CN116794301A - 一种呼吸道合胞病毒抗原定量检测试剂盒及其定量检测方法 - Google Patents

一种呼吸道合胞病毒抗原定量检测试剂盒及其定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种呼吸道合胞病毒抗原定量检测试剂盒及其定量检测方法，属于酶联免疫技术领域，所述检测方法为用呼吸道合胞病毒特异性抗体RV94包被ELISA板，制成固相抗体，依次加入不同浓度梯度稀释的标准抗原或待检测的抗原样品、呼吸道合胞病毒特异性的酶标抗体2RV56‑HRP，再加底物溶液显色，加入2M H2SO4溶液终止显色，测定OD450nm值，根据测定的吸光度值和标准抗原浓度绘制标准曲线方程，根据标准曲线方程和待检测抗原样品的吸光度值来计算待检测样品的浓度。本发明将针对呼吸道合胞病毒融合前F糖蛋白(pre‑F)的特异性抗体RV94作为一抗，将针对呼吸道合胞病毒融合前F糖蛋白(pre‑F)的特异性酶标抗体2RV56‑HRP作为二抗，在对于呼吸道合胞病毒疫苗生产过程中融合前F糖蛋白抗原生产、监测、评估等方面具有一定的实用价值。

Description

一种呼吸道合胞病毒抗原定量检测试剂盒及其定量检测方法
技术领域
本发明属于酶联免疫技术领域，具体涉及一种呼吸道合胞病毒抗原定量检测试剂盒及其定量检测方法。
背景技术
呼吸道合胞病毒是一种非常普遍且具有传染性的呼吸道感染，是导致支气管炎和肺炎的主要原因，每年在全世界范围内影响超过6400万人，根据WHO披露，RSV感染引起1岁以下患儿病死率达到6.7％,，仅次于疟疾，在全球范围内造成严重的疾病负担，然而，市场上仍未有批准上市的RSV疫苗，因此，研发有效预防RSV感染的疫苗是当前迫切要求，被WHO列为全球最优先发展的疫苗之一。由于中和最敏感的抗原位点仅存在于RSV融合前F蛋白(RSV pre F)上，目前全球研发的RSV疫苗主要是围绕融合前F蛋白抗原进行，包括位于第一梯队的葛兰素史克(GSK)公司，其研发的RSVPreF3疫苗预防严重性RSV下呼吸道疾病的有效性为94.6％，以及由辉瑞(Pfizer)公司研发的RSVpreF疫苗的有效率为85.7％，本发明以杂交瘤技术筛选得到的RSV pre F蛋白特异性抗体RV94和2RV56分别作为捕获抗体和检测抗体，以RSV pre F蛋白DS-CaV2蛋白作为标准品，建立了一种定量检测RSV pre F蛋白含量的方法，此方法可用于对以RSV pre F蛋白作为抗原的RSV疫苗研发生产过程的培养液、灭活液、纯化液中RSV pre F抗原进行定量检测，为RSV疫苗研发生产提供帮助。
发明内容
本发明的目的在于提供一种呼吸道合胞病毒抗原定量检测试剂盒及其定量检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种呼吸道合胞病毒抗原定量检测试剂盒，所包含的捕获抗体RV94或其与抗原结合片段，其选自以下各自组成的组：
1)包含如SEQ ID NO:1所示重链可变区包含的RV94HCDR1，RV94HCDR2和RV94HCDR3，以及如SEQ ID NO:2所示轻链可变区包含的RV94LCDR1，RV94LCDR2和RV94LCR3；按照IMGT编号系统，所述抗体包含：
RV94HCDR1，其包含SEQ ID NO:3所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成；
RV94HCDR2，其包含SEQ ID NO:4所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成；
RV94HCDR3，其包含SEQ ID NO:5所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成，并且所述抗体还包含：
RV94LCDR1，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸，或与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成；
RV94LCDR2，其包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成；
RV94LCDR3，其包含SEQ ID NO:8所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成；
2)所包含的捕获抗体2RV56或其与抗原结合片段，其选自以下各自组成的组：
包含如SEQ ID NO:9所示重链可变区包含的2RV56HCDR1，2RV56HCDR2和2RV56HCDR3，以及如SEQ ID NO:10所示轻链可变区包含的2RV56LCDR1，2RV56LCDR2和2RV56LCR3；按照IMGT编号系统，所述抗体包含：
2RV56HCDR1，其包含SEQ ID NO:11所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成，
