WO2019108085A1 - Способ определения активности теломеразы методом двойной амплификации теломерных повторов в реальном времени - Google Patents

Способ определения активности теломеразы методом двойной амплификации теломерных повторов в реальном времени Download PDF

Info

Publication number
WO2019108085A1
WO2019108085A1 PCT/RU2017/001002 RU2017001002W WO2019108085A1 WO 2019108085 A1 WO2019108085 A1 WO 2019108085A1 RU 2017001002 W RU2017001002 W RU 2017001002W WO 2019108085 A1 WO2019108085 A1 WO 2019108085A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
primer
sequence
seq
homologous
telomerase
Prior art date
Application number
PCT/RU2017/001002
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Александр Иванович ГЛУХОВ
Денис Сергеевич НАЛОБИН
Сергей Андреевич ГОРДЕЕВ
Сергей Николаевич КАЛАБУШЕВ
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "Научно-Исследовательский Центр Молекулярной Биомедицины" (ООО "НИЦ МолБиоМед")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "Научно-Исследовательский Центр Молекулярной Биомедицины" (ООО "НИЦ МолБиоМед") filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "Научно-Исследовательский Центр Молекулярной Биомедицины" (ООО "НИЦ МолБиоМед")
Publication of WO2019108085A1 publication Critical patent/WO2019108085A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the invention relates to biology, medicine, oncology, veterinary medicine, reproduction, and can be used, in particular, to determine the activity of telomerase in the diagnosis of malignant tumors, in the preparatory stages in the application of assisted reproductive technologies, scientific research, etc.
  • Telomeres are the end sections of chromosomes that shorten with each cell division. Telomerase is a ribonucleoprotein complex that completes telomeres, thereby compensating for their shortening. High telomerase activity is characteristic of embryonic, germ, and stem cells. In the tissues of a healthy person, normal, with the exception of a number of organs, telomerase activity is completely absent and begins to manifest itself during oncogenesis. Telomerase activity is a universal marker for 85% of malignant tumors. This allows us to develop modern highly sensitive and highly specific kits for the diagnosis of most malignant tumors, including in the early stages of the disease.
  • telomerase activity is not an easy task, since a characteristic feature is the low number of copies per cell, and, consequently, low activity, even in tumor cells where telomerase is activated.
  • the use of the determination of telomerase activity in diagnostic tests is very promising, since a positive result can be obtained if there are only a few telomerase-positive tumor cells in the sample.
  • samples obtained by non-invasive and minimally invasive methods may be suitable for diagnosis.
  • telomerase activity can be used in the field of assisted reproductive technologies, both in reproductive medicine and in agriculture, to determine the quality of spermatozoa, oocytes and eggs of vertebrate animals and humans.
  • the determination of telomerase activity can be carried out in follicular cells (cumulus cells and granulosa cells) to predict the outcomes of assisted reproductive technology programs, and also for the diagnosis of a number of diseases of the reproductive system, for example, ovarian failure syndrome.
  • this method can be used to study the effects of drugs that affect the mechanisms of aging through the stabilization / destabilization of telomere length.
  • telomerase To determine the activity of telomerase, if there are inhibitors in the sample, first of all, a reliable method is needed. In some cases, due to the low concentration of telomerase in the cell (100 molecules per cell), the detection of telomerase components and its activity becomes a complex process.
  • the first method used to study telomerase was the direct method for the detection of telomerase activity. This method is based on the elongation of the primer by telomerase in the cell extract in the presence of a radioactively labeled nucleotide, which is included in the telomeric repeat. Next, the elongation products are analyzed by electrophoresis. This method is very reliable, it shows not only the activity, but also the number of added telomeric repeats. However, this method has limited sensitivity, which requires a significant amount of cell sample and radioactive material, which often limits the use of this method in conventional research and clinical diagnostic laboratories.
  • telomerase activity (TRAP - Telomeric Repeat Amplification Protocol) is considered ineffective when a very small amount of cellular material is analyzed. This makes it impossible to conduct a non-invasive diagnosis of a number of diseases when the amount of cellular material is small. In this regard, the development of more sensitive variants of TRAP analysis is a very urgent task of biology and medicine.
  • the objective of the invention is to develop a method for quantitative determination of telomerase activity, ensuring its high sensitivity and specificity when conducting analysis in biological samples, including samples containing a low amount of telomerase-positive cells and / or inhibitors of telomerase.
  • RT-TRAP-2PCR a method for determining the telomerase activity by the method of double amplification of telomeric repeats in real time
  • a method for detecting and / or quantifying telomerase activity in a biological sample of a eukaryotic organism comprising the following steps:
  • telomerizing oligonucleotide and deoxynucleoside triphosphates or their labeled derivatives, under conditions suitable for telomerase producing elongation products based on a telomerizing oligonucleotide for a sufficient amount of eloxidation product based on the telomerizing oligonucleotide for iodine iodine elongation products based on a telomerizing oligonucleotide oligonucleotide oligonucleotides
  • step (3) carrying out real-time polymerase chain reaction (PCR N ° 2) In the reaction mixture obtained in step (3), with the addition of at least one primer pair, one of which is capable of complementary interaction with the chain of telomeric repeats, and the other - with its complementary chain, and under conditions suitable for amplifying the product obtained in step (3);
  • the biological sample is a biological sample of a vertebrate animal or human.
  • the vertebrate animal is a mammal.
  • the biological sample is tissue, fluid, or individual cells isolated from a living organism.
  • the telomerization oligonucleotide has a sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, or a sequence that is homologous to at least 80% of one of these sequences, more preferably homologous at least 90%, even more preferably homologous at least 95%.
  • a primer of the form is used in step (3).
  • V is a chain of 0-20 nucleotide residues independently selected from A, C, T, G,
  • W is selected from C, CC, CCC, CCST, CSTV, CSTAA,
  • k is an integer from 1 to 3.
  • a primer in step (3), having the sequence of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or a primer having a sequence homologous to at least 80% of one of these sequences, more than preferably homologous to at least 90%, even more preferably homologous to at least 95%.
  • a pair of primers is used in step (4), one of which is a primer of the form:
  • Y 7 Y 8 are independently selected from AG, GT, GG, TA or TT,
  • Yvy’e are independently selected from AA, CC, TS, CA, CT or AT,
  • n, m - independently selected from integers from 1 to 8,
  • the length of the primer independently is not less than 18, but not more than 55 nucleotides.
  • a primer pair is used, consisting of
  • TelG primer having the sequence of SEQ ID NO: 8 or a sequence at least 80% homologous to it; and TeO primer having the sequence of SEQ ID NO: 9 or a sequence at least 80% homologous to it and constructed according to the rules as described above; or Tel 1 primer having the sequence of SEQ ID NO: 10, or at least 80% homologous to it; and Te12-primer having the sequence of SEQ ID NO: 11 or a sequence that is at least 80% homologous to it and constructed according to the rules as described above; or
  • Tel 1 primer having the sequence of SEQ ID NO: 10 or a sequence at least 80% homologous to it; and Te12b-primer having the sequence of SEQ ID NO: 12 or a sequence that is at least 80% homologous to it and constructed according to the rules as described above.
  • the method includes the preliminary preparation of a biological sample.
  • the primer in any of the steps is independently a fluorescently labeled primer, a luminescently labeled primer, a primer, radiolabelled or a biotinylated primer.
  • the labeled deoxynucleoside triphosphate derivatives are biotinylated nucleotides or fluorescent labeled nucleotides containing chemical modifications (such as quenchers and fluorescence emitters).
  • the present invention also relates to the use of a method for detecting and / or quantifying telomerase activity in a biological sample. for the diagnosis of cancer in humans or vertebrates.
  • the biological sample contains no more than 10 cells, more specifically, no more than 10 telomerase-positive cells or potentially telomerase-positive cells (in the case of analysis of tumor tissues - no more than 10 tumor cells).
  • the present invention also relates to the use of a method for detecting and / or quantifying the activity of telomerase in a biological sample in the field of assisted reproductive technologies for assessing the quality of spermatozoa, eggs and oocytes (cumulus cells, i.e., granulose cells surrounding the oocyte itself) and other vertebrate animals or person.
  • the present invention also relates to the use of a method for detecting and / or quantifying telomerase activity in a biological sample for studying the effect of anti-aging drugs and stabilizing telomere length in vertebrate animals or humans.
  • the invention also relates to the determination of telomerase activity in various cells for the diagnosis of a number of diseases, for example, in granulosa cells, for the diagnosis of a number of diseases of the reproductive system (such as ovarian failure syndrome).
  • the present invention also relates to a kit for detecting and / or quantifying telomerase activity by the method according to the invention, comprising at least a telomerization oligonucleotide, deoxyribonucleoside triphosphates dATP, dGTP, dCTP, dTTP or their labeled derivatives; a primer complementary to telomeric repeats in the genome of the biological object under study; as well as a pair of primers, one of which is capable of complementarily interacting with a chain of telomeric repeats, and the other with a chain complementary to it, in quantities sufficient to conduct telomerase activity analysis.
  • the kit further comprises an extract of the tumor cell line or synthetic double-stranded matrix ds (GGGTTA / CCCAAT) n (n is an integer reflecting the number of repetitions; in preferred embodiments, n is chosen from 4 to 16, in the most preferred from 8 to 9) used as a positive control.
  • GGGTTA / CCCAAT synthetic double-stranded matrix ds
  • composition of the kit according to the invention also includes buffer solutions and components necessary for the creation of conditions for the implementation of the relevant steps of the method for detecting and / or quantifying the telomerase activity in biological sample.
  • Each of the components of the kit is used in an amount at least sufficient for analysis.
  • the execution of the invention telomerizing oligonucleotide included in the set has the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or a sequence that is homologous to at least 80% of one of these sequences, more preferably homologous to at least 90%, even more preferably homologous to at least 95%.
  • the kit as a primer, complementary telomeric repeats in the genome of the studied biological object includes a primer of the form
  • V is a chain of 0-20 nucleotide residues independently selected from A, C, T, G,
  • W is chosen from C, CC, CCC, CCST, CSTV, CSTA,
  • k is an integer from 1 to 3.
  • the kit contains a primer having the sequence SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, or a primer having a sequence homologous to at least 80% of one of these sequences.
  • a pair of primers one of which is capable of complementary interaction with the chain of telomeric repeats, and the other with a chain complementary to it, includes a pair of primers, one of which is a primer of the form:
  • Y 7 Y 8 are independently selected from AG, GT, GG, TA or TT,
  • Y ′ 7 Y ′ 8 is independently selected from AA, CC, TC, CA, CT, or AT,
  • n, m - independently selected from integers from 1 to 8,
  • the length of the primer independently is not less than 18, but not more than 55 nucleotides.
  • a primer pair consisting of TelG primer having the sequence of SEQ ID NO: 8 or a sequence at least 80% homologous to it; and TeO primer having the sequence of SEQ ID NO: 9 or a sequence at least 80% homologous to it and constructed according to the rules as described above; or
  • TeI primer having the sequence of SEQ ID NO: 10, or a sequence at least 80% homologous to it
  • Te12-primer having the sequence of SEQ ID NO: 11 or a sequence that is at least 80% homologous to it and constructed according to the rules as described above; or
  • TeI primer having the sequence of SEQ ID NO: 10 or a sequence at least 80% homologous to it
  • Te12b-primer having the sequence of SEQ ID NO: 12 or a sequence that is at least 80% homologous to it and constructed according to the rules as described above.
  • At least one of the primers included in the kit is independently a fluorescently labeled primer, a luminescently labeled primer, a primer, radiolabelled or a biotinylated primer.
  • the labeled deoxynucleoside triphosphate (dNTP, dNTP) derivatives dATP, dGTP, dCTP, dTTP, included in the kit are biotinylated nucleotides or fluorescently labeled nucleotides containing chemical modifications (representing quenchers) and imitants and quenchers, and imitators and quithers.
  • the composition of the kit includes Tris-HCI, MgCI 2 , EGTA, PMSF, b-mercaptoethanol, CHAPS, glycerin, Coomassie Brilliant Blue G-250, (NH 4 ) 2 S0 4 , Tween-20, dNTPs, TS primer, CX primer, tumor cell line extract, DNA polymerase, SYBR Green I, ROX, betain, TelG primer, TelC primer, each of which is included in the kit in an amount at least sufficient carrying out the detection and / or quantitative determination of telomerase activity in a biological sample of vertebrate animals or humans by double amplification of telomeric tori realtime (RT-TRAP-2PCR).
  • RT-TRAP-2PCR double amplification of telomeric tori realtime
  • the developed method allows the analysis of telomerase activity in the presence of various impurities of nucleic acids, proteins and other components of cells and tissues characteristic of clinical samples, while samples obtained by non-invasive and minimally invasive methods may be suitable for diagnosis;
  • the developed method allows efficient analysis in samples with a low content of telomerase-positive cells, as well as in the presence of telomerase inhibitors, while avoiding the appearance of false-negative results;
  • the method is simple in preparation and operation, has a low cost.
