CN116478879A - 一种用于降解除虫脲的菌株及其应用 - Google Patents
一种用于降解除虫脲的菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于降解除虫脲的菌株及其应用，具体涉及微生物技术领域。所述菌株经鉴定为阿氏芽孢杆菌，命名为除虫脲降解菌株AMRL‑7，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2021年5月28日，保藏编号为GDMCCNO:61704。所述菌株在降解水体环境中苯甲酰脲类杀虫剂中的应用。本发明的降解菌剂可以用发酵工业通用发酵设备进行生产，具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合治理水体环境中苯甲酰脲类杀虫剂造成的污染；本发明对于保护生态环境，降低杀虫剂对水体的药害，保护人民的身体健康，提高水产品的附加值具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种用于降解除虫脲的菌株及其应用。
背景技术
水产养殖过程离不开杀虫剂的使用，主要用于杀灭或驱除水生动物体内外寄生虫及敌害生物等，避免造成较大的水产养殖经济损失。近年来，为有效控制水产养殖过程中的病虫害，部分农药以杀虫剂等被广泛应用于养殖生产中。在水产养殖中使用的杀虫剂主要为苯甲酰脲类杀虫剂，这类杀虫剂尽管在农业上已获得使用批准，但在水产养殖中未经批准，仍存在大量使用现象。苯甲酰脲类杀虫剂中的除虫脲(Diflubenzuron，DFB)，不仅被广泛用于植物防治鳞翅目害虫，同时也被用于鱼类寄生虫病的防治，主要用于淡水鱼的车轮虫病的防治。但由于除虫脲在施用中药效速度较慢、残效期较长等问题，已经直接影响到人类的身体健康。而对氯苯胺、对氯苯基脲作为除虫脲的降解产物，已被证明具有一定的毒性。
苯甲酰脲类杀虫剂的降解主要有物理法、化学法和微生物法。其中，微生物法因其无二次污染、成本低等特点成为苯甲酰脲类杀虫剂降解的主要方法。国内外对微生物法降解苯甲酰脲类杀虫剂的研究主要集中于灭幼脲和氟铃脲，降解菌主要集中于青霉菌、曲霉菌及红球菌等霉菌，尚未见对除虫脲降解菌株的研究及应用。
发明内容
为此，本发明提供一种用于降解除虫脲的菌株及其应用，以解决现有除虫脲降解菌研究少的问题。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
根据本发明第一方面提供的一种用于降解除虫脲的菌株，所述菌株经鉴定为阿氏芽孢杆菌，命名为除虫脲降解菌株AMRL-7，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2021年5月28日，保藏编号为GDMCC NO:61704。
进一步的，所述菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
根据本发明第二方面提供的如上述的菌株在降解苯甲酰脲类杀虫剂中的应用。
进一步的，所述菌株在降解水体环境中苯甲酰脲类杀虫剂中的应用。
进一步的，所述苯甲酰脲类杀虫剂为除虫脲。
根据本发明第三方面提供的一种利用上述菌株生产的降解苯甲酰脲类杀虫剂的菌剂。
进一步的，所述菌剂中菌体数量为2×107～8×107CFU/mL。
根据本发明第四方面提供的一种降解苯甲酰脲类杀虫剂的方法，包括利用上述菌剂，稀释后降解水体中苯甲酰脲类杀虫剂。
作为示例：将除虫脲降解菌株于LB培养基接种，恒温振荡(30℃、150r/min)培养12h，以6000r/min的转速下离心10mL菌液，弃上清液，AMRL-7沉淀菌体备用。以50mg/L除虫脲为起始浓度，接种菌体量1％，
进一步的，降解条件为：30℃、pH＝7、接种浓度为6×107CFU/mL；该菌7天内可对50mg/L除虫脲降解效率达90.23％。
本发明具有如下优点：
本发明经分离筛选获得菌株为阿氏芽孢杆菌，命名为除虫脲降解菌株AMRL-7，可以用于水体环境中残留的除虫脲这种苯甲酰脲类杀虫剂；该菌株制备的降解菌剂能降解除虫脲，本菌剂可在短时间内使水体环境中残留的除虫脲的降解率达90％以上，消除水产品中的除虫脲残留，解决除虫脲对水体环境和人体健康的危害问题。
