CN116437817A - 用于增进和/或改善皮肤健康状态的组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本公开的目的在于提供用于增进和/或改善皮肤健康状态的组合物。一种组合物,其用于增进和/或改善皮肤的健康状态,所述组合物包含通过在添加透明质酸的培养基中培养间充质干细胞得到的干细胞、培养上清液和/或细胞分泌物。
Description
技术领域
本公开涉及用于增进和/或改善皮肤健康状态的组合物及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞是存在于成体内的干细胞(stem cell)之一,并且具有能够分化为来自中胚层的组织(例如,骨、软骨、血管、心肌细胞等)的能力。作为间充质干细胞的例子,可举出来自骨髓的间充质干细胞、来自脂肪组织的间充质干细胞等。
近年来,间充质干细胞对美容的效果被期待着,特别是该细胞的培养上清液被利用于皮肤护理。例如,在非专利文献1中,公开了调配间充质干细胞的培养上清液及胶原等的化妆品。培养上清液是在培养基中培养细胞时所得到的、包含培养基自身和细胞分泌的各种分泌物的组合物。
在专利文献1中,公开了通过在皮肤涂布使得来自脂肪的干细胞迁移的药剂,使来自脂肪的干细胞迁移到真皮层,提高皮肤状态。在专利文献2中,公开了包含透明质酸的干细胞用培养基。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2016/194760号
专利文献2:美国专利申请公开第2020/0002678号说明书
非专利文献
非专利文献1:https://beauty.hotpepper.jp/kr/slnH000455287/blog/bidA031357383.html
发明内容
发明要解决的课题
像这样,间充质干细胞被期待应用于化妆品,但希望进一步提高对适用对象的组织(例如皮肤)的效果。因此,本公开的目的在于提供用于增进和/或改善皮肤健康状态的组合物。
用于解决课题的手段
发明人进行了深入研究,发现在得到培养上清液时,通过在培养基中添加透明质酸后培养间充质干细胞,培养上清液的性质发生了大变化。具体而言,在该培养上清液中培养皮肤成纤维细胞时,发现对皮肤成纤维细胞的基因表达产生大影响。虽然该机制不明确,但已知透明质酸促进创伤治疗等皮肤状态的改善,认为可能通过在含有透明质酸的培养基中培养干细胞,干细胞被刺激,生成用于调节皮肤状态的物质等。
本公开的发明是基于上述见解完成的,在一个方面中,包括以下发明。
(发明1)
一种组合物,其用于增进和/或改善皮肤的健康状态,所述组合物包含通过在添加透明质酸的培养基中培养间充质干细胞得到的干细胞、培养上清液和/或细胞分泌物。
(发明2)
根据发明1所述的组合物,其中,所述透明质酸的重均分子量为5000以下。
(发明3)
根据发明1或2所述的组合物,其中,所述透明质酸的浓度为20μg/ml以上、1000μg/ml以下。
(发明4)
根据发明1~3中任一个所述的组合物,其为用于化妆品的组合物。
(发明5)
根据发明1~3中任一个所述的组合物,其为用于健康食品的组合物。
(发明6)
根据发明1~3中任一个所述的组合物,其为用于治疗特应症的组合物。
(发明7)
根据发明1~3中任一个所述的组合物,其用于治疗与以下任一种以上基因相关的皮肤疾病,
(a)Col3A1,
(b)Meprin-α,
(c)弹性蛋白,
(d)P16INK4a,以及
(e)HAS1。
(发明8)
根据发明1~3中任一个所述的组合物,其用于创伤愈合。
(发明9)
根据发明1~3中任一个所述的组合物,其为生发和/或育发促进剂。
(发明10)
根据发明1~9中任一个所述的组合物,其中,所述组合物包含通过在添加透明质酸的培养基中培养间充质干细胞得到的培养上清液和/或它们的加工物。
(发明11)
根据发明1~10中任一个所述的组合物,其中,所述组合物包含在添加透明质酸的培养基中培养的间充质干细胞。
(发明12)
一种用于增进和/或改善皮肤健康状态的组合物的制备方法,其中,所述方法包括:
在培养基中添加透明质酸的工序,