  • Fig. 1A Analysis of samples of lysates of the K562 cell line (human chronic promyelocytic leukemia) containing different numbers of cells and equivalent to different levels of telomerase activity (AT) using the RT-TRAP-2PCR method:
  • Fig. 1B Electrophoresis of TRAP-assay products of telomerase activity in extracts of the K562 cell line containing different cell numbers and equivalent to different levels of telomerase activity (AT) (10% polyacrylamide gel electrophoresis (PAAG), stained with SYBR Gold dye, photo in UV light).
  • AT telomerase activity
  • PAAG polyacrylamide gel electrophoresis
  • Track 1 is a positive control sample (100 cells
  • Track 5 is a negative control sample (0% AT).
  • Fig.1 C Linear regression between the telomerase activity (the number of cells in the lysate of the K562 cell line) and the threshold cycle value (C t ) in the analysis of telomerase activity using the RT-TRAP-2PCR method.
  • Fig.2A Electrophoresis of the products of TRAP-analysis of telomerase activity in cell extracts obtained from a cell urine sediment and tissue sample after a biopsy was performed on a patient diagnosed with bladder cancer (stage T1 N0M0G1) (10% polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) stained with SYBR Gold dye, photo in UV light). Analysis of protein extracts from samples of cell urine sediment (lanes 1-4) and bladder tissue (MP, lanes 5-8). The reaction samples contained different amounts of extract protein: 8 ⁇ g (lanes 1 and 5), 4 ⁇ g (lanes 2 and 6), 2 ⁇ g (lanes 3 and 7) and 0.7 ⁇ g (lanes 4 and 8). K - - negative control sample (TRAP in the absence of protein extract), I - positive control - 0.04 ⁇ g of protein extract of the K562 cell line was added;
  • Fig. 2B Analysis of telomerase activity by the RT-TRAP-2PCR method in the clinical material of a patient with bladder cancer:
  • telomeric repeat amplification products by RT-TRAP-2PCR in the samples of the reaction mixtures of lysates of cellular urine sediment (curves Ns 1-4) and tissue (curves Ns5-8) of the same patient (bladder cancer, stage T1 N0M0G1) with different protein content in the extract: 8 ⁇ g (curves Ns 1 and 5), 4 ⁇ g (curves Ns 2 and 6), 2 ⁇ g (curves Ns 3 and 7), 0.7 ⁇ g (curves Ns 4 and 8).
  • Fig. 3 Curves of accumulation of telomeric repeat amplification products by RT-TRAP-2PCR in samples of reaction mixtures of lysates of clinical material from 5 different patients diagnosed with pancreatic cancer (curves 1-5).
  • ⁇ ⁇ - positive control sample 100 cells of the K562 line - 100% of telomerase activity
  • K- - negative control sample 0% of telomerase activity
  • the fluorescence yield in sample K- is the result of non-specific amplification of the duplex of primers TS and CX.
  • Fig. 4 Curves of accumulation of telomeric repeat amplification products by the RT-TRAP-2PCR method in samples of reaction mixtures of lysates of clinical material from 3 patients diagnosed with gastric cancer (curves 1-3).
  • K * - positive control sample 100 cells of the K562 line - 100% telomerase activity
  • K “ - negative control sample 0% telomerase activity).
  • the yield of fluorescence in sample K is the result of non-specific amplification of the duplex of primers TS and CX.
  • Fig.5. Comparative sensitivity analysis of the standard RT-TRAP method (dashed line) and the TRAP method using magnetic force microscopy (solid line). Used synthetic ds (GGGTTA / CCCAAT) 9 matrix.
  • RTA units
  • 6T2 ms
  • magnetic field distortion disortion of changes in the magnetic field
  • Fig. 6 Determination of the sensitivity of the RT-TRAP-2PCR method using a synthetic ds (GGGTTA / CCCAAT) 9 matrix.
  • RT-TRAP-2PCR is a method of real-time dual amplification of telomeric repeats (Real-Time - Telomeric Repeat Amplification Protocol - 2 Polymerase Chain Reaction).
  • telomerase an enzyme that adds telomeric repeats (TTAGGG repeats in humans and vertebrates) to the 3'-end of the DNA chain at telomeres at the ends of chromosomes
  • telomerase of any eukaryotic organisms.
  • human or vertebrate telomerase is meant.
  • telomerizing oligonucleotide any oligonucleotide whose sequence does not coincide with the telomeric sequence, but which is suitable as a substrate for telomerase.
  • examples of such a telomerizing oligonucleotide (but not limited to) in determining the activity of telomerase in biological samples of vertebrate animals or humans may be oligonucleotides having the sequence 5'- ATTCCGTCGAGCAGAGTT-3 '(SEQ ID NO: 1, known as TS-primer), 5 '- AATCCGTCGAGCGAGGTT-3' (SEQ ID NO: 2), 5 -AGAGTT CCCCAAGGGGAG-3 '(SEQ ID NO: 3), 5'-GGGATTGGGATTGGGATTGGGTT-3' (SEQ ID NO: 4, known as TSG4, GHGGATTGGGTT-3 '(SEQ ID NO: 4, known as TSG4) having a sequence homologous to at least 80% of one
  • PCR s1 is a polymerase chain reaction, during which amplification of the products of elongation of telomerizing oligonucleotides, resulting from their elongation by telomerase by adding telomeric repeats, occurs.
  • the formation of complementary chains to single-stranded DNA which are the products of the elongation of telomerizing oligonucleotides, occurs.
  • the resulting double-stranded DNA is amplified.
  • a direct primer in PCR N ° 1 a telomerizing oligonucleotide acts, selected as telomerase substrate.
  • a primer is used that is complementary to telomeric repeats in the genome of the biological object under study.
  • the principles for designing PCR primers are well known to those skilled in the art. When designing, it is necessary that the primer has a structure that is complementary to the G-rich telomeric repeat, but does not form duplexes with the elongation primer, and also has a complementary telomeric repeat area from the 3 'end.
  • the implementation of the invention in determining the activity of telomerase in biological samples of vertebrate animals or humans as a reverse primer can be used primer species
  • V is a chain of 0-20 nucleotide residues independently selected from A, C, T, G, W is selected from C, CC, CAS, CSTS, CSTSA, CSTAA, and k is an integer from 1 to 3.
  • a primer having the sequence 5'-CSTTSSSTTCSSSTASSSTA-3 is used '(SEQ ID NO: 5, known as CX primer), 5'-GCGCGCCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3' (SEQ ID NO: 6, known as ACX primer), 5'-TAGAGCACAGCCTGTCCGTG (CTAACC) 3 (SEQ ID NO: 7 known as XRDF primer) or primer having a sequence homologous to at least 80% of one of these sequences, more preferably, homologous by at least 90%, even more preferably homologous by at least 95%.
  • primers are meant which do not form complementary complexes with non-targeted portions of DNA, i.e. their use does not lead to the emergence of non-specific products.
  • PCR Ns2 is a polymerase chain reaction, during which the amplification of DNA chain fragments obtained as a result of PCR Ns1 occurs.
  • a pair of primers is used, one of which is capable of complementary interaction with the telomeric repeat chain, and the other with the chain complementary to it, it is important that the primers do not form dimers (duplexes) between themselves at least, did not interfere with the PCR reaction).
  • the implementation of the invention in determining the activity of telomerase in biological samples of vertebrate animals or humans during PCR N ° 2 can be used a pair of primers
  • Y 7 Y 8 are independently selected from AG, GT, GG, TA or TT
  • YVY's are independently selected from AA, CC, TC, CA, CT or AT
  • an, m are independently selected from integers from 1 to 8
  • the length of the primer is independently not less than 18 but not more than 55 nucleotides. In preferred embodiments, the difference in the length of the primers should not be more than 20%.
  • primer pairs having the following sequences can be used as primers during PCR Ns2:
  • primers homologous to them at least 80%, more preferably, at least 90%, even more preferably at least 95%.
  • the Ne2 PCR is performed in real time (qRT-PCR), including the detection and quantitative determination of the total content of all telomeric repeats ((TTAGGG) n for vertebrates, including humans), which is provided by measuring the amount of amplified DNA in real time after each amplification cycle.
  • qRT-PCR real time
  • any of the known methods can be used, for example, using fluorescent dyes (for example, SYBR Green) intercalating into double-stranded DNA molecules, or using modified oligonucleotides (DNA probes) that fluoresce after hybridization with complementary regions DNA
  • thermostable DNA polymerase enzyme known to those skilled in the art can be used, including, but not limited to, Taq DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, Tth DNA polymerase.
  • the PCR reaction mixture also typically includes a magnesium salt (for example, MgCI 2 ), in order to ensure optimal conditions for PCR amplification.
  • percent homology of two sequences is defined by the number of positions of identical nucleotides in these two sequences, while differences in homologous sequences can be associated with the presence of deletions, insertions of 3 'and / or 5' - and / or nucleotide substitutions; those. structural homology is meant, provided, however, that the homologous sequence does not lose its original function.
  • a “biological sample” includes tissues, cells and biological fluids isolated from a subject, as well as tissues, cells and biological fluids present in the subject.
  • the biological sample also includes primary cells, transformed cells and any other cultured cells.
  • the biological sample is a cell or tissue extract, in particular an extract from human cells or tissues.
  • the extract can be obtained by re-thawing / freezing the cells, homogenizing the cells or tissues, or lysing the cells or tissues in a lysis buffer containing non-ionic and / or zwitterionic detergent.
  • non-ionic detergent examples include, but are not limited to, Tween 20, Triton X-100, Triton X-114, Polidocanol (Thesit), NP-40, n-octyl glucoside, p-dodecyl glucoside, p-dodecyl-beta-D-maltose, Octanoyl-M-methylglucamide (MEGA-8), decanoyl-1M-methylglucamide (MEGA-10) and isotridecyl-poly (ethylene glycol ether) p.
  • zwitterionic detergents include, but are not limited to, CHAPS (3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonium] -1-propanesulfonate), CHAPSO (3 - [(3-cholamidopropyl) dimethyl-ammonium] -2-hydroxy-1-propanesulfonate ), N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonium-1-propanesulfonate and digitonin. Since telomerase contains both RNA and protein components, protease and / or RNase inhibitors can be added to the extract to prevent telomerase destruction in the extract by other cellular proteases.
  • protease inhibitors include, but are not limited to, amasten, 4-amidinophenylmethanesulfonylfluoride (aus.), Antipain, aprotinin, bestatin, chymostatin, cystatin, 3,4-dichlorozoumarin, ebelacgon A and B, elastatin, ethylenediaminetetrauxuscrycerus, ebelatgon A and B, elastatin, ethylenediaminetetrauxuscrycerin, ebellagon A and B, elastatin, ethylenediaminetetrasucries, elastatin, ethylenediamine tetrasucrin, ebelagon A and B (EGTA), leupeptin, pepstatin A, phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), phosphoramidone, tosylsyl siloxyl ketone (TLCK), tosyl
  • Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) in the reaction mixture include, but are not limited to, dezoksiadenozintrifosfat (dATP), dezoksiguanozintrifosfat (dGTP), dezoksiuridintrifosfat (dUTP) dezoksitimidintrifosfat (dTTP) and dezoksitsitidintrifosfat (dCTP).
  • the reaction mixture contains dATP, dGTP, dCTP, and one of dUTP and dTTP in equal molar terms.
  • labeled derivatives of deoxynucleoside triphosphates can be used, for example, biotinylated nucleotides or fluorescently labeled nucleotides containing chemical modifications.
  • the reaction mixtures used at each stage of the analysis may also contain a buffer system to maintain the optimum pH for the telomerase primer extension reaction.
  • buffer systems include, but are not limited to, phosphate buffer system, citrate buffer system, borate buffer system, tris (hydroxymethyl) aminomethane, 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammoniol] -1- propanesulfonate (CHAPS), L- [ 2-hydroxyethyl] piperazine-M'-2- [ethanesulfonic acid] (HEPES) and 3- [N-morpholino] propanesulfonic acid (MOPS).
  • telomere elongation reaction is carried out at a temperature of about 20-30 ° C for about 10-60 minutes, preferably at a temperature of about 25 ° C or about 30 ° C for about 15-30 minutes. and most preferably at about 25 ° C for about 20 minutes.
  • fluorescent dyes can be used, for example, SYBR Green I or SYBR Gold, fluorescently-labeled primers, luminescently-labeled primers, primers, radiolabelled, biotinylated primers.
  • the proposed method is based on the modification of the classical method for the determination of telomerase activity by the TRAP method.
  • a key feature of the proposed approach is the presence of a second sequential PCR reaction in real time (PCR Ns2) with another pair of primers.
  • PCR Ns2 a second sequential PCR reaction in real time
  • Nsl PCR the total content of telomeric repeats newly synthesized as a result of the first stage of PCR (Nsl PCR) with primers is measured, one of which is a telomerizing oligonucleotide, and the other is a primer complementary to telomeric repeats in the genome of the biological object under study (in particular examples inventions are, for example, primers TS and CX) in the sample under study, that is, in essence, a quantitative analysis is performed of the total content of all telomeric repeats (TTAGGG) n for vonochnyh and including humans.
