KR102189991B1 - miRNA를 포함하는 상처 치료 또는 피부 개선용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 마이크로RNA(miRNA)를 유효 성분으로 포함하여, 상처 치료 및 피부 개선의 효과를 갖는 다양한 용도의 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 서열번호 1 내지 9 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 종자 서열(seed sequence)을 포함하는 miRNA; 이를 포함하는 발현 벡터; 또는 상기 발현 벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 유효 성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

miRNA를 포함하는 상처 치료 또는 피부 개선용 조성물 {Composition for wound healing or improving skin comprising miRNA}
본 발명은 마이크로RNA(miRNA)를 포함하며, 상처 치료 및 피부 개선 효과를 갖는 다양한 용도의 조성물에 관한 것이다.
miRNA는 18-25 뉴클레오티드(nucleotide, nt)로 구성된 작은 비-암호화 RNA로서, 표적 유전자의 3'-비번역 부위(untranslated region, UTR)에 결합하여 유전자 발현을 조절하고(Bartel DP, et al., Cell 116: 281-297, 2004; Lewis BP, et al., Cell 120: 15-20, 2005), 인트론(intron), 엑손(exon) 또는 유전자 간 부위(intergenic region)로부터 공정된다(Rodriguez A, et al., Genome Res14: 1902-1910, 2004). 첫째로, miRNA는 수천 개의 뉴클레오티드를 포함하는 초기 miRNA(pri-miRNA) 분자 내로 RNA 폴리머라아제 에 의해 전사된다. 그런 다음, pri-miRNA는 miRNA 전구체로 알려진 대략 70 nt 줄기 고리 중간체를 형성하기 위해 마이크로프로세서[DroshaRNase 엔도뉴클레아제 및 디조지증후군 부위 유전자 8 단백질(DroshaRNase endonuclease and DiGeorge syndrome region gene 8 protein, DGCR8)]에 의해 연속적으로 공정된다(Lee Y, et al., EMBO J21: 4663-4670, 2000; Zeng Y, et al., Proc Natl Acad Sci U S A100: 9779-9784, 2003). 그런 다음, pre-miRNA는 엑소폴틴-5(Exportin-5, EXP5)와 공동인자 Ran-GTP를 통해 핵으로부터 세포질로 이동되고, 여기서 pre-miRNA는 RNase 엔도뉴클레아제 다이서에 의해 18-25 nt 성숙 miRNA 듀플렉스(duplexe)로 공정된다(Lee Y, et al., EMBO J23: 4051-4060, 2004; Shenouda SK, et al., Cancer Metastasis Rev28: 369-378, 2009). 성숙 miRNA 듀플렉스는 RNA-유도 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex, RISC) 내로 아르고노트(Argonaute) 단백질과 단일 가닥 RNA로서 통합되고, 이는 표적 mRNA의 절단 또는 번역 억제 중 어느 하나를 유도한다(Diederichs S, et al., Cell131: 1097-1108, 2007; Hammond SM, et al., Nature404: 293-296, 2000; Martinez et al., Cell 110: 563-574, 2002).
한편, 상처는 창상(創傷)이라고 칭해지기도 하며, 그 원인에 따라 절창(切創), 자창(刺創), 할창(割創), 좌창(挫創), 열창(裂創), 사창(射創), 교창(咬創) 등으로 나뉘고, 형상에 따라 선상창(線狀創), 판상창(瓣狀創), 결손창 등으로 나뉜다. 상처에 따른 증세로는 통증, 출혈, 기능장애 등이 있으며, 상처를 입는 경우, 생체는 이를 치유하기 위하여 다양한 생리적 반응을 나타낸다. 통상, 상해를 받은 세포의 변성(變性), 사멸 과정을 거처 주위의 조직으로부터의 유주세포(遊走細胞), 조직액의 유출되고, 섬유소의 석출과 육아조직(肉芽組織)이 형성되어 상처를 치유하게 된다.
일반적으로 EGF(Epidermal Growth Factor), FGF(Fibroblast Growth Factor), TGF-α(Transforming Growth Factor-α), TGF-β, IGF-I (Insulin-like Growth Factor-1) 등의 성장인자들이 상처를 치료하거나 상처 치료를 촉진시키는 것으로 알려져 있다.
그러나, EGF 등의 특정 성장인자를 분리하여 임상에 적용할지라도 아직까지 만족할만한 상처 치료 또는 상처 치료 촉진 효과를 기대하기가 곤란하다. 또한, MSC 등의 줄기세포를 직접 사용할 경우에는 세포의 생존율을 높게 유지하면서 제제화하는 것이 곤란할 뿐만 아니라 세포의 원천(source)에 따라 다양한 개체편차를 나타내어 목적하는 치료효과를 동일하게 나타내는 것이 여전히 곤란하다.
최근 의료기술 및 공중위생 혜택이 개선됨에 따라 초고령화 사회가 급속히 도래하고 있다. 이에 따라, 생활의 질적인 향상이 도모되고 있으며 젊음의 유지에 대한 욕구도 증가하고 있다. 외모, 특히 피부에서 가장 먼저 나타내게 되는 노화를 지연시키고 예방하기 위하여 여러 영역에서 많은 연구가 진행되고 있다.
피부(skin)는 표피(epidermis), 진피(dermis) 및 피하조직(subcutaneous tissue)으로 이루어진다. 피부의 바깥층인 표피는 중층편평상피(stratified squamous epithelium)로 구성되며, 외부 환경에 대한 신체의 보호 장벽으로 작용한다. 표피는 바깥에서부터 각질층(stratum corneum), 투명층(stratum lucidum), 과립층(stratum granulosum), 유극층(stratum spinosum) 및 기저층(stratum basale)으로 나뉜다. 진피는 표피와 피하조직(subcutaneous tissue) 사이의 층으로서, 유두층(papillary dermis) 및 망상층(reticular dermis)으로 나뉘며, 표피에는 없는 혈관, 콜라겐, 엘라스틴 섬유, 모공, 입모근, 피지선, 한선, 여러 가지 감각신경, 섬유아세포 및 대식세포 등이 존재하며 피부 중 가장 많은 부위를 차지한다.
진피는 주로 콜라겐과 엘라스틴 섬유로 이루어지는데, 이들은 피부를 지지하는 역할을 한다. 따라서 이러한 진피에 문제가 발생하면 주름이 생기고 피부탄력이 없어져서 피부노화가 진행된다. 콜라겐은 피부 재생, 피부 함수율, 상처 치유 및 주 름개선 등에 있어서 가장 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있으며, 섬유아세포로부터 생성된다. 콜라겐은 수분을 다량 함유할 수 있는 기능이 있어서 진피에 수분을 공급하는 역할을 하는데, 노화가 되면 콜라겐의 수분 함유 기능이 떨어지게 되어 주름이 늘어나게 된다. 콜라겐은 또한 상처가 생겼을 때 섬유아세포의 지속적인 콜라겐 생성으로 상처 부위를 메워주어 상처치유 작용도 한다.
