CN116790814A - 用于FAdV、AIV、NGPV、DTMUV和NGoAstV检测的五重PCR引物组 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及用于FAdV、AIV、NGPV、DTMUV和NGoAstV检测的五重PCR引物组。本发明提供的引物组、试剂盒、检测系统以及方法具有如下效果：1)高通量、经济；2)特异性强3)灵敏度高：对单一模板的灵敏度能达到102copies/μL，对五重模板的敏感性能达到103copies/μL；4)重复性好。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及用于FAdV、AIV、NGPV、DTMUV和NGoAstV检测的五重PCR引物组。
背景技术
我国是世界上最大的水禽生产国与消费国，水禽饲养量占世界总量的75％以上，同时我国也世界养鹅大国，鹅的存栏量和出栏量一直稳居世界第一位。但是随着我国养鹅业的不断发展，鹅的饲养密度不断增大，发病率逐年增多，特别是禽流感、腺病毒、新型鹅细小病毒、坦布苏病毒和新型鹅星状病毒感染等。禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)是当前危害水禽养殖最严重的疫病，雏鸭感染高致病性禽流感病毒的发病率达100％，病死率为30％～95％，雏番鸭发病率达100％,死亡率达90％以上。7周龄以上的肉鸭和蛋鸭感染后主要造成生殖系统损伤，影响产蛋。鹅对禽流感病毒比鸭更易感，各年龄段的死亡率都非常高。禽腺病毒(Fowl adeno virus，FAdV)是全球家禽常见的传染病病原之一，多数禽腺病毒可在健康禽体内存在并复制，不表现临床症状或症状比较轻微，但可以成为混合感染时的条件性病原，腺病毒有时也可以作为原发性病原，引起禽类的多种病征。新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus，NGPV)可引起“短喙-侏儒综合征”，是一种新发传染病，其典型的临床症状为软脚、短嘴和生长障碍。鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)可引起的一种以蛋鸭、蛋鹅产蛋骤降、肉鹅或育成鹅出现神经症状为主要特征的急性传染病。新型鹅星状病毒(Novel Goose astrovirus，NGoAstV)是近年危害我国养鹅业重要的病毒性传染病病原之一，主要感染3周龄以内的雏鹅,感染后鹅群发生高度致死性内脏痛风病，病死率可高达30％。上述病毒它们单一感染或共感染，造成鹅的发病、死亡或生产性能降低，给养鹅业造成了巨大的经济损失。在临床上仅靠肉眼观察发病症状、剖检变化和发病特征等，难以作出快速鉴别诊断，因此建立能够普遍适用这些病毒感染的快速高通量鉴别检测方法迫在眉睫。
目前主要的诊断方法主要分为临床诊断与实验室诊断，因为鹅病在临床上症状不典型多以混感为主，因此主要依靠实验室诊断方法来确诊。常用的实验室诊断方法包括病毒分离鉴定、血清学检测、ELISA、免疫电镜、荧光定量PCR等技术已被均可应用于这些病毒感染的检测，但是传统方法如病毒分离鉴定耗时长，血清学和ELISA检测耗时费力，常受临床病料新鲜度、污染程度或病程等因素的限制，免疫电镜和荧光定量PCR对设备及病毒的纯化要求较高，均给实验室诊断带来了局限性。因此，如何能够快速、准确、高特异性、高灵敏度、并且对病毒纯化要求不是十分严格，便于操作、节约成本的同时检测上述五种病毒成为本领域有待解决的技术问题。
发明内容
本发明的第一方面的目的，在于提供引物组。
本发明的第二方面的目的，在于提供一种试剂盒。
本发明的第三方面的目的，在于提供一种检测系统。
本发明的第四方面的目的，在于提供本发明第一方面的引物组、第二方面的的试剂盒、第三方面的检测系统的应用。
本发明的第五方面的目的，在于提供一种方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供引物组，包含：用于鉴定禽腺病毒的特异引物对A、用于鉴定禽流感病毒的特异引物对B、用于鉴定新型鹅细小病毒的特异引物对C、用于鉴定鸭坦布苏病毒的特异引物对D和用于鉴定新型鹅星状病毒的特异引物对E；
所述用于鉴定禽腺病毒的特异引物对A包含：FAdV-F和FAdV-R；所述用于鉴定禽流感病毒的特异引物对B包含：AIV-F和AIV-R；所述用于鉴定新型鹅细小病毒的特异引物对C包含：N-GPV-F和N-GPV-R；所述用于鉴定鸭坦布苏病毒的特异引物对D包含：DTMUV-F和DTMUV-R；所述用于鉴定新型鹅星状病毒的特异引物对E包含：N-GoAstV-F和N-GoAstV-R；
所述FAdV-F的序列如SEQ ID NO.1所示；所述FAdV-R的序列如SEQ ID NO.2所示；所述AIV-F的序列如SEQ ID NO.3所示；所述AIV-R的序列如SEQ ID NO.4所示；所述N-GPV-F的序列如SEQ ID NO.5所示；所述N-GPV-R的序列如SEQ ID NO.6所示；所述DTMUV-F的序列如SEQ ID NO.7所示；所述DTMUV-R的序列如SEQ ID NO.8所示；所述N-GoAstV-F的序列如SEQ ID NO.9所示；所述N-GoAstV-R的序列如SEQ ID NO.10所示。
优选地，所述引物组用于a1)～a4)中至少一种：
