CN116438317A - 基因多态性检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的主要课题在于，提供迅速且对被检者的侵入性低的ApoE基因多态性的新的检测方法。作为本发明，可列举例如：一种基因多态性检测方法，其用于检测采自被检者的基因组DNA中存在的载脂蛋白E的基因多态性，所述方法包括下述的步骤1～3。步骤1：制作使DNA从唾液游离而成的被检体；步骤2：向包含该DNA的被检体中添加(1)PCR酶、(2)用于扩增载脂蛋白E基因的核酸片段的PCR引物对、以及(3)具有用于检测载脂蛋白E的基因多态性的寡核苷酸的荧光标记探针组并进行混合；和，步骤3：进行PCR，从其PCR产物测定与载脂蛋白E的基因多态性对应的荧光强度。

Description

基因多态性检测方法
技术领域
本发明属于基因多态性检测方法的技术领域。本发明涉及检测载脂蛋白E(以下也称为“ApoE”。)基因的多态性的方法。详细而言，本发明涉及由唾液等外分泌液检测ApoE基因多态性的方法。
背景技术
ApoE是由299个氨基酸构成的分子量34200Da的蛋白质。其ApoE基因有ε2、ε3和ε4等位基因(allele)，存在由各基因编码的3种主要异形体ApoE2、ApoE3、ApoE4。这些的第112位和第158位这2个位点的氨基酸残基不同，ApoE2中为Cys/Cys，ApoE3中为Cys/Arg，ApoE4中为Arg/Arg。这些中，第112位的氨基酸残基为Cys、第158位的氨基酸残基为Arg的ApoE3为野生型，频率最高。ApoE2和ApoE4为突变型。
ApoE是与胆固醇运载、脂蛋白代谢等脂质代谢相关的分子，参与肝脏脂肪酶、脂蛋白脂肪酶、卵磷脂-胆固醇酰基转移酶等脂质代谢酶的活化。
与阿尔茨海默型痴呆症(AD)的发病、认知功能障碍(MCI等)相关的风险基因已经报道了很多，其中，ApoE是风险最高的基因。并且，在高龄发病AD中，已确认ApoE4的频率高，报道了ApoE2的频率低。进而还已知，在女性的情况下，在低龄发病型、高龄发病型中ApoE4的频率大致相同，而在男性的情况下，高龄发病型的ApoE4的频率高于低龄发病型，ApoE4/4会使AD的发病年龄提前5～10岁左右，具有ApoE4/4的AD患者对AD治疗药的反应性差且糖代谢率也低，脑萎缩容易按照ApoE4/4、ApoE3/4、ApoE3/3的顺序进展等。
另外还已知，在此外的属于痴呆症的血管性痴呆症(VD)、路易体痴呆等情况下ApoE4的频率高，在脑淀粉样血管病所致的脑出血患者中ApoE2的频率高，等。
而且，据报道在帕金森病、精神分裂症、抑郁症、焦虑症、癫痫之类的精神神经疾病中ApoE4的频率高。
如上所述，可认为ApoE基因多态性是获知AD等的发病风险的重要因子。
以往在进行AD的发病诊断、预测时，通常由例如MRI(Magnetic ResonanceImaging：磁共振图像诊断装置)、CT(Computed Tomography，电子计算机断层扫描)的图像来判断。但是，拍摄MRI图像需要一定时间，患者的负担也大。因此，正在研究能够更迅速地进行判定的、使用ApoE基因多态性的信息的AD发病诊断/预测方法。
以往的ApoE基因多态性的测定通常是采自被检者血液来进行的。例如，专利文献1公开了检测血液样品中的ApoE4或其片段的方法。非专利文献1中使用实时PCR检测了ApoE基因多态性。这样的将血液作为样品来检测ApoE基因多态性的方法的问题在于侵入性高、被检者的负担依然大。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特表2019-536007号公报
非专利文献
非专利文献1:Clinical Chemistry 45，No.7，1999，pp.1094-1097
发明内容
发明要解决的问题
以往的ApoE基因多态性测定通常是采自被检者血液而进行的，侵入性高，与图像诊断同样地被检者的负担依然大。
本发明的主要课题在于，提供迅速且对被检者的侵入性低、能够解决上述那样的课题的ApoE基因多态性的新的检测方法或判定方法。另外，还提供用于其中的试剂盒、系统等。
用于解决问题的方案
本发明人们进行深入研究的结果是，发现了能够由唾液等外分泌液简便迅速地检测ApoE基因多态性、由此能够解决上述课题，从而完成了本发明。
作为本发明，可列举例如以下的方式。
[1]一种基因多态性检测方法，其用于检测采自被检者的基因组DNA中存在的载脂蛋白E的基因多态性，所述方法包括下述的步骤1～3：
步骤1：使DNA从采自被检者的包含上皮细胞的外分泌液或粘液中游离而制作包含该DNA的被检体；
步骤2：向包含该DNA的被检体中添加下述(1)～(3)并进行混合，
(1)PCR酶；
(2)用于扩增载脂蛋白E基因的核酸片段的PCR引物对，其包含编码载脂蛋白E的第112位或第158位的氨基酸残基(Cys或Arg)的密码子；以及，
(3)荧光标记探针组，所述荧光标记探针组为具有包含编码载脂蛋白E的第112位的氨基酸残基为野生型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针与具有包含编码该第112位的氨基酸残基为突变型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针所组成的组，并且用于标记的荧光色素彼此不同，
或者，所述荧光标记探针组为具有包含编码载脂蛋白E的第158位的氨基酸残基为野生型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针与具有包含编码该第158位的氨基酸残基为突变型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针所组成的组，并且用于标记的荧光色素彼此不同；
步骤3：对上述混合物进行PCR，从其PCR产物测定与该被检者的载脂蛋白E的第112位或第158位的氨基酸残基对应的荧光强度。
[2]根据上述[1]所述的基因多态性检测方法，其中，在上述步骤1中，使用表面活性剂和蛋白酶K使DNA游离。
[3]根据上述[2]所述的基因多态性检测方法，其中，上述表面活性剂为十二烷基硫酸钠。
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，向上述被检体中还添加包含氯化钾、氯化镁和dNTP混合物的Tris盐酸缓冲液并进行混合。
[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，向上述被检体中还添加下述物质并进行混合，所述物质是与吸附于PCR酶的生物来源的负电荷物质和吸附于DNA的生物来源的正电荷物质这样的抑制PCR的物质结合、从而中和该负电荷物质和正电荷物质的PCR抑制作用的物质。
[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，上述外分泌液或粘液为唾液。
[7]根据上述[6]所述的基因多态性检测方法，其中，利用棉棒、脱脂棉、吐出、DNA采集试剂盒来采集上述唾液。
[8]根据上述[1]～[7]中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，上述PCR引物对为下述的序列号1与序列号2、或序列号3与序列号4、或序列号5与序列号6、或序列号7与序列号8所示的碱基序列所成的对。
正向：5’-CAAGGAGCTGCAGGCGG-3’···(序列号1)
反向：5’-CAGCTCCTCGGTGCTCTG-3’···(序列号2)
正向：5’-GGCGCAGGCCCGGCT-3’···(序列号3)
反向：5’-CGGCGCCCTCGCGG-3’···(序列号4)
正向：5’-CGCAAGCTGCGTAAGCG-3’···(序列号5)
反向：5’-CGCGGATGGCGCTGAG-3’···(序列号6)
正向：5’-CGTAAGCGGCTCCTCCG-3’···(序列号7)
反向：5’-CGGCGCCCTCGCGG-3’···(序列号8)