본 발명의 일 목적은 상처 치료 효과가 뛰어난 상처 치료용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 피부 보습, 피부 미백, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 주름 개선 및 노화 방지 등의 효과가 우수한 피부 개선용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 발명자들은 hsa-miR-328-3p, hsa-miR-6514-5p, hsa-miR-503-3p, hsa-miR-4665-5p, hsa-miR-6820-3p, hsa-miR-4287, hsa-miR-6879-5p, hsa-miR-4484 및 hsa-miR-619-5p의 miRNA는 피부 투과도가 우수하고, 피부에 흡수되면 상처 치료, 피부 보습, 피부 미백, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 주름 개선 및 노화 방지 등의 효과가 우수한 것을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 서열번호 1 내지 9 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 종자 서열(seed sequence)을 포함하는 miRNA; 이를 포함하는 발현 벡터; 또는 상기 발현 벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 유효 성분으로 포함하는 상처의 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열(UGGCCCU)은, 서열번호 10의 염기서열(CUGGCCCUCUCUGCCCUUCCGU)로 표시되는 hsa-miR-328-3p miRNA의 종자 서열일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열(AUGGAGU)은, 서열번호 11의 염기서열(UAUGGAGUGGACUUUCAGCUGGC)로 표시되는 hsa-miR-6514-5p miRNA의 종자 서열일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 3으로 표시되는 염기서열(GGGUAUU)은, 서열번호 12의 염기서열(GGGGUAUUGUUUCCGCUGCCAGG)로 표시되는 hsa-miR-503-3p miRNA의 종자 서열일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 4로 표시되는 염기서열(UGGGGGA)은, 서열번호 13의 염기서열(CUGGGGGACGCGUGAGCGCGAGC)로 표시되는 hsa-miR-4665-5p miRNA의 종자 서열일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 5로 표시되는 염기서열(GUGACUU)은, 서열번호 14의 염기서열(UGUGACUUCUCCCCUGCCACAG)로 표시되는 hsa-miR-6820-3p miRNA의 종자 서열일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 6으로 표시되는 염기서열(CUCCCUU)은, 서열번호 15의 염기서열(UCUCCCUUGAGGGCACUUU)로 표시되는 hsa-miR-4287 miRNA의 종자 서열일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 7로 표시되는 염기서열(AGGGCAG)은, 서열번호 16의 염기서열(CAGGGCAGGGAAGGUGGGAGAG)로 표시되는 hsa-miR-6879-5p miRNA의 종자 서열일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 8로 표시되는 염기서열(AAAGGCG)은, 서열번호 17의 염기서열(AAAAGGCGGGAGAAGCCCCA)로 표시되는 hsa-miR-4484 miRNA의 종자 서열일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 9로 표시되는 염기서열(CUGGGAU)은, 서열번호 18의 염기서열(GCUGGGAUUACAGGCAUGAGCC)로 표시되는 hsa-miR-619-5p miRNA의 종자 서열일 수 있다.
본 발명에서 상기 "종자 서열(seed sequence)"이란 miRNA가 타겟을 인식할 때 완전한 상보성을 가지고 결합하는 miRNA 내 일부 영역의 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 이는 miRNA가 타겟에 결합하기 위해 필수적으로 요구되는 부분이자 실질적으로 유효한 기능을 하는 부위이다.
따라서, 본 발명에서 상기 miRNA로는 서열번호 1 내지 9 중 어느 하나로 표시되는 폴리뉴클레오타이드이거나, 혹은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 miRNA라면 제한없이 포함될 수 있다. 바람직하게는 상기 서열번호 1 내지 9 중 어느 하나로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 연속하여 상처 치료의 기능을 하는 핵산 분자가 존재하는 것으로, 총 핵산 분자가 19 내지 25nt, 더욱 바람직하게는 21, 22 또는 23nt 길이의 성숙 miRNA 형태일 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 상기 miRNA는 (ⅰ) hsa-miR-328-3p, hsa-miR-6514-5p, hsa-miR-503-3p, hsa-miR-4665-5p, hsa-miR-6820-3p, hsa-miR-4287, hsa-miR-6879-5p, hsa-miR-4484 및 hsa-miR-619-5p로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 miRNA; 및 (ⅱ) 상기 서열번호 1 내지 9 중 어느 하나로 표시되는 염기서열은 포함하되, 상기 (ⅰ)의 염기서열과 상동성이 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상인 염기서열로 이루어진 miRNA; 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 miRNA 들은 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, miRNA 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실, 치환 또는 삽입에 의해 변형되더라도 상기 miRNA 핵산 분자와 기능적으로 동등한 작용을 할 수 있는 변이체를 포함하는 개념이다. 예를 들어, 본 발명의 miRNA는 각 해당 서열번호의 염기서열과 80% 이상의 상동성을 나타낼 수 있으며, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내는 것을 포함할 수 있다. 이러한 상동성은 당 분야에 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 Align 또는 BLAST 알고리즘을 이용하여 뉴클레오티드의 서열을 표적 유전자의 상응하는 부분과 비교하여 용이하게 결정할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 miRNA는 상기한 바와 같이 성숙한 miRNA일 수 있으나, miRNA 전구체(miRNA precursor), 일차 miRNA (pri-miRNA) 또는 플라스미드 (plasmid) 형태의 miRNA 전구체일 수 있다. 다만, 본 발명에서 miRNA 전구체 또는 일차 miRNA를 구성하는 핵산 분자는 50 내지 100nt, 더욱 바람직하게는 65 내지 95nt 길이를 가질 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 miRNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 성숙 miRNA 분자는 주로 단일 가닥으로 존재하지만, 전구체 miRNA 분자는 이중 가닥을 형성할 수 있는 부분적인 자가-상보적인 구조(예를 들어 스템-루프 구조)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 miRNA를 구성하는 핵산 분자 중 적어도 하나는, 인산 뼈대 구조 (phosphate backbone structure)가 황 원소로 치환한 형태인 포스포로사이오에이트 (phosphorothiolate) 구조가 포함하는 형태; DNA, PNA(petide nucleic acids) 또는 LNA(locked nucleic acid) 분자로 치환된 형태; 또는 당의 2'수산화기가 메틸화, 메톡시화 또는 플르오르화 구조로 치환된 형태일 수 있다.
본 발명의 상기 miRNA는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서는, 상기한 바와 같이 상기 miRNA 핵산 분자를 발현 벡터에 포함된 형태로 제공할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는, 바람직하게는 발현 가능한 형태로 본 발명의 miRNA를 암호화한다. 본 발명에서 "발현 가능한 형태(in an expressible form)"는 숙주 세포에 도입할 경우, 그 벡터가 그 분자를 발현되는 것을 의미할 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 miRNA의 발현에 필요한 조절 요소를 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 본 발명의 miRNA의 생산에 사용되거나, 직접 상처 치료 또는 피부 개선을 위한 활성 성분으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는, 표적 세포의 게놈에 안정적으로 삽입시키기 위해서 이용될 수 있다(상동적 재조합 카세트 벡터의 설명에 관해서 Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987,51:503-12 참조). 예를 들면, Wolff et al., Science 1990,247:1465-8, 미국 특허 제5,580,859호; 제5,589,466호; 제5,804,566호; 제5,739,118호; 제5,736,524호; 제5,679,647호; 및 WO98/04720을 참조할 수 있다. DNA 베이스의 송달 기술의 예는, 「naked DNA」, 촉진성 [부피비카인(bupivicaine), 폴리머, 펩티드 매개(peptide-mediated)] 송달, 양이온의 지방질 복합체(cationic lipid complexes) 및 입자매개(particle-mediated) ["유전자총(gene gun)"] 또는 압력매개 전달(pressure-mediated delivery) (예를 들면, 미국 특허 제5,922,687호를 참조)을 포함한다.
본 발명에서 상기 발현 벡터는 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터인 것이 바람직하고, 비바이러스성 벡터로는 플라스미드 DNA인 것이 바람직하며, 바이러스성 벡터로는 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus) 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 발현 벡터는, 형질 전환된 세포의 선별을 용이하게 하기 위하여 선별 마커를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들, 예를 들어 녹색 형광 단백질, 퓨로마이신, 네오마이신, 하이그로마이신, 히스티디놀 디하이드로게나제(hisD) 및 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Gpt) 등을 예시할 수 있다.
본 발명에서는 상기 발현 벡터가 숙주 세포에 도입되어 형질 전환된 형질 전환체로 제공될 수 있다.
