CN116789766A - 一种用于载脂蛋白ai的纳米抗亲和介质制备方法及载脂蛋白ai的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于载脂蛋白AI的纳米抗亲和介质制备方法及载脂蛋白AI的纯化方法，纳米抗亲和介质的制备方法包括如下步骤：构建纳米抗工程菌并对菌种进行诱导表达，得重组蛋白包涵体；将包涵体复性、纯化，得复性后的纳米抗蛋白溶液；纳米抗亲和介质偶联，得纳米抗亲和介质偶联物。载脂蛋白AI的纯化方法包括如下步骤：将纳米抗亲和介质偶联物装入层析柱，用缓冲液过柱平衡；调节载脂蛋白AI溶液pH至7‑8，上样后用缓冲液淋洗至基线；采用pH为1‑3的柠檬酸洗脱，收集洗脱峰。本发明以纳米抗作为偶联填料与层析介质偶联，可得到高纯度及高回收率的目标蛋白，载脂蛋白AI纯度达到90％以上。

Description

一种用于载脂蛋白AI的纳米抗亲和介质制备方法及载脂蛋白 AI的纯化方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及一种用于载脂蛋白AI的纳米抗亲和介质制备方法及载脂蛋白AI的纯化方法。
背景技术
脂蛋白颗粒的蛋白质成分称为载脂蛋白(Apo)，包括载脂蛋白AI(ApoA-I)；载脂蛋白AI是HDL主要成分蛋白及功能执行者，是HDL参与RCT途径的关键因子，且还参与先天体液免疫，具有抗炎症潜能及抗氧化能力；此外，载脂蛋白AI与HDL含量为动脉粥样硬化及心血管疾病的判定及预测提供了有价值的指标，具有重要的诊断和预防意义。
目前，虽然载脂蛋白AI的纯化方法已有报道，但这些方法均有不尽人意之处，主要表现在生产周期较长、产生过量的再生废液、有机溶剂安全性差且易造成仪器设备及环境的污染；操作成本高、得率较低、纯化步骤繁琐，不适合大规模地、高效地纯化载脂蛋白AI；样品要求高、分辨率不高等因素，导致纯化的载脂蛋白AI活性差、回收率低，效果不理想的方面。
因此，亟需一种操作简便、纯化率高、成本低、耗时短，可应用于工业化大规模生产的载脂蛋白AI的分离纯化方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于载脂蛋白AI的纳米抗亲和介质制备方法及载脂蛋白AI的纯化方法，通过在亲和层析系统基础上开发了一种纳米抗亲和介质，以此为配基固定到基质分离纯化载脂蛋白AI，该介质吸附容量稳定，相较于其他亲和介质更易洗脱，有效克服了当前载脂蛋白AI在纯化过程中存在的多个技术难题。同时，利用本发明分离纯化载脂蛋白AI，整个过程操作简便、纯化率高、成本低、耗时短，可应用于工业化大规模生产。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种用于载脂蛋白AI的纳米抗亲和介质的制备方法，包括如下步骤：
S1：构建纳米抗工程菌并对菌种进行诱导表达，得重组蛋白包涵体；
S2：将包涵体复性、纯化，得复性后的纳米抗蛋白溶液；
S3：纳米抗与层析介质偶联，具体包括如下步骤：
S31：取环氧活化的介质微球，用纯化水多次重悬抽干后，再用缓冲液多次重悬抽干，最后将介质置换到缓冲液中；
S32：将S2中所得纳米抗蛋白溶液浓缩至1-5mg/mL；
S33：将步骤S31和步骤S32中样品按照1：(0.8-1.5)体积比、20-40℃下温和混匀14-20h后，抽干溶液后纯水清洗，然后加入乙醇胺，室温震荡，再抽干溶液；
S34：加入Tris-HCl清洗后抽干溶液；加入乙酸钠，混匀后抽干溶液；
S35：加入乙醇并于0-10℃下保存，得纳米抗亲和介质偶联物。
优选地，步骤S1中，所述纳米抗工程菌的构建方法，步骤如下：
根据纳米抗蛋白氨基酸序列进行PCR反应，依据反应结束得到的cDNA为模板扩增纳米抗工程菌目的基因；其中，纳米抗蛋白氨基酸序列如SEQNO.1所示；纳米抗工程菌目的基因如SEQNO.2所示；
采用XhoI和HindIII酶切所述扩增片段与载体质粒Pet-21a，T4连接酶将酶切后的载体质粒与扩增片段连接，构建重组表达载体；