a1)鉴定禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒；
a2)鉴定待测病毒是否为禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒；
a3)鉴别禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒；
a4)检测待测样品中是否含有禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒。
本发明的引物组除可同时检测/鉴定/鉴别上述五种病毒(禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒)外，也可检测/鉴定/鉴别上述五种病毒中的某1种、2种、3种或4种病毒。
优选地，所述引物组还包含说明书，所述说明书记载了所述引物组的使用方法。
优选地，所述引物组的使用方法为：以待测病毒/样品的DNA为模板，采用所述引物组进行扩增，检测扩增产物。
优选地，所述待测样品的DNA通过提取得到和/或通过RNA逆转录得到。
优选地，所述扩增的反应体系中所述FAdV-F、FAdV-R、AIV-F、AIV-R、N-GPV-F、N-GPV-R、DTMUV-F、DTMUV-R、N-GoAstV-F和N-GoAstV-R的摩尔比为1：1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(1.0～1.4)：(1.0～1.4)：(2.0～2.4)：(2.0～2.4)：(1.4～1.8)：(1.4～1.8)。
优选地，所述扩增的反应体系中所述FAdV-F的终浓度为0.18～0.22μM；进一步为0.2μM。
优选地，所述扩增的反应程序为：
94～96℃2～4min，1～2个循环；
94～96℃25～35s、58～62℃80～100s、70～74℃20～40s，28～32个循环；
70～74℃8～∞min。
进一步优选地，所述扩增的反应程序为：
94～96℃2～4min，1～2个循环；
94～96℃25～35s、58.4～60℃80～100s、70～74℃20～40s，28～32个循环；
70～74℃8～∞min。
本发明的第二个方面，提供一种试剂盒，包含本发明第一个方面的引物组。
优选地，所述FAdV-F、FAdV-R、AIV-F、AIV-R、N-GPV-F、N-GPV-R、DTMUV-F、DTMUV-R、N-GoAstV-F和N-GoAstV-R分别单独包装或混合在一起。
优选地，所述FAdV-F、FAdV-R、AIV-F、AIV-R、N-GPV-F、N-GPV-R、DTMUV-F、DTMUV-R、N-GoAstV-F和N-GoAstV-R的摩尔比为1：1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(1.0～1.4)：(1.0～1.4)：(2.0～2.4)：(2.0～2.4)：(1.4～1.8)：(1.4～1.8)混合在一起。
优选地，所述试剂盒还包含：PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP和Mg2+中的至少一种；进一步包含Multiplex Buffer和Mutiplex DNA Polymerase。
优选地，所述试剂盒还包含：逆转录引物和逆转录酶，用于将RNA反转录成cDNA。
优选地，所述逆转录引物为Oligo(dT)或随机引物。
优选地，所述试剂盒还包含：含有禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的阳性对照样品以及不含禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的阴性对照样品。
优选地，所述试剂盒用于a1)～a4)中至少一种：
a1)鉴定禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒；
a2)鉴定待测病毒是否为禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒；
a3)鉴别禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒；
a4)检测待测样品中是否含有禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒。
本发明的试剂盒除可同时检测/鉴定/鉴别上述五种病毒(禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒)外，也可检测/鉴定/鉴别上述五种病毒中的某1种、2种、3种或4种病毒。
本发明的第三个方面，提供一种检测系统，包含：本发明第一个方面的引物组和本发明第二个方面的试剂盒中的至少一种；以及用于检测扩增产物的装置；所述装置包含用于选自下组检测方法中的装置：琼脂糖凝胶电泳法。
优选地，所述检测系统用于a1)～a4)中至少一种：
a1)鉴定禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒；
a2)鉴定待测病毒是否为禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒；