본 발명에서 숙주 세포는 인간을 포함한 포유류의 체세포인 것이 바람직하고, 인간의 치료를 목적하는 조직 부위의 세포로 예를 들면, 피부 세포인 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에서 상기 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하기 위한 방법으로는 G-fectin, Mirus TrasIT-TKO 지질친화성 시약, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴(cellfectin), 양이온성 인지질 나노입자, 양이온성 고분자, 양이온성 미셀, 양이온성 에멀젼 또는 리포좀을 포함하는 전달 시약과 함께 세포 내로 도입되거나, 폴리에틸렌글리콜과 같은 생체적합성 고분자를 접합하여 세포 내 흡수를 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 상기 miRNA를 포함하는 세포 배양물을 유효 성분으로 포함할 수 있고, 혹은 상기 세포 배양물에서 상기 miRNA를 분리하여 이를 유효 성분으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 세포는 줄기세포일 수 있다. 이때 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 가장 바람직하게는 인간 지방 유래 줄기세포일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 세포 배양에 이용되는 배지는, 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외(in vitro)에서 줄기세포 등의 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium) 및 KnockOut DMEM 등의 상업적으로 제조된 배지 또는 인위적으로 합성한 배지를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 세포 배양물에서 miRNA를 분리하는 방법은 특별히 제한하지 않으며 당해 기술분야에서 일반적으로 사용되는 방법에 의해 수행될 수 있으나, 예를 들면 페놀계 화합물을 이용하여 분리하는 방법 또는 컬럼(column)을 이용하여 분리하는 방법을 수행할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 miRNA를 포함하는 엑소좀(exosome)을 유효 성분으로 포함할 수 있고, 혹은 상기 엑소좀으로부터 상기 miRNA를 분리하여 이를 유효 성분으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "엑소좀(exosome)"이란 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미하며, 나노베지클(nanovesicle)로도 정의된다. 상기 엑소좀의 직경은 대략 30~1,000 nm이고, 바람직하게는 평균 직경이 100~300 nm이며, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다.
본 발명에서 상기 엑소좀은 줄기세포 배양물로부터 유래된 것일 수 있고, 이때 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 가장 바람직하게는 인간 지방 유래 줄기세포일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 세포 배양에 이용되는 배지는, 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외(in vitro)에서 줄기세포 등의 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium) 및 KnockOut DMEM 등의 상업적으로 제조된 배지 또는 인위적으로 합성한 배지를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 세포 배양물에서 엑소좀을 분리하는 방법은 특별히 제한하지 않으며 당해 기술분야에서 일반적으로 사용되는 방법에 의해 수행될 수 있으나, 예를 들면, 배양액에서, 원심분리, 초고속 원심분리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 모세관 전기영동, 폴리머를 이용한 분리 등의 방법 및 이들의 조합을 이용하여 분리할 수 있으며, 바람직하게는 원심분리/초원심분리일 수 있다. 이때, 원심분리/초원심분리는, 4℃, 3,000-100,000g에서 10분 내지 5시간 동안 행하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 상기 엑소좀으로부터 miRNA를 분리하는 방법은 특별히 제한하지 않으며 당해 기술분야에서 일반적으로 사용되는 방법에 의해 수행될 수 있으나, 예를 들면 용혈 시약을 이용하여 엑소좀을 용혈시킨 뒤 페놀계 화합물을 이용하여 분리하는 방법 또는 컬럼(column)을 이용하여 분리하는 방법을 수행할 수 있다.본 발명에서 제공하는 miRNA와, 발현 벡터 또는 형질 전환체는 피부 상처를 효과적으로 치료할 수 있도록 한다.
본 발명에서 상기 "유효 성분으로 포함하는"은 피부 상처 치료 효과를 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명에서 상기 miRNA는 상기 피부 상처 치료 활성으로 인해 약학적 조성물, 화장료 조성물, 피부 외용제, 식품 조성물 등 다양한 용도로 활용될 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 서열번호 1 내지 9 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 종자 서열(seed sequence)을 포함하는 miRNA; 이를 포함하는 발현 벡터; 또는 상기 발현 벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 유효 성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열(UGGCCCU)은, 서열번호 10의 염기서열(CUGGCCCUCUCUGCCCUUCCGU)로 표시되는 hsa-miR-328-3p miRNA의 종자 서열일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열(AUGGAGU)은, 서열번호 11의 염기서열(UAUGGAGUGGACUUUCAGCUGGC)로 표시되는 hsa-miR-6514-5p miRNA의 종자 서열일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 3으로 표시되는 염기서열(GGGUAUU)은, 서열번호 12의 염기서열(GGGGUAUUGUUUCCGCUGCCAGG)로 표시되는 hsa-miR-503-3p miRNA의 종자 서열일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 4로 표시되는 염기서열(UGGGGGA)은, 서열번호 13의 염기서열(CUGGGGGACGCGUGAGCGCGAGC)로 표시되는 hsa-miR-4665-5p miRNA의 종자 서열일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 5로 표시되는 염기서열(GUGACUU)은, 서열번호 14의 염기서열(UGUGACUUCUCCCCUGCCACAG)로 표시되는 hsa-miR-6820-3p miRNA의 종자 서열일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 6으로 표시되는 염기서열(CUCCCUU)은, 서열번호 15의 염기서열(UCUCCCUUGAGGGCACUUU)로 표시되는 hsa-miR-4287 miRNA의 종자 서열일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 7로 표시되는 염기서열(AGGGCAG)은, 서열번호 16의 염기서열(CAGGGCAGGGAAGGUGGGAGAG)로 표시되는 hsa-miR-6879-5p miRNA의 종자 서열일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 8로 표시되는 염기서열(AAAGGCG)은, 서열번호 17의 염기서열(AAAAGGCGGGAGAAGCCCCA)로 표시되는 hsa-miR-4484 miRNA의 종자 서열일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 9로 표시되는 염기서열(CUGGGAU)은, 서열번호 18의 염기서열(GCUGGGAUUACAGGCAUGAGCC)로 표시되는 hsa-miR-619-5p miRNA의 종자 서열일 수 있다.
본 발명에서 상기 "피부 개선"은 피부 보습, 피부 미백, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 주름 개선 또는 노화 방지 등의 피부 상태를 개선시키는 기능을 의미하는 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miRNA로는 서열번호 1 내지 9 중 어느 하나로 표시되는 폴리뉴클레오타이드이거나, 혹은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 miRNA라면 제한없이 포함될 수 있다. 바람직하게는 상기 서열번호 1 내지 9 중 어느 하나로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 연속하여 피부 보습, 피부 미백, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 주름 개선 또는 노화 방지 등의 피부 개선 기능을 하는 핵산 분자가 존재하는 것으로, 총 핵산 분자가 19 내지 25nt, 더욱 바람직하게는 21, 22 또는 23nt 길이의 성숙 miRNA 형태일 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 상기 miRNA는 (ⅰ) hsa-miR-328-3p, hsa-miR-6514-5p, hsa-miR-503-3p, hsa-miR-4665-5p, hsa-miR-6820-3p, hsa-miR-4287, hsa-miR-6879-5p, hsa-miR-4484 및 hsa-miR-619-5p로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 miRNA; 및 (ⅱ) 상기 서열번호 1 내지 9 중 어느 하나로 표시되는 염기서열은 포함하되, 상기 (ⅰ)의 염기서열과 상동성이 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상인 염기서열로 이루어진 miRNA; 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 miRNA 들은 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, miRNA 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실, 치환 또는 삽입에 의해 변형되더라도 상기 miRNA 핵산 분자와 기능적으로 동등한 작용을 할 수 있는 변이체를 포함하는 개념이다. 예를 들어, 본 발명의 miRNA는 각 해당 서열번호의 염기서열과 80% 이상의 상동성을 나타낼 수 있으며, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내는 것을 포함할 수 있다. 이러한 상동성은 당 분야에 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 Align 또는 BLAST 알고리즘을 이용하여 뉴클레오티드의 서열을 표적 유전자의 상응하는 부분과 비교하여 용이하게 결정할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 miRNA는 상기한 바와 같이 성숙한 miRNA일 수 있으나, miRNA 전구체(miRNA precursor), 일차 miRNA (pri-miRNA) 또는 플라스미드 (plasmid) 형태의 miRNA 전구체일 수 있다. 다만, 본 발명에서 miRNA 전구체 또는 일차 miRNA를 구성하는 핵산 분자는 50 내지 100nt, 더욱 바람직하게는 65 내지 95nt 길이를 가질 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 miRNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 성숙 miRNA 분자는 주로 단일 가닥으로 존재하지만, 전구체 miRNA 분자는 이중 가닥을 형성할 수 있는 부분적인 자가-상보적인 구조(예를 들어 스템-루프 구조)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 miRNA를 구성하는 핵산 분자 중 적어도 하나는, 인산 뼈대 구조 (phosphate backbone structure)가 황 원소로 치환한 형태인 포스포로사이오에이트 (phosphorothiolate) 구조가 포함하는 형태; DNA, PNA(petide nucleic acids) 또는 LNA(locked nucleic acid) 분자로 치환된 형태; 또는 당의 2'수산화기가 메틸화, 메톡시화 또는 플르오르화 구조로 치환된 형태일 수 있다.