[9]根据上述[1]～[8]中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，荧光标记探针中的、包含编码载脂蛋白E的第112位的氨基酸残基为野生型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的碱基序列和包含编码该第112位的氨基酸残基为突变型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的碱基序列分别为下述的序列号9和序列号10所示的碱基序列，包含编码载脂蛋白E的第158位的氨基酸残基为野生型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的碱基序列和包含编码该第158位的氨基酸残基为突变型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的碱基序列分别为下述的序列号11和序列号12所示的碱基序列。
5’-GGACGTGTGCGGCCG-3’···(序列号9)
5’-GGACGTGCGCGGCCG-3’···(序列号10)
5’-CTGCAGAAGCGCCTGGC-3’···(序列号11)
5’-CTGCAGAAGTGCCTGGC-3’···(序列号12)
[10]一种基因多态性判定方法，其用于判定采自被检者的基因组DNA中存在的载脂蛋白E的基因多态性，所述方法包括下述的步骤1和2：
步骤1：通过上述[1]～[9]中任一项所述的基因多态性检测方法获得基于第112位的氨基酸残基和第158位的氨基酸残基的扩增曲线的工序；
步骤2：
工序(a)：在上述工序所获得的基于第112位的氨基酸残基的扩增曲线中，
仅来自具有包含编码野生型Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针(第112位Cys探针)的荧光强度观察到实质性增加，来自具有包含编码突变型Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针(第112位Arg探针)的荧光强度未观察到实质性增加，并且，
在上述工序所获得的基于第158位的氨基酸残基的扩增曲线中，
仅来自具有包含编码野生型Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针(第158位Arg探针)的荧光强度观察到实质性增加，来自具有包含编码突变型Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针(第158位Cys探针)的荧光强度未观察到实质性增加，这种情况下判定为载脂蛋白E3/E3；
工序(b)：在上述工序所获得的基于第112位的氨基酸残基的扩增曲线中，
仅来自第112位Cys探针的荧光强度观察到实质性增加，来自第112位Arg探针的荧光强度未观察到实质性增加，并且，
在上述工序所获得的基于第158位的氨基酸残基的扩增曲线中，
来自第158位Arg探针的荧光强度未观察到实质性增加，仅来自第158位Cys探针的荧光强度观察到实质性增加，这种情况下判定为载脂蛋白E2/E2；
工序(c)：在上述工序所获得的基于第112位的氨基酸残基的扩增曲线中，
仅来自第112位Cys探针的荧光强度观察到实质性增加，来自第112位Arg探针的荧光强度未观察到实质性增加，并且，
在上述工序所获得的基于第158位的氨基酸残基的扩增曲线中，
来自第158位Arg探针的荧光强度观察到实质性增加，且来自第158位Cys探针的荧光强度也观察到实质性增加，这种情况下判定为载脂蛋白E2/E3；
工序(d)：在上述工序所获得的基于第112位的氨基酸残基的扩增曲线中，
来自第112位Cys探针的荧光强度未观察到实质性增加，仅来自第112位Arg探针的荧光强度观察到显著增加，并且，
在上述工序所获得的基于第158位的氨基酸残基的扩增曲线中，
仅来自第158位Arg探针的荧光强度观察到实质性增加，来自第158位Cys探针的荧光强度未观察到实质性增加，这种情况下判定为载脂蛋白E4/E4；
工序(e)：在上述工序所获得的基于第112位的氨基酸残基的扩增曲线中，
来自第112位Cys探针的荧光强度和来自第112位Arg探针的荧光强度均观察到实质性增加，并且
在上述工序所获得的基于第158位的氨基酸残基的扩增曲线中，
仅来自第158位Arg探针的荧光强度观察到实质性增加，来自第158位Cys探针的荧光强度未观察到实质性增加，这种情况下判定为载脂蛋白E3/E4；或者，
工序(f)：在上述工序所获得的基于第112位的氨基酸残基的扩增曲线中，
来自第112位Cys探针的荧光强度和来自第112位Arg探针的荧光强度均观察到实质性增加，并且，
在上述工序所获得的基于第158位的氨基酸残基的扩增曲线中，
来自第158位Arg探针的荧光强度和来自第158位Cys探针的荧光强度均观察到实质性增加，这种情况下判定为载脂蛋白E2/E4。
[11]一种试剂盒，其用于检测或判定采自被检者的基因组DNA中存在的载脂蛋白E的基因多态性，所述试剂盒包含下述的(1)～(3)：
(1)PCR酶；
(2)用于扩增载脂蛋白E基因的核酸片段的PCR引物对，其包含编码载脂蛋白E的第112位或第158位的氨基酸残基(Cys或Arg)的密码子；以及，
(3)荧光标记探针组，所述荧光标记探针组为具有包含编码载脂蛋白E的第112位的氨基酸残基为野生型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针与具有包含编码该第112位的氨基酸残基为突变型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针所组成的组，并且用于标记的荧光色素彼此不同，
或者，所述荧光标记探针组为具有包含编码载脂蛋白E的第158位的氨基酸残基为野生型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针与具有包含编码该第158位的氨基酸残基为突变型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针所组成的组，并且用于标记的荧光色素彼此不同。
[12]根据上述[11]所述的试剂盒，其还包含表面活性剂和蛋白酶K。
[13]根据上述[12]所述的试剂盒，其中，上述表面活性剂为十二烷基硫酸钠。
[14]根据上述[11]～[13]中任一项所述的试剂盒，其还包含含有氯化钾、氯化镁和dNTP混合物的Tris盐酸缓冲液。
[15]根据上述[11]～[14]中任一项所述的试剂盒，其还包含下述物质，所述物质是与吸附于PCR酶的生物来源的负电荷物质和吸附于DNA的生物来源的正电荷物质这样的抑制PCR的物质结合、从而中和该负电荷物质和正电荷物质的PCR抑制作用的物质。
[16]根据上述[11]～[14]中任一项所述的试剂盒，其还包含棉棒、脱脂棉、唾液采集器具、DNA采集试剂盒。
[17]根据上述[11]～[16]中任一项所述的试剂盒，其中，上述PCR引物对为下述的序列号1与序列号2、或序列号3与序列号4所示的碱基序列所成的对。
正问：5’-CAAGGAGCTGCAGGCGG-3’···(序列号1)
反向：5’-CAGCTCCTCGGTGCTCTG-3’···(序列号2)
正向：5’-GGCGCAGGCCCGGCT-3’···(序列号3)
反向：5’-CGGCGCCCTCGCGG-3’···(序列号4)
正向：5’-CGCAAGCTGCGTAAGCG-3’···(序列号5)
反向：5’-0CGCGGATGGCGCTGAG-3’···(序列号6)
正向：5’-CGTAAGCGGCTCCTCCG-3’···(序列号7)
反向：5’-CGGCGCCCTCGCGG-3’···(序列号8)
[18]根据上述[11]～[17]中任一项所述的试剂盒，其中，荧光标记探针中的、包含编码载脂蛋白E的第112位的氨基酸残基为野生型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的碱基序列和包含编码该第112位的氨基酸残基为突变型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的碱基序列分别为下述的序列号9和序列号10所示的碱基序列，包含编码载脂蛋白E的第158位的氨基酸残基为野生型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的碱基序列和包含编码该第158位的氨基酸残基为突变型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的碱基序列分别为下述的序列号11和序列号12所示的碱基序列。