在添加后的培养基中,培养间充质干细胞的工序,以及
回收培养后的培养上清液和/或细胞的工序。
发明效果
在一个方面,本公开的组合物通过在添加透明质酸的培养基中培养间充质干细胞得到。由此,从间充质干细胞分泌对皮肤细胞(特别是皮肤成纤维细胞、表皮角化细胞等)基因表达产生影响的成分。从而,通过该成分,可以增减参与增进和/或改善皮肤的健康状态的基因的表达量。
附图简单说明
[图1]是将基于定量PCR的各基因的表达量相对化的图。
[图2]是将基于定量PCR的各基因的表达量相对化的图。
[图3]是将基于定量PCR的各基因的表达量相对化的图。
发明的具体实施方式
以下,对用于实施本公开的发明的具体实施方式进行说明。以下的说明用于促进对发明的理解。即,并不意图限定本发明的范围。
1.用于增进和/或改善皮肤健康状态的组合物
在一个实施方式中,本公开涉及用于增进和/或改善皮肤健康状态的组合物。这样的组合物通过在添加透明质酸的培养基中培养间充质干细胞得到。更具体地说,所述组合物可以包含通过培养间充质干细胞得到的培养上清液和/或它们的加工物。作为另一个具体实例,所述组合物包含在添加透明质酸的培养基中培养的间充质干细胞和/或该细胞的分泌物。或者,所述组合物可以包含这些干细胞、培养上清液和/或细胞分泌物的任意组合。
1-1.定义
本说明书中记载的术语“增进和/或改善皮肤的健康状态”包括改善与皮肤相关的特定疾病的目的。进而,该术语并不限于治疗目的。例如,该术语包括即使没有特定疾病也提高皮肤的外观(光泽、弹性等)的目的。
另外,本说明书中记载的术语“增进和/或改善”不仅包括外观上的增进和/或改善,还包括维持现状。例如,本说明书中记载的术语“增进和/或改善”还包括维持本来随着年龄增加而衰弱的特征(例如,防止皱纹、色斑的增加等)。
进而,本说明书中记载的“通过在添加透明质酸的培养基中培养间充质干细胞得到”并不限于直接得到的物质,也包含间接得到的物质。作为前者的例子,可举出培养间充质干细胞后的培养上清液和间充质干细胞。作为后者的例子,可举出加工培养上清液的物质,例如添加其他成分的物质及进行进一步处理的物质。作为进一步处理的例子,例如可举出对培养上清液进行过滤处理的物质、从培养上清液除去水分后浓缩的物质、从该上清液中提取特定成分(例如细胞分泌物)的物质等。
1-2.成分
在一个实施方式中,本公开的组合物可以包含以下(1)~(2)中的至少一种:
(1)间充质干细胞或它们的分泌物,
(2)培养上清液或它们的加工物。
考虑到产品化时的操作简便性等,优选(2)。
另外,除了上述成分之外,也可以根据需要添加其他成分。例如,作为其他成分,可举出赋形剂、抗生素、pH缓冲剂等。进而,作为其他成分,可举出用于增进和/或改善皮肤的健康状态的其他成分(例如,抗氧化剂、香料、美白成分、保湿成分、美白成分等)。
1-3.制造方法
在一个实施方式中,本公开涉及用于增进和/或改善皮肤健康状态的组合物的制备方法。
所述制造方法至少包括以下工序:
·在培养基中添加透明质酸,
·在添加后的培养基中,培养间充质干细胞,
·回收培养后的培养上清液和/或细胞。
1-3-1.间充质干细胞(来自脂肪、来自骨髓)
间充质干细胞并不限于来自特定组织的物质,也可以是来自任意组织的物质。例如,可举出来自骨髓、来自脐带血、来自胎盘、来自脂肪组织等。典型地,可以使用来自骨髓和/或来自脂肪组织的间充质干细胞。
1-3-2.透明质酸
在培养基中所添加的透明质酸没有特别限定,优选低分子量的透明质酸。更具体地说,重均分子量为5000以下,优选为2000以下,更优选为1500以下,最优选为1000以下。另外,优选的使用浓度为20~1000μg/ml。透明质酸的分子量是指,通过组合了尺寸排阻色谱法和光散射检测器的方法(SEC-LS)计算出的分子量。
1-3-3.培养基
培养基没有特别限定,可以使用本领域公知的培养基(例如,DMEM、F12、RPMI等)。作为培养基的例子,可举出Invitrogen制的间充质干细胞基础培养基、三光纯药制的间充质干细胞基础培养基、TOYOBO公司制的MF培养基、BioMimetics Sympathies公司的sf-DOT(注册商标)等。