본 발명의 상기 miRNA는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서는, 상기한 바와 같이 상기 miRNA 핵산 분자를 발현 벡터에 포함된 형태로 제공할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는, 바람직하게는 발현 가능한 형태로 본 발명의 miRNA를 암호화한다. 본 발명에서 "발현 가능한 형태(in an expressible form)"는 숙주 세포에 도입할 경우, 그 벡터가 그 분자를 발현되는 것을 의미할 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 miRNA의 발현에 필요한 조절 요소를 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 본 발명의 miRNA의 생산에 사용되거나, 직접 상처 치료 또는 피부 개선을 위한 활성 성분으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는, 표적세포의 게놈에 안정적으로 삽입시키기 위해서 이용될 수 있다(상동적 재조합 카세트 벡터의 설명에 관해서 Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987,51:503-12 참조). 예를 들면, Wolff et al., Science 1990,247:1465-8, 미국 특허 제5,580,859호; 제5,589,466호; 제5,804,566호; 제5,739,118호; 제5,736,524호; 제5,679,647호; 및 WO98/04720을 참조할 수 있다. DNA 베이스의 송달 기술의 예는, 「naked DNA」, 촉진성 [부피비카인(bupivicaine), 폴리머, 펩티드 매개(peptide-mediated)] 송달, 양이온의 지방질 복합체(cationic lipid complexes) 및 입자매개(particle-mediated) ["유전자총(gene gun)"] 또는 압력매개 전달(pressure-mediated delivery) (예를 들면, 미국 특허 제5,922,687호를 참조)을 포함한다.본 발명에서 상기 발현 벡터는 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터인 것이 바람직하고, 비바이러스성 벡터로는 플라스미드 DNA인 것이 바람직하며, 바이러스성 벡터로는 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus) 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 발현 벡터는, 형질 전환된 세포의 선별을 용이하게 하기 위하여 선별마커를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들, 예를 들어 녹색 형광 단백질, 퓨로마이신, 네오마이신, 하이그로마이신, 히스티디놀 디하이드로게나제(hisD) 및 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Gpt) 등을 예시할 수 있다.
본 발명에서는 상기 발현 벡터가 숙주 세포에 도입되어 형질 전환된 형질 전환체로 제공될 수 있다.
본 발명에서 숙주 세포는 인간을 포함한 포유류의 체세포인 것이 바람직하고, 인간의 치료를 목적하는 조직 부위의 세포로 예를 들면, 피부 세포인 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에서 상기 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하기 위한 방법으로는 G-fectin, Mirus TrasIT-TKO 지질친화성 시약, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴(cellfectin), 양이온성 인지질 나노입자, 양이온성 고분자, 양이온성 미셀, 양이온성 에멀젼 또는 리포좀을 포함하는 전달 시약과 함께 세포 내로 도입되거나, 폴리에틸렌글리콜과 같은 생체적합성 고분자를 접합하여 세포 내 흡수를 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 상기 miRNA를 포함하는 세포 배양물을 유효 성분으로 포함할 수 있고, 혹은 상기 세포 배양물에서 상기 miRNA를 분리하여 이를 유효 성분으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 세포는 줄기세포일 수 있다. 이때 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 가장 바람직하게는 인간 지방 유래 줄기세포일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 세포 배양에 이용되는 배지는, 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외(in vitro)에서 줄기세포 등의 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium) 및 KnockOut DMEM 등의 상업적으로 제조된 배지 또는 인위적으로 합성한 배지를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 세포 배양물에서 miRNA를 분리하는 방법은 특별히 제한하지 않으며 당해 기술분야에서 일반적으로 사용되는 방법에 의해 수행될 수 있으나, 예를 들면 페놀계 화합물을 이용하여 분리하는 방법 또는 컬럼(column)을 이용하여 분리하는 방법을 수행할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 miRNA를 포함하는 엑소좀(exosome)을 유효 성분으로 포함할 수 있고, 혹은 상기 엑소좀으로부터 상기 miRNA를 분리하여 이를 유효 성분으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 엑소좀의 직경은 대략 30~1,000 nm이고, 바람직하게는 평균 직경이 100~300 nm이며, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다
본 발명에서 상기 엑소좀은 줄기세포 배양물로부터 유래된 것일 수 있고, 이때 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 가장 바람직하게는 인간 지방 유래 줄기세포일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 세포 배양에 이용되는 배지는, 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외(in vitro)에서 줄기세포 등의 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium) 및 KnockOut DMEM 등의 상업적으로 제조된 배지 또는 인위적으로 합성한 배지를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 세포 배양물에서 엑소좀을 분리하는 방법은 특별히 제한하지 않으며 당해 기술분야에서 일반적으로 사용되는 방법에 의해 수행될 수 있으나, 예를 들면 배양액에서, 원심분리, 초고속 원심분리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 모세관 전기영동, 폴리머를 이용한 분리 등의 방법 및 이들의 조합을 이용하여 분리할 수 있으며, 바람직하게는 원심분리/초원심분리일 수 있다. 이때, 원심분리/초원심분리는, 4℃, 3,000-100,000g에서 10분 내지 5시간 동안 행하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서 상기 엑소좀으로부터 miRNA를 분리하는 방법은 특별히 제한하지 않으며 당해 기술분야에서 일반적으로 사용되는 방법에 의해 수행될 수 있으나, 예를 들면 용혈 시약을 이용하여 엑소좀을 용혈시킨 뒤 페놀계 화합물을 이용하여 분리하는 방법 또는 컬럼(column)을 이용하여 분리하는 방법을 수행할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 miRNA와, 발현 벡터 또는 형질 전환체는 피부 투과도가 우수하면서, 흡수 시 피부 개선 효과가 우수할 뿐만 아니라, 피부에 대한 자극이나 부작용이 없고 안전하다. 여기서, 상기 피부 개선 효과는 피부 보호, 피부 상태 개선, 피부 미백, 피부 탄력 개선, 피부 노화 및 주름의 예방 또는 개선, 피부의 염증 반응의 완화, 또는 피부 장벽 기능 개선, 피부 자극 완화, 피부 세포 증식 및 재생능, 항산화능, 콜라겐 합성 증진능 등 피부에 유익한 효과를 모두 포괄할 수 있다.
