CN116626218A - 一种柴胡的指纹图谱及其构建方法和应用 - Google Patents

一种柴胡的指纹图谱及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种柴胡的指纹图谱及其构建方法和应用，属于中药质量控制技术领域。该柴胡的指纹图谱，包括7个柴胡抗抑郁成分的特征峰，按照所述特征峰的出峰先后顺序依次为：柴胡皂苷C、柴胡皂苷F、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷E、6″‑O‑乙酰基柴胡皂苷A和柴胡皂苷D。柴胡指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：将柴胡提取液通过高效液相色谱分析，以乙腈作为流动相A，水作为流动相B进行梯度洗脱。本发明还提出一种上述柴胡的指纹图谱或者上述构建方法构建的指纹图谱在柴胡质量控制中的应用。本发明获得了以柴胡抗抑郁活性为导向的指纹图谱和含量测定，可以该指纹图谱进行药材质量控制，具有较高的准确性和专属性。

Description

一种柴胡的指纹图谱及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及中药质量控制技术领域，具体涉及一种柴胡的指纹图谱及其构建方法和应用。
背景技术
柴胡始载于《神农本草经》，“柴胡，味苦，平。主心腹，去肠胃中结气，饮食积聚，寒热邪气，推陈出新。久服，轻身，明目，益精。一名地熏。生川谷。”2020版药典规定柴胡为伞形科植物柴胡(Bupleurum chinense DC.)或狭叶柴胡(Bupleurum scorzonerifoliumWilld.)的干燥根。其味辛苦，性微寒，归肝、胆、肺经，具有疏散退热，疏肝解郁，升举阳气之功，用于治疗感冒发热，寒热往来，胸胁胀痛，月经不调，子宫脱垂，脱肛。柴胡为多个抗抑郁疗效明确的复方如《伤寒论》中四逆散、《太平惠民和剂局方》中逍遥散、《景岳全书》中柴胡疏肝散等的君药。本发明以柴胡为对象，建立了一种基于抗抑郁活性导向的柴胡综合质量控制方法。
柴胡主要含有皂苷类、多糖类、黄酮类、木脂素类等成分，现代药理研究表明柴胡具有解热、镇痛、抗抑郁、抗炎、护肝、护心、护肾、抗肿瘤、免疫增强等多种作用(李月阳,等.柴胡的现代药理作用研究进展[J].海南医学院学报,2022,28(22):1748-1754.)，故发挥其不同药理作用的物质基础应有所差异，评价其质量的方法应与其药理活性相对应。然而，目前未见针对柴胡抗抑郁作用的质量控制方法。
柴胡皂苷类成分被认为是柴胡抗抑郁的主要有效成分，但多数为关于柴胡皂苷A、柴胡皂苷D的报道，其他柴胡皂苷成分的抗抑郁作用尚未清晰。大量文献多通过测定柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的含量或指纹图谱的方法对柴胡进行质量控制，这使质量控制与评价研究与药理作用脱节(于健东,等.HPLC法测定柴胡中柴胡皂苷的含量及皂苷类成分指纹图谱初步研究[J].中国中医药信息杂志,2004,11(2):137-138/闵宇航,等.柴胡饮片皂苷类成分变化及质量控制研究[J].药物分析杂志,2014,34(5):836-843.)。缺乏以活性为导向的质量控制方法严重制约了临床治疗抑郁症精准用药及建立专属有效的中药标准。缺乏治疗抑郁症的柴胡活性成分的指纹图谱以及该指纹图谱的构建方法。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术不足，提供一种柴胡的指纹图谱及其构建方法和应用，解决现有技术中缺乏针对治疗抑郁症的柴胡活性成分的指纹图谱的技术问题。
为达到上述技术目的，本发明的技术方案提供一种柴胡的指纹图谱，包括7个柴胡抗抑郁成分的特征峰，按照所述特征峰的出峰先后顺序依次为：柴胡皂苷C、柴胡皂苷F、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷E、6″-O-乙酰基柴胡皂苷A和柴胡皂苷D；
所述柴胡皂苷A的结构式为：
所述柴胡皂苷B2的结构式为：
所述胡皂苷C的结构式为：
所述柴胡皂苷D的结构式为：
所述柴胡皂苷E的结构式为：
所述柴胡皂苷F的结构式为：
所述6″-O-乙酰基柴胡皂苷的结构式为：
此外，本发明还提出一种上述柴胡指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