1-3-4.培养条件
培养条件没有特别限定,只要是本领域公知的条件即可。例如,温度可以为35℃~40℃,典型为37℃。适当地,也可以以CO2成为5%的方式控制培养器。培养期间没有特别限定,优选培养至少24h、优选48h以上。上限没有特别限定,为168h以下。以下的说明并不意图限制发明的范围,但认为通过透明质酸的刺激,间充质干细胞发生变化,分泌某种有用的成分。因此,透明质酸的刺激后,到间充质干细胞发生变化为止,需要一定时间,所以一定程度的培养期间是必要的。
在优选的实施方式中,使间充质干细胞最初在培养皿上增殖,然后在添加透明质酸的培养基中进行培养。例如,使其从半汇合(例如,在显微镜视野中80%以上细胞所占据的状态)到达汇合(confluent),然后在添加透明质酸的培养基中进行培养。在这种情况下,透明质酸与其说是起到作为存在于细胞与培养皿之间的支架的作用,不如说是起到对间充质干细胞赋予生理刺激的作用。从这样的观点出发,与使用透明质酸作为细胞的支架的专利文献2相比,优选的实施方式涉及的本发明在技术思想上不同。
在更优选的实施方式中,在培养基中所添加的透明质酸是低分子量的透明质酸。一般来说,成为细胞支架的细胞外基质多为胶原、纤连蛋白等经聚合的高分子。关于透明质酸,也不例外,在作为支架使用的情况下,通常使用高分子的透明质酸。从这样的观点出发,与使用透明质酸作为细胞的支架的专利文献2相比,更优选的实施方式涉及的本发明在技术思想上不同。
另外,认为低分子的透明质酸对细胞死亡的抑制功能高,而且,作为信号传递的触发作用的倾向与高分子的透明质酸相比强。并且,认为通过成为有益的信号传递的触发,向细胞外分泌有益的物质。优选的实施方式涉及的本发明利用分泌到细胞外的有益物质,与要利用细胞内成分的专利文献2在技术思想上不同。
在更优选的实施方式中,使用大量含有从细胞分泌的因子的培养上清液(也称为培养液),而不是专利文献2中使用的细胞破碎提取物(extract)。如果使用细胞破碎提取物,例如,在将含有其的物质涂布于皮肤的情况下,则可预期通常不释放到细胞外的许多蛋白、核酸等暴露在皮肤。如果产生对该蛋白或核酸的抗体,则有可能导致自身免疫疾病。具体地说,已知抗DNA双链抗体或抗组蛋白抗体在全身性红斑狼疮发病患者中大量产生,抗着丝粒抗体在全身性硬皮病的发病患者中大量产生,认为这样的抗体攻击全身的细胞,由此出现自身免疫疾病。因此,如果使用细胞破碎提取物,则在皮肤有裂伤等的情况下,细胞内成分渗透到血管内,有产生对该成分的抗体的危险性,因此期望使用培养上清液,更优选的实施方式涉及的本发明在技术思想上与专利文献2不同。
1-3-5.其他处理(过滤器等)
培养后,可以回收培养上清液和/或细胞以供进一步处理。例如,在培养上清液的情况下,也可以用过滤器处理或浓缩处理。在细胞的情况下,为了冷冻保存,可以转移到添加DMSO的培养基中。
1-3-6.向剂型的加工
另外,在一个实施方式中,本公开的组合物可以被加工成特定形状而用于特定用途的产品。例如,组合物可以是固体,也可以是液体,还可以是半固体(凝胶状)。在固体的情况下,可以加工成粉末状,也可以加工成片状。在组合物的成分为细胞的情况下,可以是将细胞悬浮在保存液等的状态。
2.用途
在一个实施方式中,本公开的组合物可以利用于各种用途。例如,本公开的组合物可以应用于化妆品、健康食品、治疗药等。如上所述,认为通过透明质酸的刺激,间充质干细胞发生变化,分泌某种有用的成分。因此,如果组合物中含有培养上清液和培养后的细胞中的至少一种,则含有有用的成分。另外,在培养后的细胞的情况下,可以分泌对细胞外有用的成分。并且,该有用的成分可以对皮肤等组织(例如,皮肤成纤维细胞、表皮角化细胞等)产生良好的影响。
2-1.用于化妆品的组合物
在一个实施方式中,本公开的组合物可以应用于化妆品,特别适用于皮肤化妆品。施用方式没有特别限定,但在皮肤的化妆品用途的情况下,优选适合涂在皮肤的形态。例如,本公开的组合物优选糊状、液体状或凝胶状。