본 발명에서 상기 "유효 성분으로 포함하는"은 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는, 예컨대, 항염 활성, 주름 개선 효능과 관련된 콜라겐 합성, 탄력 개선 또는 항산화 활성 등을 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명에서 상기 miRNA는 상기 피부 상태 개선 활성으로 인해 약학적 조성물, 화장료 조성물, 피부 외용제, 식품 조성물 등 다양한 용도로 활용될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 miRNA는 상기 피부 상태 개선 활성으로 인해 미용 또는 치료적 목적의 필러용 조성물, 보다 상세하게는 필러 주사용 조성물로 매우 유용하게 사용될 수 있으며, 구체적인 예시로서 생물학적 조직의 필링(filling) 또는 대체를 위한 조성물, 주름의 필링(filling wrinkle), 안면의 리모델링(remodeling of the face) 또는 입술 용적(lip volume)의 증가를 위한 조성물, 메조테라피(mesotherapy)에 의한 피부의 재수화(rehydration) 치료에 사용하기 위한 조성물 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서, "치료" 및 "개선"은 본 발명의 조성물을 이용하여 상처 부위나 피부 상태가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 용도의 조성물에서 상기 miRNA의 처리 농도를 특별히 제한하지 않으나, 1 nM 내지 1 μM일 수 있고, 바람직하게는 1 nM 내지 100 nM, 보다 바람직하게는 1 nM 내지 10 nM일 수 있다.
본 발명의 miRNA를 포함하는 발현 벡터의 경우 구체적으로 0.01 내지 500 mg을 함유하고, 보다 구체적으로 0.1 내지 300 mg을 함유하며, 본 발명의 miRNA를 포함하는 재조합 바이러스의 경우, 구체적으로 103 내지 1012 IU(10 내지 1010 PFU)를 함유하고, 보다 구체적으로 105 내지 1010 IU를 함유하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 miRNA를 포함하는 형질 전환체의 경우, 구체적으로 103 내지 108 개를 함유하고, 보다 구체적으로 104 내지 107개를 함유하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 miRNA를 포함하는 발현 벡터 또는 형질 전환체를 유효성분으로 함유하는 조성물의 유효 용량은 체중 1 ㎏당 벡터의 경우에는 0.05 내지 12.5 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 107 내지 1011 바이러스 입자(105 내지 109 IU)/㎏, 세포의 경우에는 103 내지 106 세포/㎏이고, 구체적으로 벡터의 경우에는 0.1 내지 10 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 108 내지 1010 입자(106 내지 108 IU)/㎏, 세포의 경우에는 102 내지 105 세포/㎏이며, 하루 2 내지 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.
또한, 본 발명의 miRNA를 포함하는 엑소좀의 경우 단백질량 기준 0.001 내지 1000 ㎍/ml, 0.01 내지 100 ㎍/ml, 또는 0.1 내지 50 ㎍/ml의 양으로 포함될 수 있거나, 혹은 파티클 수 기준 1 X 108 개/ml 내지 1 X 1014 개/ml, 1 X 109 개/ml 내지 1 X 1013 개/ml, 1 X 1010 개/ml 내지 1 X 1012 개/ml의 양으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 miRNA를 포함하는 세포 배양물의 경우 단백질량 기준 0.001 내지 1000 ㎍/ml, 0.01 내지 100 ㎍/ml, 또는 0.1 내지 50 ㎍/ml의 양으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명에서 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용 목욕물 첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 크렌징밀크, 탈모제{화장용}, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누{비의료용}, 크림비누, 페이셜 워시, 전신 세정제, 두피 세정제, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 용매나, 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 용매의 종류는 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 물, 식염수, DMSO 또는 이들의 조합을 사용할 수 있고, 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다.
상기 오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다.
지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸 알콜, 옥틸 도데칸올, 올레일 알콜, 판텐올, 라놀린 알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면 활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다.
그 외에도 화장품 분야에서 널리 알려진 흡습제, 증점제, 항산화제 등을 포함할 수 있으며, 이들의 종류와 양은 당업계에 공지된 바에 따른다.
본 발명의 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 식물추출물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 miRNA, 발현 벡터 또는 형질전환체가 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 50%의 비율로 첨가할 수 있다.
여기서, 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다.
그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 목적하는 개체에 본 발명에서 제공하는 miRNA, 발현 벡터 또는 형질 전환체, 또는 본 발명에서 제공하는 상처 개선 또는 치료용 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상처의 개선 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "목적하는 개체"란, 피부에 상처가 발병하였거나, 발병 가능성이 높은 개체를 의미한다.
본 발명의 방법에서 상기 목적하는 개체에 상기 miRNA를 포함하는 세포 배양물을 투여할 수 있고, 혹은 상기 세포 배양물로부터 상기 miRNA를 분리하여 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에서 상기 목적하는 개체에 상기 miRNA를 포함하는 엑소좀을 투여할 수 있고, 혹은 상기 엑소좀으로부터 상기 miRNA를 분리하여 이를 투여할 수 있다.
본 발명에서 상기 miRNA, 발현 벡터, 형질 전환체, 세포 배양물, 엑소좀 및 상처 개선 또는 치료용 조성물은 상기 기재된 바와 중복되어 이하 자세한 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 목적하는 개체에 본 발명에서 제공하는 miRNA, 발현 벡터 또는 형질 전환체, 또는 본 발명에서 제공하는 피부 개선용 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 피부 개선 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "목적하는 개체"란, 피부 보습, 피부 미백, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 주름 개선 또는 노화 방지 등의 피부 상태의 개선이 필요한 개체를 의미한다.
본 발명의 방법에서 상기 목적하는 개체에 상기 miRNA를 포함하는 세포 배양물을 투여할 수 있고, 혹은 상기 세포 배양물로부터 상기 miRNA를 분리하여 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에서 상기 목적하는 개체에 상기 miRNA를 포함하는 엑소좀을 투여할 수 있고, 혹은 상기 엑소좀으로부터 상기 miRNA를 분리하여 이를 투여할 수 있다. 본 발명에서 상기 miRNA, 발현 벡터, 형질 전환체, 세포 배양물, 엑소좀 및 피부 개선용 조성물은 상기 기재된 바와 중복되어 이하 자세한 기재를 생략한다.
본 발명에서 제공하는 miRNA, 발현 벡터 또는 형질 전환체의 투여량, 스케줄 및 투여 경로는 개체의 크기 및 조건에 따라, 그리고 표준 약제학적 관행에 따라 결정될 수 있다. 예시적인 투여 경로는 정맥내, 동맥내, 복강내, 폐내, 혈관내, 근육내, 기관내, 피하, 안내, 척수강내 또는 경피를 포함한다.
본 발명의 방법에서 목적하는 개체에 투여되는 miRNA, 발현 벡터 또는 형질 전환체의 용량은, 예를 들어, 투여되는 miRNA, 발현 벡터 또는 형질 전환체의 특정 유형, 투여 경로 및 치료 또는 개선되는 상처 또는 피부의 특정 유형과 병기에 따라 달라질 수 있다. 상기 양은 심한 독성 또는 유해 사례없이, 상처에 대한 치료 반응 또는 피부 개선과 같은 원하는 반응을 가져오기 충분해야 한다. 정제된 효소를 사용한 시험관내 검정, 세포 기반 검정, 동물 모델 또는 인체 실험과 같은 표준 방법을 사용하여 효과의 규모를 측정할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 방법에서 상기 miRNA의 투여 농도를 특별히 제한하지 않으나, 1 nM 내지 1 μM일 수 있고, 바람직하게는 1 nM 내지 100 nM, 보다 바람직하게는 1 nM 내지 10 nM일 수 있다.