将柴胡提取液通过高效液相色谱分析，以乙腈作为流动相A，水作为流动相B进行梯度洗脱。
进一步地，柱温为25-35℃，流速为0.5-1.0mL/min。
进一步地，进样体积10-12μL。
进一步地，检测波长为210-230nm。
进一步地，所述梯度洗脱的程序为：0～5min，体积浓度为25％～33％的流动相A；5～10min，体积浓度为33％～35％的流动相A；10～20min，体积浓度为35％～35％的流动相A；20～35min，体积浓度为35％～38％的流动相A；35～43min，体积浓度为38％～43％的流动相A；43～50min，体积浓度为43％～43％的流动相A；50～55min，体积浓度为43％～50％的流动相A；55～60min，体积浓度为50％～90％的流动相A。
进一步地，采用的色谱柱：长度220-250mm，直径4.0-4.6mm，粒径4-5μm。
进一步地，还包括对照溶液的制备：将对照品柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C、柴胡皂苷D、柴胡皂苷E、柴胡皂苷F和6″-O-乙酰基柴胡皂苷A分别与甲醇混合配制成对照溶液。
进一步地，所述柴胡提取液由以下步骤制得：将0.5-0.6g柴胡粉末与25-30mL含0-5％浓氨试液的70-90％甲醇溶液，30-35℃下超声之后过滤得到滤液，将滤液蒸发得到残渣，将残渣加70-80％甲醇溶解并定容至5mL容量瓶，超声之后离心得上清液，将所述上清液过滤膜制得柴胡提取液。
进一步地，30-35℃下超声的功率为200-250W，频率为35-40kHz，时间为30-35min。
此外，本发明还提出一种上述柴胡的指纹图谱或者上述构建方法构建的指纹图谱在柴胡质量控制中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明提出的指纹图谱，包括7个柴胡抗抑郁成分，获得了以柴胡抗抑郁活性为导向的指纹图谱和含量测定，可以该指纹图谱进行药材质量控制，具有较高的准确性和专属性。
本发明提出的构建方法建立了一种同时测定7个柴胡抗抑郁成分：柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C、柴胡皂苷D、柴胡皂苷E、柴胡皂苷F、6″-O-乙酰基柴胡皂苷A含量的方法，保障柴胡药材的临床使用的精准性。
附图说明
图1是本发明实施例1测得的12批柴胡样品的指纹图谱。
图2是本发明实施例1中12批柴胡样品对照图谱。
图3是本发明实施例1的混合对照品溶液(A)和柴胡药材(B)HPLC图。
具体实施方式
本具体实施方式提供了一种柴胡的指纹图谱，包括7个柴胡抗抑郁成分的特征峰，按照所述特征峰的出峰先后顺序依次为：柴胡皂苷C、柴胡皂苷F、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷E、6″-O-乙酰基柴胡皂苷A和柴胡皂苷D；
所述柴胡皂苷A的结构式为：
所述柴胡皂苷B2的结构式为：
所述胡皂苷C的结构式为：
所述柴胡皂苷D的结构式为：
所述柴胡皂苷E的结构式为：
所述柴胡皂苷F的结构式为：
所述6″-O-乙酰基柴胡皂苷的结构式为：
本具体实施方式还提出一种上述柴胡指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
将柴胡提取液通过高效液相色谱分析，以乙腈作为流动相A，水作为流动相B进行梯度洗脱，柱温为25-35℃，流速为0.5-1.0mL/min，进样体积10-12μL，检测波长为210-230nm；采用的色谱柱：长度220-250mm，直径4.0-4.6mm，粒径4-5μm；
还包括对照溶液的制备：将对照品柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C、柴胡皂苷D、柴胡皂苷E、柴胡皂苷F和6″-O-乙酰基柴胡皂苷A分别与甲醇混合配制成对照溶液。
在某些实施例中，所述梯度洗脱的程序为：0～5min，体积浓度为25％～33％的流动相A；5～10min，体积浓度为33％～35％的流动相A；10～20min，体积浓度为35％～35％的流动相A；20～35min，体积浓度为35％～38％的流动相A；35～43min，体积浓度为38％～43％的流动相A；43～50min，体积浓度为43％～43％的流动相A；50～55min，体积浓度为43％～50％的流动相A；55～60min，体积浓度为50％～90％的流动相A。