  • TTAGGG total content of all telomeric repeats
  • the proposed method allows to achieve the following threshold cycle values (C t ): 10 cells lysate - 12 cycles, 4 cells from 100 cells.
  • the threshold cycle (C t ) in the proposed test system corresponds to the 4th cycle at maximum levels of telomerase activity. With minimal levels of telomerase activity, C t corresponds to the 18th cycle.
  • the calibration curves method can be used using the tumor cell line extract (with a known content of the number of telomerase molecules per cell) or a double-stranded synthetic matrix ds (GGGTTA / CCCAAT) n as a positive control.
  • RT-TRAP-PCR real-time PCR
  • the proposed method can be applied to the analysis of telomerase activity in a biological sample of any eukaryotic organism, ranging from unicellular (eg, protozoa, yeast), invertebrates, to higher plants and vertebrates, in particular mammals and humans, both in scientific research and in practical fields.
  • this method can be used in the field of oncology and veterinary medicine for the diagnosis of malignant neoplasms in vertebrates and humans.
  • telomere activity can be used in the field of assisted reproductive technologies, both in reproductive medicine and in agriculture, to determine the quality of spermatozoa, oocytes and egg cells of vertebrate animals and humans.
  • the determination of telomerase activity can be carried out in follicular cells (cumulus cells and granulosa cells) to predict the outcomes of assisted reproductive technology programs, as well as to diagnose a number of diseases of the reproductive system, such as ovarian failure syndrome.
  • this method can be used to study the effects of drugs that affect the mechanisms of aging through the stabilization / destabilization of telomere length.
  • the proposed method can be carried out as follows.
  • the biological sample is washed in a sterile solution of PBS (sodium phosphate buffer), or nat. the solution and then immediately frozen. Samples can be stored at -70 ° C.
  • PBS sodium phosphate buffer
  • CHAPS buffer containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM MgCI 2 , 1 mM EGTA, 0.1 mM PMSF, 5 mM b-mercaptoethanol, 0.5% (in / o) CHAPS and 10% (w / v) glycerol.
  • CHAPS buffer is added at the rate of 1 ⁇ l per 1000 cells.
  • the sample is then resuspended in buffer and incubated on ice for 30 minutes. During the incubation process, the sample is vigorously stirred every 5 minutes. on the Vortex for a few seconds.
  • the obtained cell extract is centrifuged at 12,000 g for 30 minutes. at + 4 ° C.
  • Ready-made extracts can be stored at -70 ° C.
  • the protein concentration in the cell and tissue extracts is determined using the Coomassie Brilliant Blue G-250 dye according to the Bradford method.
  • the elongation of the oligonucleotide substrate and the subsequent amplification is carried out in 50 ⁇ l of the reaction mixture containing 67 mM Tris-HC1 (pH 8.8); 16.6 mM (NH 4 ) 2 S0 4 ; 0.01% Tween-20; 1, 5 mM MgCl 2 ; 1 mM EGTA; 50 mM each from dNTP; 0.1 ⁇ g TS-primer.
  • 1 ⁇ l of cell extract of the K562 tumor cell line (chronic promyeloid leukemia) diluted with CHAPS lytic buffer and equivalent to 100 cells of the tumor line with a protein concentration of 0.04 ⁇ g / ⁇ l was used.
  • an extract containing 100 cells in 1 ⁇ l is diluted with lytic buffer CHAPS to final values of 10, 40, 80 cells per 1 ⁇ l.
  • lytic buffer CHAPS As a negative control, 1 ⁇ l of CHAPS buffer was used instead of the extract.
  • Telomerase-mediated TS primer elongation occurs when the reaction mixture is incubated at + 37 ° C for 25 minutes. At the end of the incubation, the mixture is incubated for 5 minutes. at +94 ° C for telomerase inactivation.
  • TRAP-PCR reaction N ° 1 (PCR N ° 1).
  • the reaction mixture is amplified for 35 cycles of PCR in the following mode: + 94 ° C - 60 s, + 50 ° C - 60 s, + 72 ° C - 90 s.
  • TRAP-PCR reaction N ° 2 (PCR Ns2).
  • PCR Ns2 TRAP-PCR reaction N ° 2
  • a volume of 25 ⁇ l containing 67 mm Tris-HCl (pH 8.8); 16.6 mM (NH 4 ) 2 S0; 0.01% Tween-20; 1, 5 mM MgCl 2 ; 50 mM each from dNTP; 0.9 ⁇ M TelG primer and Te primer, as well as 0.75 x SYBR Green I (dye), 1 x ROX (reference dye), 1M betaine, 1, 25 units.
  • SmarTaq DNA polymerase containing 67 mm Tris-HCl (pH 8.8); 16.6 mM (NH 4 ) 2 S0; 0.01% Tween-20; 1, 5 mM MgCl 2 ; 50 mM each from dNTP; 0.9 ⁇ M TelG primer and Te primer, as well as 0.75 x SYBR Green I (dye),
  • the protein extract is subjected to inhibitory analysis.
  • TRAP-analysis when setting TRAP-analysis to a telomerase-positive extract of the K562 tumor cell line (which is a positive reaction control) containing 0.04 ⁇ g of protein, 1 ⁇ l of the studied extract is added at both stages of the reaction - before the elongation of the oligonucleotide substrate by telomerase (check for inhibitors of telomerase and SmarTaq polymerase) and prior to the amplification stage of the obtained TRAP products (checking for the presence of inhibitors of SmarTaq polymerase only).
  • TRAP-RT-2PCR to detect telomerase activity.
  • fig. 1A The results of the analysis carried out in this way using the example of lysates of the K562 cell line, which contain different numbers of cells and are equivalent to different levels of telomerase activity (AT), are shown in fig. 1A.
  • fig. 1B shows the results of the analysis of the same samples using the classical TRAP method using electrophoretic separation of PCR products and photographing the gel.
  • the proposed modification of the TRAP method allows to increase the sensitivity of the method of analyzing the activity of telomerase and makes it possible to approach the quantitative analysis of telomerase activity.
  • Figure 1C shows a linear regression between the number of cells in the lysate of the K562 cell line and the value of the threshold cycle (C t ) in the analysis of telomerase activity using the RT-TRAP-2PCR method.
  • the presented data demonstrate a high sensitivity of the method (the threshold cycle value is only from 4 to 12 (with 10% AT)), confirming the ability to effectively carry out the analysis in samples with a low content of telomerase-positive cells, as well as in the presence of telomerase inhibitors, while avoiding the appearance of false-negative results.
  • Example 2 In this example, telomerase activity in cell urine sediment and a biopsy specimen of bladder tissue was evaluated.
  • the contents of all the tubes were evenly distributed into two 15 ml culture tubes and centrifuged for 10 minutes. at 2500 rpm, after which the procedure of washing the precipitates in 1 ml of a single solution of PBS was repeated. After that, the pellet in each tube was resuspended in 1 ml of PBS solution and transferred to two microtubes for 1.5 ml, then centrifuged on a microcentrifuge for 10 minutes. at 2500 rpm The supernatant was discarded, and the remainder of the liquid droplets in the tube with sediment was carefully removed with a strip of filter paper. Next, the cell pellet was frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ° C.
  • CHAPS buffer containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM MgCI 2 , 1 mM EGTA, 0.1 mM PMSF, 5 mM b-mercaptoethanol, 0.5% (in / o) CHAPS and 10% (w / v) glycerol.
  • CHAPS buffer was added at the rate of 1 ⁇ l per 1000 cells of the precipitate.
  • the cell pellet is then resuspended intensively in buffer and incubated on ice for 30 minutes. In the process of incubation, the precipitate is intensively mixed every 5 minutes. on the Vortex for a few seconds.
  • the obtained cell extract is centrifuged at 12000 g for 30 min at + 4 ° C.
  • the supernatant without touching the sediment, gently transfer 25 ⁇ l to clean microtubes and quickly freeze in liquid nitrogen.
  • Ready-made extracts can be stored at -70 ° C.
  • the sample is homogenized. To do this, about 30 mg of thawed sample is placed in a glass mini-homogenizer and the first homogenization is carried out on ice for 1 minute. in 300 ⁇ l lysis CHAPS buffer. CHAPS buffer is added at the rate of 10 ⁇ l per 1 mg of tissue. Then every 5 min. spend another 6 stages of homogenization, not more than one minute each. Further, as in the treatment of the cells, the homogenate is centrifuged, the supernatant is carefully collected, divided into 20-50 ⁇ l aliquots, which are frozen and stored at -70 ° C. The study of telomerase activity was carried out according to the method described in example 1.
  • stage T1 N0M0G1 (lanes 5–8, “MP biopsy specimen”)
  • characteristic discrete TRAP products were observed, indicating the presence of telomerase activity in the samples.
  • telomerase activity in extracts from cell urine sediment of this patient (lanes 1–4) was detected only in two samples (lanes 1 and 2), and in the other two samples (lanes 3 and 4), classical TRAP products were practically not observed and did not differed from the negative control sample.
  • telomerase activity was conducted in clinical material obtained from patients diagnosed with pancreatic cancer.
  • fig. 3 presents the results of the analysis of telomerase activity by the RT-TRAP-2PCR method in the biological material of 5 patients diagnosed with pancreatic cancer.
  • curves Ns 1, 2, 3 high telomerase activity was observed, and two more patients (curves Ns 4, 5) showed average telomerase activity.
  • the curves characterizing telomerase activity are significantly different from the negative control sample.
  • telomerase activity in postoperative clinical material of the stomach obtained from patients with diagnoses of moderately differentiated gastric adenocarcinoma (clinical sample Ns1), low-differentiated and moderately differentiated gastric adenocarcinoma (clinical sample Ns2) and gastric lymphoma ( clinical specimen Ns3).
  • Data on the measurement of telomerase activity by the RT-TRAP-2PCR method are presented in Fig. 4 (curve numbers correspond to patient sample numbers).
  • telomere activity was observed in sample Ns1; in sample Ns2, the average telomerase activity was observed and in the sample N ° 3 - low telomerase activity, with all the curves characterizing the activity of telomerase, significantly differ from the negative control sample, which indicates a high sensitivity of the method.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биологии, медицине, онкологии, ветеринарии, репродуктологии и может быть использовано, в частности, для определения активности теломеразы при диагностике злокачественных новообразований, на подготовительных этапах при применении вспомогательных репродуктивных технологий, научных исследованиях и др. Предложен способ выявления, а также количественного определения активности теломеразы в биологических образцах эукариотических организмов методом двойной амплификации теломерных повторов в реальном времени, основанном на измерении суммарного содержания теломерных повторов, новосинтезированных теломеразой в анализируемом образце. Изобретение позволяет обеспечить высокую чувствительность и специфичность метода, в том числе при проведении анализа в биологических образцах, характеризующихся низким содержанием теломеразопозитивных клеток и присутствием ингибиторов теломеразы.

Description

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ТЕЛОМЕРАЗЫ МЕТОДОМ ДВОЙНОЙ АМПЛИФИКАЦИИ ТЕЛОМЕРНЫХ ПОВТОРОВ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
Изобретение относится к биологии, медицине, онкологии, ветеринарии, репродукгологии и может быть использовано, в частности, для определения активности теломеразы при диагностике злокачественных новообразований, на подготовительных этапах при применении вспомогательных репродуктивных технологий, научных исследованиях и др.
Уровень техники
Теломеры - это концевые участки хромосом, которые укорачиваются с каждым делением клетки. Теломераза - рибонуклеопротеидный комплекс, который достраивает теломеры, тем самым компенсируя их укорачивание. Высокая теломеразная активность характерна для эмбриональных, половых и стволовых клеток. В тканях здорового человека в норме, за исключением ряда органов, теломеразная активность полностью отсутствует и начинает проявляться в процессе онкогенеза. Теломеразная активность является универсальным маркером для 85% злокачественных опухолей. Это позволяет разрабатывать современные высокочувствительные и высокоспецифичные наборы для диагностики большинства злокачественных новообразований, в том числе на ранних стадиях заболевания.
Знание структурных и функциональных особенностей теломеразы открывает дорогу для поиска ингибиторов и активаторов теломеразы, а также новых подходов к диагностике злокачественных новообразований. Однако измерение активности теломеразы - это непростая задача, поскольку характерной особенностью является низкое число ее копий на клетку, а, следовательно, и низкая активность, даже в опухолевых клетках, где теломераза активирована. Тем не менее, использование определения активности теломеразы в диагностических тестах очень перспективно, так как позитивный результат может быть получен при наличии в образце всего лишь нескольких теломеразопозитивных опухолевых клеток. При этом важно, что для диагностики могут оказаться пригодными образцы, полученные неинвазивными и минимально инвазивными способами.