a3)鉴别禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒；
a4)检测待测样品中是否含有禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒。
本发明的检测系统除可同时检测/鉴定/鉴别上述五种病毒(禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒)外，也可检测/鉴定/鉴别上述五种病毒中的某1种、2种、3种或4种病毒。
本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面的引物组、第二个方面的的试剂盒、第三个方面的检测系统的应用。
b1)～b3)中至少一种在c1)～c8)中至少一种中的应用：
b1)本发明第一个方面的引物组；
b2)本发明第二个方面的的试剂盒；
b3)本发明第三个方面的检测系统；
c1)非诊断目的地鉴定禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒；
c2)非诊断目的地鉴定待测病毒是否为禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒；
c3)非诊断目的地鉴别禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒；
c4)非诊断目的地检测待测样品中是否含有禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒；
c5)制备鉴定禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的产品；
c6)制备鉴定待测病毒是否为禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的产品；
c7)制备鉴别禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的产品；
c8)制备检测待测样品中是否含有禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的产品。
本发明的第五个方面，提供d1)～d3)中任一种方法：
d1)一种非诊断目的地鉴定待测病毒是否为禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的方法，包含采用本发明第一个方面的引物组、第二个方面的试剂盒和/或第三个方面的检测系统的步骤；
d2)一种非诊断目的地鉴别禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的方法，包含采用本发明第一个方面的引物组、第二个方面的试剂盒和/或第三个方面的检测系统的步骤；
d3)一种非诊断目的地检测待测样品中是否含有禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的方法，包含采用本发明第一个方面的引物组、第二个方面的试剂盒和/或第三个方面的检测系统的步骤。
优选地，所述非诊断目的地鉴定待测病毒是否为禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的方法包含如下步骤：以待测病毒的DNA为模板，采用本发明第一个方面的引物组进行扩增，检测扩增产物；
若所述扩增产物中含有大小为131bp的条带，则所述待测病毒为禽腺病毒；
若所述扩增产物中含有大小为168bp的条带，则所述待测病毒为禽流感病毒；
若所述扩增产物中含有大小为201bp的条带，则所述待测病毒为新型鹅细小病毒；
若所述扩增产物中含有大小为243bp的条带，则所述待测病毒为鸭坦布苏病毒；
若所述扩增产物中含有大小为349bp的条带，则所述待测病毒为新型鹅星状病毒；
若所述扩增产物中不含有大小为131、168、201、243和349bp的条带，则所述待测病毒不为禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒。
优选地，所述待测病毒的DNA通过提取得到和/或通过RNA逆转录得到。
优选地，所述非诊断目的地鉴别禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的方法包含如下步骤：以待测病毒的DNA为模板，采用本发明第一个方面的引物组进行扩增，检测扩增产物；
若所述扩增产物中含有大小为131bp的条带，则所述待测病毒为禽腺病毒；
若所述扩增产物中含有大小为168bp的条带，则所述待测病毒为禽流感病毒；
若所述扩增产物中含有大小为201bp的条带，则所述待测病毒为新型鹅细小病毒；
若所述扩增产物中含有大小为243bp的条带，则所述待测病毒为鸭坦布苏病毒；
若所述扩增产物中含有大小为349bp的条带，则所述待测病毒为新型鹅星状病毒。
优选地，所述待测病毒的DNA通过提取得到和/或通过RNA逆转录得到。
优选地，所述非诊断目的地检测待测样品中是否含有禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的方法包含如下步骤：以待测样品的DNA为模板，采用本发明第一个方面的引物组进行扩增，检测扩增产物；
若所述扩增产物中含有大小为131bp的条带，则所述待测样品含有禽腺病毒；反之则所述待测样品不含有禽腺病毒；