5’-GGACGTGTGCGGCCG-3’···(序列号9)
5’-GGACGTGCGCGGCCG-3’···(序列号10)
5’-CTGCAGAAGCGCCTGGC-3’···(序列号11)
5’-CTGCAGAAGTGCCTGGC-3’···(序列号12)
[19]一种痴呆症诊断系统，其包含上述[11]～[18]中任一项所述的试剂盒并且包含MRI或CT。
[20]根据上述[19]所述的痴呆症诊断系统，其中，上述痴呆症为阿尔茨海默型痴呆症。
发明的效果
根据本发明，能够被检者的负担少且较为简便/迅速地检测、判定载脂蛋白E的基因多态性。
附图说明
图1为关于载脂蛋白E的各基因多态性的PCR扩增曲线。上侧的各图示出与第112位的氨基酸残基对应的扩增曲线，下侧的各图示出与第158位的氨基酸残基对应的扩增曲线。纵轴表示荧光强度，横轴表示PCR循环数。
图2为关于使用唾液的直接采集样品的本发明检测方法的PCR扩增曲线。右侧的各图示出实施例1～4的扩增曲线，左侧的各图示出对照的扩增曲线。纵轴表示荧光强度，横轴表示PCR循环数。
图3为关于使用唾液的棉棒采集样品的本发明检测方法的PCR扩增曲线。右侧的各图示出实施例1～4的扩增曲线，左侧的各图示出对照的扩增曲线。纵轴表示荧光强度，横轴表示PCR循环数。
具体实施方式
以下对本发明进行详述。
如上所述，载脂蛋白E存在ApoE2、ApoE3和ApoE4这3种异形体。这些的第112位和第158位这两个位点的氨基酸残基不同，ApoE2中为Cys(半胱氨酸残基)/Cys(半胱氨酸残基)，ApoE3中为Cys(半胱氨酸残基)/Arg(精氨酸残基)，ApoE4中为Arg(精氨酸残基)/Arg(精氨酸残基)。这些中，第112位的氨基酸残基为Cys、第158位的氨基酸残基为Arg的ApoE3为野生型，频率最高。ApoE2和ApoE4为突变型。
另外，编码载脂蛋白E的第112位和第158位的Cys的密码子为“TGC”，编码载脂蛋白E的第112位和第158位的Arg的密码子为“CGC”。
1本发明的基因多态性检测方法
本发明的基因多态性检测方法(以下称为“本发明检测方法”。)的特征在于，其用于检测采自被检者的基因组DNA中存在的载脂蛋白E的基因多态性，所述方法包括下述的步骤1～3。
步骤1：使DNA从采自被检者的包含上皮细胞的外分泌液或粘液中游离而制作包含该DNA的被检体。
步骤2：向包含该DNA的被检体中添加下述(1)～(3)并进行混合，
(1)PCR酶；(2)用于扩增载脂蛋白E基因的核酸片段的PCR引物对，其包含编码载脂蛋白E的第112位或第158位的氨基酸残基(Cys或Arg)的密码子；以及，(3)荧光标记探针组，所述荧光标记探针组为具有包含编码载脂蛋白E的第112位的氨基酸残基为野生型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针与具有包含编码该第112位的氨基酸残基为突变型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针所组成的组，并且用于标记的荧光色素彼此不同，或者，所述荧光标记探针组为具有包含编码载脂蛋白E的第158位的氨基酸残基为野生型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针与具有包含编码该第158位的氨基酸残基为突变型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针所组成的组，并且用于标记的荧光色素彼此不同。
步骤3：对上述混合物进行PCR，从其PCR产物测定与该被检者的载脂蛋白E的第112位或第158位的氨基酸残基对应的荧光强度。
1.1步骤1
步骤1为使DNA从采自被检者的包含上皮细胞的外分泌液或粘液中游离而制作包含该DNA的被检体的工序。
作为该外分泌液或粘液，没有特别限定，可列举例如唾液、鼻粘膜液。本发明中，为了简便而优选其中的唾液。作为从被检者采集唾液的方法，没有特别限定，可列举例如请被检者直接吐出唾液而得到的方法、用棉棒等器具擦拭腮部内侧的方法。
作为该外分泌液或粘液的采集量，为少量即可，具体而言，在例如0.1～10μL的范围内是合适的，优选在0.5～5μL的范围内。作为该外分泌液，在直接吐出唾液而得到的情况下，可以采集大于等于上述范围的唾液并适宜地使用必要量。
使DNA从该外分泌液或粘液中游离可以通过常规方法来进行。例如，可以通过用表面活性剂和蛋白酶K对采集的外分泌液等进行处理来进行。具体而言，可以将采集的外分泌液等添加到包含表面活性剂、氯化钠、Tris盐酸(pH8.0)、EDTA的溶液或在这些中包含蛋白酶K的溶液中，使用涡旋混合机等进行搅拌，由此而进行。根据需要也可以进行加温。
作为上述表面活性剂，可以适宜地选择阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、或非离子表面活性剂。其中，优选阴离子表面活性剂，其中更优选十二烷基硫酸钠。例如可以在0.1～0.5％(w/v)的范围内使用该表面活性剂。
蛋白酶K有使DNA和RNA分解酶失活的作用，例如可以在5～20mg/mL的范围内使用。
1.2步骤2
步骤2是向被检体中加入PCR酶、PCR引物对、荧光标记探针等并混合而制备开始进行聚合酶链式反应(PCR：Polymerase Chain Reaction)所需的所谓PCR反应液的工序。
作为PCR酶，可列举例如DNA聚合酶。DNA聚合酶是嗜热性细菌来源的耐热性DNA聚合酶，可以使用Taq、Tth、KOD、Pfu和这些的突变体，但是不限于这些。为了避免DNA聚合酶所致的非特异性扩增，可以使用热启动DNA聚合酶。作为热启动DNA聚合酶，可列举例如BIOTAQ(注册商标)热启动DNA聚合酶。热启动DNA聚合酶中存在结合有抗DNA聚合酶抗体的DNA聚合酶和酶活性部位经热敏性化学修饰的DNA聚合酶，本发明中这些均可使用。
本发明检测方法中使用的PCR引物对能够以采自被检者的外分泌液等中的基因组DNA为模板通过PCR来扩增作为分析对象的载脂蛋白E基因的多态性部位、即包含编码载脂蛋白E的第112位或第158位的氨基酸残基(Cys或Arg)的密码子部位的核酸片段。
作为所扩增的核酸片段的长度，在包含载脂蛋白E基因多态性中的上述多态性部位的20～1000碱基的范围内是适当的，优选在20～200碱基的范围内。作为这样的PCR引物对，优选与序列号13和14所示的碱基序列所构成的区域在严谨条件下杂交的寡核苷酸(正向引物和反向引物)。这里的严谨条件是指：在引物结合到模板DNA的步骤、即PCR中的退火中，使模板DNA与引物的结合具有特异性的条件。本发明的PCR引物对以碱基长度计优选为50～150碱基。作为本发明中更优选的PCR引物对的碱基序列，可列举例如以下碱基序列。
<对于与第112位的氨基酸残基对应的基因多态性>
正向：5’-CAAGGAGCTGCAGGCGG-3’···(序列号1)
反向：5’-CAGCTCCTCGGTGCTCTG-3’···(序列号2)
正向：5’-GGCGCAGGCCCGGCT-3’···(序列号3)
反向：5’-CGGCGCCCTCGCGG-3’···(序列号4)
<关于与第158位的氨基酸残基对应的基因多态性>
正向：5’-CGCAAGCTGCGTAAGCG-3’···(序列号5)
反向：5’-CGCGGATGGCGCTGAG-3’···(序列号6)
正向：5’-CGTAAGCGGCTCCTCCG-3’···(序列号7)
反向：5’-CGGCGCCCTCGCGG-3’···(序列号8)
下述的序列号13和14是在野生型的ApoE基因(ApoE3/E3)中分别包含与第112位的氨基酸残基对应的基因多态性和与第158位的氨基酸残基对应的基因多态性的区域的碱基序列。任一者中，用引号示出的位置分别为与第112位和第158位的氨基酸残基对应的密码子。只要包含该多态性位点，就能够扩增序列号13和14中的任意的碱基序列。
5’-