将所述重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE)感受态细胞中，转染成功后测序分析验证阳性克隆，得到纳米抗工程菌。
优选地，步骤S1中，纳米抗工程菌的诱导表达步骤如下：
将所述纳米抗工程菌接种于LB-Amp固体培养基培养12-16h，挑取单菌落接种于LB-Amp培养基，获得活化种子培养基；
将所述活化种子培养基按照3％(V/V)比例接种于LB-Amp培养基，35-40℃培养至OD600达到0.6-0.8，采用终浓度0.1mM的异丙基硫代半乳糖昔IPTG诱导培养液，30℃诱导8-12h；
将上述培养液加入上样缓冲液悬浮沉淀，超声破碎菌体，超声破碎菌体条件为：功率300W，超声5s间隔5s，重复200次；
诱导全菌液、超声破菌上清液与超声破菌沉淀分别加入4×上样缓冲液，电泳处理进行蛋白表达分析，得到包涵体。
优选地，所述上样缓冲液中含有35-65mMNaH2PO4、250-360mM NaCl；且100mL菌液与20-35mL上样缓冲液相结合。
优选地，所述待测样品与4×上样缓冲液的体积比为(2-5):1，煮沸8-20min；采用SDS-PAGE电泳进行蛋白表达分析。
优选地，步骤S2中，包涵体复性、纯化的具体步骤为：
用洗涤缓冲液洗涤包涵体后离心去除上清，然后溶解于变性缓冲液，包涵体与变性缓冲液添加量比例为1:8-12；再搅拌离心，得变性后的包涵体；
采用稀释法对变性溶解后的包涵体进行复性；并在变性条件下对包涵体进行分离纯化，收集洗脱峰后过柱，得到复性的纳米抗蛋白溶液。
优选地，所述的洗涤缓冲液是pH7.0-8.5、含有50mM Tris、1-3mM EDTA的1-3M尿素；
所述的变性缓冲液是pH8-9、含有20mM Tris的7-10M脲。
优选地，步骤S3中，所述的缓冲液中含有0.1-0.5M NaHCO3与0.2-0.7M NaCl，置换液pH为8-9。
一种载脂蛋白AI的纯化方法，采用任一上述的方法制备得到的纳米抗亲和介质作为层析介质。
优选地，所述载脂蛋白AI的纯化方法，包括如下步骤：
S51：将纳米抗亲和介质偶联物装入层析柱，用缓冲液过柱平衡；
S52：调节载脂蛋白AI溶液pH至7-8，上样后用缓冲液淋洗至基线；
S53：采用pH为1-3的柠檬酸洗脱，收集洗脱峰。
本发明以纳米抗工程菌作为偶联填料与亲和层析介质偶联，纯化后载脂蛋白AI与烘烤处理纯化后载脂蛋白AI纯度均高于90％，37℃、72h烘烤后载脂蛋白AI的浓度相较于原样降低5％，该方法具有提纯程度较高、蛋白热稳定性高、回收率亦较高的优势。本发明还具有如下优点：
(1)在高流速下，纳米抗亲和介质的动态载量及蛋白结合量高，能够更好地吸附和纯化载脂蛋白AI，可以满足大批量纯化蛋白的需求；
(2)纳米抗亲和介质制备工艺简单、造价低、介质易再生、批次重复性较好，极大地降低了载脂蛋白AI的纯化成本；
(3)纳米抗亲和介质配基选择简单且稳定性高，应用于亲和层析分离纯化蛋白可以保证载脂蛋白AI的活性，同时具有纯化条件温和、特异性高、选择性及通用性较好等特点。
因此，通过制备纳米抗亲和介质并将其与亲和层析联用，具备生产效率、生产成本、生物安全性等多方面的显著优势，适用于大规模、高效地纯化载脂蛋白AI。
附图说明
图1是本发明的SDS-PAGE分析纳米抗工程菌重组蛋白表达图。其中，M泳道：蛋白分子质量标准；1号泳道：未诱导的全菌液；2号泳道：IPTG诱导菌液超声破碎的上清液；3号泳道：IPTG诱导菌液超声破碎的沉淀。
图2是本发明实施例5中的载脂蛋白AI分离纯化方法中亲和层析的层析图。
图3是本发明实施例5中的载脂蛋白AI分离纯化方法中洗脱峰电泳示意图。其中，1号泳道：上柱样；2号泳道：流穿峰；3号泳道：洗脱峰。
图4是本发明实施例6中载脂蛋白AI的SDS-PAGE图谱。其中，1号泳道：蛋白分子质量标准；2号泳道(还原型Loadingbuffer)：载脂蛋白AI；3号泳道(还原型Loadingbuffer)：37℃烘烤处理后的载脂蛋白AI；4号泳道(非还原型Loadingbuffer)：载脂蛋白AI；5号泳道(非还原型Loadingbuffer)：37℃烘烤处理后的载脂蛋白AI。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做具体的介绍。