在某些实施例中，所述柴胡提取液由以下步骤制得：将0.5-0.6g柴胡粉末与25-30mL含0-5％浓氨试液的70-90％甲醇溶液，30-35℃下超声之后过滤得到滤液，将滤液蒸发得到残渣，将残渣加70-80％甲醇溶解并定容至5mL容量瓶，超声之后离心得上清液，将所述上清液过滤膜制得柴胡提取液；30-35℃下超声的功率为200-250W，频率为35-40kHz，时间为30-35min；超声之后离心得上清液中超声的功率为200-250W，频率为35-40kHz，时间为5-7min。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1实验材料
1.1仪器
Waters e2695(美国waters公司)，2498UV/Vis检测器，ME204型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，FW135型粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)，KQ5200DV型数控超声清洗仪器(昆山市超声仪器有限公司)，Mini-Q Intergral纯水系统(美国Millipore公司)，X3R型冷冻离心机(Thermo Fisher公司)，RE-52A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂，中国)，VM-96EB型旋涡混合器(JEIO TECH公司，韩国)。
1.2试药
样品柴胡，选自柴胡道地产区(甘肃、山西和内蒙古)，见表1。对照品柴胡皂苷A(批号P03M9F50593)、柴胡皂苷D(批号P26N11F132137)、6″-O-乙酰基柴胡皂苷A(批号Z02A10L94589)和柴胡皂苷E(批号M28GB150097)购于上海源叶生物科技有限公司；柴胡皂苷C(批号wkq21101907)、柴胡皂苷F(批号wkq21070102)、柴胡皂苷B2(批号wkq21070611)和购于四川维克奇生物科技有限公司；以上标准品质量分数均≥98.00％。HPLC纯甲醇、乙腈购于美国Thermo Scientific公司；其他试剂均为分析纯。
表1柴胡生药材产地批次
2实验方法
2.1供试品溶液的制备
柴胡粉碎后过4号筛，精密称定柴胡粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，加入25mL含3％浓氨试液的70％甲醇溶液，密塞，30℃超声(功率200W，频率40kHz)30min，过滤，用20mL70％甲醇分2次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，用水浴锅蒸发溶剂，残渣加70％甲醇溶解并定容至5mL容量瓶，超声(功率200W，频率40kHz)5min，离心、取上清液，过0.45μm滤膜供HPLC分析。
2.2对照品溶液的制备
称取对照品柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C、柴胡皂苷D、柴胡皂苷E、柴胡皂苷F、6″-O-乙酰基柴胡皂苷A适量，精密称定，以70％甲醇配制成分浓度分别为0.491mg/mL、0.010mg/mL、0.100mg/mL、0.499mg/mL、0.019mg/mL、0.052mg/mL、0.101mg/mL。
2.3色谱条件
Venusil XBP C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相乙腈(A)-水(B)梯度洗脱(0～5min，25％～33％A；5～10min，33％～35％A；10～20min，35％～35％A；20～35min，35％～38％A；35～43min，38％～43％A；43～50min，43％～43％A；50～55min，43％～50％A；55～60min，50％～90％A)，柱温35℃，流速为1.0mL/min，进样体积10μL，检测波长210nm。
3实验结果
3.1指纹图谱方法学考察
3.1.1精密度实验
取同一批次药材，按照“2.1”项制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下，连续进样6次。测得13个共有峰相对保留时间RSD均小于0.2％，相对峰面积RSD均小于3.0％(结果见表2和表3)，表明仪器精密度良好。