Определение активности теломеразы может быть использовано в области вспомогательных репродуктивных технологий, как в репродуктивной медицине, так и в сельском хозяйстве, для определения качества сперматозоидов, ооцитов и яйцеклеток позвоночных животных и человека. Определение активности теломеразы может быть проведено в фолликулярных клетках (клетки кумулюса и клетки гранулезы) для прогнозирования исходов программ вспомогательных репродуктивных технологий, а также для диагностики ряда заболеваний репродуктивной системы, например, синдрома недостаточности яичников. Кроме того, данный метод может быть использован для исследования воздействия лекарственных препаратов, влияющих на механизмы старения через стабилизацию/дестабилизацию длины теломер.
Для определения активности теломеразы, при наличии в образце ее ингибиторов, в первую очередь, необходим надежный метод. В ряде случаев из-за низкой концентрации теломеразы в клетке (100 молекул на 1 клетку) детекция компонентов теломеразы и ее активности становится сложным процессом. Первым для исследования теломеразы использовался прямой метод детекции теломеразной активности. Этот метод основан на удлинении праймера теломеразой в клеточном экстракте в присутствии радиоактивно меченого нуклеотида, который включается в теломерный повтор. Далее продукты удлинения анализируют электрофорезом. Этот метод очень надежный, показывает не только активность, но и количество добавленных теломерных повторов. Однако этот метод имеет ограниченную чувствительность, из-за чего необходимо значительное количество клеточного образца и радиоактивного материала, что часто ограничивает использование данного метода в обычных исследовательских и клинико- диагностических лабораториях.
Известен метод определения активности теломеразы методом TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) в реальном времени, в котором для визуализации продуктов реакции используется система TaqMan (John Р. Jakupciak et al. Preparation and Characterization of Candidate Reference Materials for Telomerase Assays // Clinical Chemistry, Vol. 51 , Issue 8, August 2005, p.1443-1450). Однако его чувствительность невысока при очень низком содержании клеток в образце и/или наличии в нем ингибиторов реакции.
В патенте US7390621 (Methods and compositions for detecting telomerase activity) описан метод определения теломеразной активности с помощью удлинения праймера с последующим проведением ПЦР в реальном времени в одной пробирке. Особенностью данного метода является использование очень большого числа циклов ПЦР в течение одной стадии (40 циклов), что приводит к существенному изменению зависимости между скоростью синтеза ампликона и временем реакции, а также к возможному синтезу неспецифических продуктов. Данный метод имеет высокое значение порогового цикла, что также существенно отражается на качестве анализа.
Известен метод определения теломеразной активности с помощью удлинения праймера с последующим проведением количественной ПЦР в реальном времени в одной пробирке (Hou М, Xu D, Bjorkholm М, Gruber А. (2001 ) Real-Time Quantitative Telomeric Repeat Amplification Protocol Assay for the Detection of Telomerase Activity. Clin Chem;47:519-24. В отличие от приведённого выше метода (патент US7390621), в данной работе используется модифицированный СХ праймер - АСХ. В данной работе, тем не менее, также используется достаточно большое число циклов ПЦР в течение одной стадии (40 циклов), что приводит к существенному изменению зависимости между скоростью синтеза ампликона и временем реакции, а также к возможному синтезу неспецифических продуктов.
Известен метод, в котором для визуализации продуктов реакции при проведении ПЦР в «реальном времени» используется флуоресцентно меченый (по запатентованной технологии Amplifluor® primer) праймер RP (TRAPEZE® RT Telomerase Detection Kit). В данной работе используется очень большое число циклов ПЦР в течение одной стадии (45 циклов), что приводит к существенному изменению зависимости между скоростью синтеза ампликона и временем реакции, а также к возможному синтезу неспецифических продуктов.
Классический метод анализа теломеразной активности (TRAP - Telomeric Repeat Amplification Protocol - Протокол амплификации теломерных повторов) считается неэффективным, когда анализируется очень маленькое количество клеточного материала. Это делает невозможным проведение неинвазивного варианта диагностики ряда заболеваний, когда количество клеточного материала мало. В связи с этим, разработка более чувствительных вариантов TRAP анализа является весьма актуальной задачей биологии и медицины.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является разработка способа количественного определения активности теломеразы, обеспечивающего его высокую чувствительность и специфичность при проведении анализа в биологических образцах, в том числе в образцах, содержащих низкое количество теломеразопозитивных клеток и/или ингибиторы теломеразы.
Для решения поставленной задачи был разработан способ определения активности теломеразы методом двойной амплификации теломерных повторов в реальном времени (RT-TRAP-2PCR), который может быть охарактеризован как
способ выявления и/или количественного определения активности теломеразы в биологическом образце эукариотического организма, включающий следующие этапы:
(1) инкубацию указанного биологического образца в среде, включающей по меньшей мере один теломеримитирующий олигонуклеотид и дезоксинуклеозидтрифосфаты (дНТФ) или их меченые производные, в условиях, подходящих для продуцирования теломеразой продуктов элонгации на основе теломеримитирующего олигонуклеотида в течение времени, достаточного для элонгации;
(2) выдерживание реакционной смеси, полученной на этапе (1), при температуре и в условиях, подходящих для инактивации теломеразы; (3) проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР Ns1) в реакционной смеси, полученной на этапе (2), с добавлением по меньшей мере одного праймера, комплементарного теломерным повторам в геноме исследуемого биологического объекта, и в условиях, подходящих для амплификации продуктов элонгации, полученных на этапе (1);
(4) проведение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР N°2) В реакционной смеси, полученной на этапе (3), с добавлением по меньшей мере одной пары праймеров, один из которых способен комплементарно взаимодействовать с цепью теломерных повторов, а другой - с комплементарной ей цепью, и в условиях, подходящих для амплификации продукта, полученного на этапе (3);
(5) анализ присутствия и/или активности теломеразы в анализируемом образце путем проведения, соответственно, качественного и/или количественного анализа продуктов реакции, полученных на этапе (4).
В некоторых вариантах изобретения биологический образец представляет собой биологический образец позвоночного животного или человека.
В некоторых вариантах изобретения позвоночное животное представляет собой млекопитающее.
В частных вариантах воплощения изобретения биологическим образцом является ткань, жидкость или отдельные клетки, выделенные из живого организма.
В некоторых вариантах изобретения теломеримитирующий олигонуклеотид имеет последовательность SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% одной из этих последовательностей, более предпочтительно, гомологичную по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно гомологичную по меньшей мере на 95%.
В некоторых вариантах изобретения на этапе (3) используют праймер вида
5’-V(CCCTTA)kW-3’ или 5’-V(CTAACC)kW-3’,
где V - цепочка из 0-20 нуклеотидных остатков, независимо выбранных из A,C,T,G,
W выбран из С, СС, ССС, СССТ, СССТА, СССТАА,
к - целое число от 1 до 3.
В частных вариантах изобретения на этапе (3) используют праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 или праймер, имеющий последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% одной из этих последовательностей, более предпочтительно, гомологичную по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно гомологичную по меньшей мере на 95%.
В некоторых вариантах изобретения на этапе (4) используют пару праймеров, один из которых представляет собой праймер вида:
5’ -X1X2X3X4X5X6X7X8(TTTGGG)nY1Y2Y3Y4Y5Y6Y7Y8> - 3’, а другой - праймер вида:
5’ - X^X zX'aX^X’sX'eX X’siCCCTTAJ^NY’zY’aY^Y’sY’eY Y’s- 3’
или 5' - X^X’aX’aX^’sX’eX X CCCTA-DmY Y'aY’a Y’eY’eY Y e, - 3’,
где каждый из X, - Х8,
Figure imgf000006_0001
- U6, Х - Х’8, U' - Y’6 независимо выбраны из A,C,T,G или отсутствуют (=0),
Y7Y8 независимо выбраны из AG, GT, GG, ТА или ТТ,
YVY’e независимо выбраны из АА, СС, ТС, СА, СТ или АТ,
a n, m - независимо выбраны из целых чисел от 1 до 8,
при этом длина праймера независимо составляет не менее 18, но не более 55 нуклеотидов.
В частных вариантах изобретения на этапе (4) используют пару праймеров, состоящую из
TelG-праймера, имеющего последовательность SEQ ID NO:8 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; и ТеЮ-праймера, имеющего последовательность SEQ ID NO:9 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей, и сконструированные по правилам, как это описано выше; или Tel 1 -праймера, имеющего последовательность SEQ ID NO: 10, или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; и Те12-праймера, имеющего последовательность SEQ ID NO: 11 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей и сконструированные по правилам, как это описано выше; или
Tel 1 -праймера, имеющего последовательность SEQ ID NO:10 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; и Те12Ь-праймера, имеющего последовательность SEQ ID NO: 12 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей и сконструированные по правилам, как это описано выше.
В некоторых вариантах изобретения способ включает предварительную подготовку биологического образца.
В некоторых вариантах воплощения изобретения праймер на любом из этапов независимо представляет собой флуоресцентно-меченый праймер, люминесцентно- меченый праймер, праймер, меченый радиоактивным изотопом или биотинилированный праймер.
В некоторых вариантах воплощения изобретения меченые производные дезоксинуклеозидтрифосфатов представляют собой биотинилированные нуклеотиды или флуоресцентномеченые нуклеотиды, содержащие химические модификации (такие, как гасители (quenchers) и эммитеры флуоресценции).
Предлагаемое изобретение также относится к применению способа выявления и/или количественного определения активности теломеразы в биологическом образце для диагностики онкологических заболеваний у человека или позвоночных животных. В некоторых частных вариантах биологический образец содержит не более 10 клеток, более конкретно, не более 10 теломеразопозитивных клеток или потенциально теломеразопозитивных клеток (в случае анализа опухолевых тканей - не более 10 опухолевых клеток).
Предлагаемое изобретение также относится к применению способа выявления и/или количественного определения активности теломеразы в биологическом образце в области вспомогательных репродуктивных технологий для оценки качества сперматозоидов, яйцеклеток и ооцитов (по клеткам кумулюса, то есть клеткам гранулезы, окружающих сам ооцит) и др. позвоночных животных или человека.
Предлагаемое изобретение также относится к применению способа выявления и/или количественного определения активности теломеразы в биологическом образце для исследования действия препаратов, препятствующих старению и стабилизирующих длину теломер у позвоночных животных или человека.
Изобретение также относится к определению активности теломеразы в различных клетках для диагностики ряда заболеваний, например, в клетках гранулезы - для диагностики ряда заболеваний репродуктивной системы (таких как синдром недостаточности яичников).
Предлагаемое изобретение также относится к набору для выявления и/или количественного определения активности теломеразы способом по изобретению, включающему, по меньшей мере, теломеримитирующий олигонуклеотид, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ или их меченые производные; праймер, комплементарный теломерным повторам в геноме исследуемого биологического объекта; а также пару праймеров, один из которых способен комплементарно взаимодействовать с цепью теломерных повторов, а другой - с комплементарной ей цепью, в количествах, достаточных для проведения анализа активности теломеразы. Все компоненты набора входят в набор и используются в количествах, по меньшей мере, необходимых для проведения анализа согласно изобретению. В частных случаях выполнения изобретения набор дополнительно содержит экстракт опухолевой клеточной линии или синтетическую двунитевую матрицу ds(GGGTTA/CCCAAT)n (п - целое число, отражающее количесто повторов; в предпочтительных вариантах п выбирают от 4 до 16, в наиболее предпочтительных - от 8 до 9), используемую в качестве положительного контроля.
В состав набора по изобретению также входят буферные растворы и компоненты, необходимые для создания условий для осуществления соответствующих этапов способа выявления и/или количественного определения активности теломеразы в биологическом образце. Каждый из компонентов набора используются в количестве, по меньшей мере, достаточном для проведения анализа.
В частных случаях выполнения изобретения теломеримитирующий олигонуклеотид, входящий в набор, имеет последовательность SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% одной из этих последовательностей, более предпочтительно, гомологичную по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно гомологичную по меньшей мере на 95%.
В некоторых вариантах изобретения в состав набора в качестве праймера, комплементарного теломерным повторам в геноме исследуемого биологического объекта, входит праймер вида
5’-V(CCCTTA)kW-3’ или 5’-V(CTAACC)kW-3’,
где V - цепочка из 0-20 нуклеотидных остатков, независимо выбранных из A,C,T,G,
W выбирают из С, СС, ССС, СССТ, СССТА, СССТАА,
к - целое число от 1 до 3.
В частных вариантах изобретения в качестве праймера, комплементарного теломерным повторам в геноме исследуемого биологического объекта, в состав набора входит праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 или праймер, имеющий последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% одной из этих последовательностей.
В некоторых вариантах изобретения в качестве пары праймеров, один из которых способен комплементарно взаимодействовать с цепью теломерных повторов, а другой - с комплементарной ей цепью, входит пара праймеров, один из которых представляет собой праймер вида:
5’ -CΊ Х2Х3Х4Х5Х6Х7Х8 (TTTGGG)nYiY2Y3Y4Y5Y6Y7Y8, - 3’,
а другой - праймер вида:
5’ - X^X’zX’aX X’sX’eX X’eCCCCTTAi.^Y Y zY’aY Y’sY’eV Y’e- 3’
или 5’ - X X’zX’sX^X'sX’eX X’eiCCCTATirnY^Y’zY’sY^Y’sY’eWY’s, - 3’,
где каждый из
Figure imgf000008_0001
- Х8, Yi - Y6, X’i - Х’8, Y’i - Y’e независимо выбраны из A,C,T,G или отсутствуют (=0),
Y7Y8 независимо выбраны из AG, GT, GG, ТА или ТТ,
Y'7Y’8 независимо выбраны из АА, СС, ТС, СА, СТ или АТ,
a n, m - независимо выбраны из целых чисел от 1 до 8,
при этом длина праймера независимо составляет не менее 18, но не более 55 нуклеотидов.