2RV56HCDR2，其包含SEQ ID NO:12所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成，和
2RV56HCDR3，其包含SEQ ID NO:13所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成，并且所述抗体还包含：
2RV56LCDR1，其包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸，或与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成；
2RV56LCDR2，其包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成；
2RV56LCDR3，其包含SEQ ID NO:16所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成；
作为本发明再进一步的方案，本发明还提供一种定量检测呼吸道合胞病毒抗原的方法，用呼吸道合胞病毒特异性抗体RV94包被ELISA板，制成固相抗体，依次加入不同浓度梯度稀释的标准抗原或待检测的抗原样品、呼吸道合胞病毒特异性的酶标抗体2RV56-HRP，再加底物溶液显色，加入2M H2SO4溶液终止显色，测定OD450nm值，根据测定的吸光度值和标准抗原浓度绘制标准曲线方程，根据标准曲线方程和待检测抗原样品的吸光度值来计算待检测样品的浓度。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明将针对呼吸道合胞病毒糖蛋白的特异性抗体RV94作为一抗，将针对呼吸道合胞病毒糖蛋白的特异性酶标抗体2RV56-HRP作为二抗，开发了一个定量检测呼吸道合胞病毒抗原含量的方法，在对于呼吸道合胞病毒糖蛋白抗原生产，实时监测，疫苗质量评估等方面具有一定的实用价值。
附图说明
图1为DS-CaV2蛋白的SuperoseTM 6Increase 10/300GL纯化及SDS-PAGE检测图；
图2为ELISA验证抗体对RSV F蛋白DS-CaV2的结合活性图；
图3为抗体蛋白的Hiload 16/600SuperdexTM 200pg纯化及SDS-PAGE检测图；
图4为抗原定量检测方法的特异性检测结果图；
图5为RSV抗原定量检测方法标准曲线图；
图6为转染细胞上清中RSV F蛋白DS-Cav2含量检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中，一种呼吸道合胞病毒抗原定量检测试剂盒，所包含的捕获抗体RV94或其与抗原结合片段，其选自以下各自组成的组：
1)包含如SEQ ID NO:1所示重链可变区包含的RV94HCDR1，RV94HCDR2和RV94HCDR3，以及如SEQ ID NO:2所示轻链可变区包含的RV94LCDR1，RV94LCDR2和RV94LCR3；优选地，按照IMGT编号系统，所述抗体包含：
RV94HCDR1，其包含SEQ ID NO:3所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
RV94HCDR2，其包含SEQ ID NO:4所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，和
RV94HCDR3，其包含SEQ ID NO:5所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，并且所述抗体还包含：
RV94LCDR1，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸，或与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
RV94LCDR2，其包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，和
RV94LCDR3，其包含SEQ ID NO:8所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；
2)一种特异性定量检测呼吸道合胞病毒糖蛋白抗原的酶联免疫检测试剂盒所包含的捕获抗体2RV56或其与抗原结合片段，其选自以下各自组成的组：
包含如SEQ ID NO:9所示重链可变区包含的2RV56HCDR1，2RV56HCDR2和2RV56HCDR3，以及如SEQ ID NO:10所示轻链可变区包含的2RV56LCDR1，2RV56LCDR2和2RV56LCR3；优选地，按照IMGT编号系统，所述抗体包含：
2RV56HCDR1，其包含SEQ ID NO:11所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
2RV56HCDR2，其包含SEQ ID NO:12所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，和
2RV56HCDR3，其包含SEQ ID NO:13所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，并且所述抗体还包含：