본 발명의 방법에서 상기 miRNA를 포함하는 발현 벡터의 경우 구체적으로 0.01 내지 500 mg의 양으로 투여될 수 있고, 보다 구체적으로 0.1 내지 300 mg의 양으로 투여될 수 있으며, 본 발명의 miRNA를 포함하는 재조합 바이러스의 경우, 구체적으로 103 내지 1012 IU(10 내지 1010 PFU)로 투여될 수 있고, 보다 구체적으로 105 내지 1010 IU의 양으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 miRNA를 포함하는 형질 전환체의 경우, 구체적으로 103 내지 108 개의 양으로 투여될 수 있고, 보다 구체적으로 104 내지 107개의 양으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 방법에서 miRNA를 포함하는 발현 벡터 또는 형질 전환체의 유효 투여 용량은 체중 1 ㎏당 벡터의 경우에는 0.05 내지 12.5 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 107 내지 1011 바이러스 입자(105 내지 109 IU)/㎏, 세포의 경우에는 103 내지 106 세포/㎏이고, 구체적으로 벡터의 경우에는 0.1 내지 10 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 108 내지 1010 입자(106 내지 108 IU)/㎏, 세포의 경우에는 102 내지 105 세포/㎏이며, 하루 2 내지 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.
또한, 본 발명의 miRNA를 포함하는 엑소좀의 경우 단백질량 기준 0.001 내지 1000 ㎍/ml, 0.01 내지 100 ㎍/ml, 또는 0.1 내지 50 ㎍/ml의 양으로 포함될 수 있거나, 혹은 파티클 수 기준 1 X 108 개/ml 내지 1 X 1014 개/ml, 1 X 109 개/ml 내지 1 X 1013 개/ml, 1 X 1010 개/ml 내지 1 X 1012 개/ml의 양으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 miRNA를 포함하는 세포 배양물의 경우 단백질량 기준 0.001 내지 1000 ㎍/ml, 0.01 내지 100 ㎍/ml, 또는 0.1 내지 50 ㎍/ml의 양으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 방법에서는 상기 miRNA, 발현 벡터 또는 형질 전환체를 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 투여할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 miRNA, 발현 벡터 또는 형질 전환체 외에 약제적으로 허용 가능한 담체를 함께 투여할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 분비 단백체를 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 miRNA, 발현 벡터 또는 형질 전환체는 상처 부위로 세포 이동을 촉진하여 우수한 상처 치료 또는 상처 치료 촉진 활성을 갖는다.
또한, 본 발명에서 제공하는 miRNA, 발현 벡터 또는 형질 전환체는 피부 투과도가 우수하면서, 흡수 시 피부 보습, 피부 미백, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 주름 개선 및 노화 방지 등의 피부 개선 효과가 우수할 뿐만 아니라, 피부에 대한 자극이나 부작용이 없고 안전하다.
도 1a는 실시예 1에서 인간 진피 유래 섬유아세포에 인간 지방 유래 줄기세포 유래 엑소좀을 농도를 달리하며 처리한 뒤 피부 재생 관련 유전자인 1형 콜라겐(Collagen type 1)의 mRNA 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 1b는 실시예 1에서 인간 진피 유래 섬유아세포에 인간 지방 유래 줄기세포 유래 엑소좀을 농도를 달리하며 처리한 뒤 피부 재생 관련 유전자인 엘라스틴(Elastin)의 mRNA 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 1c는 실시예 1에서 인간 진피 유래 섬유아세포에 인간 지방 유래 줄기세포 유래 엑소좀을 농도를 달리하며 처리한 뒤 피부 재생 관련 유전자인 케라티노사이트 성장 인자(keratinocyte growth factor; KGF)의 mRNA 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 1d는 실시예 1에서 인간 진피 유래 섬유아세포에 인간 지방 유래 줄기세포 유래 엑소좀을 농도를 달리하며 처리한 뒤 피부 재생 관련 유전자인 CD34의 mRNA 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 1e는 실시예 1에서 인간 진피 유래 섬유아세포에 인간 지방 유래 줄기세포 유래 엑소좀을 농도를 달리하며 처리한 뒤 피부 재생 관련 유전자인 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor; VEGF)의 mRNA 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1에서 인간 진피 유래 섬유아세포에 인간 지방 유래 줄기세포 유래 엑소좀을 농도를 달리하며 처리한 뒤 상기 인간 진피 유래 섬유아세포의 이동율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 1에서 인간 진피 유래 섬유아세포에 인간 지방 유래 줄기세포 유래 엑소좀을 농도를 달리하며 처리한 뒤 각 세포 주기에 속하는 세포의 비율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 2에서 마이크로어레이를 이용하여 인간 지방 유래 줄기세포와 그로부터 분비된 엑소좀에 있어서 miRNA의 발현 수준을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 2에서 인간 지방 유래 줄기세포로부터 분비된 엑소좀에서 발현 수준이 증가된 10개의 miRNA의 타겟 유전자를 분류한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 2에서 인간 지방 유래 줄기세포로부터 분비된 엑소좀에서 발현 수준이 증가된 hsa-miR-619-5p, hsa-miR-4484 및 hsa-miR-6879-5p와 이들과 관련된 유전자를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 3에서 피부섬유아세포(HDF)에 hsa-miR-328-3p(P1), hsa-miR-6514-5p(P2), hsa-miR-503-3p(P3), hsa-miR-4665-5p(P4), hsa-miR-6820-3p(P5), hsa-miR-4287(P6), hsa-miR-6879-5p(P7), hsa-miR-4484(P8) 및 hsa-miR-619-5p(P9)를 처리한 뒤 세포 생존율의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8a는 실시예 4에서 피부섬유아세포(HDF)에 hsa-miR-328-3p(P1), hsa-miR-4287(P6), hsa-miR-6879-5p(P7), hsa-miR-4484(P8) 및 hsa-miR-619-5p(P9)를 처리한 뒤 피부 재생 관련 유전자인 1형 콜라겐(Collagen I)의 mRNA 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8b는 실시예 4에서 피부섬유아세포(HDF)에 hsa-miR-328-3p(P1), hsa-miR-4287(P6), hsa-miR-6879-5p(P7), hsa-miR-4484(P8) 및 hsa-miR-619-5p(P9)를 처리한 뒤 피부 재생 관련 유전자인 피브로넥틴(Fibronectin)의 mRNA 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8c는 실시예 4에서 피부섬유아세포(HDF)에 hsa-miR-328-3p(P1), hsa-miR-4287(P6), hsa-miR-6879-5p(P7), hsa-miR-4484(P8) 및 hsa-miR-619-5p(P9)를 처리한 뒤 피부 재생 관련 유전자인 염기성 섬유모세포 생장인자(basic fibroblast growth factor; bFGF)의 mRNA 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8d는 실시예 4에서 피부섬유아세포(HDF)에 hsa-miR-328-3p(P1), hsa-miR-4287(P6), hsa-miR-6879-5p(P7), hsa-miR-4484(P8) 및 hsa-miR-619-5p(P9)를 처리한 뒤 피부 재생 관련 유전자인 기질 금속단백분해효소 1(matrix metalloproteinase-1; MMP1)의 mRNA 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 실시예 5에서 피부섬유아세포(HDF)에 hsa-miR-328-3p(P1), hsa-miR-4287(P6), hsa-miR-6879-5p(P7), hsa-miR-4484(P8) 및 hsa-miR-619-5p(P9)를 처리한 뒤 세포의 이동을 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 10은 실시예 5에서 피부섬유아세포(HDF)에 hsa-miR-328-3p(P1), hsa-miR-4287(P6), hsa-miR-6879-5p(P7), hsa-miR-4484(P8) 및 hsa-miR-619-5p(P9)를 처리한 뒤 이주한 세포의 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시형태들을 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
실시예
[실시예 1] 인간 지방 유래 줄기세포 엑소좀의 분리
인간 지방 유래 줄기세포 배양액을 원심분리하여 그 상층액만을 회수한 뒤 그로부터 엑소좀을 분리하였다. TEM(Transmission electron microscopy) 및 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석 결과 분리된 엑소좀은 직경이 70-150 nm에 속하는 전형적인 엑소좀 형상을 나타내었다. 이 후 웨스턴 블럿을 통해 상기 지방 유래 줄기세포 용해물(lysate)과는 달리 상기 엑소좀에서는 엑소좀 마커인 HSP70, CD63 및 CD9가 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 유세포 분석기를 통한 분석 결과, 상기 엑소좀은 CD9, CD63 및 CD81에 대하여 양성인 결과를 나타내었다.