В частных вариантах изобретения в качестве такой пары праймеров используют пару праймеров, состоящую из TelG-праймера, имеющего последовательность SEQ ID NO:8 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; и ТеЮ-праймера, имеющего последовательность SEQ ID NO:9 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей, и сконструированные по правилам, как это описано выше; или
ТеИ -праймера, имеющего последовательность SEQ ID NO: 10, или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; и Те12-праймера, имеющего последовательность SEQ ID NO:11 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей и сконструированные по правилам, как это описано выше; или
ТеИ -праймера, имеющего последовательность SEQ ID NO:10 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; и Те12Ь-праймера, имеющего последовательность SEQ ID NO: 12 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей и сконструированные по правилам, как это описано выше.
В некоторых вариантах воплощения изобретения, по меньшей мере, один из праймеров, входящих в набор, независимо представляет собой флуоресцентно-меченый праймер, люминесцентно-меченый праймер, праймер, меченый радиоактивным изотопом или биотинилированный праймер.
В некоторых вариантах воплощения изобретения меченые производные дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ, dNTP) дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ, входящие в набор, представляют собой биотинилированные нуклеотиды или флуоресцентномеченые нуклеотиды, содержащие химические модификации (представляющие собой гасители (quenchers) и эммитеры флуоресценции).
Например, в одном из частных случаев выполнения изобретения состав набора включает Трис-HCI, MgCI2, EGTA, PMSF, b-меркаптоэтанол, CHAPS, глицерин, Coomassie Brilliant Blue G-250, (NH4)2S04, Tween-20, dNTPs, TS-праймер, СХ-праймер, экстракт опухолевой клеточной линии, ДНК-полимеразу, SYBR Green I, ROX, betain, TelG-праймер, TelC-праймер, каждый из которых входит в набор в количестве, по меньшей мере, достаточном для проведения выявления и/или количественного определения активности теломеразы в биологическом образце позвоночных животных или человека методом двойной амплификации теломерных повторов в реальном времени (RT-TRAP-2PCR).
При осуществлении изобретения достигаются следующие технические результаты: разработан специфический и высокочувствительный метод анализа теломеразной активности, позволяющий проводить не только качественный, но и количественный анализ активности теломеразы в образце;
- достигнуто существенное снижение порогового цикла (Ct), что определяет значительное повышение чувствительности метода (для проведения анализа достаточно всего лишь 10 клеток); - достигнуто снижение минимального количества циклов для каждой стадии ПЦР, достаточных для проведения анализа, т.е. для достижения порогового цикла (Ct);
- отсутствие необходимости использования радиоактивных изотопов;
- разработанный метод позволяет проводить анализ теломеразной активности в присутствии различных примесей нуклеиновых кислот, белков и других компонентов клеток и тканей, характерных для клинических образцов, при этом для диагностики могут оказаться пригодны образцы, полученные неинвазивными и малоинвазивными способами;
- разработанный метод позволяет эффективно проводить анализ в образцах с низким содержанием теломеразопозитивных клеток, а также в присутствии ингибиторов теломеразы, позволяя при этом избежать появления ложноотрицательных результатов;
- метод прост в подготовке и эксплуатации, имеет низкую стоимость.
Краткое описание рисунков
Рис. 1А. Анализ образцов лизатов клеточной линии К562 (хронический промиелолейкоз человека), содержащих различное количество клеток и эквивалентных различному уровню теломеразной активности (АТ) методом RT-TRAP-2PCR:
«100% АТ (К*)» - положительный контрольный образец (100 клеток - 100% АТ),
«80% АТ» - образец с высокой теломеразной активностью (80% АТ от К"),
«40% АТ» - образец со средней теломеразной активностью (40% АТ от К*);
«10% АТ» - образец с низкой теломеразной активностью (10% АТ от ");
«0% АТ (К-)» - отрицательный контрольный образец (0% АТ).
Рис. 1В. Электрофорез продуктов TRAP-анализа активности теломеразы в экстрактах клеточной линии К562, содержащих различное количество клеток и эквивалентных различному уровню теломеразной активности (АТ) (10% электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), окрашенный красителем SYBR Gold, фотография в УФ- свете).
Дорожка 1 -положительный контрольный образец (100 клеток
Дорожка 2 -образец с высокой теломеразной активностью (80
Дорожка 3 -образец со средней теломеразной активностью (4
Дорожка 4 -образец с низкой теломеразной активностью (10%
Figure imgf000010_0001
Дорожка 5 -отрицательный контрольный образец (0% АТ).
Рис.1 С. Линейная регрессия между активностью теломеразы (количеством клеток в лизате клеточной линии К562) и значением порогового цикла (Ct) при анализе теломеразной активности методом RT-TRAP-2PCR.
Рис.2А. Электрофорез продуктов TRAP-анализа активности теломеразы в клеточных экстрактах, полученных из клеточного осадка мочи и образца ткани после проведения биопсии у пациента с диагнозом рак мочевого пузыря (стадия T1 N0M0G1) (10% электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), окрашенный красителем SYBR Gold, фотография в УФ-свете). Анализ белковых экстрактов из образцов клеточного осадка мочи (дорожки 1-4) и ткани мочевого пузыря (МП, дорожки 5-8). Реакционные пробы содержали различное количество белка экстракта: 8 мкг (дорожки 1 и 5), 4 мкг (дорожки 2 и 6), 2 мкг (дорожки 3 и 7) и 0,7 мкг (дорожки 4 и 8). К- - отрицательный контрольный образец (TRAP в отсутствии белкового экстракта), I - положительный контроль - внесено 0,04 мкг белка экстракта клеточной линии К562;
Рис. 2В. Анализ активности теломеразы методом RT-TRAP-2PCR в клиническом материале пациента с раком мочевого пузыря:
«К*» - положительный контрольный образец (100 клеток линии К562 - 100% АТ),
«К- »- отрицательный контрольный образец (0% АТ),
Приведены кривые накопления продуктов амплификации теломерных повторов методом RT-TRAP-2PCR в образцах реакционных смесей лизатов клеточного осадка мочи (кривые Ns 1-4) и ткани (кривые Ns5-8) этого же пациента (рак мочевого пузыря, стадия T1 N0M0G1) с различным содержанием белка в экстракте: 8 мкг (кривые Ns 1 и 5), 4 мкг (кривые Ns 2 и 6), 2 мкг (кривые Ns 3 и 7), 0,7 мкг (кривые Ns 4 и 8).
Рис. 3. Кривые накопления продуктов амплификации теломерных повторов методом RT-TRAP-2PCR в образцах реакционных смесей лизатов клинического материала от 5-ти разных пациентов с диагнозом рак поджелудочной железы (кривые 1-5). \С - положительный контрольный образец (100 клеток линии К562 - 100% теломеразной активности), К- - отрицательный контрольный образец (0% теломеразной активности). Выход флуоресценции в образце К- является результатом неспецифической амплификации дуплекса праймеров TS и СХ.
Рис. 4. Кривые накопления продуктов амплификации теломерных повторов методом RT-TRAP-2PCR в образцах реакционных смесей лизатов клинического материала от 3-х пациентов с диагнозом рак желудка (кривые 1-3). К* - положительный контрольный образец (100 клеток линии К562 - 100% теломеразной активности), К“ - отрицательный контрольный образец (0% теломеразной активности). Выход флуоресценции в образце К является результатом неспецифической амплификации дуплекса праймеров TS и СХ.
Рис.5. Сравнительный анализ чувствительности стандартного метода RT-TRAP (пунктирная линия) и метода TRAP с использованием магнитно-силовой микроскопии (сплошная линия). Использована синтетическая ds(GGGTTA/CCCAAT)9 матрица.
RTA (ед.) - Related Telomerase Activity (относительные единицы активности теломеразы), 6Т2 (мс) - magnetic field distortion (искажение изменения магнитного поля)
Рис. 6. Определение чувствительности метода RT-TRAP-2PCR с использованием синтетической ds(GGGTTA/CCCAAT)9 матрицы. «К"» - положительный контрольный образец (100 клеток линии К562 - 100% теломеразной активности), «К“ » - отрицательный контрольный образец (0% теломеразной активности), «100 фмоль» (1 фмоль=10 15 моль), «10 фмоль», «1 фмоль», «100 амоль» (1 амоль=1018 моль), «10 амоль» - исследованные образцы, содержащие соответствующее количество ds(GGGTTA/CCCAAT)9 матрицы.
Определения (термины)
RT-TRAP-2PCR - метод двойной амплификации теломерных повторов в реальном времени (Real-Time - Telomeric Repeat Amplification Protocol - 2 Polymerase Chain Reaction).
В данном документе под теломеразой (ферментом, добавляющим теломерные повторы (TTAGGG-повторы у человека и позвоночных) к З'-концу цепи ДНК на участках теломер на концах хромосом) подразумевается теломераза любых эукариотических организмов. В частных вариантах воплощения изобретения подразумевается теломераза человека или позвоночных.
Под теломеримитирующим олигонуклеотидом подразумевается любой олигонуклеотид, последовательность которого не совпадает с теломерной последовательностью, но который пригоден в качестве субстрата для теломеразы. Примерами такого теломеримитирующего олигонуклеотида (но не ограничиваются ими) при определении активности теломеразы в биологических образцах позвоночных животных или человека, могут быть олигонуклеотиды, имеющие последовательность 5’- ATTCCGTCGAGCAGAGTT-3' (SEQ ID NO:1 , известный как TS-праймер), 5’- AATCCGTCGAGCGAGGTT-3' (SEQ ID NO:2), 5 -AGAGTT CCCCAAGGGGAG-3’ (SEQ ID NO:3), 5’-GGGATTGGGATTGGGATTGGGTT-3’ (SEQ ID NO:4, известный как TSG4 праймер) или олигонуклеотиды, имеющие последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% одной из приведенных последовательностей, более предпочтительно, гомологичную по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно, гомологичную по меньшей мере на 95%. При этом здесь и далее в настоящем изобретении подразумеваются только такие олигонуклеотиды, которые не образуют комплементарные комплексы с нетаргетными участками ДНК, т.е. их использование не приводит к появлению неспецифических продуктов.
ПЦР s1 - полимеразная цепная реакция, в процессе которой происходит амплификация продуктов элонгации теломеримитирующих олигонуклеотидов, полученных в результате удлинения их теломеразой путем добавления теломерных повторов. При этом в первом цикле ПЦР Ns1 происходит образование комплементарных цепей к однонитевым ДНК, являющихся продуктами элонгации теломеримитирующих олигонуклеотидов. Во втором и последующих циклах происходит амплификация образовавшихся двунитевых ДНК. В качестве прямого праймера в ПЦР N°1 выступает теломеримитирующий олигонуклеотид, выбранный в качестве субстрата теломеразы. В качестве обратного праймера используют праймер, комплементарный теломерным повторам в геноме исследуемого биологического объекта. Принципы конструирования праймеров для ПЦР хорошо известны специалистам в данной области техники. При конструировании необходимо, чтобы праймер имел структуру, комплементарную G-богатому теломерному повтору, но не образовывал дуплексов с праймером элонгации, а также имел комплементарную теломерному повтору область с 3’ конца. В частных случаях осуществления изобретения при определении активности теломеразы в биологических образцах позвоночных животных или человека качестве обратного праймера может быть использован праймер вида
5’-V(CCCTTA)kW-3’ или 5’-V(CTAACC)kW-3’, где V - цепочка из 0-20 нуклеотидных остатков, независимо выбранных из A,C,T,G, W выбран из С, СС, ССС, СССТ, СССТА, СССТАА, а к - целое число от 1 до 3. В некоторых частных, но не ограничивающих, вариантах изобретения при проведении ПЦР N°1 используют праймер, имеющий последовательность 5’-СССТТАСССТТАСССТТАСССТАА-3’ (SEQ ID NO:5, известный как СХ-праймер), 5’-GCGCGCCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3’ (SEQ ID NO:6, известный как АСХ-праймер), 5’-TAGAGCACAGCCTGTCCGTG(CTAACC)3 (SEQ ID NO:7, известный как РРСЗ-праймер) или праймер, имеющий последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% одной из этих последовательностей, более предпочтительно, гомологичную по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно гомологичную по меньшей мере на 95%. При этом здесь и далее в настоящем изобретении подразумеваются только такие праймеры, которые не образуют комплементарные комплексы с нетаргетными участками ДНК, т.е. их использование не приводит к появлению неспецифических продуктов.