本发明的降解菌剂可以用发酵工业通用发酵设备进行生产，具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合治理水体环境中苯甲酰脲类杀虫剂造成的污染；本发明对于保护生态环境，降低杀虫剂对水体的药害，保护人民的身体健康，提高水产品的附加值具有重要的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例2提供的不同温度梯度对除虫脲降解菌AMRL-7降解效率的影响图；
图2为本发明实施例2提供的不同pH对菌株AMRL-7降解效率的影响图；
图3为本发明实施例2提供的不同接种浓度对菌株AMRL-7降解效率的影响图；
图4为本发明实施例3提供的7d内菌株AMRL-7对除虫脲的降解图；
图5为本发明实施例4提供的菌株AMRL-7在模拟养殖废水中的应用效果图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
菌种保藏说明：本发明的用于降解除虫脲的菌株阿氏芽孢杆菌Bacillusaryabhattai，Bacillus aryabhattai AMRL-7，于2021年5月28日，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，其保藏编号为GDMCC NO:61704。
Bacillus aryabhattaiAMRL-7--除虫脲降解菌株AMRL-7
活性污泥来源为江苏省无锡市某水产养殖公司水产养殖区底泥。
培养基和试剂为：
无机盐(MSM)培养基(g/L):K2HPO42g，KH2PO41g，NH4Cl 1g，NaCl0.08g，MgSO4·7H2O0.2g，pH 7.0-7.2。
LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10g，酵母5g，NaCl 8g，pH 7.0-7.2。
除虫脲标准储备溶液：准确称取适量除虫脲标准品(精确至0.1mg)，用乙腈配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备液，置-18℃冰箱中保存。根据需要用乙腈将标准储备溶液稀释成适当浓度的标准工作液。
实施例1
本实施例提供一种降解除虫脲的菌株分离筛选：
1.污泥中菌群富集
取5g养殖区污泥加入100mL MSM培养基的培养瓶中进行微生物群落的富集，使其唯一碳源为50mg/L除虫脲，培养条件为30℃、150r/min，恒温避光震荡培养7d，其后每7d以10％(v/w)接入新鲜MSM培养基，同时培养瓶中除虫脲浓度提高1倍，连续7d传代4次，最终使富集物中的磺胺甲恶唑浓度达到300mg/L。
2.除虫脲降解菌的分离
选择耐受除虫脲浓度为300mg/L的第4代富集样品开展除虫脲降解菌的分离。涂布100μL第4代富集菌液在MSM固体平板上(含100mg/L除虫脲)，划线培养并挑选菌落，经连续多次划线，纯化分离除虫脲降解菌。纯化分离后的除虫脲降解菌株进行基因组提取，纯化回收，进行16S rDNA序列扩增，产物回收后进行测序，获得的降解菌序列进行多序列比对分析，并进行系统发育树的构建。
3.除虫脲降解菌的鉴定及初步降解研究
将除虫脲降解菌株于LB培养基接种，恒温振荡(30℃、150r/min)培养7d，以6000r/min的转速下离心10mL菌液，弃上清液，AMRL-7沉淀菌体备用。以50mg/L除虫脲为起始浓度，接种菌体量1％，研究除虫脲降解菌对除虫脲的降解效果。除虫脲残留检测的高效液相色谱(Agilent 1290，USA)条件为，采用Kinetex XB C18柱(100mm×2.1mm，2.6μm)；流动相A为0.1％甲酸(V/V)，B为甲醇；进样20μL；柱温30℃；流速0.3mL/min。通过除虫脲标准曲线换算出培养液中除虫脲浓度，计算菌株降解能力。
于第4代次富集菌液中分离到7株除虫脲降解菌，如表1所示。
表1复合系中分离筛选的菌株