GAAGGCCTACAAATCGGAACTGGAGGAACAACTGACCCCGGTGGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTG“TGC”GGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCTGCGGGTGCGCCTCGCCTCCCACCTGCGCAAGCTGCGTAAGCGGCTCCTCCGCGATGCC-3’···(序列号13)
5’-
GCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCTGCGGGTGCGCCTCGCCTCCCACCTGCGCAAGCTGCGTAAGCGGCTCCTCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAG“CGC”CTGGCAGTGTACCAGGCCGGGGCCCGCGAGGGCGCCGAGCGCGGCCTCAGCGCCATCCGCGAGCGCCTGGG-3’···(序列号14)
本发明检测方法中使用的荧光标记探针组是具有包含编码载脂蛋白E的第112位的氨基酸残基为野生型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针(以下称为“第112位Cys探针”。)与具有包含编码该第112位的氨基酸残基为突变型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针(以下称为“第112位Arg探针”。)的组合，或者是具有包含编码载脂蛋白E的第158位的氨基酸残基为野生型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针(以下称为“第158位Arg探针”。)与具有包含编码该第158位的氨基酸残基为突变型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针(以下称为“第158位Cys探针”。)的组合。
并且，第112位Cys探针和第112位Arg探针中的荧光色素彼此不同，以及，第158位Arg探针和第158位Cys探针中的荧光色素彼此不同。由此，能够判别该位点处的氨基酸残基是Cys还是Arg。
第112位Cys探针和第158位Cys探针与通过PCR扩增而得的、将第112位或第158位的氨基酸残基编码为Cys的核酸片段在严谨条件下杂交，但是与通过PCR扩增而得的、将第112位或第158位的氨基酸残基编码为Arg的核酸片段在严谨条件下不进行杂交。另一方面，第112位Arg探针和第158位Arg探针与通过PCR扩增而得的、将第112位或第158位的氨基酸残基编码为Arg的核酸片段在严谨条件下杂交，但是与通过PCR扩增而得的、将第112位或第158位的氨基酸残基编码为Cys的核酸片段在严谨条件下不进行杂交。
这里的严谨条件是指：通过PCR扩增而得的核酸片段与荧光标记探针中的寡核苷酸之间在退火时形成特异性的杂交体、不会形成非特异性的杂交体的条件。
本发明检测方法中使用的荧光标记探针中的寡核苷酸以碱基长度计优选为10～25碱基，更优选为15～20碱基。本发明检测方法中最优选的荧光标记探针组中的各寡核苷酸的碱基序列如以下所示。序列号9是与载脂蛋白E的第112位的氨基酸残基为野生型(Cys)的核酸片段结合的碱基序列。同样，序列号10～12分别是与第112位为突变型(Arg)、第158位为野生型(Arg)、第158位为突变型(Cys)的情况时进行结合的碱基序列。
5’-GGACGTGTGCGGCCG-3’···(序列号9)
5’-GGACGTGCGCGGCCG-3’···(序列号10)
5’-CTGCAGAAGCGCCTGGC-3’···(序列号11)
5’-CTGCAGAAGTGCCTGGC-3’···(序列号12)
上述PCR反应液通常包含PCR缓冲液。作为该PCR缓冲液，优选Tris盐酸。该PCR缓冲液中通常包含KCl、MgCl2和dNTP混合物(脱氧核糖核苷酸5’-三磷酸酯；包含dATP、dGTP、dCTP和dTTP的混合物)，但是不限于此。dNTP、MgCl2、KCl和缓冲液的浓度可以由本领域技术人员适宜设定。例如，作为MgCl2，可列举1.5mM，作为KCl，可列举35mM，作为dNTP，可列举200μM，作为Tris盐酸，可列举10mM。
另外，本发明检测方法中，该PCR缓冲液可以包含下述物质，所述物质是与吸附于DNA聚合酶的生物来源的负电荷物质(例如某些种类的糖和色素等)和吸附于DNA的生物来源的正电荷物质(例如某些种类的蛋白质等)那样的抑制PCR的物质结合、从而中和上述负电荷物质和正电荷物质的PCR抑制作用的物质。
作为具体的该PCR缓冲液，可列举例如基因扩增用试剂Ampdirect(注册商标)、Ampdirect(注册商标)Plus(均为株式会社岛津制作所制)。
1.3步骤3
步骤3是对所制备的被检体进行PCR，从其PCR产物测定与载脂蛋白E的第112位或第158位的氨基酸残基对应的荧光强度的工序。
本发明检测方法中，为了检测载脂蛋白E的基因多态性，使用PCR。关于PCR条件(温度、时间和循环数)的设定，只要是本领域技术人员就能够适当且容易地进行。本发明检测方法中，PCR产物的检测可以通过实时测定来进行。PCR产物的实时测定也被称为实时PCR。
本发明检测方法中，通过荧光来检测PCR产物，因此可以使用具有寡核苷酸的荧光标记探针。作为该荧光标记探针，可列举例如水解探针(TaqMan(注册商标)探针等)、Molecular Beacon和循环探针等，但是当然不限于这些。其中，从检测的特异性和多重(Multiplex)分析可能性的观点出发，优选使用水解探针。进而，从高灵敏度检测的观点出发，优选使用Molecular Beacon。另外，从高精度检测的观点出发，优选使用循环探针。
水解探针是5'末端被荧光色素修饰、另外3'末端被淬灭剂物质修饰的寡核苷酸。在PCR退火时，水解探针特异性杂交到模板DNA上，但是由于探针上存在淬灭剂，因此即使照射激发光，通过荧光共振能量转移(FRET：Fluorescence Resonance Energy Transfer)而产生荧光的情况也被抑制(淬灭)。在此后的延伸反应步骤中，由于Taq DNA聚合酶所具有的5'→3'外切核酸酶活性，杂交到模板DNA上的水解探针被分解，荧光色素从探针游离，淬灭剂所致的淬灭解除而发出荧光。通过测定该荧光强度，能够测定扩增产物的生成量。
从更高精度地检测基因多态性的观点出发，上述荧光标记探针可以为包含瓣状核酸内切酶(FEN)的形态。作为这样的荧光标记探针，可列举例如包含FEN、检测用探针和与该探针对应的检测用FRET盒的分子组。该检测用探针可以为野生型检测用探针和突变型检测用探针，可以是分别在末端具有各个瓣状序列的探针。并且，野生型检测用探针可以为包含能与野生型DNA特异性杂交那样的碱基序列的寡核苷酸的结构，突变型检测用探针同样地可以为包含能与突变型DNA特异性杂交的寡核苷酸的结构。检测用FRET盒是识别各检测用探针的分子，可以是在识别位点的末端结合有荧光色素的结构。该荧光色素可以是被FRET盒中的淬灭剂淬灭的状态。
使用这样的荧光标记探针进行PCR，在退火和延伸反应步骤中，寡核苷酸和检测用探针与模板DNA杂交时，可形成由该寡核苷酸、检测用探针和模板DNA构成的三链结构(瓣状结构)。这种情况下，FEN将键切断而使该检测用探针末端的瓣状序列游离(需要说明的是，该寡核苷酸经过延伸反应步骤而成为PCR扩增产物。)。
游离出的该瓣状序列与对应的FRET盒杂交，形成由该瓣状序列、FRET盒和其上结合的荧光色素构成的三重结构(瓣状结构)。这种情况下，FEN将键切断而使荧光色素游离。游离后的荧光色素的由FRET所致的淬灭得以解除，从而发出荧光。通过测定该荧光强度，能够测定PCR扩增产物的生成量。
作为上述荧光色素，可列举例如FAM(6-羧基荧光素)、ROX(6-羧基-X-罗丹明)、Cy3和Cy5(花青系色素)以及HEX(4,7,2',4',5',7'-六氯-6-羧基荧光素)等，但是不限于这些。
作为上述淬灭剂，可列举TAMRA(注册商标)、BHQ(Black Hole Quencher、注册商标)1、BHQ2、MGB-Eclipse(注册商标)和DABCYL、BHQ3等，但是不限于这些。
