinum 203的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1、藻种制备：取保藏编号为CCTCC NO.M2019801的伪枝藻Scytonema hyalinum203在培养基上扩大培养一段时间后静置沉淀；

步骤2、污水预处理：将污水采集经预处理后备用；

步骤4、污水培养伪枝藻Scytonema hyalinum 203：将所述浓缩藻液接种到装有城市生活污水的培养装置中通气培养；

步骤5、伪枝藻Scytonema hyalinum 203的收集与储存。

4.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的培养条件为：光照40～60 μmol·m^-2·s^-1，温度20～30℃，光暗比12 h∶12 h，按1L污水量计算通气量为0.5 L/min。

5.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1中所述培养基为BG110培养基，所述BG110培养基的配方为：2×10^-2mg/LNa₂CO₃ +6×10^-3mg/L柠檬酸+6×10^-3mg/L柠檬酸铁铵+7.5×10^-2mg/LMgSO₄·7H₂O +3.6×10^-2mg/LCaCl₂·2H₂O +4×10^-2mg/LK₂HPO₄ +1×10^-3mg/LEDTANa₂ +2.86×10^-6mg/L H₃BO₃+1.86×10^-6mg/LMnCl₂·4H₂O+2.2×10^-7mg/LZnSO₄·7H₂O+3.9×10^-7mg/LNa₂MoO₄·2H₂O+8×10^-7mg/LCuSO₄· 5H₂O+5×10^-7mg/LCO(NO₃)₂·6H₂O。

6.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2中采集的污水通过静置静止或粗纱布过滤预处理，以除去大颗粒悬浮物。

7.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤3中所述的逐步驯化的培养条件为：温度20～30℃，光照强度40～60 μmol·m^-2·s^-1，光暗比12 h：12 h，通气量为0.5 L/min；所述的逐步驯化的具体步骤为：所述藻种在培养基上扩大培养一段时间后静置沉淀后，移去1/2体积培养基，接入等体积城市生活污水在一定的培养条件下培养9～11d，重复所述逐步驯化的具体步骤3次。

8.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤4中培养条件为：初始接种量按叶绿素a计算为0.4～0.8 mg/L，在温度20～30℃，光照强度40～60 μmol·m^-2·s^-1，光暗比12 h∶12 h条件下通气培养30～35天。

9.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤4中所述浓缩藻液在培养30～35天后，停止通气，静置沉淀，虹吸法移去上清液，收集底部浓缩藻泥，干燥后保存获得干粉菌剂。

10.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括液体菌剂或干粉菌剂，所述液体菌剂为通过权利要求3-9任一所述的方法获得的浓缩藻泥，所述干粉菌剂为将所述浓缩藻泥经干燥获得。