다음으로, 상기 엑소좀의 성분들이 인간 진피 유래 섬유아세포(human dermal fibroblasts, HDFs)로 이동될 수 있는 지 확인하였다. 구체적으로, 인간 진피 유래 섬유아세포를 상기 얻어진 PKH26-표지된 엑소좀과 24시간 동안 공동 배양한 결과, PKH26의 붉은 형광이 인간 진피 유래 섬유아세포의 세포질 내에 존재하는 것을 확인할 수 있었고, 이를 통하여 상기 엑소좀이 인간 진피 유래 섬유아세포 내부로 이동하였음을 알 수 있었다.
또한, 인간 진피 유래 섬유아세포에 상기 얻어진 인간 지방 유래 줄기세포 유래 엑소좀을 양을 달리하며 처리한 뒤 정량적 실시간 PCR(quantitative real-time PCR)을 이용하여 피부 재생 관련 유전자인 제1형 콜라겐(Collagen type 1), 엘라스틴(Elastin), 케라티노사이트 성장 인자(keratinocyte growth factor; KGF), CD34 및 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor; VEGF)의 발현 수준을 확인한 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 엑소좀 첨가량에 비례하여 상기 유전자의 발현 수준이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 인간 진피 유래 섬유아세포에 상기 얻어진 인간 지방 유래 줄기세포 유래 엑소좀을 5 ㎍/mL 및 10 ㎍/mL의 양으로 처리한 결과, 도면에는 도시하지 않았지만 상기 엑소좀을 10 ㎍/mL의 양으로 처리하였을 때 인간 진피 유래 섬유아세포의 증식율이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 인간 진피 유래 섬유아세포에 상기 얻어진 인간 지방 유래 줄기세포 유래 엑소좀을 처리한 후 상기 인간 진피 유래 섬유아세포의 이동율을 확인한 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 엑소좀 첨가량에 비례하여 상기 인간 진피 유래 섬유아세포의 이동이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이와 유사하게, 인간 진피 유래 섬유아세포에 상기 얻어진 인간 지방 유래 줄기세포 유래 엑소좀을 처리한 후 FACS를 이용하여 세포 주기를 분석한 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 엑소좀 처리 시 S기에 속하는 세포의 비율이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 2] 인간 지방 유래 줄기세포와 그로부터 분비된 엑소좀에서의 miRNA 차이
마이크로어레이를 이용하여 상기 실시예 1에서 얻어진 인간 지방 유래 줄기세포와 그로부터 분비된 엑소좀에 있어서 microRNA의 발현 수준을 분석하였다. 도 4에서 보는 바와 같이, 상기 인간 지방 유래 줄기세포와 엑소좀에서 각기 다르게 발현하는 miRNA를 선별한 결과(>2-folds), 총 333개의 miRNA 중 292개의 miRNA의 발현 수준이 상이한 것을 확인할 수 있었다. 보다 구체적으로는 상기 인간 지방 유래 줄기세포와 달리, 엑소좀에서 199개의 miRNA 발현 수준이 증가하였고, 93개의 miRNA 발현 수준은 감소하였다.
이렇게 발현 수준이 달리 나타나는 miRNA를 miRTarBase(http://http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)를 참조하여 기능 별로 구분하였다. 대표적으로 발현 수준이 증가된 10개의 miRNA에 있어서 718개의 유효 유전자 타겟을 gene ontology (GOTERM_BP_FAT)과 enrichment EASE score < 0.05를 근거하여 분류하였다(도 5).
엑소좀에서 발현 수준이 대표적으로 증가된 miRNA로, hsa-miR-619-5p, hsa-miR-4484 및 hsa-miR-6879-5p의 miRNA와 관련된 유전자를 분석하여 그 모식도를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 보는 바와 같이 지방 유래 줄기세포로부터 분리된 엑소좀은 NPM1, PDCD4, CCL5 및 NUP62를 포함하는 유전자를 억제하고, 그에 따라 진피 섬유아세포의 증식을 촉진하여 피부 섬유아세포의 재생력을 높이는 것을 알 수 있었다.
즉, 상기한 실험 결과를 통하여 본 발명에 따른 hsa-miR-619-5p, hsa-miR-4484 및 hsa-miR-6879-5p의 miRNA는 상처 치료 및 피부 개선 효과가 뛰어남을 확인할 수 있었다.
[실시예 3] miRNA의 피부 개선 효과 확인(1)
하기 표 1에 나타낸 염기 서열로 표시되는 9종의 miRNA를 합성하였다. 피부섬유아세포(Human Dermal Fibroblast, HDF) 3,000개를 1% FBS를 포함하는 DMEM 배지에 접종한 뒤, 리포펙타민(lipofectamine)을 이용하여 상기 표 1에 나타낸 9종의 miRNA 각각을 2 nM의 농도로 세포 내에 도입한 뒤, 48시간 후 CCK 어쎄이를 이용하여 세포 생존율의 변화(miR-CT 대비 증식률)를 측정해 그 결과를 하기 표 2 및 도 7에 나타내었다.