2RV56LCDR1，其包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸，或与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
2RV56LCDR2，其包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，和
2RV56LCDR3，其包含SEQ ID NO:16所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。
优选的，本发明还提供一种定量检测呼吸道合胞病毒抗原的方法，用呼吸道合胞病毒特异性抗体RV94包被ELISA板，制成固相抗体，依次加入不同浓度梯度稀释的标准抗原或待检测的抗原样品、呼吸道合胞病毒特异性的酶标抗体2RV56-HRP，再加底物溶液显色，加入2M H2SO4溶液终止显色，测定OD450nm值，根据测定的吸光度值和标准抗原浓度绘制标准曲线方程，根据标准曲线方程和待检测抗原样品的吸光度值来计算待检测样品的浓度。
本发明优选的实施例利用呼吸道合胞病毒PreF抗原糖蛋白DS-CaV2免疫小鼠，并与骨髓瘤细胞进行细胞融合，再进行了多次的筛选，获得到了两株抗体—RV94和2RV56，经抗原竞争ELISA方法鉴定，这两株抗体结合于呼吸道合胞病毒PreF抗原糖蛋白两个不同的表位，将RV94作为捕获抗体，辣根过氧化物酶标记的2RV56作为检测抗体，将表达纯化的重组蛋白PreF抗原糖蛋白作为标准品，建立了一种特异性定量检测呼吸道合胞病毒抗原的检测方法，可用于呼吸道合胞病毒疫苗生产过程中培养液、灭活液、纯化液等中的呼吸道合胞病毒糖蛋白抗原的检测。
实施案例1：RSV F蛋白DS-CaV2的制备
(1)pCAGGS-RSV-DS-CaV2-his质粒获得：将呼吸道合胞病毒融合前F糖蛋白DS-CaV2按照密码子偏好性请公司进行合成，在3’端加入8×His标签，在5’端加入信号肽，根据EcoRI和XhoI两个酶切位点构建至pCAGGS载体上，获得质粒pCAGGS-RSV-DS-CaV2-his。将公司寄回的冻存菌液从-80℃冰箱取出，取50μl菌液加入3-4mL的LB培养基中，以1:1000加入Amp+，置于37℃摇床约4-5h。取配好的300mL的LB培养基,以1：1000的比例加入Amp+，以1:100加入活化好的菌液，置于37℃摇床过夜摇菌约14h。质粒提取按照TIANGEN质粒大提试剂盒说明书进行提取，将过夜摇好的菌液收集于离心桶中，8000rpm/min离心10min，弃去上清，将离心桶倒置于干净的吸水纸上，上清液去除的更加彻底，最后只留下桶底的菌体。加入12mL的P1溶液，用涡旋震荡仪涡旋菌体，使菌体完全溶解于P1溶液中至无明显的块状沉淀，加入12mL的P2溶液，温和混匀，继续加入12mL的P4溶液，温和混匀，静置10min，此时可以发现有白色絮状沉淀生成，以8000rpm/min转速，离心5min,收集上清液于50mL离心管中，加入滤液0.3倍体积大小的异丙醇溶液，上下颠倒混匀，放置于-20℃冰箱沉淀1-2h。将吸附柱使用平衡液平衡后，加入沉淀好的质粒DNA溶液，以8000rpm/min转速，离心2min，使质粒DNA挂柱，加入PW溶液，以8000rpm/min转速，离心2min，重复两次，之后将吸附柱空离、烘干后，即可进行洗脱，获得到pCAGGS-RSV-DS-CaV2-his质粒。
(2)DS-CaV2蛋白表达与纯化
在转染前一天将HEK293F细胞进行传代，使其细胞密度至1.5-1.8×106cell/mL左右，在转染当天对HEK293F细胞进行计数，当其密度在2.5-3.0×106cell/mL左右时，即可准备转染，以转染1L HEK293F细胞为例，使用灭菌的150mM NaCl溶液将1mg的pCAGGS-RSV-DS-CaV2-his质粒稀释至终体积25mL，此为转染A液，静置5min，将5mL转染试剂与20mL灭菌的150mM NaCl溶液混合，此为转染B液，同样静置5min，随后将转染A液和转染B液混合均匀，静置15min后逐滴加入HEK293F细胞中，在转染后的24h添加补料液，1L 293F细胞需要35mL的补料液，之后再每隔48h添加补料液。
在转染后的第5天，将转染细胞培养液收集起来置于离心桶中，以7500g转速4℃离心1h，收集细胞上清用0.22μm的滤膜除杂后，可使用Ni2+亲和层析柱进行挂柱，待所有细胞上清全部挂柱完成后即可进行洗脱，以20mM Tris，150mM NaCl pH 8.0溶液作为平衡液，以20mM Tris，150mM NaCl，1M咪唑pH8.0溶液作为洗脱液，将所有洗脱峰收集起来，经SDS-PAGE电泳鉴定，含400mM咪唑的洗脱峰为目标蛋白所在位置，将此洗脱峰收集起来置于10KDa大小的浓缩管中，待其体积浓缩至500μl以下时，即可使用SuperoseTM 6Increase 10/300GL层析柱纯化。DS-CaV2蛋白在SuperoseTM 6Increase 10/300GL层析柱中的出峰位置为16.7mL左右，将DS-CaV2蛋白收集起来分装保存至-80℃冰箱。