本发明检测方法中，使用第112位Cys探针与第112位Arg探针、或第158位Arg探针与第158位Cys探针的各2种荧光标记探针来区分、检测2种DNA靶碱基序列。因此，上述各2种荧光标记探针用彼此不同的荧光色素进行了标记。彼此不同的荧光色素的组合只要荧光特性不同、在荧光测定中不会相互干扰就没有特别限制。具体而言，例如可以使用FAM作为第112位Cys探针、使用ROX作为第112位Arg探针、使用FAM作为第158位Arg探针、使用ROX作为第158位Cys探针。即，可以对于野生型使用FAM、对于突变型使用ROX。
2载脂蛋白E的基因多态性的判定
本发明检测方法中，在PCR产物的实时测定中，使用与所用的荧光色素对应的荧光滤光片监测PCR产物的扩增曲线。荧光强度根据PCR循环数而实质性增加时，判定为被检体中的分析对象DNA的存在为阳性，另一方面，PCR中荧光强度未实质性增加时，判定为阴性。
本发明中，通过本发明检测方法可以对载脂蛋白E的各基因多态性获得例如图1所示那样的基于第112位的氨基酸残基和第158位的氨基酸残基的扩增曲线。图1中，基于第112位的氨基酸残基的各数据中，实线表示来自Cys的荧光强度，虚线表示来自Arg的荧光强度。另一方面，在基于第158位的氨基酸残基的各数据中，实线表示来自Arg的荧光强度，虚线表示来自Cys的荧光强度。因此，实线对应于野生型载脂蛋白E基因编码的氨基酸残基，虚线对应于突变型载脂蛋白E基因编码的氨基酸残基。
然后，可以由获得的该扩增曲线如下述那样判定该载脂蛋白E的基因多态性。
·在获得的第112位的氨基酸残基的扩增曲线中，仅来自第112位Cys探针的荧光强度(图1中实线，以下相同。)观察到实质性增加，来自第112位Arg探针的荧光强度(图1中虚线，以下相同。)未观察到实质性增加，并且在获得的第158位的氨基酸残基的扩增曲线中，仅来自第158位Arg探针的荧光强度(图1中实线，以下相同。)观察到实质性增加，来自第158位Cys探针的荧光强度(图1中虚线，以下相同。)未观察到实质性增加，这种情况下，可以将该载脂蛋白E的基因多态性判定为E3/E3(纯合型)。
·在获得的第112位的氨基酸残基的扩增曲线中，仅来自第112位Cys探针的荧光强度观察到实质性增加，来自第112位Arg探针的荧光强度未观察到实质性增加，并且在获得的第158位的氨基酸残基的扩增曲线中，来自第158位Arg探针的荧光强度未观察到实质性增加，仅来自第158位Cys探针的荧光强度观察到实质性增加，这种情况下，可以将该载脂蛋白E的基因多态性判定为E2/E2(纯合型)。
·在获得的第112位的氨基酸残基的扩增曲线中，仅来自第112位Cys探针的荧光强度观察到实质性增加，来自第112位Arg探针的荧光强度未观察到实质性增加，并且在获得的第158位的氨基酸残基的扩增曲线中，来自第158位Arg探针的荧光强度观察到实质性增加，且来自第158位Cys探针的荧光强度也观察到实质性增加，这种情况下，可以将该载脂蛋白E的基因多态性判定为E2/E3(杂合型)。
·在获得的第112位的氨基酸残基的扩增曲线中，来自第112位Cys探针的荧光强度未观察到实质性增加，仅来自第112位Arg探针的荧光强度观察到显著增加，并且在获得的第158位的氨基酸残基的扩增曲线中，仅来自第158位Arg探针的荧光强度观察到实质性增加，来自第158位Cys探针的荧光强度未观察到实质性增加，这种情况下，可以将该载脂蛋白E的基因多态性判定为E4/E4(纯合型)。
·在获得的第112位的氨基酸残基的扩增曲线中，来自第112位Cys探针的荧光强度和来自第112位Arg探针的荧光强度均观察到实质性增加，并且在获得的第158位的氨基酸残基的扩增曲线中，仅来自第158位Arg探针的荧光强度观察到实质性增加，来自第158位Cys探针的荧光强度未观察到实质性增加，这种情况下，可以将该载脂蛋白E的基因多态性判定为E3/E4(杂合型)。
·在获得的第112位的氨基酸残基的扩增曲线中，来自第112位Cys探针的荧光强度和来自第112位Arg探针的荧光强度均观察到实质性增加，并且在获得的第158位的氨基酸残基的扩增曲线中，来自第158位Arg探针的荧光强度和来自第158位Cys探针的荧光强度均观察到实质性增加，这种情况下，可以将该载脂蛋白E的基因多态性判定为E2/E4(杂合型)。
在此，荧光强度的“实质性增加”例如是指：并不是由人工产物(Artifact)、其它因素(例如温度导致探针逐渐被破坏而与淬灭剂解离，荧光逐渐上升。)所带来的假信号增加，而是本领域技术人员能够判断为真正来自结合于与该氨基酸残基对应的碱基序列的探针的荧光强度发生增加的增加。
对上述判定方法换种方式说明，在图1的各数据中，将荧光强度仅实线实质性增加的情况设为判断标识1，将仅虚线实质性增加的情况设为判断标识2，将两种线实质性增加的情况设为判断标识12，则可以得到下述表1所示的载脂蛋白E基因多态性的判定表。
[表1]
Figure BDA0004177984610000201
如表1所示，第112位和第158位的判断标识分别为1和1、1和2、2和1者为纯合型，其中1和1的情况下判定为野生型，这之外的情况下判定为E2或E4的突变型。第112位和第158位的判断标识为12和12者可以判定为突变型彼此的E2/E4杂合型，这之外的组合为野生型与突变型的杂合型，可以判定为E2/E3或E3/E4。
3本发明的试剂盒
本发明的试剂盒(以下称为“本发明试剂盒”。)的特征在于，其用于检测或判定采自被检者的基因组DNA中存在的载脂蛋白E的基因多态性且包含下述的(1)～(3)。
(1)PCR酶；
(2)用于扩增载脂蛋白E基因的核酸片段的PCR引物对，其包含编码载脂蛋白E的第112位或第158位的氨基酸残基(Cys或Arg)的密码子；以及，
(3)荧光标记探针组，所述荧光标记探针组为第112位Cys探针和第112位Arg探针所组成的组，并且用于标记的荧光色素彼此不同，或者，所述荧光标记探针组为第158位Arg探针和第158位Cys探针所组成的组，并且用于标记的荧光色素彼此不同。
本发明试剂盒中，PCR引物对、荧光标记探针组等术语与上述含义相同。本发明试剂盒可以用于在临床现场简便且迅速地进行基因检查的基因型迅速判定系统中。作为基因型迅速判定系统，可列举例如株式会社岛津制作所制GTS-7000。
本发明的一实施方式中，本发明试剂盒为了容易应用于基因型迅速判定系统而可以具备在被检体前处理中使用的、包含表面活性剂和蛋白酶K的PCR缓冲液。上述表面活性剂优选为阴离子表面活性剂，更优选为十二烷基硫酸钠。一实施方式中，该PCR缓冲液可以是包含KCl、MgCl2和dNTP混合物(包含dATP、dGTP、dCTP和dTTP的混合物)的Tris缓冲液。一实施方式中，该PCR缓冲液可以包含下述物质，所述物质是与吸附于DNA聚合酶的生物来源的负电荷物质和吸附于DNA的生物来源的正电荷物质这样的抑制PCR的物质结合、从而中和上述负电荷物质和正电荷物质的PCR抑制作用的物质。一实施方式中，本发明试剂盒可以具备基因扩增用试剂Ampdirect(注册商标)或基因扩增用试剂Ampdirect(注册商标)Plus(均为株式会社岛津制作所制)。
将本发明试剂盒应用于基因型迅速判定系统时，通过向上述系统中整合作为阳性对照的、人工合成的包含编码载脂蛋白E的第112位的氨基酸残基为野生型的Cys的密码子的野生型基因和包含编码该第112位的氨基酸残基为突变型的Arg的密码子的突变型基因、以及/或者包含编码载脂蛋白E的第158位的氨基酸残基为野生型的Arg的密码子的野生型基因和包含编码该第158位的氨基酸残基为突变型的Cys的密码子的突变型基因，由此能够进行基因型的自动判定。
本发明另外提供痴呆症诊断系统，其包含本发明试剂盒且包含MRI和/或CT。通过将本发明试剂盒或使用本发明试剂盒的本发明检测方法与MRI和/或CT组合，由此能够提高痴呆症诊断的准确性。作为该痴呆症，可列举例如阿尔茨海默型痴呆症。
实施例
以下示出实施例来说明本发明，但是本发明不受这些实施例任何限定。
[使用唾液样品的ApoE基因多态性的测定]
使用人类(4名)的唾液样品，基于本发明试剂盒和本发明检测方法确认ApoE基因多态性的判定精度。
使用的试剂如下所述。
·细胞溶解液：将Tris盐酸(pH8.0，20mM)、EDTA(5mM)、NaCl(400mM)、SDS(0.3％)和蒸馏水混合而制备(各浓度表示各成分的最终浓度。)。
·PCR缓冲液：Ampdirect(注册商标)Plus试剂(株式会社岛津制作所制)
·酶：BIOTAQ(注册商标)DNA聚合酶(Bioline公司制)
·112-PT：引物(序列号1和2)/荧光标记探针(包含序列号9和10的寡核苷酸。)混合液