若所述扩增产物中含有大小为168bp的条带，则所述待测样品含有禽流感病毒；反之则所述待测样品不含有禽流感病毒；
若所述扩增产物中含有大小为201bp的条带，则所述待测样品含有新型鹅细小病毒；反之则所述待测样品不含有新型鹅细小病毒；
若所述扩增产物中含有大小为243bp的条带，则所述待测样品含有鸭坦布苏病毒；反之则所述待测样品不含有鸭坦布苏病毒；
若所述扩增产物中含有大小为349bp的条带，则所述待测样品含有新型鹅星状病毒；反之则所述待测样品不含有新型鹅星状病毒。
优选地，所述待测样品的DNA通过提取得到和/或通过RNA逆转录得到。
优选地，所述扩增的反应体系中所述FAdV-F、FAdV-R、AIV-F、AIV-R、N-GPV-F、N-GPV-R、DTMUV-F、DTMUV-R、N-GoAstV-F和N-GoAstV-R的摩尔比为1：1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(1.0～1.4)：(1.0～1.4)：(2.0～2.4)：(2.0～2.4)：(1.4～1.8)：(1.4～1.8)。
优选地，所述扩增的反应体系中所述FAdV-F的终浓度为0.18～0.22μM；进一步为0.2μM。
优选地，所述扩增的反应程序为：
94～96℃2～4min，1～2个循环；
94～96℃25～35s、58～62℃80～100s、70～74℃20～40s，28～32个循环；
70～74℃8～∞min。
进一步优选地，所述扩增的反应程序为：
94～96℃2～4min，1～2个循环；
94～96℃25～35s、58.4～60℃80～100s、70～74℃20～40s，28～32个循环；
70～74℃8～∞min。
本发明的有益效果是：
本发明提供的引物组、试剂盒、检测系统以及方法具有如下效果：1)高通量、经济：通过一次实验可以同时最多检测5种不同的病毒，极大地提高了检测效率，且无需克隆、测序和序列比对，只需根据PCR扩增产物的大小即可准确判断病毒种类，显著节约了检测时间和成本；除同时最多检测五种病毒外，也可同时检测某1种、2种、3种或4种病毒；2)特异性强：5对特异性引物是通过对已报道的5种病毒基因序列多重比对后在保守区域设计，并反复实验、筛选而得到：能够分别从感染禽腺病毒、禽流感病毒、新型小鹅瘟病毒、鸭坦布苏病毒、新型鹅星状病毒的各样品上扩增到大小为131bp、168bp、201bp、243bp、349bp的特异性目的片段，而从健康样品上未扩增到相应的目的片段；3)灵敏度高：对单一模板的灵敏度能达到102copies/μL，对五重模板的敏感性能达到103copies/μL；4)重复性好。
本发明根据已报道的禽腺病毒、禽流感病毒、新型小鹅瘟病毒、鸭坦布苏病毒、新型鹅星状病毒5种主要病毒基因序列，设计、筛选出五对特异性引物，并经引物浓度、退火温度等参数的反复优化确定了最佳PCR反应体系和反应程序，提供了五种病毒的多重PCR检测试剂盒及检测方法。通过实验证明：本发明的多重PCR检测试剂盒及检测方法可同时检测五种病毒，具有检测效率高、特异性强、灵敏度高、重复性好的优点，相对于其他检测方法成本更低，快速简便，省时省力。
附图说明
图1是不同引物组对扩增的影响的结果图。
图2是引物组中不同引物的比例对扩增的影响的结果图。
图3是不同退火温度对扩增的影响的结果图。
图4是实施例5中PCR方法扩增结果图。
图5是实施例5中PCR方法的特异性检测结果图。
图6是实施例5中PCR方法检测单一病毒的灵敏度的结果图：其中，A是实施例5中PCR方法检测不同浓度的FAdV的结果图；B是实施例5中PCR方法检测不同浓度的AIV的结果图；C是实施例5中PCR方法检测不同浓度的N-GPV的结果图；D是实施例5中PCR方法检测不同浓度的DTMUV的结果图；E是实施例5中PCR方法检测不同浓度的N-GoAstV的结果图。
图7是实施例5中PCR方法检测混合病毒的灵敏度的结果图。
图8是实施例5中PCR方法检测临床样品的结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
本实施例中的多重PCR酶为Taq Pro Multiplex DNA Polymerase(Highspecificity)(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)；反转录试剂盒为PrimeScriptTM RTreagent Kit(Perfect Real Time)(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)。
实施例1用于FAdV、AIV、NGPV、DTMUV和NGoAstV检测的五重PCR引物组的设计与筛选
根据GenBank数据库中登录的禽腺病毒(FAdV，AY683543.1)、禽流感病毒(AIV，KJ907546)、新型小鹅瘟病毒(N-GPV，MN356043.1)、鸭坦布苏病毒(DTMUV，MN649262.1)、新型鹅星状病毒(N-GoAstV，ON745304.1)基因序列，使用MEGAX软件进行分析，针对其保守序列分别设计特异性引物，每种病毒设计3对特异性引物进行筛选，选出特异性好无交叉反应的引物。下述实施例中涉及的各病毒特异性引物如表1所示。
表1：本发明检测五种病毒的特异性引物
实施例2标准质粒构建
第一步：引物合成