因此,在一个实施方式中,根据施用方式,本公开的组合物可以调配适当的附加成分。例如,本公开的组合物可以包含皮肤化妆品中通常含有的成分。作为该成分的例子,可举出保湿成分、表面活性剂、润肤剂成分、屏障改善成分、抗老化成分、美白成分、细胞赋活成分、抗炎症(刺激缓和、抗过敏)成分、抗氧化成分、紫外线防御成分、抗菌成分、血液循环促进成分、收缩成分、角质剥离成分、稳定成分(防腐、螯合物、pH调节等)、温冷感成分、香料、着色剂、溶剂、抗静电剂、表面处理剂、刷洗剂、植物油脂、植物提取物等。
2-2.用于健康食品的组合物(施用方式、其他成分)
在一个实施方式中,本公开的组合物可以应用于健康食品,特别是可以是对皮肤具有有用效果的用于健康食品的组合物。施用方式没有特别限定,但考虑到在消化器官的消化和吸收,也可以内包在适当的胶囊、肠溶胶囊等中。在用于健康食品的组合物的情况下,施用方式为经口摄取。因此,例如,本公开的组合物优选为固体状、液体状或凝胶状。更具体地,组合物只要是可通过咀嚼和/或咽下而摄取的形式即可。因此,组合物不仅可以是补品片、饼干等固体物,还可以是果冻、饮料等液体状或凝胶状。
因此,在一个实施方式中,根据施用方式,本公开的组合物可以调配适当的附加成分。例如,本公开的组合物可以包含健康食品中通常含有的成分。作为该成分的例子,可举出保存剂、防腐剂、香料、pH调节剂、抗氧化剂、防霉剂、甜味剂、着色剂等。
2-3.用于治疗特应症的组合物
在一个实施方式中,本公开的组合物可以应用于特应症治疗,特别是可以是对皮肤具有有用效果的特应症治疗组合物。施用方式没有特别限定,例如可举出涂布、皮下注射、口服等。因此,例如,本公开的组合物优选为固体状、液体状、糊状或凝胶状。
因此,在一个实施方式中,根据施用方式,本公开的组合物可以调配适当的附加成分。作为该成分的例子,可举出赋形剂、载体、pH缓冲液、转染促进剂、其他特应症治疗药等。
2-4.其他用途的组合物
在一个实施方式中,本公开的组合物可以应用于其他用途(例如,用于创伤愈合、用于皮肤疾病治疗、用于生发和/或育发促进剂等)。特别地,本公开的组合物有可能对与以下中选择的至少一种蛋白的表达的增减相关的疾病有用:
(a)Col3A1,
(b)Meprin-α,
(c)弹性蛋白,
(d)P16INK4a,以及
(e)HAS1。
(a)Col3A1也被称为III型胶原的α1,是胶原纤维的三重螺旋的构成要素之一,并且在组织学上是构成皮肤的蛋白。已知该蛋白的减少有助于皮肤的老化征兆。另外,除此之外,Col3A1还可参与创伤愈合(包括手术创伤的愈合)。
(b)Meprin-α是Zn蛋白酶的亚单位。并且,具有切断III型胶原的前肽的功能。已知III型胶原/I型胶原的比例随着年龄增加而减少,并且已知Meprin也随着年龄增加而减少。进而,报告了通过防止因年龄增加而导致的meprin的减少,抑制III型胶原/I型胶原的比例的减少的见解(https://www.jstage.jst.go.jp/article/sccj/47/4/47_278/_article/-char/ja/)。
(c)弹性蛋白(Elastin)是具有支撑胶原纤维的作用的纤维。而且,弹性蛋白随着年龄增加而减少,该现象成为皱纹的原因。另外,已知也可以作为化妆品和/或补品的成分调配。另外,除此之外,弹性蛋白还可参与创伤愈合(包括手术创伤愈合)。进而,生发和/或育发剂中可调配弹性蛋白成分,弹性蛋白可参与育发。
(d)已知p16INK4a具有抑制细胞周期的功能,进而,已知该蛋白的表达量增加时,老化加剧。
(e)HAS1被称为透明质酸合成酶1(Hyaluronan Synthase1),是具有合成透明质酸功能的酶之一。已知在特应症患者的皮肤中,HAS1的表达量和透明质酸减少。已知该透明质酸也可以作为化妆品和/或补品的成分调配。另外,除此之外,HAS1经由合成的透明质酸还可参与创伤愈合(包括手术创伤愈合)。进而,HAS1经由合成的透明质酸还可参与生发和/或育发。
实施例
3.实施例
3-1.实施例1(间充质干细胞的初代培养)
首先,准备来自脂肪组织的间充质干细胞。具体地说,从预定接受使用来自脂肪组织的间充质干细胞的再生医疗的患者中,分取皮下脂肪组织。该皮下脂肪组织是制备施用用细胞所必要的原料。将分取该皮下脂肪组织后的剩余供于初代培养。此外,预先从患者取得了关于研究利用的同意。