实施案例2：杂交瘤抗体上清获得与结合活性测定
将制备得到的DS-CaV2免疫BALB/c小鼠，免疫剂量为15μg，在进行三次免疫后，我们委托公司进行杂交瘤技术的筛选流程，最终获得了8株杂交瘤抗体上清，通过ELISA实验进行这8株抗体的结合活性验证，将抗原蛋白DS-CaV2稀释至2μg/mL，每孔加入稀释好的DS-CaV2蛋白100μl，即每孔包被了200ng抗原蛋白，将其放置于4℃冰箱中，过夜包被。第二天，将ELISA板中的液体大力拍掉，加入用PBST溶液配置的5％的脱脂牛奶，每孔200μl，并将其置于37℃培养箱中孵育1h，1h后将牛奶拍掉。将杂交瘤上清依次加入酶标板中，每个样品做两个重复，以5％牛奶作为阴性对照，将其置于37℃培养箱中孵育1h，1h后用PBST缓冲液清洗三次，每次每孔加入200μl。将羊抗鼠HRP二抗(购自北京中杉金桥生物技术公司)按照稀释倍数1:2000稀释，将其加入到ELISA板中，同样每孔100μl，随后将其置于37℃培养箱中孵育1h，1h后用PBST缓冲液清洗五次，加入100μl的TMB显色液进行显色，5min后每孔加入100μl 2M H2SO4溶液，随即在450nm的波长下进行读数。牛奶孔的读数的2.1倍即为Cut-off值，若抗体上清平均读数大于此值，表示该抗体可特异结合DS-CaV2蛋白，小于Cut-off值表示该抗体不能结合DS-CaV2蛋白。结果表明，RV94、2RV56这2株抗体可特异性结合DS-CaV2蛋白。
实施案例3：RV94、2RV56抗体的纯化
将杂交瘤细胞分泌表达的细胞上清液收集起来，8000g转速，4℃离心1h以上，收集细胞上清，将所有上清用0.22μm抽滤除杂后，以1.5mL/min的速度流经protein A亲和层析柱，挂柱完成后，通入20mM Na3po4 pH 7.0溶液约3-5个柱体积，当UV检测线下降至平稳时，可切换为0.1M Glycine pH 3.0溶液，大约经过2-3个柱体积即可出现一个洗脱峰，洗脱峰收集体积为3.2mL，向洗脱峰对应的收集管中加入0.8mL1MTris-HClpH9.0溶液中和样品的酸性，将收集管收集起来，用SDS-PAGE鉴定，将用Protein A亲和层析柱纯化得到的样品加入到30KDa的浓缩管中进行浓缩，当浓缩体积约为500μl时，即可将蛋白样本吸出置于1.5mLep管中，15000rpm/min,4℃离心15min后，将其吸出置于一个干净的1.5mL ep管中，除杂完成后可将蛋白样品用1mL Loop环上样，设置好报警压、峰收集体积等参数，收集出峰位置的收集管，将抗体蛋白收集起来经液氮速冻后，将其分装，置于-80℃冰箱中保存备用。
实施案例4：竞争结合ELISA实验
使用30KDa的浓缩管，将RV94、2RV56、MEDI8897、Palivizumab这4株抗体蛋白换液至PBS溶液中或者不含Tris的溶液中，按照生物素化试剂与蛋白质的摩尔比为20:1的比例添加生物素化试剂，混合均匀，放置于室温，30min后使用30KDa的浓缩管换液至少三次，提前一天包被DS-CaV2蛋白，包被蛋白浓度为2μg/mL，每孔100μl，置于4℃冰箱，过夜。第二天将包被液大力甩掉，倒扣于吸水纸上，大力拍打至孔底无液体，称取5g脱脂奶粉，溶于50mLPBST溶液中，获得5％浓度脱脂牛奶，向酶标板每孔加入200μl的脱脂牛奶，将其置于37℃恒温箱中，孵育1h。将5％脱脂牛奶大力甩掉，倒扣于吸水纸上，大力拍打至孔底无液体，将RV94、2RV56这六株抗体稀释至200μg/mL，每孔加入100μl，同时设置牛奶孔作为阳性对照孔，置于37℃恒温箱中，孵育1h。将RV94、2RV56、MEDI8897以及Palivizumab这4株抗体加入孔中至终浓度为1μg/mL，置于37℃恒温箱中，孵育1h。使用洗板机清洗酶标板三次，每次加入200μl的PBST溶液，每次清洗时间隔10s，清洗完成后，将酶标板倒扣于吸水纸上大力拍干至孔底无液体残留，将HRP标记的链霉亲和素按照1:5000稀释比例稀释，加入酶标板中，每孔100μl，置于37℃恒温箱中，孵育1h。使用洗板机清洗酶标板五次，每次加入200μl的PBST溶液，每次清洗时间隔10s，清洗完成后，将酶标板倒扣于吸水纸上大力拍干至孔底无液体残留，加入TMB显色液，每孔100μl，5min后，加入2M H2SO4显色终止液，于450nm波长处读数。之后计算样品孔与阳性对照孔的比值，若此值<30％，则表明这对抗体结合表位存在竞争，若此值>70％则表明这对抗体结合表位不竞争，若此值在30％-70％中间，则表明这对抗体的结合表表位部分重叠。最后筛选出RV94和2RV56这一对结合表位不竞争抗体，并且RV94抗体与MEDI8897结合表位竞争。
表1RSV特异性抗体竞争结果
实施案例5：捕获抗体及检测抗体最佳工作浓度确定