·158-PT：引物(序列号5和6)/荧光标记探针(包含序列号11和12的寡核苷酸。)混合液
·E2/E2：ApoE2/ApoE2对照DNA
·E3/E3：ApoE3/ApoE3对照DNA
·E4/E4：ApoE4/ApoE4对照DNA
·E2/E3：ApoE2/ApoE3对照DNA
·E2/E4：ApoE2/ApoE4对照DNA
·E3/E4：ApoE3/ApoE4对照DNA
需要说明的是，作为上述各荧光标记探针，使用水解探针(TaqMan(注册商标)探针)。关于荧光色素，具有序列号9和11的寡核苷酸的探针使用FAM，具有序列号10和12的寡核苷酸的探针使用ROX。
[实施例1～4]使用直接采集样品的测定(采集方法1)
作为样品，使用直接吐到微型管(1.5mL)的人类(4名)唾液各2μL。
用于检测ApoE所编码的蛋白质的第112位的氨基酸残基所对应的多态性的PCR反应液，是通过将PCR缓冲液、Enzyme、112-PT和纯化水混合而制备的。向PCR反应管中分注上述PCR反应液各24μL，向其中加入上述各唾液样品1μL并进行混合。另外，用于检测第158位的氨基酸残基所对应的多态性的PCR反应液是通过将PCR缓冲液、Enzyme、158-PT和纯化水混合而制备的。对于该反应液，也同样地各分注24μL，向其中加入上述各唾液样品1μL并进行混合。
对于得到的各混合液，立即使用实时PCR装置(GTS-7000、株式会社岛津制作所制)测定PCR反应(实施例1～4)。测定中，首先在95℃/10分钟的条件下使酶活化，接着，使PCR在95℃/10秒～60℃/30秒的条件下进行50个循环。
需要说明的是，作为阳性对照和阴性对照，分别制备代替唾液样品而加入上述E2/E2～E3/E4的各DNA或蒸馏水的混合液，同样地测定PCR反应。
将测定结果示于图2。实施例1～4中，均仅对于来自第112位Cys探针的荧光强度(实线)观察到实质性扩增，来自第112位Arg探针的荧光强度(虚线)未观察到扩增。另外，对于第158位，也是仅来自第158位Arg探针的荧光强度(实线)观察到实质性扩增，来自第158位Cys探针的荧光强度(虚线)未观察到实质性扩增。由这些结果可以判定，各实施例均为E3/E3(纯合型)。
[实施例5～8]使用棉棒采集样品的测定(采集方法2)
作为样品，使用利用棉棒采集的人类(与实施例1～4同样为4名)唾液和口腔内上皮细胞。具体而言，用棉棒擦拭每个人的腮部内侧，浸入微型管(1.5mL)内的细胞溶解液100μL中，搅拌约20秒。将搅拌后的溶解液作为样品，使用2μL。
与上述实施例1～4时同样地制备混合液，在同样的条件下测定PCR反应。关于阳性对照和阴性对照，也与上述相同。
将测定结果示于图3。实施例5～8中，均仅对于来自第112位Cys探针的荧光强度(实线)观察到实质性扩增，来自第112位Arg探针的荧光强度(虚线)未观察到扩增。另外，对于第158位，也是仅来自第158位Arg探针的荧光强度(实线)观察到实质性扩增，来自第158位Cys探针的荧光强度(虚线)未观察到实质性扩增。由这些结果可以判定，各实施例均为E3/E3(纯合型)。
以上表明，使用本发明试剂盒和本发明检测方法能够正确地识别ApoE多态性。上述各实施例中，扩增曲线在反应开始后约30分时开始增强，与通常对血液样品进行测定时相比荧光强度的陡增较早。可以说，与以往的使用血液的检测方法相比，本发明检测方法能够迅速地进行基因多态性的判定。
序列表自由文本
序列号1：用于扩增包含编码载脂蛋白E的第112位的氨基酸残基的密码子的、载脂蛋白E基因的核酸片段的PCR正向引物。
序列号2：用于扩增包含编码载脂蛋白E的第112位的氨基酸残基的密码子的、载脂蛋白E基因的核酸片段的PCR反向引物。
序列号3：用于扩增包含编码载脂蛋白E的第112位的氨基酸残基的密码子的、载脂蛋白E基因的核酸片段的PCR正向引物。
序列号4：用于扩增包含编码载脂蛋白E的第112位的氨基酸残基的密码子的、载脂蛋白E基因的核酸片段的PCR反向引物。
序列号5：用于扩增包含编码载脂蛋白E的第158位的氨基酸残基的密码子的、载脂蛋白E基因的核酸片段的PCR正向引物。
序列号6：用于扩增包含编码载脂蛋白E的第158位的氨基酸残基的密码子的、载脂蛋白E基因的核酸片段的PCR反向引物。
序列号7：用于扩增包含编码载脂蛋白E的第158位的氨基酸残基的密码子的、载脂蛋白E基因的核酸片段的PCR正向引物。
序列号8：用于扩增包含编码载脂蛋白E的第158位的氨基酸残基的密码子的、载脂蛋白E基因的核酸片段的PCR反向引物。
序列号9：用于检测包含载脂蛋白E的第112位的氨基酸残基为野生型的密码子的、载脂蛋白E基因的扩增核酸片段的探针。
序列号10：用于检测包含载脂蛋白E的第112位的氨基酸残基为突变型的密码子的、载脂蛋白E基因的扩增核酸片段的探针。
序列号11：用于检测包含载脂蛋白E的第158位的氨基酸残基为野生型的密码子的、载脂蛋白E基因的扩增核酸片段的探针。
序列号12：用于检测包含载脂蛋白E的第158位的氨基酸残基为突变型的密码子的、载脂蛋白E基因的扩增核酸片段的探针。
序列号13：ApoE基因中包含与第112位的氨基酸残基对应的基因多态性的区域的碱基序列。
序列号13：序列中的第122位～第124位的位置为与载脂蛋白E的第112位的氨基酸残基对应的野生型密码子。
序列号14：ApoE基因中包含与第158位的氨基酸残基对应的基因多态性的区域的碱基序列。
序列号14：序列中的第135位～第137位的位置为与载脂蛋白E的第158位的氨基酸残基对应的野生型密码子。
序列表
<110> 株式会社岛津制作所（SHIMADZU CORPORATION）
国立研究开发法人国立循环器病研究中心（NATIONAL CEREBRAL ANDCARDIOVASCULAR CENTER）
<120> 基因多态性检测方法
<130> P19044WO
<150> JP 2020-172944
<151> 2020-10-14
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸，其为用于扩增ApoE基因片段的正向引物，
所述基因片段包含编码对应于第112位氨基酸残基者。
<400> 1
caaggagctg caggcgg 17
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸，其为用于扩增ApoE基因片段的反向引物，
所述基因片段包含编码对应于第112位氨基酸残基者。
<400> 2
cagctcctcg gtgctctg 18
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸，其为用于扩增ApoE基因片段的正向引物，
所述基因片段包含编码对应于第112位氨基酸残基者。
<400> 3
ggcgcaggcc cggct 15
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸，其为用于扩增ApoE基因片段的反向引物，
所述基因片段包含编码对应于第112位氨基酸残基者。
<400> 4
cggcgccctc gcgg 14
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸，其为用于扩增ApoE基因片段的正向引物，
所述基因片段包含编码对应于第158位氨基酸残基者。
<400> 5
cgcaagctgc gtaagcg 17
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸，其为用于扩增ApoE基因片段的反向引物，
所述基因片段包含编码对应于第158位氨基酸残基者。
<400> 6
cgcggatggc gctgag 16
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸，其为用于扩增ApoE基因片段的正向引物，
所述基因片段包含编码对应于第158位氨基酸残基者。
<400> 7
cgtaagcggc tcctccg 17
<210> 8
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸，其为用于扩增ApoE基因片段的反向引物，
所述基因片段包含编码对应于第158位氨基酸残基者。
<400> 8