ПЦР Ns2 - полимеразная цепная реакция, в процессе которой происходит амплификация фрагментов цепей ДНК, полученных в результате проведения ПЦР Ns1. При проведении ПЦР N°2 используют пару праймеров, один из которых способен комплементарно взаимодействовать с цепью теломерных повторов, а другой - с комплементарной ей цепью, при этом важно, чтобы праймеры не образовывали между собой димеры (дуплексы) (или количество образуемых димеров, по меньшей мере, не препятствовало проведению реакции ПЦР). В частных случаях осуществления изобретения при определении активности теломеразы в биологических образцах позвоночных животных или человека при проведении ПЦР N°2 может быть использована пара праймеров
один из которых представляет собой праймер вида:
5’ -X Х2Х3Х4Х5Х6Х7Х8 (TTTGGG)nY ! Y 2Y 3U4U 5U 6Y7Y8, - 3’,
а другой - праймер вида:
5 gi g> gi gi gi gi gi
— A 1A 2L зА 4L 5L бА 7X'a{CCCTTA)mY^r2r3r4Ysr9Y7Yb- y или
Figure imgf000014_0001
где каждый из - Х8, UΊ - Y6, X’i - X’8, Y’i - Y’6 независимо выбраны из A,C,T,G или отсутствуют (=0), Y7Y8 независимо выбраны из AG, GT, GG, ТА или ТТ, YVY’s независимо выбраны из АА, СС, ТС, СА, СТ или AT, a n, m - независимо выбраны из целых чисел от 1 до 8, при этом длина праймера независимо составляет не менее 18, но не более 55 нуклеотидов. В предпочтительных вариантах различие в длине праймеров не должно составлять более 20%.
В некоторых частных, но не ограничивающих, вариантах изобретения в качестве праймеров при проведении ПЦР Ns2 могут быть использованы пары праймеров, имеющие следующие последовательности:
5’-ACACTAAGGTTTGGGTTT GGGTTT GGGTTTGGGTT AGT GT -3’ (SEQ ID NO:8, известный как TelG-праймер) и
5’-TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA-3' (SEQ ID NO:9, известный как TelC-праймер) или
5’-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3’ (SEQ ID NO: 10, известный как Tell -праймер) и
5’-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT— 3’ (SEQ ID NO: 1 1 , известный как Те12-праймер) или
5’-CGGTTT GTTT GGGTTTGGGTTT GGGTTT GGGTTT GGGTT-3’ (SEQ ID NO: 10, известный как Tell -праймер) и
5’-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3’ (SEQ ID NO: 12, известный как Те12Ь-праймер)
или праймеры, гомологичные им, по меньшей мере на 80%, более предпочтительно, - по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно - по меньшей мере на 95%.
В предпочтительных вариантах воплощения изобретения ПЦР Ne2 проводится в режиме реального времени (qRT-PCR), включая в себя одновременно детекцию и количественное определение суммарного содержания всех теломерных повторов ((TTAGGG)n для позвоночных, в том числе для человека), что обеспечивается за счет измерения количества амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации. Для обеспечения такого количественного определения согласно изобретению может быть использован любой из известных методов, например, использование флуоресцентных красителей (например, SYBR Green), интеркалирующих в двуцепочечные молекулы ДНК, или использование модифицированных олигонуклеотидов (ДНК-зондов), которые флуоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК.
В качестве ферментов при проведении ПЦР N°1 и ПЦР N°2 может быть использован любой термостабильный фермент ДНК-полимераза, известный для специалистов в данной области техники, в том числе, но не ограничиваясь, Taq ДНК- полимераза, Pfu ДНК-полимераза, Tth ДНК-полимераза. Реакционная смесь для проведения ПЦР также обычно включает магниевую соль (например, MgCI2), с целью обеспечения оптимальных условий для ПЦР-амплификации.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Используемый здесь термин «процент гомологичности двух последовательностей» определяется числом положений идентичных нуклеотидов в этих двух последовательностях, при этом различия гомологичных последовательностей могут быть связаны с наличием делеции, инсерции по 3' и/или 5' - концу и/или нуклеотидных замен; т.е. имеется в виду структурная гомология при условии, однако, что гомологичная последовательность не утрачивает своей первоначальной функции.
Согласно изобретению, «биологический образец» включает в себя ткани, клетки и биологические жидкости, выделенные от субъекта, а также ткани, клетки и биологические жидкости, присутствующие в субъекте. Биологический образец также включает в себя первичные клетки, трансформированные клетки и любые другие культивируемые клетки. Предпочтительно, биологический образец представляет собой клеточный или тканевый экстракт, в частности экстракт из клеток или тканей человека. Экстракт может быть получен повторным оттаиванием / замораживанием клеток, гомогенизацией клеток или тканей, или лизированием клеток или тканей в буфере для лизиса, содержащем неионный и/или цвиттерионный детергент. Примеры неионного детергента включают, но не ограничиваются ими, Tween 20, Triton Х-100, Triton Х-114, полидоканол (Thesit), NP-40, n-октилглюкозид, п-додецилглюкозид, п-додецил-бета-D- мальтозид, октаноил-М-метилглюкамид (MEGA-8), деканоил-1М-метилглюкамид (MEGA-10) и изотридецил-поли (этиленгликолевый эфир)п. Примеры цвиттерионных детергентов включают, но не ограничиваются ими, CHAPS (3-[(3-холамидопропил) диметиламмоний]- 1 -пропансульфонат), CHAPSO (3-[(3-холамидопропил)диметил-аммоний]-2-гидрокси-1 - пропансульфонат), Ы-додецил-Ы,Ы-диметил-3-аммоний-1 -пропансульфонат и дигитонин. Поскольку теломераза содержит как РНК, так и белковые компоненты, к экстракту могут быть добавлены ингибиторы протеазы и/или РНКазы, чтобы предотвратить разрушение теломеразы в экстракте другими клеточными протеазами. Примеры ингибиторов протеазы включают, но не ограничиваются ими, амастин, 4- амидинофенилметансульфонилфторид (AMPSF), антипаин, апротинин, бестатин, химостатин, цистатин, 3,4-дихлоризозумарин, эбелакгон А и В, эластатин, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), этиленгликольтетрауксусную кислоту (ЭГТА), леупептин, пепстатин А, фенилметилсульфонилфторид (PMSF), фосфорамидон, тозилсилсилокметилкетон (TLCK), тозилфенилаланилхлорметилкетон (TPCK) и ингибиторы трипсина. Примеры ингибиторов РНКазы включают, но не ограничиваются ими, ингибиторы РНКазы поджелудочного типа, ингибиторы РНКазы плаценты человека и диэтилпирокарбонат (DEPC).
Дезоксинуклеозидтрифосфаты (дНТФ) в реакционной смеси включают, но не ограничиваются ими, дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ), дезоксиуридинтрифосфат (дУТФ), дезокситимидинтрифосфат (дТТФ) и дезоксицитидинтрифосфат (дЦТФ). В некоторых вариантах осуществления реакционная смесь содержит дАТФ, дГТФ, дЦТФ и один из дУТФ и дТТФ в равном молярном отношении. В ряде вариантов изобретения могут быть использованы меченые производные дезоксинуклеозидтрифосфатов, например, биотинилированные нуклеотиды или флуоресцентномеченые нуклеотиды, содержащие химические модификации.
В дополнение к специфическим, перечисленным выше компонентам, реакционные смеси, применяемые на каждом из этапов анализа, могут также содержать буферную систему для поддержания оптимального pH для реакции удлинения праймера для теломеразы. Примеры буферных систем включают, но не ограничиваются ими, фосфатную буферную систему, цитратную буферную систему, боратную буферную систему, трис- (гидроксиметил) аминометан, 3-[(3-холамидопропил) диметиламмониол]-1- пропансульфонат (CHAPS), Ы-[2-гидроксиэтил] пиперазин-М'-2-[этансульфановую кислоту] (HEPES) и 3- [N-морфолино] пропансульфоновую кислоту (MOPS).
Условия, подходящие для теломеразы для получения продукта удлинения из теломеримитирующего олигонуклеотида, хорошо известны в данной области. Обычно реакцию удлинения теломер проводят при температуре около 20-30 °С в течение примерно 10-60 мин, предпочтительно при температуре около 25 °С или около 30 °С в течение примерно 15-30 мин. и наиболее предпочтительно примерно при 25 °С в течение примерно 20 мин.
Для визуализации продуктов реакции в настоящем изобретении могут быть использованы флуоресцентные красители, например, SYBR Green I или SYBR Gold, флуоресцентно-меченые праймеры, люминесцентно-меченые праймеры, праймеры, меченые радиоактивными изотопами, биотинилированные праймеры.
Все компоненты набора входят в набор и используются в количествах, необходимых для проведения анализа согласно изобретению.
Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученными в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области.
Сущность изобретения поясняется рисунками.
Подробное раскрытие изобретения
Предлагаемый метод основан на модификации классического метода определения активности теломеразы методом TRAP. Ключевой особенностью предлагаемого подхода является наличие второй последовательной реакции ПЦР в реальном времени (ПЦР Ns2) с другой парой праймеров. На второй стадии ПЦР измеряется суммарное содержание теломерных повторов, новосинтезированных в результате проведения первого этапа ПЦР (ПЦР Nsl) с праймерами, один из которых представляет собой теломеримитирующий олигонуклеотид, а другой - праймер, комплементарный теломерным повторам в геноме исследуемого биологического объекта (в частных примерах осуществления изобретения это, например, праймеры TS и СХ) в исследуемом образце, то есть, по сути, проводится количественный анализ суммарного содержания всех теломерных повторов (TTAGGG)n для позвоночных и в том числе для человека. Этот шаг позволяет добиться значительного увеличения чувствительности и специфичности метода. Так, на примере клеточной линии К562 (хронический промиелолейкоз человека) предлагаемый метод позволяет достичь следующих значений пороговых циклов (Ct): лизат из 10 клеток - 12 циклов, из 100 клеток - 4 цикла. При стандартных методах анализа пороговый цикл (Ct) в предлагаемой тест-системе соответствует 4-му циклу при максимальных уровнях теломеразной активности. При минимальных уровнях теломеразной активности Ct соответствует 18-му циклу. Для количественной оценки активности теломеразы в образце может быть использована методика калибровочных кривых с использованием в качестве положительного контроля экстракта опухолевой клеточной линии (с известным содержанием количества молекул теломеразы на клетку) или двунитевой синтетической матрицы ds(GGGTTA/CCCAAT)n.
Таким образом, по чувствительности предлагаемый подход существенно превосходит существующие методы определения теломеразной активности с помощью ПЦР в реальном времени (RT-TRAP-PCR).
Как известно, большое число циклов ПЦР в течение одной стадии приводит к существенному изменению зависимости между скоростью синтеза ампликона и временем реакции, а также к возможности синтеза неспецифических продуктов. Достигаемое значительное снижение числа циклов ПЦР позволяет избежать этих проблем, что в конечном итоге положительно влияет на чувствительность и специфичность метода.
При условии учета нуклеотидной последовательности теломерного повтора (что будет определять структуры используемых праймеров), предлагаемый метод может быть применен для анализа активности теломеразы в биологическом образце любого эукариотического организма, начиная от одноклеточных (например, простейших, дрожжей), беспозвоночных, заканчивая высшими растениями и позвоночными, в частности млекопитающими и человеком, как при проведении научных исследований, так и в практических областях. Так, например, данный метод может быть использован в области онкологии и ветеринарии для диагностики злокачественных новообразований у позвоночных животных и человека. Кроме того, определение активности теломеразы предлагаемым методом может быть использовано в области вспомогательных репродуктивных технологий, как в репродуктивной медицине, так и в сельском хозяйстве, для определения качества сперматозоидов, ооцитов и яйцеклеток позвоночных животных и человека. Определение активности теломеразы может быть проведено в фолликулярных клетках (клетки кумулюса и клетки гранулезы) для прогнозирования исходов программ вспомогательных репродуктивных технологий, а также для диагностики ряда заболеваний репродуктивной системы, например, синдрома недостаточности яичников. Кроме того, данный метод может быть использован для исследования воздействия лекарственных препаратов, влияющих на механизмы старения через стабилизацию/дестабилизацию длины теломер.
Нижеследующие примеры приведены в целях иллюстрирования способа согласно настоящему изобретению и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Пример 1
В одном из возможных вариантов изобретения предлагаемый способ может быть осуществлен следующим образом.
Биологический образец промывают в стерильном растворе PBS (натрий- фосфатный буфер), или физ. растворе и далее сразу замораживают. Образцы можно хранить при -70°С.