将皮下脂肪组织供于离心分离(400×g,5分钟),分离成3层。具体地说,从上层依次分离为脂质级分、脂肪组织级分和水性级分这3层。保留中层的脂肪组织级分,废弃上层和下层。相对于保留的脂肪组织级分,添加每组织重量为4倍量的0.15%胶原酶溶液。在37℃渗透1小时,进行酶处理。脂肪组织通过酶处理分散后,将该脂肪组织供于离心分离(400×g,5分钟)。将沉淀级分用30mL PBS(-)溶液悬浮,作为含有间充质干细胞的间质血管细胞级分。然后,在细胞过滤器(网格尺寸70μm径)中通入悬浮液,废弃由细胞过滤器捕捉到的组织残渣等。然后,再次将通液级分供于离心分离(400×g,5分钟),将沉淀级分用6mL无血清培养液sf-DOT(BioMimetics Sympathies公司)悬浮。将细胞悬浮液总量接种到T25烧瓶(CellBIND;Corning,3289)中,在培养器内(37℃,5%CO2)静置,开始初代培养。
以每3天1次的频率,实施培养基全部更换。废弃上清液,使在烧瓶底面上增殖的细胞选择性地增殖。对于增殖至半汇合的T-25烧瓶内的细胞,添加2mL酶溶液(TrypLEExpress;Thermo Fisher Scientific,12604021),从烧瓶的底面剥离细胞(37℃,静置5分钟)。用PBS(-)稀释细胞,供于离心分离(400×g,5分钟)。将沉淀的细胞用培养液sf-DOT悬浮,分取一部分,用台盼蓝染色法进行细胞数计测。在新的T75烧瓶(CellBIND;Corning,3290)中接种用sf-DOT悬浮的细胞,在培养器内(37℃,5%CO2)静置,进行继代培养(P0→P1)。之后,也按照同样的顺序进行继代培养,得到所需的细胞数(P1→P2)。
3-3.实施例3(培养上清液的制备)
首先,如上所述,用sf-DOT培养来自脂肪组织的间充质干细胞。在该培养基中,将来自脂肪组织的间充质干细胞以每1个T75烧瓶为3000细胞/cm2播种。在到达半汇合的第3天,用PBS(-)清洗一次。然后,准备以下2种培养上清液用培养基:
(i)基本培养基(DMEM/F12;SIGMA,D8900)、
(ii)基本培养基(DMEM/F12;SIGMA,D8900)+低分子量透明质酸HA4(添加100μg/ml)。
在这些(i)和(ii)的培养基中进一步培养3天,回收各自的上清液。将回收的培养上清液用0.2μm的PES注射过滤器(25mm GD/X注射过滤器(PES 0.2μm已灭菌);6896-2502;GE HealthCare Japan)过滤。将过滤后的培养上清液在-28℃冷冻保存,直至用于分析。
使用上述中得到的培养上清液,制备以下3种培养上清液:
CM1:来自上述(i)的培养上清液,
H-CM:来自上述(ii)的培养上清液,
CM2:在来自上述(i)的培养上清液中,添加低分子量透明质酸HA4(100μg/ml)的物质。
3-4.实施例4(使用培养上清液的皮肤成纤维细胞处理)
准备正常人皮肤成纤维细胞(Normal Human Dermal Fibroblast(NHDF);Takara,C-12302)。该细胞是在成纤维细胞培养基(Fibroblast medium(Sciencell,2301)中继代和维持的。将NHDF以3000细胞/cm2接种到12孔板(Corning,3336)的各孔中,培养过夜。
3-5.实施例5(使用培养上清液的表皮角化细胞处理)
准备正常人表皮角化细胞(Normal Human Epidermal Keratinocyte(NHEK);Takara,C-12006)。该细胞是在角化细胞-SFM(ThermoFisher Scientific,17005042)中继代和维持的。将NHEK以10000细胞/cm2接种到12孔板(Corning,3336)的各孔中,培养过夜。