表2精密度实验中各共有峰相对保留时间结果
表3精密度实验中各共有峰相对峰面积结果
3.1.2稳定性实验
取同一批次药材，按照“2.1”项制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下，分别于0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h进样。测得13个共有相对保留时间RSD均小于0.2％，峰相对峰面积RSD均小于3.0％(见表4和表5)，表明供试品溶液在24h内稳定。
表4稳定性实验中各共有峰相对保留时间结果
表5稳定性实验中各共有峰相对峰面积结果
3.1.3重复性实验
取同一批次药材，按“2.1”项下的制备方法平行制备6份供试品溶液，在”2.3”项色谱条件下重复进样。测得13个共有相对保留时间RSD均小于0.10％，峰相对峰面积RSD均小于3.0％(见表6和表7)，说明方法重复性良好。
表6重复性实验中相对保留时间结果
表7重复性实验中相对峰面积结果
3.2指纹图谱的建立
取12批柴胡样品，按“2.1”项下的方法制备供试品溶液，按”2.3”项下色谱条件进行HPLC指纹图谱测定，依次导入国家药典委员会研制的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004版本)中，进行全谱峰匹配，确定共有峰并进行分析，得到相应的色谱指纹图谱，见图1。在12批柴胡样品色谱图中共发现13个共有峰，因柴胡皂苷A是柴胡抗抑郁的主要活性成分之一，且柴胡皂苷A峰面积较大且稳定，所以选择柴胡皂苷A作为参照峰。
3.3指纹图谱相似度计算
将12批柴胡样品的高效液相色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统2004A版”进行数据分析，建立柴胡提取物的共有模式，生成柴胡的对照图谱，见图2。经与对照品保留时间比较，共指认7个共有峰，即3号峰为柴胡皂苷C、4号峰为柴胡皂苷F、6号峰为柴胡皂苷A、7号峰为柴胡皂苷B2、9号峰为柴胡皂苷E、10号峰为6″-O-乙酰基柴胡皂苷A、13号峰为柴胡皂苷D。所得12批样品的相似度分析结果见表8，12批柴胡药材的相似度均大于0.970。
表8 12批柴胡药材相似度
3.4抗抑郁活性成分含量测定
3.4.1系统适应性考察
按“2.2”项下制备混合对照品溶液；取同一批柴胡药材，按“2.1”项下制备柴胡供试品溶液；按“2.3”项下色谱条件分别进样，得到柴胡混合对照品HPLC图和柴胡样品溶液HPLC图(图3)。结果显示，抗抑郁活性成分柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C、柴胡皂苷D、柴胡皂苷E、柴胡皂苷F、6″-O-乙酰基柴胡皂苷A之间分离度良好，相邻色谱峰间分离度均大于1.50，表明样品测定无干扰。
3.4.2线性关系考察
精密吸取混合对照品溶液2、5、10、20、25、40μL分别注入高效液相色谱仪，测定相应条件下的峰面积。以峰面积为纵坐标，以浓度(μg/μL)为横坐标，制得标准曲线并计算相对应的回归方程及线性范围，见表9，浓度和峰面积存在线性关系。
表9 7个柴胡抗抑郁活性成分的规格方程﹑线性相关系数及线性范围
3.4.3精密度实验
取同一批次药材，按照“2.1”项制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下，连续进样6次，测得7个成分的峰面积RSD均小于3.00％(结果见表10)，表明仪器精密度良好。
表10 7个柴胡抗抑郁活性成分的精密度实验结果
3.4.4稳定性实验
取同一批次药材，按照“2.1”项制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下，分别于0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h进样，测得7个成分的峰面积RSD均小于3.00％(结果见表11)，表明供试品溶液在24h内稳定。
表11 7个柴胡抗抑郁活性成分的稳定性实验结果
3.4.5重复性实验
取同一批次药材，按“2.1”项下的制备方法平行制备6份供试品溶液，按”2.3”项色谱条件下重复进样。测得7个成分的峰面积均RSD小于2.60％(结果见表12)，说明该含量测定方法重复性良好。