本发明所设计的5对病毒质粒构建引物如表1中SEQ ID NO.1～10所示，由广州天一辉远生物科技有限公司合成。
第二步：病毒总DNA/RNA提取与RNA反转录
按照提取试剂盒说明书分别提取5种病毒已有毒株或疫苗株的基因组，其中FAdV、N-GPV基因组为DNA；AIV、DTMUV、N-GoAstV基因组为RNA，按照说明书反转录为cDN A，所有DNA/cDNA放置于-80℃保存备用。
第三步：PCR扩增
50μL的PCR反应体系：Premix Taq(TaKaRa TaqTM Version 2.0plus dye)25μL，以第一步中合成的各个病毒的引物(10μM)2μL，第二步得到的cDNA/DNA为模板2μL，加去离子水补足至50μL，分别进行PCR扩增。PCR仪的反应参数为：94℃变性30s，55℃退火30s，74℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10min。
第四步：质粒标准品制备
将第三步获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，按照DNA Gel Extraction Kit操作方法回收目的片段，将回收产物连接到pMD18-T载体上，通过DH5α大肠杆菌感受态转化，划平板过夜培养后挑取其中白色单菌落进行鉴定，重组质粒序列委托上海生工生物公司进行序列测定。利用Plasmid Mini Kit提取测序正确的重组质粒，利用DeNovix DS-11FX+测定重组质粒浓度，以无菌双蒸水将重组质粒按照1×106～1×100copies/μL 10倍梯度稀释制备质粒标准品。
实施例3引物筛选及引物比例优化
同时在一个反应孔中检测五种病毒是十分困难的，不同引物之间经常相互干扰导致检测失败，或者形成发夹结构、引物二聚体、引物与DNA之间发生错配等情况，因此引物设计是成败关键。与此同时，各引物之间的比例也会影响检测结果，所以探索引物间的比例也十分重要。引物优化前如图1泳道4DTMUV引物(300bp，DTMUV-F2、DTMUV-R2，其他引物为本发明请求保护的对应病毒的引物)在多重PCR体系中无法正常工作，泳道11DTMUV引物(263bp，DTMUV-F3、DTMUV-R3，其他引物为本发明请求保护的对应病毒的引物)以及N-GoAstV引物(404bp，N-GoAstV-F2、N-GoAstV-R2，其他引物为本发明请求保护的对应病毒的引物)在多重PCR体系中无法正常工作(反应体系如下：模板(起始浓度105copies/μL，本实施例中使用的模板均为实施例2制备得到的质粒)1uL，2×Multiplex Buffer 12.5μL；Mutiplex DNAPolymerase 1μL；各病毒引物对(起始浓度10μM)各0.5μL；去离子水补足25μL；反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸30s，进行30个循环后；72℃延伸10min)。引物比例优化前如图2各病毒引物终浓度为0.2μM时(反应体系如下：模板(起始浓度105copies/μL)1uL，2×Multiplex Buffer 12.5μL；Mutiplex DNA Polymerase 1μL；各病毒引物对(起始浓度10μM)0.5μL；去离子水补足25μL；反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸30s，进行30个循环后；72℃延伸10min)，多重PCR体系对泳道1～5中的单一病毒可检出，对于泳道6中的混合模板在凝胶电泳图中只能明显看到其中3种病毒对应的条带，其余两种病毒对应条带较淡，不利于结果阅读及判断。经过发明人多次重复设计与实验验证，最终确定了能够高灵敏度、高特异性的同时检测五种病毒的五重PCR引物对，各病毒引物终浓度控制在0.2μM-0.44μM(反应体系如下：单一病毒模板(起始浓度105copies/μL，实施例2制备得到的质粒)1uL(混合病毒模板5uL，即各病毒模板各1uL)，2×Multiplex Buffer 12.5μL；Mutiplex DNA Polymerase 1μL；FAdV-F/R(起始浓度10μM)各0.5μL；AIV-F/R(起始浓度10μM)各0.5μL；N-GPV-F/R(起始浓度10μM)各0.6μL；DTMUV-F/R(起始浓度10μM)各1.1μL；N-GoAstV-F/R(起始浓度10μM)各0.8μL；去离子水补足25μL；反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸30s，进行30个循环后；72℃延伸10min)。本发明五对引物之间彼此不会相互干扰，之间，PCR条带明亮、清晰、无杂带。如图4五重条带分别为FAdV(131bp)、AIV(168bp)、N-GPV(201bp)、DTMUV(243bp)、N-GoAstV(349bp)。
实施例4退火温度优化