实施例1
一种纳米抗工程菌的构建方法，包括以下步骤：
S1、引物设计与合成
根据NCBI查询纳米抗工程菌氨基酸序列(SEQNO.1)以及Pet-21a载体序列，通过无缝克隆技术与Primer5.0软件设计引物序列，密码子优化合成目的基因的上游引物和下游引物。
S2、目的基因的获取
1μg RNA、1μL Oligo(dT)、DEPC水共6μL反应体系于PCR仪，70℃反应10min后放置冰上3min。依次加入2μL 5×M-MLV buffer、2μL dNTP mixture、0.5μL RNase Inhibitor、5μL逆转录酶M-MLV0、1.5μL DEPC水。PCR反应参数：30℃10min、42℃1h、70℃10min。依据反应结束得到的cDNA为模板扩增目的基因(基因序列为SEQNO.2)，1％琼脂糖凝胶电泳回收纯化PCR产物，-20℃保存备用。PCR反应体系及扩增步骤如下：
表1PCR反应体系(20μL)
表2PCR扩增步骤
S3、纳米抗工程菌的构建
选用XhoI和HindIII对载体切割12h，回收纯化双酶切载体片段。将酶切后基因产物与Pet-21a质粒通过T4连接酶连接，反应体系中两者的摩尔比例为3:1，55℃水浴连接15min。热激法将连接产物转化BL21(DE)感受态细胞，转化产物涂布于LB-Amp固体培养基培养过夜，长出单菌落即为阳性克隆，挑取单菌落接种于5mL LB-Amp液体培养基中37℃培养6h。针对上述菌落测序分析验证阳性克隆。
实施例2
一种纳米抗工程菌诱导表达的方法，具体步骤如下：
S1、菌体培养
S11、菌种活化：无菌条件下接种针挑取少量甘油保藏的菌液，平板画线法接种于含有100μg/mL的LB-Amp固体培养基，37℃孵育12～16h。
S12、种子培养：接种针挑取S11步骤培养的单菌落于30mL LB-Amp培养基(250mL摇瓶)，250rpm 37℃过夜培养，得到种子培养基。
S13、摇瓶发酵：取3％(V/V)上述S12种子培养液接种于装有30mL LB-Amp培养基的250mL摇瓶，250rpm 37℃恒温培养至OD600达到0.6～0.8。
S14、诱导表达：S13步骤培养液加入终浓度0.1mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖昔)，220rpm30℃诱导过夜(8～12h)。取诱导后菌液于离心管中，12000rpm离心10min，弃去上清，收集菌体，-20℃保藏备用。
S2、菌体收集与破碎
S21、菌体破碎：将S14步骤菌体加入含有50mM NaH2PO4、300mM NaCl的上样缓冲液(LoadingBuffer)悬浮沉淀，100mL菌液与30mL Buffer相互结合。超声破碎菌体，超声破碎菌体条件为：功率300W，超声5s间隔5s，重复200次。
S22、菌体收集：上述S21步骤菌体悬液12000rpm、4℃离心20min，收集菌体。
S3、蛋白表达分析
S31、样品预处理：分别取30μL诱导全菌液、超声破碎诱导菌液的上清和沉淀，加入10μL的4×上样缓冲液，充分混匀后煮沸10min。
S32、SDS-PAGE电泳：将标准蛋白样品与S31样品上样到制备的凝胶中，120V恒压电泳约60min，当蓝色条带到达凝胶底部时停止电泳(结果如图1所示)。凝胶用考马斯亮蓝染色约20min，脱色液脱色至无色。
S33、诱导表达分析：纳米抗工程菌有效表达，表达的重组蛋白以不可溶的包涵体形式存在，2L摇瓶共获得0.83g包涵体。
实施例3
一种包涵体的复性及纯化方法，具体操作步骤如下：
S1、洗涤：将实施例2获得的包涵体加入2M尿素(含50mM Tris，1mM EDTA，pH7.0～8.5)，洗涤搅拌1～2h，重复2～3次，12000rpm离心30min，弃上清。
S2、溶解：取适量S1步骤包涵体，按照1:10比例加入8M脲(20mM Tris，pH8.5)，室温搅拌6h，溶解包涵体。