表12 7个柴胡抗抑郁活性成分的重复性实验结果
3.4.6加样回收率
平行精密称取6份已知成分含量的柴胡供试品0.25g，分别加入与样品含量相当的对照品溶液，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件下进样，测定柴胡皂苷C、柴胡皂苷F、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷E、6″-O-乙酰柴胡皂苷A、柴胡皂苷D 7个柴胡抗抑郁活性成分的回收率，结果见表13，回收率分别为98.48％、96.56％、100.91％、94.28％、94.33％、98.23％和90.74％。
表13 7个柴胡抗抑郁活性成分的加样回收率结果
3.4.6含量测定
分别取12批柴胡药材，按“2.1”项下制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件下进行含量测定，利用外表法计算样品中柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C、柴胡皂苷D、柴胡皂苷E、柴胡皂苷F、6″-O-乙酰柴胡皂苷A的含量，结果见表14。
表14柴胡样品中7个抗抑郁活性成分的含量测定结果(mg/g，n＝2)
4提取与分离条件优化
4.1提取条件的考察
该实验考察了不同提取条件下，各成分的分离度。
(1)在“2.1”的供试品制备方法中，采用了纯水提取药材和甲醇提取药材的方法，纯水提取方法会导致生药材中柴胡皂苷B2的峰面积较低，为了提高柴胡皂苷B2的峰面积，则选择了使用甲醇提取的方法；
(2)同时在“2.3”的供试品制备方法中，采用了90％甲醇和70％甲醇的提取方法，两种提取条件的谱图保留时间与色谱峰的分离及峰型差异性不大，但由于柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C、柴胡皂苷D、柴胡皂苷E、柴胡皂苷F、6″-O-乙酰柴胡皂苷A的峰面积更加稳定。则选择了70％的甲醇溶液的提取方法。
(3)在“2.3”的供试品制备方法中，由于出现拖尾峰的影响，考察了不加浓氨的70％甲醇溶液、3％浓氨的70％甲醇溶液和5％浓氨的70％甲醇溶液，由于浓氨溶液的含量降低，出现拖尾峰的情况也有很大的好转，所以最终选择了3％浓氨的70％甲醇溶液。
4.2洗脱条件的选择
本实验中采取的是梯度洗脱方法，尝试了多种洗脱梯度，例如
(1)纯水(A)-乙腈(B)0～50min，25％～90％A；
(2)纯水(A)-乙腈(B)0～5min，25％～33％A；5～10min，33％～35％A；10～20min，35％～35％A；20～35min，35％～38％A；35～43min，38％～43％A；43～50min，43％～43％A；50～55min，43％～50％A；55～60min，50％～90％A；结果发现以洗脱梯度(2)的分离度最好，得到色谱峰信息最多，且样品的保留时间稳定，则选择了洗脱梯度(2)。
4.3柱温的选择
该实验在相同的实验条件下，考察了柱温对色谱分离效果的影响，考察了25℃、30℃和35℃对色谱分离的影响，结果发现35℃的柱温对于目标峰有较好的分离度，故最终选择了35℃的柱温。
4.4流速的参考
在相同的实验条件下，为了探查流速对目标峰分离效果的影响，考察了0.5mL/min和1.0mL/min的流速对色谱分离的影响，结果发现1.0mL/min的流速拥有较好的分离度，故最终选用1.0mL/min的流速。
4.5检测波长的考察
在相同的实验条件下，本实验参考了不同的检测波长对于色谱峰的影响，分别参考检测波长为210nm和230nm时的峰面积及峰形，结果发现检测波长在210nm时的峰面积和峰形最好，故选用210nm作为检测波长。
4.6参照物的选择
前期柴胡抗抑郁活性成分研究表明，柴胡皂苷A是柴胡抗抑郁的主要活性成分之一，故选择峰面积较大、保留时间居中、且最稳定的柴胡皂苷A作为参照物。
其他有益效果：
(1)由于现有的柴胡药材质量控制方法缺乏与药理作用相联系，评价体系的准确性和专属性较差，本发明通过以柴胡抗抑郁活性为导向的指纹图谱和含量测定进行药材质量控制，具有较高的准确性和专属性。