次日(播种后16~24小时),在各种上清液(CM1、CM2、H-CM)进行培养基更换,进一步培养3天(约72小时)。培养后,使用ReliaPrep RNA Miniprep系统(Promega,Z6012),从NHDF和NHEK中提取总RNA。提取后,使用500ng的RNA进行cDNA合成(PrimeScript RT MasterMix;Takara,RR036A),进一步进行定量PCR(Thunderbird Sybr qPCR Mix;TOYOBO,QPS-201X5)。
根据以下组成,制备用于cDNA合成的混合物(mixture):
5×PrimeScript RT Master Mix 2μl(最终浓度1×)
总RNA 500ng
去RNA酶水 调整为合计10μl
使用Applied Biosystems公司的Veriti 96well Thermal Cycler,在以下条件下处理上述混合物:
使用90μl的TE(10mM Tris-HCl pH8.0+1mM EDTA pH8.0),将合成的cDNA(10μl)稀释10倍。将该稀释物供于定量PCR。
3-6.实施例6(皮肤成纤维细胞和表皮角化细胞的基因表达的分析)
更具体地说,将该稀释物在以下条件下混合:
对于上述混合物,使用Bio-Rad公司的CFX-Connect,扩增cDNA。PCR循环的条件如下所述:
1.95℃ 1分钟(初期变性)
2.95℃ 15秒(变性)
3.60℃ 30秒(延伸)
(将步骤2~3重复40次,每次步骤3结束时检测荧光信号)
4.从65℃到95℃以每次0.5℃使温度上升,每5秒保持温度后检测荧光信号。
在上述循环中,进行PCR产物的检测,并通过熔解曲线(Melting curve)进行PCR产物的单一性的确认。
作为内部标准(在所有细胞、条件下进行相同的表达的管家基因),使用GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶,Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)。
用于检测各基因的引物序列如下所述:
GAPDH正向引物:5’-agccacatcgctcagacac-3’(序列号1)
GAPDH反向引物:5’-gcctaatacgaccaaatcc-3’(序列号2)
Col3A1正向引物:5’-ctggaccccagggtcttc-3’(序列号3)
Col3A1反向引物:5’-gaccatctgatccagggtttc-3’(序列号4)
Meprin-α正向引物:5’-gcaccacaactcacactctttt-3’(序列号5)
Meprin-α反向引物:5’-ttccacagatgtttgccttc-3’(序列号6)
弹性蛋白正向引物:5’-ggaggtgttcccggagtc-3’(序列号7)
弹性蛋白反向引物:5’-ggtccccactccgtacttg-3’(序列号8)
p16INK4a正向引物:5’-gtggacctggctgaggag-3’(序列号9)
p16INK4a反向引物:5’-ctttcaatcggggatgtctg-3’(序列号10)
HAS1正向引物:5’-acgtgcggatccttaaccc-3’(序列号11)
HAS1反向引物:3’-aggcctagaggaccgctgat-3’(序列号12)
所有的引物都是从FASMAC株式会社购买的(反相柱纯化等级)。各基因的表达量表示将基于定量PCR得到的各基因的表达量进一步除以GAPDH的表达量而标准化的结果。进而,将未处理上清液的对照组条件下的表达量标准化为“1”。通过熔解曲线,确认使用以上引物扩增的PCR产物全是单一的(即,用相同引物,没有扩增多种序列)。
将结果示于图1和图2中。在用H-CM处理的皮肤成纤维细胞中,确认了验证的基因的表达量向良好的方向变化。即,认为希望增加的基因(Col3A1、Meprin-α、弹性蛋白)的表达量增加。另一方面,认为希望减少的基因(p16INK4a)的表达量减少。另外,在用H-CM处理的表皮角化细胞中,也确认了验证的基因的表达量(具体而言,HAS1的表达量)向良好的方向变化。
值得特别指出的一点是,通过这样的H-CM处理的基因的表达量的变化比通过CM2处理的基因的表达量的变化显著。如上所述,CM2是将来自脂肪组织的间充质干细胞在培养基中处理后、向培养基中添加HA4的条件。另一方面,H-CM是将来自脂肪组织的间充质干细胞在培养基中处理之前、向培养基中添加HA4的条件。