S3、复性：采用稀释法对变性溶解后的包涵体进行复性。
S4、纯化：变性条件下选用镍亲和柱分离纯化，收集洗脱峰，G25脱盐柱置换缓冲液至20mM Tris，pH8.5，相同缓冲液调节蛋白浓度0.1～0.5mg/mL，4℃放置过夜，得到复性的纳米抗蛋白溶液。
实施例4
一种纳米抗亲和介质偶联的方法，包括如下步骤：
S1、取沉降胶1.0g，用纯化水将环氧活化介质重悬后抽干，重复3-5次。
S2、加入5倍体积A液(0.2M NaHCO3、0.5M NaCl，pH8.3)，将介质重悬后抽干，重复2～3次，将介质置换到A液中。
S3、将偶联的样品用A液溶解或置换到A液中，浓缩至5mg/ml左右。
S4、步骤S2和步骤S3样品按照等比例混合，20℃～40℃条件下温和混匀16h，溶液抽干，纯水清洗1～2次。
S5、加入适量1M Ethanolamine(pH8.0)，室温震荡3～5h，抽干。
S6、加入1M Tris-HCl(含0.5M NaCl，pH8.5)，清洗抽干，随后加入0.1M乙酸钠(含0.5MNaCl，pH3.5)，抽干。
S7、加入20％乙醇，4℃保存。
实施例5
本实施例提供了一种采用纳米抗亲和介质的载脂蛋白AI亲和层析纯化方法，该纳米抗亲和介质为实施4提供的介质偶联物。载脂蛋白AI分离纯化操作流程如下：
S1、样品前处理：调节载脂蛋白AI溶液的pH为7.4。
S2、装柱：将实施例4制备的纳米抗亲和介质装入层析柱。
S3、平衡：用50mM PBS(pH7.4)过柱，流速为1mL/min。
S4、上样：取预处理过的载脂蛋白AI溶液上样，流速为1mL/min。
S5、洗脱：50mM PBS(pH7.4)淋洗至基线，随后选用100mM柠檬酸(pH2.8)进行洗脱，基线开始上升时(出现洗脱峰，图2)，取干净的离心管收集洗脱峰。
S6、平衡：收集洗脱液至洗脱峰回到基线后，继续用50mM PBS(pH7.4)平衡5～10倍柱床体积，流速为1mL/min。采用三蒸水平衡10倍柱床体积。
S7、电泳鉴定：SDS-PAGE对收集的样品进行分析鉴定(图3)。
载脂蛋白AI的纯度和稳定性测定，具体操作如下：
S1、纯度分析：将实施例5得到的载脂蛋白AI加入20μl非还原样品缓冲液或还原样品缓冲液进行SDS-PAGE电泳检测(附Mark)，考马斯亮蓝染色后使用凝胶成像仪分析目的蛋白的纯度(结果如图4所示)，SDS-PAGE图谱表明载脂蛋白AI纯度≥90％且无明显杂质。
S2、稳定性分析：将实施例5得到的载脂蛋白AI于37℃烘烤72h后进行SDS-PAGE电泳检测，考马斯亮蓝染色后使用凝胶成像仪分析目的蛋白的纯度(结果如图4所示)。取一定量的载脂蛋白AI(原样)与烘烤后载脂蛋白AI，使用相应的稀释液将样品进行倍比稀释3-4个梯度(如表3所示)。
表3待测样品稀释表
采用载脂蛋白AI(ApoA1)测定试剂盒(免疫透射比浊法)检测待测样品活性浓度(结果如表4所示)。载脂蛋白AI浓度经计算后为4.08mg/mL，37℃原样浓度为4.28mg/mL，降低5％，SDS-PAGE图谱显示37℃原样纯度仍高于90％，实施例5获得的载脂蛋白AI具有较高的热稳定性。质控品测值在合理范围内，结果可信。
表4免疫比浊法检测载脂蛋白AI活性浓度
以上所述仅是本发明专利的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明专利原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明专利的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于载脂蛋白AI的纳米抗亲和介质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：构建纳米抗工程菌并对菌种进行诱导表达，得重组蛋白包涵体；
S2：将包涵体复性、纯化，得复性后的纳米抗蛋白溶液；
S3：纳米抗与层析介质偶联，具体包括如下步骤：
S31：取环氧活化的介质微球，用纯化水多次重悬抽干后，再用缓冲液多次重悬抽干，最后将介质置换到缓冲液中；