cggcgccctc gcgg 14
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸，其为用于检测所扩增的ApoE基因片段的探针，
所述基因片段包含对应于第112位氨基酸残基的野生型基因多态性。
<400> 9
ggacgtgtgc ggccg 15
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸，其为用于检测所扩增的ApoE基因片段的探针，
所述基因片段包含对应于第112位氨基酸残基的突变型基因多态性。
<400> 10
ggacgtgcgc ggccg 15
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸，其为用于检测所扩增的ApoE基因片段的探针，
所述基因片段包含对应于第158位氨基酸残基的野生型基因多态性。
<400> 11
ctgcagaagc gcctggc 17
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸，其为用于检测所扩增的ApoE基因片段的探针，
所述基因片段包含对应于第158位氨基酸残基的突变型基因多态性。
<400> 12
ctgcagaagt gcctggc 17
<210> 13
<211> 244
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> misc_feature
<223> 包含对应于第112位氨基酸残基的基因多态性的区域的ApoE基因序列。
<220>
<221> variation
<222> (122)..(124)
<223> 对应于第112位氨基酸残基的野生型密码子。
<400> 13
gaaggcctac aaatcggaac tggaggaaca actgaccccg gtggcggagg agacgcgggc 60
acggctgtcc aaggagctgc aggcggcgca ggcccggctg ggcgcggaca tggaggacgt 120
gtgcggccgc ctggtgcagt accgcggcga ggtgcaggcc atgctcggcc agagcaccga 180
ggagctgcgg gtgcgcctcg cctcccacct gcgcaagctg cgtaagcggc tcctccgcga 240
tgcc 244
<210> 14
<211> 208
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> misc_feature
<223> 包含对应于第158位氨基酸残基的基因多态性的区域的ApoE基因序列。
<220>
<221> variation
<222> (135)..(137)
<223> 对应于第158位氨基酸残基的野生型密码子。
<400> 14
gccgcctggt gcagtaccgc ggcgaggtgc aggccatgct cggccagagc accgaggagc 60
tgcgggtgcg cctcgcctcc cacctgcgca agctgcgtaa gcggctcctc cgcgatgccg 120
atgacctgca gaagcgcctg gcagtgtacc aggccggggc ccgcgagggc gccgagcgcg 180
gcctcagcgc catccgcgag cgcctggg 208

Claims (20)

1.一种基因多态性检测方法，其用于检测采自被检者的基因组DNA中存在的载脂蛋白E的基因多态性，所述方法包括下述的步骤1～3：
步骤1：使DNA从采自被检者的包含上皮细胞的外分泌液或粘液中游离而制作包含该DNA的被检体；
步骤2：向包含该DNA的被检体中添加下述(1)～(3)并进行混合，(1)PCR酶；
(2)用于扩增载脂蛋白E基因的核酸片段的PCR引物对，其包含编码载脂蛋白E的第112位或第158位的氨基酸残基(Cys或Arg)的密码子；以及，
(3)荧光标记探针组，所述荧光标记探针组为具有包含编码载脂蛋白E的第112位的氨基酸残基为野生型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针与具有包含编码该第112位的氨基酸残基为突变型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针所组成的组，并且用于标记的荧光色素彼此不同，
或者，所述荧光标记探针组为具有包含编码载脂蛋白E的第158位的氨基酸残基为野生型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针与具有包含编码该第158位的氨基酸残基为突变型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针所组成的组，并且用于标记的荧光色素彼此不同；
步骤3：对所述混合物进行PCR，从其PCR产物测定与该被检者的载脂蛋白E的第112位或第158位的氨基酸残基对应的荧光强度。
2.根据权利要求1所述的基因多态性检测方法，其中，在所述步骤1中，使用表面活性剂和蛋白酶K使DNA游离。
3.根据权利要求2所述的基因多态性检测方法，其中，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，向所述被检体中还添加包含氯化钾、氯化镁和dNTP混合物的Tris盐酸缓冲液并进行混合。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，向所述被检体中还添加下述物质并进行混合，所述物质是与吸附于PCR酶的生物来源的负电荷物质和吸附于DNA的生物来源的正电荷物质这样的抑制PCR的物质结合、从而中和该负电荷物质和正电荷物质的PCR抑制作用的物质。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，所述外分泌液或粘液为唾液。
7.根据权利要求6所述的基因多态性检测方法，其中，利用棉棒、脱脂棉、吐出、DNA采集试剂盒来采集所述唾液。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，所述PCR引物对为下述的序列号1与序列号2、或序列号3与序列号4、或序列号5与序列号6、或序列号7与序列号8所示的碱基序列所成的对，
正向：5’-CAAGGAGCTGCAGGCGG-3’···(序列号1)
反向：5’-CAGCTCCTCGGTGCTCTG-3’···(序列号2)
正向：5’-GGCGCAGGCCCGGCT-3’···(序列号3)
反向：5’-CGGCGCCCTCGCGG-3’···(序列号4)
正向：5’-CGCAAGCTGCGTAAGCG-3’···(序列号5)
反向：5’-CGCGGATGGCGCTGAG-3’···(序列号6)
正向：5’-CGTAAGCGGCTCCTCCG-3’···(序列号7)
反向：5’-CGGCGCCCTCGCGG-3’···(序列号8)。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，荧光标记探针中的、包含编码载脂蛋白E的第112位的氨基酸残基为野生型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的碱基序列和包含编码该第112位的氨基酸残基为突变型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的碱基序列分别为下述的序列号9和序列号10所示的碱基序列，包含编码载脂蛋白E的第158位的氨基酸残基为野生型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的碱基序列和包含编码该第158位的氨基酸残基为突变型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的碱基序列分别为下述的序列号11和序列号12所示的碱基序列，
5’-GGACGTGTGCGGCCG-3’···(序列号9)
5’-GGACGTGCGCGGCCG-3’···(序列号10)