由表1可见，AMRL-7降解效果相对较好，7天内对50mg/L的除虫脲降解率达84.50％，因此，对除虫脲降解菌株AMRL-7进行形态学、生理生化等鉴定。经检测，菌株AMRL-7菌落表面光滑，边缘整齐，呈短杆状，革兰氏染色阳性。菌株AMRL-7的基因序列提交GenBank数据库，比对结果表明，AMRL-7与Bacillus aryabhattai B8W22相似性为99.86％。因此，初步将除虫脲降解菌株AMRL-7鉴定为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)。
实施例2
本实施例提供一种除虫脲降解菌的降解调节对比：本实施例主要从培养温度、pH值和接种量三个方面进行考察。
实验方法：以NaCl溶液(0.9％)洗AMRL-7降解菌3次，配置为菌悬液(OD600约为1)。AMRL-7菌悬液以1％接种量接种至含50mg/L的除虫脲无机盐培养基中。分别在不同降解条件下以150rpm恒温振荡培养7d。每个取样点离心6min后(转速8000rpm)，取上清液测定SMX的浓度，计算降解率。除虫脲残留检测与实施例1方法相同。
优化降解条件：培养温度(15、20、25、30、35和40℃)，培养基初始pH(5、6、7、8和9)，初始接种量(2×107、3×107、6×107、8×107和10×107CFU/mL)。
1.不同温度梯度对除虫脲降解菌AMRL-7降解效率的影响
如图1所示，菌株AMRL-7温度耐受性较好，在15-40℃间均可降解除虫脲，降解效率最高为30℃，达85.3％。
2.不同pH对菌株AMRL-7降解效率的影响
如图2所示，AMRL-7在pH 5-9范围内均可降解除虫脲，最适pH值为7，最高降解效率达到了87.8％。
3.不同接种浓度对菌株AMRL-7降解效率的影响
如图3所示，菌株AMRL-7降解效率最高为接种浓度6×107cfu/mL时，降解率达86.1％，但接种浓度在2-8×107cfu/mL内降解率均超80％，由此，初始接种量对菌株AMRL-7降解除虫脲的效率影响较低。
实施例3
本实施例了提供除虫脲降解菌降解特性研究：在降解条件最优情况下(30℃、pH7、接种浓度为6×107cfu/mL)，研究了7d内菌株AMRL-7对除虫脲的降解情况。
实验方法：与实施例2方法相同。
如图4所示，菌株AMRL-7对除虫脲的降解在1-4d内降解效率较高，降解效率与菌体生长浓度正相关。5-7d，菌株AMRL-7的菌体生长进入平台期，随时间增加，降解速率逐步递减。7d内菌株AMRL-7对50mg/L的除虫脲降解率达90.23％。
实施例4
本实施例提供菌株AMRL-7在模拟养殖废水中的应用效果研究：
取水产养殖公司养殖池排放污水，水样添加50mg/L的除虫脲，于最佳降解条件下对养殖废水进行了降解效果研究，降解及检测方法与实施例2相同，如图5所示，在7d时对除虫脲降解率最高，达到了85.31％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种用于降解除虫脲的菌株，其特征在于，所述菌株经鉴定为阿氏芽孢杆菌，命名为除虫脲降解菌株AMRL-7，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2021年5月28日，保藏编号为GDMCCNO:61704。
2.根据权利要求1所述一种用于降解除虫脲的菌株，其特征在于，所述菌株的16SrDNA的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
3.如权利要求1或2的菌株在制备降解苯甲酰脲类杀虫剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述菌株在降解水体环境中苯甲酰脲类杀虫剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述苯甲酰脲类杀虫剂为除虫脲。
6.一种利用权利要求1所述菌株生产的降解苯甲酰脲类杀虫剂的菌剂。
7.根据权利要求6所述菌剂，其特征在于，所述菌剂中菌体数量为2×107～8×107CFU/mL。
8.一种降解苯甲酰脲类杀虫剂的方法，其特征在于，包括利用权利要求6的菌剂，稀释后降解水体中苯甲酰脲类杀虫剂。
9.根据权利要求8所述一种降解苯甲酰脲类杀虫剂的方法，其特征在于，降解条件为：30℃、pH＝7、接种浓度为6×107CFU/mL。
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