退火温度决定PCR特异性与产量：温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降，且样品蒸发量大；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。五重PCR反应中有5对引物，各自的合适的退火温度也是不一样的，为此发明人摸索了五重PCR反应最佳的退火温度﹐结果图3所示(反应体系如下：混合病毒模板(起始浓度105copies/μL，实施例2制备得到的质粒)5uL(即各病毒模板各1uL)，2×Multiplex Buffer 12.5μL；Mutiplex DNA Polymerase 1μL；FAdV-F/R(起始浓度10μM)各0.5μL；AIV-F/R(起始浓度10μM)各0.5μL；N-GPV-F/R(起始浓度10μM)各0.6μL；DTMUV-F/R(起始浓度10μM)各1.1μL；N-GoAstV-F/R(起始浓度10μM)各0.8μL；去离子水补足25μL；反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，55.0℃/56.0℃/56.9℃/57.6℃/58.4℃/59.1℃/60.0℃/61.9℃退火90s，72℃延伸30s，进行30个循环后；72℃延伸10min)，泳道1～8的退火温度分别是55.0℃，56.0℃，56.9℃，57.6℃，58.4℃，59.1℃，60.0℃，61.9℃。由图可知退火温度为58.4～60.0℃时反应结果最好，考虑到实际样品检测中样品核酸成分复杂，为避免非特异性结合过多，综合考量后选择60.0℃为最佳反应温度。
实施例5多重PCR体系建立
经过以上优化最终建立了多重PCR反应体系，反应体系为25μL，五种病毒的特异性引物，终浓度控制在0.2μM～0.44μM之间(FAdV-F/R(起始浓度10μM)各0.5μL；AI V-F/R(起始浓度10μM)各0.5μL；N-GPV-F/R(起始浓度10μM)各0.6μL；DTMU V-F/R(起始浓度10μM)各1.1μL；N-GoAstV-F/R(起始浓度10μM)各0.8μL)；2×Multiplex Buffer 12.5μL；MutiplexDNA Polymerase 1μL；模板cDNA(临床样本提取获得的DNA/cDNA，即FAdV、AIV、N-GPV、DTMUV、N-GoAstV、GRV、NDV、GoC V的DNA/cDNA作为模板)2μL；去离子水补足至25μL；经优化后的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸30s，进行30个循环后；72℃延伸10min。PCR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳分析。结果如图4，泳道6在约130bp、170bp、200bp、240bp、350bp大小处有明亮条带，分别为FAdV(131bp)、AIV(168bp)、N-GPV(201bp)、DTMUV(243bp)、N-GoAstV(349bp)。
实施例6多重PCR特异性检测
根据实施例5中已建立的多重PCR方法，分别以FAdV、AIV、N-GPV、DTMUV、N-GoAstV、GRV、NDV、GoCV的DNA/cDNA作为模板﹐进行PCR扩增，每个反应体系为25uL，包括单一病毒模板2uL，FAdV-F/R(起始浓度10μM)各0.5μL；AIV-F/R(起始浓度10μM)各0.5μL；N-GPV-F/R(起始浓度10μM)各0.6μL；DTMUV-F/R(起始浓度10μM)各1.1μL；N-GoAstV-F/R(起始浓度10μM)各0.8μL，2×Multiplex Buffer 12.5μL；Mutiplex DNA Polymerase 1μL；去离子水补足25μL；95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸30s，进行30个循环后；72℃延伸10min。PCR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳分析。结果如图5，该多重PCR检测方法可对FAdV、AIV、N-GPV、DTMUV、N-GoAstV的DNA/cDNA 进行扩增，并产生大小不同的产物，同时对GRV、NDV、GoCV无扩增，表明该方法特异性良好。
实施例7多重PCR灵敏度评价
将5个单一模板分别从1×105copies/μL～1×100copies/μL做6个梯度(10倍稀释)的单一模板PCR(实施例2得到的)，测定该多重PCR方法对单一模板的灵敏度；将5个单一模板等浓度混合为多重模板，从1×105copies/μL～1×100copies/μL做6个梯度(10倍稀释)的混合模板PCR，测定该多重PCR方法对五重模板的敏感性(反应体系如下：模板单一病毒模板(起始浓度105copies/μL，实施例2制备得到的质粒)1uL(混合病毒模板5uL，即各病毒模板各1uL)，2×Multiplex Buffer 12.5μL；Mutiplex DNA Polymerase 1μL；FAdV-F/R(起始浓度10μM)各0.5μL；AIV-F/R(起始浓度10μM)各0.5μL；N-GPV-F/R(起始浓度10μM)各0.6μL；DTMUV-F/R(起始浓度10μM)各1.1μL；N-GoAstV-F/R(起始浓度10μM)各0.8μL；去离子水补足25μL；反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，60.0℃退火90s，72℃延伸30s，进行30个循环后；72℃延伸10min)。通过3％琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果如图6、7所示：该多重PCR对单一模板的灵敏度能达到102copies/μL，对五重模板的敏感性能达到103copies/μL，表明该方法的灵敏度已达到多重PCR检测要求。