因此,可以认为来自脂肪组织的间充质干细胞受到HA4的刺激,向细胞外分泌了某种有用的物质。并且,可以认为通过该有用物质的存在,使皮肤成纤维细胞及表皮角化细胞的基因的表达量良好地变化。
皮肤成纤维细胞和表皮角化细胞是存在于皮肤组织中的细胞。因此,可以认为这样的基因表达量的变化对皮肤的健康状态产生良好的影响。
另外,考虑到H-CM和CM2的条件的不同以及所带来的结果的不同,可推测即使在将用H-CM处理的细胞与例如皮肤成纤维细胞和表皮角化细胞中的任一个共同培养的情况下,也能得到同样的效果。因此,可推测在H-CM的条件下处理的情况中,不仅培养上清液,培养后的细胞本身也对皮肤的健康状态产生良好的影响。为了验证这一点,如下所示,进行了实施例7的实验。
3-7.实施例7(皮肤成纤维细胞和间充质干细胞的共同培养)
按照与实施例1~2相同的顺序,准备来自脂肪组织的间充质干细胞。将来自脂肪组织的间充质干细胞以每1个T75烧瓶为3000细胞/cm2播种。在到达半汇合的第3天,用PBS(-)清洗一次。然后,准备以下2种培养上清液用培养基:
(i)基本培养基(DMEM/F12;SIGMA,D8900),
(ii)基本培养基(DMEM/F12;SIGMA,D8900)+低分子量透明质酸HA4(添加100μg/ml)。
在这些(i)和(ii)培养基中进一步培养3天,回收各自的细胞(分别为MSC和MSC-H)。
与上述一同,准备正常人皮肤成纤维细胞(Normal Human Dermal Fibroblast(NHDF);Takara,C-12302)。该细胞是在成纤维细胞培养基(Fibroblast medium(Sciencell,2301)中继代和维持的。将NHDF以100000个细胞接种到6孔板(CellBIND;Corning,3335)的各孔中。在其设置transwell(6孔板用24mm插件、0.4μm孔径;Corning,3412)。在transwell内,也注入适量的成纤维细胞培养基(Sciencell,2301),进一步准备没有播种任何细胞的对照组(仅NHDF)、播种MSC(NHDF-MSC)的组、以及播种MSC-H(NHDF-MSC-H)的组。播种的MSC和MSC-H的数量均为100000个。此外,使用的transwell通过预先用PLL(多聚-L-赖氨酸;Cultrex,3438-100-01)进行涂布,可使间充质干细胞贴附于transwell。涂布是在37℃过夜进行的。然后,用灭菌水清洗、除去多余的PLL。
将来自脂肪组织的间充质干细胞和正常人皮肤成纤维细胞共同培养3天。将正常人皮肤成纤维细胞置于下侧,将来自脂肪组织的间充质干细胞置于上侧。然后,由于在transwell中存在0.4μm的远远小于细胞的多个孔,因此transwell上部的来自脂肪组织的间充质干细胞向下部移动。比起直接与正常人皮肤成纤维细胞接触而发挥效果的方式,采用了经由0.4μm的小孔,来自脂肪组织的间充质干细胞的分泌物对正常人皮肤成纤维细胞发挥作用的方式。
然后,回收正常人皮肤成纤维细胞的RNA,用与上述实施例6同样的方法,确认表达量。将结果示于图3中。比较与MSC的共同培养和与MSC-H的共同培养的结果,确认了与MSC-H的共同培养的结果在基因表达方面向良好方向变化。即,在正常人皮肤成纤维细胞中认为希望增加的基因(Col3A1,弹性蛋白)的表达量增加。另一方面,认为希望减少的基因(p16INK4a)的表达量减少。这样的结果表明,不仅培养上清液,干细胞本身也对皮肤的健康状态产生良好的影响。
以上,对具体的实施方式进行了说明。上述实施方式只是具体实例,本发明并不限于上述实施方式。例如,上述实施方式之一中公开的技术特征可适用于其他实施方式。另外,除非另有说明,对于特定的方法,也可以将一部分工序与其他工序的顺序替换,也可以在特定的两个工序之间追加进一步的工序。本发明的范围由权利要求书规定。
序列表
<110> 仿生技术支持有限公司
<120> 用于增进和/或改善皮肤健康状态的组合物及其制备方法