将RV94抗体稀释7个浓度包被，浓度分别为10ng/mL、5ng/mL、3ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL，每孔100μl，4℃过夜包被。第二天将包被液大力甩掉，倒扣于吸水纸上，大力拍打至孔底无液体，称取5g脱脂奶粉，溶于50mL PBST溶液中，获得5％浓度脱脂牛奶，向酶标板每孔加入200μl的脱脂牛奶，将其置于37℃恒温箱中，孵育1h。将5％脱脂牛奶大力甩掉，倒扣于吸水纸上，大力拍打至孔底无液体，将DS-Cav2蛋白稀释至500ng/mL，每孔加入200μl，作为阳性对照，同时加入5％牛奶作为阴性对照，置于37℃恒温箱中，孵育1h。使用洗板机清洗酶标板三次，每次加入200μl的PBST溶液，每次清洗时间隔10s，清洗完成后，将酶标板倒扣于吸水纸上大力拍干至孔底无液体残留，将HRP标记的2RV56抗体设置6个浓度梯度，分别为2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL、0.125ng/mL、0.0625ng/mL，加入酶标板中，每孔100μl，置于37℃恒温箱中，孵育1h。使用洗板机清洗酶标板五次，每次加入200μl的PBST溶液，每次清洗时间隔10s，清洗完成后，将酶标板倒扣于吸水纸上大力拍干至孔底无液体残留，加入TMB显色液，每孔100μl，5min后，加入2M H2SO4显色终止液，于450nm波长处读数。计算在每个浓度条件下阳性对照和阴性对照的比值，选取阳性对照OD450值为1.5左右，阴性对照值小于0.1,且阳性对照与阴性对照比值为较大值的条件作为最佳捕获抗体RV94与检测抗体2RV56的最佳反应浓度，实验结果表明，RV94最佳反应浓度为2μg/mL，2RV56最佳反应浓度为1μg/mL。
表2：不同RV94与2RV56浓度ELISA结果
实施案例6：最佳封闭液的选择
将捕获抗体RV94稀释至2μg/mL，加入到酶标板中，每孔100μl，4℃过夜包被。设置6种封闭液，分别为2.5％脱脂牛奶溶液、5％脱脂牛奶溶液、2.5％胎牛血清溶液、5％胎牛血清溶液、2.5％ BSA溶液、5％ BSA溶液。将包被液大力甩掉，甩板方向尽量平行地面，防止串孔，加入用上述6种不同的封闭液，每孔200μl，置于37℃恒温箱中，孵育1h。每个封闭条件下设置阴性对照和阳性对照，阳性对照为500ng/mL的RSV F抗原蛋白DS-Cav2，阴性对照为新鲜的293F培养基，把封闭液大力拍掉，加入DS-Cav2蛋白和阴性对照，每孔100μl，将其置于37℃恒温培养箱中，孵育1h。将酶标板从37℃恒温培养箱中取出，置于洗板机上，每孔加入200μl的PBST溶液，洗板三次，每次洗板后震荡20s，最后一次需在干净的吸水纸上大力排干净残留的PBST溶液。将酶标检测抗体2RV56稀释至1μg/mL，每孔100μl，加入到酶标板中，置于37℃恒温培养箱中孵育1h。将酶标板从37℃恒温培养箱中取出，置于洗板机上，每孔加入200μl的PBST溶液，洗板五次，每次洗板后震荡20s，最后一次需在干净的吸水纸上大力排干净残留的PBST溶液。向酶标板中加入TMB显色液，每孔100μl，避光静置5min。向酶标板中加入100μl的2MH2SO4终止液，置于酶标仪内读取450nm波长处的读数。计算每种封闭液条件下阳性对照与阴性对照的比值，选取比值最大的为最佳封闭液，实验结果表明，当将5％的脱脂牛奶作为封闭液时，阳性对照OD450值为1.493，阴性对照值为0.074，其阳性对照与阴性对照的比值最大，封闭效果最好，故最终确定该ELISA方法的封闭液为5％脱脂牛奶。
表3不同封闭液的ELISA结果
实施案例7：特异性检测
将捕获抗体RV94稀释至2μg/mL，加入到酶标板中，每孔100μl，4℃过夜包被。将包被液大力甩掉，甩板方向尽量平行地面，防止串孔，加入用PBST配置的浓度为5％的脱脂牛奶溶液，每孔200μl，置于37℃恒温箱中，孵育1h。同时孵育起始浓度为500ng/mL，两倍倍比稀释至第十一个浓度梯度的DS-CaV2蛋白、SARS CoV-2RBD蛋白、OmicronBQ.1RBD蛋白、Ebola GP蛋白、SARS CoV RBD蛋白、MERS S蛋白，把封闭液大力拍掉，向酶标板中加入稀释好的抗原，同时加入5％的牛奶作为阴性对照，将其置于37℃恒温培养箱中，孵育1h。将酶标板从37℃恒温培养箱中取出，置于洗板机上，每孔加入250μl的PBST溶液，洗板三次，每次洗板后震荡20s，最后一次需在干净的吸水纸上大力排干净残留的PBST溶液。将酶标检测抗体2RV56稀释至1μg/mL，加入到酶标板中，置于37℃恒温培养箱中孵育1h。将酶标板从37℃恒温培养箱中取出，置于洗板机上，每孔加入200μl的PBST溶液，洗板五次，每次洗板后震荡20s，最后一次需在干净的吸水纸上大力排干净残留的PBST溶液。向酶标板中加入TMB显色液，每孔100μl，避光静置5min。向酶标板中加入100μl的2M H2SO4终止液，置于酶标仪内读取450nm波长处的读数。用抗原的浓度的对数作为横坐标，以各个抗原浓度所对应的OD450nm值为纵坐标，拟合曲线，从实验结果来看，只有RSV F蛋白DS-CaV2蛋白有一个明显的剂量依赖效应之外，其他病毒抗原蛋白都显示阴性结果，这表明该方法仅对RSV抗原有特异性结合，对其他病毒抗原无交叉反应。
实施案例8：灵敏度检测