Перед приготовлением лизатов образцы размораживают на льду. Далее к ним добавляют холодный лизирующий CHAPS-буфер, содержащий 10 мМ Трис-HCI (pH 7,5), 1 мМ MgCI2, 1 мМ EGTA, 0,1 мМ PMSF, 5 мМ b-меркаптоэтанола, 0,5% (в/о) CHAPS и 10% (в/о) глицерина. CHAPS-буфер добавляют из расчета 1 мкл на 1000 клеток. Затем образец ресуспендируют в буфере и инкубируют на льду в течение 30 мин. В процессе инкубации образец интенсивно перемешивают через каждые 5 мин. на аппарате Vortex в течение нескольких секунд. Полученный клеточный экстракт центрифугируют при 12000 g в течение 30 мин. при +4°С. Супернатант, не касаясь осадка, аккуратно переносят по 25 мкл в чистые микропробирки и быстро замораживают в жидком азоте. Готовые экстракты можно хранить при -70°С. Концентрацию белка в экстрактах клеток и тканей определяют с помощью красителя Coomassie Brilliant Blue G-250 по методу Брэдфорда. Элонгацию олигонуклеотидного субстрата и последующую амплификацию проводят в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Трис-НС1 (pH 8,8); 16,6 мМ (NH4)2S04; 0,01% Tween-20; 1 ,5 мМ MgCI2; 1 мМ EGTA; по 50 мМ каждого из dNTP; 0,1 мкг TS-праймера. В качестве положительного контроля используют 1 мкл клеточного экстракта опухолевой клеточной линии К562 (хронический промиелоидный лейкоз), разбавленного лизирующим буфером CHAPS и эквивалентного 100 клеткам опухолевой линии, с концентрацией белка 0,04 мкг/мкл. Для анализа чувствительности метода экстракт, содержащий 100 клеток в 1 мкл, разводят лизирующим буфером CHAPS до конечных значений 10, 40, 80 клеток на 1 мкл. В качестве отрицательного контроля вместо экстракта используют 1 мкл буфера CHAPS. Опосредованное теломеразой удлинение TS праймера происходит при инкубации реакционной смеси при +37°С в течение 25 мин. По окончании инкубации смесь выдерживают 5 мин. при +94 °С для инактивации теломеразы.
Затем в каждую пробу добавляют по 0,1 мкг СХ-праймера и 2,5 ед. SmarTaq ДНК- полимеразы.
TRAP-PCR-реакция N°1 (ПЦР N°1). Реакционную смесь амплифицируют в течение 35 циклов ПЦР в следующем режиме: +94°С - 60 сек, +50°С - 60 сек, +72°С - 90 сек.
TRAP-PCR-реакция N°2 (ПЦР Ns2). Далее готовится инкубационная смесь объемом 25 мкл, содержащая 67 мМ Трис-HCI (pH 8,8); 16,6 мМ (NH4)2S0 ; 0,01% Tween- 20; 1 ,5 мМ MgCI2; по 50 мМ каждого из dNTP; по 0,9 мкМ TelG-праймера и Те -праймера, а также 0,75 х SYBR Green I (краситель), 1 х ROX (референсный краситель), 1М бетаина, 1 ,25 ед. SmarTaq ДНК-полимеразы. В подготовленную смесь добавляют 1 мкл реакционной смеси после ПЦР реакции N°1 и проводят 22 цикла ПЦР в реальном времени в следующем режиме: +95°С - 15 мин; 2 цикла в режиме: +94°С - 15 сек, +49°С - 15 сек; 20 циклов в режиме: +94°С - 15 сек, +62°С - 10 сек, +72°С - 30 сек. со снятием сигнала.
Для отделения ложноотрицательных результатов от истинно отрицательных результатов и выявления ингибиторов активности теломеразы белковый экстракт подвергается ингибиторному анализу. Для этого при постановке TRAP-анализа к теломеразопозитивному экстракту опухолевой клеточной линии К562 (который является положительным контролем реакции), содержащему 0,04 мкг белка, вносят по 1 мкл исследуемого экстракта на обоих этапах реакции - перед этапом элонгации олигонуклеотидного субстрата теломеразой (проверка на наличие ингибиторов теломеразы и SmarTaq-полимеразы) и перед этапом амплификации полученных TRAP- продуктов (проверка на наличие ингибиторов только SmarTaq-полимеразы). Образцы экстрактов, в которых было установлено наличие ингибиторов активности теломеразы, повторно анализируют методом TRAP-RT-2PCR. Для этого исходный экстракт разводят CHAPS-буфером в 2, 4, 8 и 16 раз, и 1 мкл каждого разведения исследуют методом
TRAP-RT-2PCR с целью выявления активности теломеразы.
Результаты проведенного таким образом анализа на примере лизатов клеточной линии К562, содержащих различное количество клеток и эквивалентных различному уровню теломеразной активности (АТ), приведены на рис. 1А. На рис. 1 В приведены результаты анализа этих же образцов, проведенные с использованием классического метода TRAP с использованием электрофоретического разделения продуктов ПЦР и фотографированием геля.
Как следует из рисунка 1А, значение порогового цикла (Ct) для положительного контрольного образца, содержащего 100 клеток (все 100% клеток имеют активированную теломеразу) составляет всего 4 (Ct=4). При разведении образца значение порогового цикла увеличивается, достигая в образце с низкой теломеразной активностью (10% АТ от К*) значения Ct=12 (наблюдаемый выход флуоресценции в отрицательном контрольном образце (К- - образец, не содержащий клеток, т.е. имеющий 0 % теломеразной активности) является результатом неспецифической амплификации дуплекса праймеров TS и СХ). Анализ кривых накопления продуктов амплификации теломерных повторов показывает, что значение порогового цикла Ct для пяти исследуемых образцов коррелирует с уровнем активности теломеразы каждого образца. Как видно из рисунка, значение Ct для I (100% АТ) составило 4, для высокой АТ (80% АТ от К") - 6, для средней АТ (40% АТ от Ю) - 11 , для низкой АТ (10% АТ от К") - 12 и для IC (0% АТ) - 19.
В то же время, как следует из рис.1 В, при анализе активности теломеразы лизатов клеточной линии К562 классическим методом TRAP в образце с низкой теломеразной активностью (10% АТ от К+, дорожка 4), классические TRAP-продукгы практически не наблюдались, что свидетельствует о недостаточной чувствительности этого метода анализа активности теломеразы.
Таким образом, предлагаемая модификация метода TRAP позволяет повысить чувствительность метода анализа активности теломеразы и дает возможность подойти к количественному анализу теломеразной активности.
На рис.1C приведена линейная регрессия между количеством клеток в лизате клеточной линии К562 и значением порогового цикла (Ct) при анализе теломеразной активности методом RT-TRAP-2PCR.
Представленные данные демонстрируют высокую чувствительность метода (величина порогового цикла составляет всего лишь от 4-х до 12 (при 10% АТ)), подтверждающую возможность эффективно проводить анализ в образцах с низким содержанием теломеразопозитивных клеток, а также в присутствии ингибиторов теломеразы, избегая при этом появления ложноотрицательных результатов.
Пример 2 В данном примере проводилась оценка активности теломеразы в клеточном осадке мочи и биопсийном образце ткани мочевого пузыря.
Все процедуры центрифугирования при получении клеточного осадка мочи проводили при комнатной температуре. Для промывки клеточных осадков применяли охлаждённый до +4°С стерильный однократный раствор PBS (0,145 М NaCI, 0,76 М NaH2P04, 2.24 М Na2HP04). Для получения клеточных осадков предпочтительно использовали вторую утреннюю порцию мочи пациента. Каждую пробу в течение 30 мин. охлаждали при температуре +4°С. Далее 100 мл каждой пробы равномерно распределяли по культуральным пробиркам объемом 15 мл и центрифугировали при 2500 об/мин в течение 10 минут. Супернатант отбрасывали и осадки в каждой пробирке ресуспендировали в 1 мл однократного раствора PBS. Далее содержимое всех пробирок равномерно распределяли по двум культуральным пробиркам объемом 15 мл и центрифугировали в течение 10 мин. при 2500 об/мин, после чего повторяли процедуру промывки осадков в 1 мл однократного раствора PBS. После этого осадок в каждой пробирке ресуспендировали в 1 мл раствора PBS и переносили в две микропробирки на 1 ,5 мл, затем центрифугировали на микроцентрифуге 10 мин. при 2500 об/мин. Супернатант отбрасывали, а остаток капель жидкости в пробирке с осадком аккуратно удаляли полоской фильтровальной бумаги. Далее осадок клеток замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С.
Перед приготовлением лизатов образцы клеточных осадков размораживают на льду. Далее к ним добавляют холодный лизирующий CHAPS-буфер, содержащий 10 мМ Трис-HCI (pH 7,5), 1 мМ MgCI2, 1 мМ EGTA, 0,1 мМ PMSF, 5 мМ b-меркаптоэтанола, 0,5% (в/о) CHAPS и 10% (в/о) глицерина. CHAPS-буфер добавляли из расчета 1 мкл на 1000 клеток осадка. Затем клеточный осадок интенсивно ресуспендируют в буфере и инкубируют на льду в течение 30 мин. В процессе инкубации осадок интенсивно перемешивают через каждые 5 мин. на аппарате Vortex в течение нескольких секунд. Полученный клеточный экстракт центрифугируют при 12000 g в течение 30 мин при +4°С. Супернатант, не касаясь осадка, аккуратно переносят по 25 мкл в чистые микропробирки и быстро замораживают в жидком азоте. Готовые экстракты можно хранить при -70°С.
При использовании образцов тканей (операционный материал) непосредственно перед стадией лизирования проводят гомогенизацию образца. Для этого около 30 мг размороженного образца помещают в стеклянный мини-гомогенизатор и проводят первую гомогенизацию на льду в течение 1 мин. в 300 мкл лизирующего CHAPS-буфера. CHAPS- буфер добавляют из расчета 10 мкл на 1 мг ткани. Затем каждые 5 мин. проводят ещё 6 стадий гомогенизации, не более одной минуты каждая. Далее, как и при обработке клеток, гомогенат центрифугируют, аккуратно отбирают супернатант, разделяют его на аликвоты по 20-50 мкл, которые замораживают и хранят при -70°С. Исследование теломеразной активности проводилось по методике, описанной в примере 1.
Результаты анализа приведены на рисунке 2.
Как видно из рис. 2А, во всех пробах, содержащих различное количество белка из экстракта образца ткани рака мочевого пузыря, стадия T1 N0M0G1 (дорожки 5-8, «биопсийный образец МП») наблюдались характерные дискретные полосы TRAP- продуктов, что свидетельствует о наличии активности теломеразы в образцах. При этом активность теломеразы в экстрактах из клеточного осадка мочи этого пациента (дорожки 1-4) детектировалась только в двух пробах (дорожки 1 и 2), а в двух остальных пробах (дорожки 3 и 4) классические TRAP-продукты практически не наблюдались и не отличались от отрицательного контрольного образца. При анализе активности теломеразы в этих экстрактах методом RT-TRAP-2PCR (рис. 2В) видно, что как в случае анализа ткани (кривые 5-8), так и в случае анализа клеточного осадка мочи (кривые1-4) пациента с раком мочевого пузыря, кривые, характеризующие активность теломеразы, достоверно отличались от отрицательного контрольного образца. Эти результаты свидетельствуют в пользу более высокой чувствительности определения активности теломеразы методом RT-TRAP-2PCR по сравнению с неизотопным методом TRAP.
Пример 3
Согласно методике, описанной в примере 1 , было проведено исследование теломеразной активности в клиническом материале, полученном от пациентов с диагнозом рак поджелудочной железы. На рис. 3 представлены результаты анализа теломеразной активности методом RT-TRAP-2PCR в биологическом материале 5-ти пациентов с диагнозом рак поджелудочной железы. Как видно из рисунка, в клинических образцах трех пациентов (кривые Ns 1, 2, 3) наблюдалась высокая теломеразная активность, еще двоих пациентов (кривые Ns 4, 5) - средняя теломеразная активность. При этом кривые, характеризующие активность теломеразы, достоверно отличаются от отрицательного контрольного образца.
Пример 4
Согласно методике, описанной в примере 1 , было проведено исследование теломеразной активности в постоперационном клиническом материале желудка, полученном от пациентов с диагнозами умеренно дифференцированная аденокарцинома желудка (клинический образец Ns1), низко дифференцированная и умеренно дифференцированная аденокарцинома желудка (клинический образец Ns2) и лимфома желудка (клинический образец Ns3). Данные по измерению теломеразной активности методом RT-TRAP-2PCR представлены на рис. 4 (номера кривых соответствуют номерам образцов пациентов). Как видно из рисунка, в образце Ns1 наблюдалась высокая теломеразная активность, в образце Ns2 - средняя теломеразная активность и в образце N°3 - низкая теломеразная активность, при этом все кривые, характеризующие активность теломеразы, достоверно отличаются от отрицательного контрольного образца, что свидетельствует о высокой чувствительности метода.