<130> P-2913-WO
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
agccacatcg ctcagacac 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
gcctaatacg accaaatcc 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
ctggacccca gggtcttc 18
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
gaccatctga tccagggttt c 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
gcaccacaac tcacactctt tt 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
ttccacagat gtttgccttc 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
ggaggtgttc ccggagtc 18
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
ggtccccact ccgtacttg 19
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
gtggacctgg ctgaggag 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
ctttcaatcg gggatgtctg 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
acgtgcggat ccttaaccc 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
aggcctagag gaccgctgat 20
Claims (12)
1.一种组合物,其用于增进和/或改善皮肤的健康状态,所述组合物包含通过在添加透明质酸的培养基中培养间充质干细胞得到的干细胞、培养上清液和/或细胞分泌物。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中,所述透明质酸的重均分子量为5000以下。
3.根据权利要求1或2所述的组合物,其中,所述透明质酸的浓度为20μg/ml以上、1000μg/ml以下。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的组合物,其为用于化妆品的组合物。
5.根据权利要求1~3中任一项所述的组合物,其为用于健康食品的组合物。
6.根据权利要求1~3中任一项所述的组合物,其为用于治疗特应症的组合物。
7.根据权利要求1~3中任一项所述的组合物,其用于治疗与以下任一种以上基因相关的皮肤疾病,
(a)Col3A1,
(b)Meprin-α,
(c)弹性蛋白,
(d)P16INK4a,以及
(e)HAS1。
8.根据权利要求1~3中任一项所述的组合物,其用于创伤愈合。
9.根据权利要求1~3中任一项所述的组合物,其为生发和/或育发促进剂。
10.根据权利要求1~9中任一项所述的组合物,其中,所述组合物包含通过在添加透明质酸的培养基中培养间充质干细胞得到的培养上清液和/或它们的加工物。
11.根据权利要求1~10中任一项所述的组合物,其中,所述组合物包含在添加透明质酸的培养基中培养的间充质干细胞。
12.一种用于增进和/或改善皮肤健康状态的组合物的制备方法,其中,所述方法包括:
在培养基中添加透明质酸的工序,
在添加后的培养基中,培养间充质干细胞的工序,以及
回收培养后的培养上清液和/或细胞的工序。
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