将捕获抗体RV94稀释至2μg/mL，加入到酶标板中，每孔100μl，4℃过夜包被。将包被液大力甩掉，甩板方向尽量平行地面，防止串孔，加入用PBST配置的浓度为5％的脱脂牛奶溶液，每孔200μl，置于37℃恒温箱中，孵育1h。将标准品RSV F蛋白DS-Cav2从起始浓度500ng/mL开始稀释，两倍倍比稀释至第十一个浓度梯度，把封闭液大力拍掉，向酶标板中加入稀释好的标准品，将其置于37℃恒温培养箱中，孵育1h。将酶标板从37℃恒温培养箱中取出，置于洗板机上，每孔加入250μl的PBST溶液，洗板三次，每次洗板后震荡20s，最后一次需在干净的吸水纸上大力排干净残留的PBST溶液。将酶标检测抗体稀释至1μg/mL，加入到酶标板中，置于37℃恒温培养箱中孵育1h。将酶标板从37℃恒温培养箱中取出，置于洗板机上，每孔加入200μl的PBST溶液，洗板五次，每次洗板后震荡20s，最后一次需在干净的吸水纸上大力排干净残留的PBST溶液。向酶标板中加入TMB显色液，每孔100μl，避光静置5min。向酶标板中加入100μl的2M H2SO4终止液，置于酶标仪内读取450nm波长处的读数。用标准品的浓度作为横坐标，以各个标准品浓度所对应的OD450nm值为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线所对应的方程式及R2值。标准曲线显示，DS-Cav2蛋白的最低稀释浓度为1.953ng/mL，故该方法的灵敏度为1.953ng/mL。
表4RSV抗原定量方法标准曲线数值
实施案例9：抗原定量检测方法的应用
我们用所建立的RSV F蛋白DS-Cav2抗原定量检测方法对DS-Cav2蛋白的转染上清中含有的DS-Cav2蛋白进行了定量，以转染当天作为第0天，自转染后开始每一天对细胞表达上清进行取样，以600g转速，4℃离心5min后，将细胞表达上清储存于-80℃冰箱备用，将捕获抗体RV94稀释至2μg/mL，加入到酶标板中，每孔100μl，4℃过夜包被。将包被液大力甩掉，甩板方向尽量平行地面，防止串孔，加入用PBST配置的浓度为5％的脱脂牛奶溶液，每孔200μl，置于37℃恒温箱中，孵育1h。将标准品RSV F蛋白DS-Cav2从起始浓度500ng/mL开始稀释，两倍倍比稀释至第十一个浓度梯度，把封闭液大力拍掉，向酶标板中加入稀释好的标准品，同时加入稀释一定倍数的转染后第1天至第6天DS-Cav2蛋白表达上清，将其置于37℃恒温培养箱中，孵育1h。将酶标板从37℃恒温培养箱中取出，置于洗板机上，每孔加入250μl的PBST溶液，洗板三次，每次洗板后震荡20s，最后一次需在干净的吸水纸上大力排干净残留的PBST溶液。将酶标检测抗体2RV56稀释至1μg/mL，加入到酶标板中，置于37℃恒温培养箱中孵育1h。将酶标板从37℃恒温培养箱中取出，置于洗板机上，每孔加入200μl的PBST溶液，洗板五次，每次洗板后震荡20s，最后一次需在干净的吸水纸上大力排干净残留的PBST溶液。向酶标板中加入TMB显色液，每孔100μl，避光静置5min。向酶标板中加入100μl的2MH2SO4终止液，置于酶标仪内读取450nm波长处的读数。用标准品的浓度作为横坐标，以各个标准品浓度所对应的OD450nm值为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线所对应的方程式及R2值。结果显示，在转染后的第一天内，有少量的DS-Cav2蛋白表达，在转染后的第2天及第3天，DS-Cav2蛋白的表达量有明显上升，在转染后的第4天至第6天，DS-Cav2蛋白表达量有提高，但是涨幅很小，最终在第六天检测到细胞表达上清中DS-Cav2蛋白的浓度为10.2μg/mL，根据此结果，并且考虑到表达蛋白所需的时间成本及材料成本，我们确定在转染后的第3天为最佳收获细胞表达上清的时间。
本发明涉及的序列表
RV94抗体重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:1
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMAVSWIRQTPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISK DSSDNQVFLKITSVDTADTATYYCAREIYYNYDYVMDFWGQGTSVTVSS
RV94抗体轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:2
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSNKSLLHSNGITYLFWYLQKPGQSPHLLIYQMSNLASGVPDRFTGSGSG TDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKLEIK
RV94抗体重链可变区CDR1氨基酸序列SEQ ID NO:3
GFSLSTSGMA
RV94抗体重链可变区CDR2氨基酸序列SEQ ID NO:4
IYWDDDK
RV94抗体重链可变区CDR3氨基酸序列SEQ ID NO:5
AREIYYNYDYVMDF