(2)文献报道多测定柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的含量，与此相比，本发明首次建立了一种同时测定7个柴胡抗抑郁成分：柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C、柴胡皂苷D、柴胡皂苷E、柴胡皂苷F、6″-O-乙酰基柴胡皂苷A含量的方法，保障柴胡药材的临床使用的精准性。
(3)本发明采用超声法制备供试品溶液和对照品溶液，利用高效液相色谱(HPLC)技术，经采集12批柴胡样品的色谱图，建立了以抗抑郁作用为导向的柴胡指纹图谱，同时测定了7个柴胡抗抑郁成分：柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C、柴胡皂苷D、柴胡皂苷E、柴胡皂苷F、6″-O-乙酰基柴胡皂苷A的含量。本发明弥补了以往柴胡质量控制与其抗抑郁成分关联性缺乏的不足，为柴胡原料生产、产地加工，中药饮片及柴胡类抗抑郁中成药的制备及质量控制提供了科学客观的评价方法。以此建立相关指纹图谱及含量方法，从而有效解决柴胡药材质量控制方法与药理作用脱节的问题，为柴胡原料生产、产地加工，中药饮片及柴胡类抗抑郁中成药的制备及质量控制提供了科学客观的评价方法。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种柴胡的指纹图谱，其特征在于，包括7个柴胡抗抑郁成分的特征峰，按照所述特征峰的出峰先后顺序依次为：柴胡皂苷C、柴胡皂苷F、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷E、6″-O-乙酰基柴胡皂苷A和柴胡皂苷D；
所述柴胡皂苷A的结构式为：
所述柴胡皂苷B2的结构式为：
所述胡皂苷C的结构式为：
所述柴胡皂苷D的结构式为：
所述柴胡皂苷E的结构式为：
所述柴胡皂苷F的结构式为：
所述6″-O-乙酰基柴胡皂苷的结构式为：
2.一种权利要求1所述的柴胡指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将柴胡提取液通过高效液相色谱分析，以乙腈作为流动相A，水作为流动相B进行梯度洗脱。
3.根据权利要求2所述的柴胡指纹图谱的构建方法，其特征在于，柱温为25-35℃，流速为0.5-1.0mL/min；和/或，进样体积10-12μL。
4.根据权利要求2所述的柴胡指纹图谱的构建方法，其特征在于，检测波长为210-230nm。
5.根据权利要求2所述的柴胡指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：0～5min，体积浓度为25％～33％的流动相A；5～10min，体积浓度为33％～35％的流动相A；10～20min，体积浓度为35％～35％的流动相A；20～35min，体积浓度为35％～38％的流动相A；35～43min，体积浓度为38％～43％的流动相A；43～50min，体积浓度为43％～43％的流动相A；50～55min，体积浓度为43％～50％的流动相A；55～60min，体积浓度为50％～90％的流动相A。
6.根据权利要求2所述的柴胡指纹图谱的构建方法，其特征在于，采用的色谱柱：长度220-250mm，直径4.0-4.6mm，粒径4-5μm。
7.根据权利要求2所述的柴胡指纹图谱的构建方法，其特征在于，还包括对照溶液的制备：将对照品柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C、柴胡皂苷D、柴胡皂苷E、柴胡皂苷F和6″-O-乙酰基柴胡皂苷A分别与甲醇混合配制成对照溶液。
8.根据权利要求2所述的柴胡指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述柴胡提取液由以下步骤制得：将0.5-0.6g柴胡粉末与25-30mL含0-5％浓氨试液的70-90％甲醇溶液，30-35℃下超声之后过滤得到滤液，将滤液蒸发得到残渣，将残渣加70-80％甲醇溶解并定容至5mL容量瓶，超声之后离心得上清液，将所述上清液过滤膜制得柴胡提取液。
9.根据权利要求8所述的柴胡指纹图谱的构建方法，其特征在于，30-35℃下超声的功率为200-250W，频率为35-40kHz，时间为30-35min。
10.一种权利要求1所述的柴胡的指纹图谱或者权利要求2-9任一项所述的构建方法构建的指纹图谱在柴胡质量控制中的应用。
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