5’-CTGCAGAAGCGCCTGGC-3’···(序列号11)
5’-CTGCAGAAGTGCCTGGC-3’···(序列号12)。
10.一种基因多态性判定方法，其用于判定采自被检者的基因组DNA中存在的载脂蛋白E的基因多态性，所述方法包括下述的步骤1和2：
步骤1：通过权利要求1～9中任一项所述的基因多态性检测方法获得基于第112位的氨基酸残基和第158位的氨基酸残基的扩增曲线的工序；
步骤2：
工序(a)：在前述工序所获得的基于第112位的氨基酸残基的扩增曲线中，
仅来自具有包含编码野生型Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针(第112位Cys探针)的荧光强度观察到实质性增加，来自具有包含编码突变型Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针(第112位Arg探针)的荧光强度未观察到实质性增加，并且，
在前述工序所获得的基于第158位的氨基酸残基的扩增曲线中，
仅来自具有包含编码野生型Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针(第158位Arg探针)的荧光强度观察到实质性增加，来自具有包含编码突变型Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针(第158位Cys探针)的荧光强度未观察到实质性增加，这种情况下判定为载脂蛋白E3/E3；
工序(b)：在前述工序所获得的基于第112位的氨基酸残基的扩增曲线中，
仅来自第112位Cys探针的荧光强度观察到实质性增加，来自第112位Arg探针的荧光强度未观察到实质性增加，并且，
在前述工序所获得的基于第158位的氨基酸残基的扩增曲线中，
来自第158位Arg探针的荧光强度未观察到实质性增加，仅来自第158位Cys探针的荧光强度观察到实质性增加，这种情况下判定为载脂蛋白E2/E2；
工序(c)：在前述工序所获得的基于第112位的氨基酸残基的扩增曲线中，
仅来自第112位Cys探针的荧光强度观察到实质性增加，来自第112位Arg探针的荧光强度未观察到实质性增加，并且，
在前述工序所获得的基于第158位的氨基酸残基的扩增曲线中，
来自第158位Arg探针的荧光强度观察到实质性增加，且来自第158位Cys探针的荧光强度也观察到实质性增加，这种情况下判定为载脂蛋白E2/E3；
工序(d)：在前述工序所获得的基于第112位的氨基酸残基的扩增曲线中，
来自第112位Cys探针的荧光强度未观察到实质性增加，仅来自第112位Arg探针的荧光强度观察到显著增加，并且，
在前述工序所获得的基于第158位的氨基酸残基的扩增曲线中，
仅来自第158位Arg探针的荧光强度观察到实质性增加，来自第158位Cys探针的荧光强度未观察到实质性增加，这种情况下判定为载脂蛋白E4/E4；
工序(e)：在前述工序所获得的基于第112位的氨基酸残基的扩增曲线中，
来自第112位Cys探针的荧光强度和来自第112位Arg探针的荧光强度均观察到实质性增加，并且
在前述工序所获得的基于第158位的氨基酸残基的扩增曲线中，
仅来自第158位Arg探针的荧光强度观察到实质性增加，来自第158位Cys探针的荧光强度未观察到实质性增加，这种情况下判定为载脂蛋白E3/E4；或者，
工序(f)：在前述工序所获得的基于第112位的氨基酸残基的扩增曲线中，
来自第112位Cys探针的荧光强度和来自第112位Arg探针的荧光强度均观察到实质性增加，并且，
在前述工序所获得的基于第158位的氨基酸残基的扩增曲线中，
来自第158位Arg探针的荧光强度和来自第158位Cys探针的荧光强度均观察到实质性增加，这种情况下判定为载脂蛋白E2/E4。
11.一种试剂盒，其用于检测或判定采自被检者的基因组DNA中存在的载脂蛋白E的基因多态性，所述试剂盒包含下述的(1)～(3)：
(1)PCR酶；
(2)用于扩增载脂蛋白E基因的核酸片段的PCR引物对，其包含编码载脂蛋白E的第112位或第158位的氨基酸残基(Cys或Arg)的密码子；以及，
(3)荧光标记探针组，所述荧光标记探针组为具有包含编码载脂蛋白E的第112位的氨基酸残基为野生型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针与具有包含编码该第112位的氨基酸残基为突变型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针所组成的组，并且用于标记的荧光色素彼此不同，
或者，所述荧光标记探针组为具有包含编码载脂蛋白E的第158位的氨基酸残基为野生型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针与具有包含编码该第158位的氨基酸残基为突变型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针所组成的组，并且用于标记的荧光色素彼此不同。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其还包含表面活性剂和蛋白酶K。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠。
14.根据权利要求11～13中任一项所述的试剂盒，其还包含含有氯化钾、氯化镁和dNTP混合物的Tris盐酸缓冲液。
15.根据权利要求11～14中任一项所述的试剂盒，其还包含下述物质，所述物质是与吸附于PCR酶的生物来源的负电荷物质和吸附于DNA的生物来源的正电荷物质这样的抑制PCR的物质结合、从而中和该负电荷物质和正电荷物质的PCR抑制作用的物质。
16.根据权利要求11～14中任一项所述的试剂盒，其还包含棉棒、脱脂棉、唾液采集器具、DNA采集试剂盒。
17.根据权利要求11～16中任一项所述的试剂盒，其中，所述PCR引物对为下述的序列号1与序列号2、或序列号3与序列号4、或序列号5与序列号6、或序列号7与序列号8所示的碱基序列所成的对，
正向：5’-CAAGGAGCTGCAGGCGG-3’···(序列号1)
反向：5’-CAGCTCCTCGGTGCTCTG-3’···(序列号2)
正向：5’-GGCGCAGGCCCGGCT-3’···(序列号3)
反向：5’-CGGCGCCCTCGCGG-3’···(序列号4)
正向：5’-CGCAAGCTGCGTAAGCG-3’···(序列号5)
反向：5’-CGCGGATGGCGCTGAG-3’···(序列号6)
正E向：5’-CGTAAGCGGCTCCTCCG-3’···(序列号7)
反向：5’-CGGCGCCCTCGCGG-3’···(序列号8)。
18.根据权利要求11～17中任一项所述的试剂盒，其中，荧光标记探针中的、包含编码载脂蛋白E的第112位的氨基酸残基为野生型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的碱基序列和包含编码该第112位的氨基酸残基为突变型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的碱基序列分别为下述的序列号9和序列号10所示的碱基序列，包含编码载脂蛋白E的第158位的氨基酸残基为野生型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的碱基序列和包含编码该第158位的氨基酸残基为突变型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的碱基序列分别为下述的序列号11和序列号12所示的碱基序列，
5’-GGACGTGTGCGGCCG-3’···(序列号9)
5’-GGACGTGCGCGGCCG-3’···(序列号10)
5’-CTGCAGAAGCGCCTGGC-3’···(序列号11)
5’-CTGCAGAAGTGCCTGGC-3’···(序列号12)。
19.一种痴呆症诊断系统，其包含权利要求11～18中任一项所述的试剂盒并且包含MRI或CT。
20.根据权利要求19所述的痴呆症诊断系统，其中，所述痴呆症为阿尔茨海默型痴呆症。
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