RV94抗体轻链可变区CDR1氨基酸序列SEQ ID NO:6
NKSLLHSN
RV94抗体轻链可变区CDR2氨基酸序列SEQ ID NO:7
HLLIYQM
RV94抗体轻链可变区CDR3氨基酸序列SEQ ID NO:8
VGVYYCAQNL
2RV56抗体重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:9
QVQLQQSGAELVRPGVSVKISCKGSGYTFTDYAIYWVKQSHVKSLEWIGLISTYSGVATYNQKFKGKATMTVD KSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCVRDLVFGYWGQGTTLTVSS
2RV56抗体轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:10
DIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWFQHKPGKTPRLLIHFTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSF TISNLEPEDFATYYCLQYDNLRTFGGGTKLEIK
2RV56抗体重链可变区CDR1氨基酸序列SEQ ID NO:11
GYTFTDYA
2RV56抗体重链可变区CDR2氨基酸序列SEQ ID NO:12
ISTYSGVA
2RV56抗体重链可变区CDR3氨基酸序列SEQ ID NO:13
VRDLVFGY
2RV56抗体轻链可变区CDR1氨基酸序列SEQ ID NO:14
QDINKY
2RV56抗体轻链可变区CDR2氨基酸序列SEQ ID NO:15
FTS
2RV56抗体轻链可变区CDR3氨基酸序列SEQ ID NO:16
LQYDNLRT
呼吸道合胞病毒糖蛋白F的氨基酸序列SEQ ID NO:17
ATMELPILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATGSGSAICSGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYCVNKQEGQSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHHHGSWSHPQFGK*
呼吸道合胞病毒糖蛋白F的核苷酸序列SEQ ID NO:18
GCCACCATGGAGCTTCCGATCCTCAAGACGAATGCGATAACTGCCATCCTGGCTGCCGTCACCTTGTGCTTTGCATCCAGCCAAAACATTACGGAGGAGTTTTACCAGAGCACCTGTTCCGCTGTTTCCAAAGGCTACCTGGGCGCCCTGAGGACAGGATGGTATACGTCCGTCATCACCATCGAGCTCTCCAACATTAAAGAGAACAAGTGCAATGGAACTGATGCCAAGGTGAAGCTGATCAAGCAAGAACTGGACAAGTACAAAAATGCCGTTACAGACCTGCAGCTGCTGATGCAGTCTACCCCAGCTACTGGCTCAGGATCAGCCATCTGCAGTGGCGTGGCTGTGTGTAAAGTCCTCCATCTGGAAGGAGAAGTCAACAAAATCAAAAGCGCATTGCTCAGTACTAACAAGGCAGTGGTGTCTCTCTCAAATGGCGTGAGCGTCCTGACCTTCAAGGTCTTGGATCTCAAGAACTACATTGATAAACAATTACTTCCCATATTGAATAAACAGTCCTGCAGCATCCCCAACATCGAGACTGTAATTGAGTTCCAGCAGAAAAACAACAGATTGCTGGAGATTACCAGAGAATTTTCTGTCAATGCAGGTGTGACCACTCCTGTGAGTACATACATGCTGACAAATTCTGAGCTGCTTTCTCTAATAAACGACATGCCCATCACCAATGACCAGAAGAAGCTGATGAGTAATAACGTACAGATTGTACGTCAGCAAAGCTACTCTATCATGTGCATCATCAAGGAAGAAGTGCTGGCGTATGTAGTGCAGCTCCCGTTGTATGGAGTAATTGACACTCCATGCTGGAAGCTACACACCTCCCCTCTCTGCACCACCAACACTAAGGAGGGCTCCAATATCTGTCTGACAAGGACCGACAGAGGCTGGTACTGTGACAACGCTGGGTCTGTTAGCTTCTTCCCCCAGGCCGAGACCTGCAAAGTTCAGTCAAATCGGGTGTTCTGTGATACCATGAACTCCCTCACGCTGCCAAGTGAAGTGAACCTGTGTAATGTTGACATATTTAATCCTAAGTATGATTGTAAGATAATGACATCCAAGACTGATGTCTCTTCGTCTGTGATTACAAGTCTTGGAGCTATTGTGAGCTGCTATGGGAAAACTAAGTGTACAGCCAGCAATAAGAACCGCGGCATCATCAAAACTTTTAGTAATGGTTGTGATTATGTGAGTAACAAAGGAGTGGACACAGTGAGCGTGGGGAACACACTTTACTGCGTTAACAAACAGGAGGGGCAGAGCCTCTATGTAAAAGGTGAACCTATTATTAACTTCTATGACCCACTGGTGTTTCCTTCAGATGAGTTTGACGCTTCTATAAGCCAGGTGAATGAGAAGATAAACCAGTCACTAGCCTTCATTCGAAAGTCAGACGAATTACTGAGTGCAATTGGTGGGTACATCCCAGAAGCACCTCGCGATGGCCAAGCCTACGTCAGGAAGGATGGAGAGTGGGTTTTGCTCTCAACATTCCTGGGGGGTTTAGTCCCCCGGGGAAGTCACCATCACCATCATCACCACCATGGATCTTGGTCCCACCCACAGTTCGGCAAGTGACTCGAGCTAGC。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (2)

1.一种呼吸道合胞病毒抗原定量检测试剂盒，其特征在于，所包含的捕获抗体RV94或其与抗原结合片段，其选自以下各自组成的组：
1)包含如SEQ ID NO:1所示重链可变区包含的RV94HCDR1，RV94HCDR2和RV94HCDR3，以及如SEQ ID NO:2所示轻链可变区包含的RV94LCDR1，RV94LCDR2和RV94LCR3；按照IMGT编号系统，所述抗体包含：
RV94HCDR1，其包含SEQ ID NO:3所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成；
RV94HCDR2，其包含SEQ ID NO:4所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成；
RV94HCDR3，其包含SEQ ID NO:5所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成，并且所述抗体还包含：
RV94LCDR1，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸，或与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成；
RV94LCDR2，其包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成；
RV94LCDR3，其包含SEQ ID NO:8所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成；
2)所包含的捕获抗体2RV56或其与抗原结合片段，其选自以下各自组成的组：
包含如SEQ ID NO:9所示重链可变区包含的2RV56HCDR1，2RV56HCDR2和2RV56HCDR3，以及如SEQ ID NO:10所示轻链可变区包含的2RV56LCDR1，2RV56LCDR2和2RV56LCR3；按照IMGT编号系统，所述抗体包含：
2RV56HCDR1，其包含SEQ ID NO:11所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成，
2RV56HCDR2，其包含SEQ ID NO:12所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成，和
2RV56HCDR3，其包含SEQ ID NO:13所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成，并且所述抗体还包含：
2RV56LCDR1，其包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸，或与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成；
2RV56LCDR2，其包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成；
2RV56LCDR3，其包含SEQ ID NO:16所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成。
2.一种定量检测呼吸道合胞病毒抗原的方法，其特征在于：用呼吸道合胞病毒特异性抗体RV94包被ELISA板，制成固相抗体，依次加入不同浓度梯度稀释的标准抗原或待检测的抗原样品、呼吸道合胞病毒特异性的酶标抗体2RV56-HRP，再加底物溶液显色，加入2MH2SO4溶液终止显色，测定OD450nm值，根据测定的吸光度值和标准抗原浓度绘制标准曲线方程，根据标准曲线方程和待检测抗原样品的吸光度值来计算待检测样品的浓度。
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