实施例8临床样品检测
对2020年9月～2022年6月采自广东省内鹅养殖场的90份病鹅病料样品，利用多重PCR方法检测分析其携带上述五种病毒的状况。将90份病料研磨液分别提取DNA/RNA，按照实施例6的方法进行检测。结果如图8所示：59份病料呈现N-GoAstV核酸阳性，17份呈DTMUV核酸阳性，20份呈AIV核酸阳性，12份呈N-GPV核酸阳性，8份呈FAdV核酸阳性(部分临床样品不存在上述五种病毒的感染或未达到检测方法的下限)；90份病料中36份为单一感染，54份为混合感染(结果与测序结果一致)，提示在鹅养殖中需特别注意病毒混感现象。通过本实验初步证实了该方法在病毒的检测方面具有可行性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.引物组，包含：用于鉴定禽腺病毒的特异引物对A、用于鉴定禽流感病毒的特异引物对B、用于鉴定新型鹅细小病毒的特异引物对C、用于鉴定鸭坦布苏病毒的特异引物对D和用于鉴定新型鹅星状病毒的特异引物对E；
所述用于鉴定禽腺病毒的特异引物对A包含：FAdV-F和FAdV-R；所述用于鉴定禽流感病毒的特异引物对B包含：AIV-F和AIV-R；所述用于鉴定新型鹅细小病毒的特异引物对C包含：N-GPV-F和N-GPV-R；所述用于鉴定鸭坦布苏病毒的特异引物对D包含：DTMUV-F和DTMUV-R；所述用于鉴定新型鹅星状病毒的特异引物对E包含：N-GoAstV-F和N-GoAstV-R；
所述FAdV-F的序列如SEQ ID NO.1所示；所述FAdV-R的序列如SEQ ID NO.2所示；所述AIV-F的序列如SEQ ID NO.3所示；所述AIV-R的序列如SEQ ID NO.4所示；所述N-GPV-F的序列如SEQ ID NO.5所示；所述N-GPV-R的序列如SEQ ID NO.6所示；所述DTMUV-F的序列如SEQID NO.7所示；所述DTMUV-R的序列如SEQ ID NO.8所示；所述N-GoAstV-F的序列如SEQ IDNO.9所示；所述N-GoAstV-R的序列如SEQ ID NO.10所示。
2.一种试剂盒，包含权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含：PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP和Mg2+中的至少一种；
优选地，所述试剂盒还包含：逆转录引物和逆转录酶；
优选地，所述试剂盒还包含：含有禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的阳性对照样品以及不含禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的阴性对照样品。
4.一种检测系统，包含：权利要求1所述的引物组和权利要求2～3任一项所述的试剂盒中的至少一种；以及用于检测扩增产物的装置；所述装置包含用于选自下组检测方法中的装置：琼脂糖凝胶电泳法。
5.b1)～b3)中至少一种在c1)～c8)中至少一种中的应用：
b1)权利要求1所述的引物组；
b2)权利要求2～3任一项所述的试剂盒；
b3)权利要求4所述的检测系统；
c1)非诊断目的地鉴定禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒；
c2)非诊断目的地鉴定待测病毒是否为禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒；
c3)非诊断目的地鉴别禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒；
c4)非诊断目的地检测待测样品中是否含有禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒；
c5)制备鉴定禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的产品；
c6)制备鉴定待测病毒是否为禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的产品；
c7)制备鉴别禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的产品；
c8)制备检测待测样品中是否含有禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的产品。
6.d1)～d3)中任一种方法：
d1)一种非诊断目的地鉴定待测病毒是否为禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的方法，包含采用权利要求1所述的引物组、权利要求2～3任一项所述的试剂盒和/或权利要求4所述的检测系统的步骤；
d2)一种非诊断目的地鉴别禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的方法，包含采用权利要求1所述的引物组、权利要求2～3任一项所述的试剂盒和/或权利要求4所述的检测系统的步骤；