S32：将S2中所得纳米抗蛋白溶液浓缩至1-5mg/mL；
S33：将步骤S31和步骤S32中样品按照1：(0.8-1.5)体积比、20-40℃下温和混匀14-20h后，抽干溶液后纯水清洗，然后加入乙醇胺，室温震荡，再抽干溶液；
S34：加入Tris-HCl清洗后抽干溶液；加入乙酸钠，混匀后抽干溶液；
S35：加入乙醇并于0-10℃下保存，得纳米抗亲和介质偶联物。
2.根据权利要求1所述的纳米抗亲和介质制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述纳米抗工程菌的构建方法，步骤如下：
根据纳米抗蛋白氨基酸序列进行PCR反应，依据反应结束得到的cDNA为模板扩增纳米抗工程菌目的基因；其中，纳米抗蛋白氨基酸序列如SEQNO.1所示；纳米抗工程菌目的基因如SEQNO.2所示；
采用XhoI和HindIII酶切所述扩增片段与载体质粒Pet-21a，T4连接酶将酶切后的载体质粒与扩增片段连接，构建重组表达载体；
将所述重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE)感受态细胞中，转染成功后测序分析验证阳性克隆，得到纳米抗工程菌。
3.根据权利要求1所述的纳米抗亲和介质制备方法，其特征在于，步骤S1中，纳米抗工程菌的诱导表达步骤如下：
将所述纳米抗工程菌接种于LB-Amp固体培养基培养12-16h，挑取单菌落接种于LB-Amp培养基，获得活化种子培养基；
将所述活化种子培养基按照3％(V/V)比例接种于LB-Amp培养基，35-40℃培养至OD600达到0.6-0.8，采用终浓度0.1mM的异丙基硫代半乳糖昔IPTG诱导培养液，30℃诱导8-12h；
将上述培养液加入上样缓冲液悬浮沉淀，超声破碎菌体，超声破碎菌体条件为：功率300W，超声5s间隔5s，重复200次；
诱导全菌液、超声破菌上清液与超声破菌沉淀分别加入4×上样缓冲液，电泳处理进行蛋白表达分析，得到包涵体。
4.根据权利要求3所述纳米抗工程菌的诱导表达，其特征在于，所述上样缓冲液中含有35-65mMNaH2PO4、250-360mM NaCl；且100mL菌液与20-35mL上样缓冲液相结合。
5.根据权利要求3所述的纳米抗亲和介质的制备方法，其特征在于，所述待测样品与4×上样缓冲液的体积比为(2-5):1，煮沸8-20min；采用SDS-PAGE电泳进行蛋白表达分析。
6.根据权利要求1所述的纳米抗亲和介质的制备方法，其特征在于，步骤S2中，包涵体复性、纯化的具体步骤为：
用洗涤缓冲液洗涤包涵体后离心去除上清，然后溶解于变性缓冲液，包涵体与变性缓冲液添加量比例为1:8-12；再搅拌离心，得变性后的包涵体；
采用稀释法对变性溶解后的包涵体进行复性；并在变性条件下对包涵体进行分离纯化，收集洗脱峰后过柱，得到复性的纳米抗蛋白溶液。
7.根据权利要求6所述的纳米抗亲和介质的制备方法，其特征在于，所述的洗涤缓冲液是pH7.0-8.5、含有50mM Tris、1-3mM EDTA的1-3M尿素；
所述的变性缓冲液是pH8-9、含有20mM Tris的7-10M脲。
8.根据权利要求1所述的纳米抗亲和介质的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述的缓冲液中含有0.1-0.5M NaHCO3与0.2-0.7M NaCl，置换液pH为8-9。
9.一种载脂蛋白AI的纯化方法，其特征在于，采用权利要求1-8中任一所述的方法制备得到的纳米抗亲和介质作为层析介质。
10.根据权利要求9所述的载脂蛋白AI的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将纳米抗亲和介质偶联物装入层析柱，用缓冲液过柱平衡；
S2：调节载脂蛋白AI溶液pH至7-8，上样后用缓冲液淋洗至基线；
S3：采用pH为1-3的柠檬酸洗脱，收集洗脱峰。
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