Пример 5
Сравнение чувствительности метода RT-TRAP-2PCR со стандартным методом TRAP и методом определения активности теломеразы с помощью магнито-силовой микроскопии на синтетической ds(GGGTTA/CCCAAT)n матрице
Для оценки чувствительности метода по изобретению было проведено исследование по сравнительному анализу чувствительности метода RT-TRAP-2PCR, RT- TRAP и метода TRAP, основанного на магнито-силовой микроскопии, на синтетической двунитевой (double-stranded) матрице ds(GGGTTA/CCCAAT)n (п - количесто повторов). Как видно из рис. 5, чувствительность метода определения активности теломеразы с помощью магнитно-силовой микроскопии (TRAP, основанного на магнитно-силовой микроскопии) и стандартного метода RT-TRAP - real-time TRAP (с использованием набора для определения активности теломеразы фирмы Roche), проведенная с использованием в качестве матрицы синтезированного 54-нуклеотидного теломерного повтора, составила 30 амоль ds(GGGTTA/CCCAAT)g, показав хорошую корреляцию в чувствительности двух методов (^=0,99), в то время как чувствительность предлагаемого метода RT-TRAP-2PCR составляет 10 амоль для аналогичной матрицы ds(GGGTTA/CCCAAT)9 (рис. 6), что свидетельствует о значительно большей чувствительности предлагаемого по изобретению метода анализа активности теломеразы.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ выявления и/или количественного определения активности теломеразы в биологическом образце эукариотического организма, включающий следующие этапы:
(1) инкубацию указанного биологического образца в среде, включающей по меньшей мере один теломеримитирующий олигонуклеотид и дезоксинукпеозидтрифосфаты (дНТФ) или их меченые производные, в условиях, подходящих для продуцирования теломеразой продуктов элонгации с теломеримитирующего олигонуклеотида;
(2) выдерживание реакционной смеси, полученной на этапе (1), при температуре и в условиях, подходящих для инактивации теломеразы;
(3) проведение полимеразной цепной реакции в реакционной смеси, полученной на этапе (2), с добавлением по меньшей мере одного праймера, комплементарного теломерным повторам в геноме исследуемого биологического объекта, и в условиях, подходящих для амплификации продуктов элонгации, полученных на этапе (1);
(4) проведение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в реакционной смеси, полученной на этапе (3), с добавлением по меньшей мере одной пары праймеров, один из которых способен комплементарно взаимодействовать с цепью теломерных повторов, а другой - с комплементарной ей цепью, и в условиях, подходящих для амплификации продукта, полученного на этапе (3);
(5) анализ присутствия и/или активности теломеразы в анализируемом образце путем проведения, соответственно, качественного и/или количественного анализа продуктов реакции, полученных на этапе (4).
2. Способ по п.1, в котором биологический образец представляет собой биологический образец позвоночного животного или человека.
3. Способ по п.2, в котором теломеримитирующий олигонуклеотид имеет последовательность SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% одной из этих последовательностей.
4. Способ по п.2, в котором на этапе (3) используют праймер вида
5’-V(CCCTTA)kW-3’ или 5’-V(CTAACC)kW-3’,
где V - цепочка из 0-20 нуклеотидных остатков, независимо выбранных из A,C,T,G,
W выбран из С, СС, ССС, СССТ, СССТА, СССТАА,
к - целое число от 1 до 3.
5. Способ по п.4, в котором на этапе (3) используют праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 или праймер, имеющий последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% одной из этих последовательностей.
6. Способ по п.2, в котором на этапе (4) используют пару праймеров, один из которых представляет собой праймер вида:
5’-X1X2X3X4X5X6X7X8 (TTTGGG)nY1Y2Y3Y4Y5V6V7Y8-3·,
а другой - праймер вида:
5,-X, 1X, 2X,3X,4X,5X,eX,7X,e(CCCTTA)mY, 1Y, 2Y, 3Y,4Y,5Y,6Y,7YW
или S’-X X’zX’sX^’sX’eX X’eiCCCTATJ^ Y^Y’aY Y’sY’eY Y’e-S’,
где каждый из
Figure imgf000025_0001
- Х8, Yi - Y6, X’i - X’e, Y’i - Y’e независимо выбраны из A,C,T,G или отсутствуют (=0),
Y7Y8 независимо выбраны из AG, GT, GG, ТА или ТТ,
Y'7Y’8 независимо выбраны из АА, СС, ТС, СА, СТ или АТ,
a n, m - независимо выбраны из целых чисел от 1 до 8,
при этом длина праймера независимо составляет не менее 18, но не более 55 нуклеотидов.
7. Способ по п.6, в котором на этапе (4) используют следующие пары праймеров:
TelG-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:8 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; и ТеЮ-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:9 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; или
Те11-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:10, или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; и Те12-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:11 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; или
Те11-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:10 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; и Те12Ь-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:12 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей.
8. Способ по любому из п.п.1-7, включающий предварительную подготовку биологического образца.
9. Способ по любому из п.1-7, в котором праймер на любом из этапов независимо представляет собой флуоресцентно-меченый праймер, люминесцентно-меченый праймер, праймер, меченый радиоактивным изотопом или биотинилированный праймер.
10. Способ по любому из п.п.1-9, в котором меченые производные дезоксинуклеозидтрифосфатов представляют собой биотинилированные нуклеотиды или флуоресцентномеченые нуклеотиды, содержащие химические модификации.
11. Применение способа по любому из п.п.1-10 для выявления и/или количественного определения активности теломеразы в биологическом образце
- для диагностики онкологических заболеваний у человека или позвоночных животных или
- в области вспомогательных репродуктивных технологий для оценки качества яйцеклеток, ооцитов и/или сперматозоидов позвоночных животных или человека или
- для исследования действия препаратов, препятствующих старению и стабилизирующих длину теломер у позвоночных животных или человека.
12. Применение по п.11 , в котором биологическим образцом является ткань или жидкость, выделенная из живого организма.
13. Применение по п.11 , в котором биологический образец содержит не более 10 клеток.
14. Набор для выявления и/или количественного определения активности теломеразы способом по п.1 , включающий, по меньшей мере, теломеримитирующий олигонуклеотид, дезоксинуклеозидтрифосфаты дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ или их меченые производные; праймер, комплементарный теломерным повторам в геноме исследуемого биологического объекта; а также пару праймеров, один из которых способен комплементарно взаимодействовать с цепью теломерных повторов, а другой - с комплементарной ей цепью, в количествах, достаточных для проведения анализа активности теломеразы.
15. Набор по п.14, включающий экстракт опухолевой клеточной линии или синтетическую матрицу ds(GGGTTA/CCCAAT)n в качестве положительного контроля, где п - количесто повторов, выбранное из целых чисел от 4 до 16.
16. Набор по п.14, в котором теломеримитирующий олигонуклеотид имеет последовательность SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% одной из этих последовательностей.
17. Набор по п.14, в который качестве праймера, комплементарного теломерным повторам в геноме исследуемого биологического объекта, входит праймер вида
5’-V(CCCTTA)kW-3’ или 5’-V(CTAACC)kW-3’,
где V - цепочка из 0-20 нуклеотидных остатков, независимо выбранных из A,C,T,G,
W выбирают из С, СС, ССС, СССТ, СССТА, СССТАА,
к - целое число от 1 до 3.
18. Набор по п.17, в котором праймер, комплементарный теломерным повторам в геноме исследуемого биологического объекта, имеет последовательность SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 или последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% одной из этих последовательностей.
19. Набор по п.14, в котором в качестве пары праймеров, один из которых способен комплементарно взаимодействовать с цепью теломерных повторов, а другой - с комплементарной ей цепью, входит пара праймеров, один из которых представляет собой праймер вида:
5 -Х1Х2Х3Х4Х5Х6Х7Х8 (TTTGGGJnY! U2U 3U4U 5U 6U 7U 8-3’,
а другой - праймер вида:
5’-Х',Х’2Х’3Х’4Х: 5Х’6Х'7Х’8(СССТТ )тГ,У’2У’3У’лУ’5Г6У’7У'5-3'
или S’-X X’zX’sX^X’sX’eX X’siCCCTATJ^ Y’zY’sY^Y’sY’eY Y’e-S’,
где каждый из X - Х8, Yi - Ye, Х’1 - X’e, Y’i - Y’e независимо выбраны из A,C,T,G или отсутствуют (=0),
U7U8 независимо выбраны из AG, GT, GG, ТА или ТТ,
Y'7Y’8 независимо выбраны из АА, СС, ТС, СА, СТ или АТ,
a n, m - независимо выбраны из целых чисел от 1 до 8,
при этом длина праймера независимо составляет не менее 18, но не более 55 нуклеотидов.
20. Набор по п.19, в который в качестве пары праймеров, один из которых способен комплементарно взаимодействовать с цепью теломерных повторов, а другой - с комплементарной ей цепью, входят
TelG-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:8 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; и ТеЮ-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:9 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; или
Tel 1 -праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO: 10, или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; и Те12-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO: 12 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; или
Те11-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:10 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; и Те12Ь-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO: 12 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей.
21. Набор по любому из п.п.16-20, в котором по меньшей мере один из праймеров представляет собой флуоресцентно-меченый праймер, люминесцентно-меченый праймер, праймер, меченый радиоактивным изотопом или биотинилированный праймер.
22. Набор по любому из п.п.16-20, в котором меченые производные дезоксинуклеозидтрифосфатов представляют собой биотинилированные нуклеотиды или флуоресцентномеченые нуклеотиды, содержащие химические модификации.
PCT/RU2017/001002 2017-12-01 2017-12-28 Способ определения активности теломеразы методом двойной амплификации теломерных повторов в реальном времени WO2019108085A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017142007 2017-12-01
RU2017142007A RU2681165C1 (ru) 2017-12-01 2017-12-01 Способ определения активности теломеразы методом двойной амплификации теломерных повторов в реальном времени

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019108085A1 true WO2019108085A1 (ru) 2019-06-06

Family

ID=65632945

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2017/001002 WO2019108085A1 (ru) 2017-12-01 2017-12-28 Способ определения активности теломеразы методом двойной амплификации теломерных повторов в реальном времени

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2681165C1 (ru)
WO (1) WO2019108085A1 (ru)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102575287B (zh) * 2009-05-15 2016-11-16 因赛特遗传学公司 用于诊断和治疗癌症的涉及alk融合物的方法和组合物
CN102925546B (zh) * 2012-07-17 2014-01-29 西安交通大学 一种端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDREW T. LUDLOW: "Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 42, no. 13, 1 September 2014 (2014-09-01), XP055464215 *
KRASNENKOV, D. S.: "Dlina telomer v bukvalnom epitelii u zhitelei raznogo vozrasta kievskoi oblasti", vol. 2, no. 24, 2015, pages 114 *
SKVORTSOV D.A. ET AL.: "Assays for detection of telomerase activity", ACTA NATURAE, vol. 3, no. 1, January 2011 (2011-01-01), pages 48 - 68, XP055568667 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2681165C1 (ru) 2019-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2379375T3 (es) Amplificación de secuencias repetitivas de ácido nucleico
KR101135829B1 (ko) 유전자 증폭용 프라이머 세트, 그것을 포함하는 유전자 증폭용 시약 및 그 용도
US9845495B2 (en) Method and kit for detecting target nucleic acid
JP2014510536A (ja) 定量的ｐｃｒによる、ホルマリン固定パラフィン包埋（ｆｆｐｅ）試料におけるテロメア長測定
WO2018042598A1 (ja) ジカウイルス検出用プライマーセット
KR101573467B1 (ko) 방광암 특이적 후성유전적 마커 유전자를 이용한 방광암의 검출방법
JP2024026825A (ja) 脳梗塞のリスク評価方法
KR101825117B1 (ko) Ｐｎａ 기반의 실시간 ｐｃｒ 클램핑을 이용한 ｂｒａｆ 돌연변이 검출 방법 및 키트
US20130171630A1 (en) Methods of using telomeres as markers for aging
US8673563B2 (en) Amplification method of methylated or unmethylated nucleic acid
JP2006506068A (ja) テロメラーゼ活性を検出するための方法及び組成物
JP2003070497A (ja) 核酸欠失シーケンスの検出方法
ES2850324T3 (es) Método de detección de hemoplasmas
EA013373B1 (ru) Определение нуклеиновой кислоты
RU2681165C1 (ru) Способ определения активности теломеразы методом двойной амплификации теломерных повторов в реальном времени
KR101845043B1 (ko) PNA 프로브를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응의 임계 사이클(Ct)에 따른 핵산 검출의 문제를 해결하는 방법
KR101308515B1 (ko) 질편모충 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 질편모충의 검출 방법
JP7176682B2 (ja) 白癬菌の遺伝子をｌａｍｐ法により検出するためのプライマーセット及びそれを含むキット並びにそれらを用いて白癬菌を検出する方法
KR102499837B1 (ko) 유행성궤양증후군 검출용 조성물 및 이의 검출방법
RU2636458C1 (ru) Способ повышения чувствительности полимеразной цепной реакции в реальном времени при обнаружении ДНК патогенных бактерий
TW200804604A (en) Detection method for koi herpes virus (KHV)
CN111712583A (zh) 使用多拷贝基因诊断恙虫病的方法
RU2630648C2 (ru) Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, и набор для его осуществления
EP4230736A1 (en) Method for detecting genetic polymorphism
KR20190100675A (ko) Sfts 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17933682

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205A DATED 08/03/2021)

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17933682

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1