d3)一种非诊断目的地检测待测样品中是否含有禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的方法，包含采用权利要求1所述的引物组、权利要求2～3任一项所述的试剂盒和/或权利要求4所述的检测系统的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述非诊断目的地鉴定待测病毒是否为禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的方法包含如下步骤：以待测病毒的DNA为模板，采用权利要求1所述的引物组进行扩增，检测扩增产物；
若所述扩增产物中含有大小为131bp的条带，则所述待测病毒为禽腺病毒；
若所述扩增产物中含有大小为168bp的条带，则所述待测病毒为禽流感病毒；
若所述扩增产物中含有大小为201bp的条带，则所述待测病毒为新型鹅细小病毒；
若所述扩增产物中含有大小为243bp的条带，则所述待测病毒为鸭坦布苏病毒；
若所述扩增产物中含有大小为349bp的条带，则所述待测病毒为新型鹅星状病毒；
若所述扩增产物中不含有大小为131、168、201、243和349bp的条带，则所述待测病毒不为禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒；或
所述非诊断目的地鉴别禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的方法包含如下步骤：以待测病毒的DNA为模板，采用权利要求1所述的引物组进行扩增，检测扩增产物；
若所述扩增产物中含有大小为131bp的条带，则所述待测病毒为禽腺病毒；
若所述扩增产物中含有大小为168bp的条带，则所述待测病毒为禽流感病毒；
若所述扩增产物中含有大小为201bp的条带，则所述待测病毒为新型鹅细小病毒；
若所述扩增产物中含有大小为243bp的条带，则所述待测病毒为鸭坦布苏病毒；
若所述扩增产物中含有大小为349bp的条带，则所述待测病毒为新型鹅星状病毒；或
所述非诊断目的地检测待测样品中是否含有禽腺病毒、禽流感病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的方法包含如下步骤：以待测样品的DNA为模板，采用权利要求1所述的引物组进行扩增，检测扩增产物；
若所述扩增产物中含有大小为131bp的条带，则所述待测样品含有禽腺病毒；反之则所述待测样品不含有禽腺病毒；
若所述扩增产物中含有大小为168bp的条带，则所述待测样品含有禽流感病毒；反之则所述待测样品不含有禽流感病毒；
若所述扩增产物中含有大小为201bp的条带，则所述待测样品含有新型鹅细小病毒；反之则所述待测样品不含有新型鹅细小病毒；
若所述扩增产物中含有大小为243bp的条带，则所述待测样品含有鸭坦布苏病毒；反之则所述待测样品不含有鸭坦布苏病毒；
若所述扩增产物中含有大小为349bp的条带，则所述待测样品含有新型鹅星状病毒；反之则所述待测样品不含有新型鹅星状病毒。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述扩增的反应体系中所述FAdV-F、FAdV-R、AIV-F、AIV-R、N-GPV-F、N-GPV-R、DTMUV-F、DTMUV-R、N-GoAstV-F和N-GoAstV-R的摩尔比为1：1：(0.8～1.2)：
(0.8～1.2)：(1.0～1.4)：(1.0～1.4)：(2.0～2.4)：(2.0～2.4)：(1.4～1.8)：
(1.4～1.8)。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述扩增的反应体系中所述FAdV-F的终浓度为0.18～0.22μM。
10.根据权利要求7～9任一项所述的方法，其特征在于：
所述扩增的反应程序为：
94～96℃2～4min，1～2个循环；
94～96℃25～35s、58～62℃80～100s、70～74℃20～40s，28～32个循环；
70～74℃8～∞min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202310747875.7A CN116790814A (zh) | 2023-06-21 | 2023-06-21 | 用于FAdV、AIV、NGPV、DTMUV和NGoAstV检测的五重PCR引物组 |
Applications Claiming Priority (1)
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| CN202310747875.7A CN116790814A (zh) | 2023-06-21 | 2023-06-21 | 用于FAdV、AIV、NGPV、DTMUV和NGoAstV检测的五重PCR引物组 |
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Family
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2023
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