구분 miRNA 종류 염기서열
P1 hsa-miR-328-3p 5'-CUGGCCCUCUCUGCCCUUCCGU-3'(서열번호 10)
P2 hsa-miR-6514-5p 5'-UAUGGAGUGGACUUUCAGCUGGC-3'(서열번호 11)
P3 hsa-miR-503-3p 5'-GGGGUAUUGUUUCCGCUGCCAGG-3'(서열번호 12)
P4 hsa-miR-4665-5p 5'-CUGGGGGACGCGUGAGCGCGAGC-3'(서열번호 13)
P5 hsa-miR-6820-3p 5'-UGUGACUUCUCCCCUGCCACAG-3'(서열번호 14)
P6 hsa-miR-4287 5'-UCUCCCUUGAGGGCACUUU-3'(서열번호 15)
P7 hsa-miR-6879-5p 5'-CAGGGCAGGGAAGGUGGGAGAG-3'(서열번호 16)
P8 hsa-miR-4484 5'-AAAAGGCGGGAGAAGCCCCA-3'(서열번호 17)
P9 hsa-miR-619-5p 5'-GCUGGGAUUACAGGCAUGAGCC-3'(서열번호 18)
구분 miRNA 종류 세포 증식률(%)
P1 hsa-miR-328-3p miRNA 40
P2 hsa-miR-6514-5p miRNA 26
P3 hsa-miR-503-3p miRNA 27
P4 hsa-miR-4665-5p 35
P5 hsa-miR-6820-3p 25
P6 hsa-miR-4287 49
P7 hsa-miR-6879-5p 31
P8 hsa-miR-4484 27
P9 hsa-miR-619-5p 29
상기 표 2 및 도 7에서 보는 바와 같이, 피부섬유아세포에 본 발명에 따른 miRNA를 처리한 경우 상기 피부섬유아세포의 증식률이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 4] miRNA의 피부 개선 효과 확인(2)
피부섬유아세포(Human Dermal Fibroblast, HDF) 100,000개를 DMEM 무혈청 배지에 접종한 뒤, 리포펙타민 2000(lipofectamine 2000)을 이용하여 상기 실시예 3에서 상기 표 1로 합성된 9종의 miRNA 각각을 2 nM의 농도로 세포 내에 도입하였다. 24시간 후 mRNA만을 추출 하고 cDNA를 합성하였다. 하기 표 3에 나타낸 피부 재생과 관련된 유전자인 제1형 콜라겐(Collagen I), 피브로넥틴(Fibronectin), 염기성 섬유모세포 생장인자(basic fibroblast growth factor; bFGF) 및 기질 금속단백분해효소 1(matrix metalloproteinase-1; MMP1)의 프라이머(primer)와 혼합한 후 Real-Time PCR 시스템을 이용하여 유전자를 증폭시켰다. 증폭된 유전자의 정량은 Delta-Delta-Ct (ddCt) 값으로 계산하였고 모든 시료는 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)인 GAPDH의 cDNA 증폭 결과로 평준화하여 발현 양을 분석하고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
프라이머 올리고 시퀀스
제1형 콜라겐 정방향 5'-GTGGCCATCCAGCTGACC-3'
역방향 5'-AGTGGTAGGTGATGTTCTGGGAG-3'
피브로넥틴 정방향 5'-GCCAGATGATGAGCTGCA C-3'
역방향 5'-GAGCAAATGGCACCGAGATA-3'
bFGF 정방향 5'-AGAGCGACCCTCACATCAAG-3'
역방향 5'-ACTGCCCAGTTCGTTTCAGT-3'
MMP1 정방향 5'-CCTAGTCTATTCATAGCTAATCAAGAGGATGT-3'
역방향 5'-AGTGGAGGAAAGCTGTGCATAC-3'
GAPDH 정방향 5'-TTAGGAAAGCCTGCCGGTGA-3'
역방향 5'-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCC-3'
도 8에서 보는 바와 같이, 피부섬유아세포에 본 발명에 따른 miRNA를 처리한 경우 피부 재생과 관련된 유전자인 제1형 콜라겐(Collagen I), 피브로넥틴(Fibronectin), bFGF 및 MMP1의 발현 수준이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 5] miRNA의 피부 개선 효과 확인(3)
Oris™ 세포 이주 어쎄이 플레이트(Cell Migration Assay plate)(96-well)에 피부섬유아세포(Human Dermal Fibroblast, HDF) 5,000개/웰을 1% FBS를 포함하는 DMEM 무혈청 배지에 접종한 뒤, 리포펙타민 2000(lipofectamine 2000)을 이용하여 상기 실시예 3에서 상기 표 1로 합성된 9종의 miRNA 각각을 2 nM의 농도로 세포 내에 도입하였다. 48 시간 후 IN Cell Developer (1.9.3)를 이용하여 이주한 세포의 사진을 촬영하여 그 결과를 도 9에 나타내었고, IN Cell 분석기 2000을 이용하여 이주한 세포 수를 측정하여 그 결과를 도 10에 나타내었으며, 세포 이주율을 계산하여 그 결과를 표 4에 나타내었다.
구분 miRNA 종류 이주율(%)
P1 hsa-miR-328-3p miRNA 39
P6 hsa-miR-4287 66
P7 hsa-miR-6879-5p 53
P8 hsa-miR-4484 23
P9 hsa-miR-619-5p 18
도 9 및 10과 상기 표 4에서 보는 바와 같이, 피부섬유아세포에 본 발명에 따른 miRNA를 처리한 경우 피부섬유아세포의 이주율이 현저히 향상되는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여 본 발명에 따른 9종의 miRNA로, hsa-miR-328-3p, hsa-miR-6514-5p, hsa-miR-503-3p, hsa-miR-4665-5p, hsa-miR-6820-3p, hsa-miR-4287, hsa-miR-6879-5p, hsa-miR-4484 및 hsa-miR-619-5p를 사용하는 경우 상처 치료 및 피부 개선(특히는 피부 재생)에 우수한 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.
<110> PROSTEMICS CO., LTD. <120> Composition for wound healing or improving skin comprising miRNA <130> DPB174161k01 <150> KR 10-2017-0159666 <151> 2017-11-27 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seed sequence of hsa-miR-328-3p miRNA <400> 1 uggcccu 7 <210> 2 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seed sequence of hsa-miR-6514-5p miRNA <400> 2 auggagu 7 <210> 3 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seed sequence of hsa-miR-503-3p miRNA <400> 3 ggguauu 7 <210> 4 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seed sequence of hsa-miR-4665-5p miRNA <400> 4 uggggga 7 <210> 5 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seed sequence of hsa-miR-6820-3p miRNA <400> 5 gugacuu 7 <210> 6 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seed sequence of hsa-miR-4287 miRNA <400> 6 cucccuu 7 <210> 7 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seed sequence of hsa-miR-6879-5p miRNA <400> 7 agggcag 7 <210> 8 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seed sequence of hsa-miR-4484 miRNA <400> 8 aaaggcg 7 <210> 9 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seed sequence of hsa-miR-619-5p miRNA <400> 9 cugggau 7 <210> 10 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-328-3p miRNA <400> 10 cuggcccucu cugcccuucc gu 22 <210> 11 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-6514-5p miRNA <400> 11 uauggagugg acuuucagcu ggc 23 <210> 12 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-503-3p miRNA <400> 12 gggguauugu uuccgcugcc agg 23 <210> 13 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-4665-5p miRNA <400> 13 cugggggacg cgugagcgcg agc 23 <210> 14 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-6820-3p miRNA <400> 14 ugugacuucu ccccugccac ag 22 <210> 15 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-4287 miRNA <400> 15 ucucccuuga gggcacuuu 19 <210> 16 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-6879-5p miRNA <400> 16 cagggcaggg aaggugggag ag 22 <210> 17 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-4484 miRNA <400> 17 aaaaggcggg agaagcccca 20 <210> 18 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-619-5p miRNA <400> 18 gcugggauua caggcaugag cc 22

Claims (27)

  1. 서열번호 4 또는 6의 염기서열로 표시되는 종자 서열(seed sequence)을 포함하는 miRNA; 이를 포함하는 발현 벡터; 또는 상기 발현 벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 유효 성분으로 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 miRNA는,
    hsa-miR-4665-5p 또는 hsa-miR-4287의 miRNA인, 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 hsa-miR-4665-5p miRNA는 서열번호 13의 염기서열로 구성되거나,
    상기 hsa-miR-4287 miRNA는 서열번호 15의 염기서열로 구성되는 것인, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 miRNA를 구성하는 핵산 분자 중 적어도 하나는,
    인산 뼈대 구조 (phosphate backbone structure)가 황 원소로 치환한 형태인 포스포로사이오에이트 (phosphorothiolate) 구조가 포함하는 형태;
    DNA, PNA(petide nucleic acids) 또는 LNA(locked nucleic acid) 분자로 치환된 형태; 또는
    당의 2'수산화기가 메틸화, 메톡시화 또는 플르오르화 구조로 치환된 형태인, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 miRNA는 miRNA 전구체(miRNA precursor), 일차 miRNA (pri-miRNA) 또는 플라스미드 (plasmid) 형태의 miRNA 전구체인, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 miRNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 형태인, 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 miRNA를 포함하는 엑소좀(exosome)을 유효 성분으로 포함하는, 약학적 조성물.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 발현 벡터는 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터인, 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 인간 진피 유래 섬유아세포(human dermal fibroblasts, HDFs)의 증식 또는 이동을 촉진하는, 약학적 조성물.
  11. 서열번호 4 또는 6의 염기서열로 표시되는 종자 서열(seed sequence)을 포함하는 miRNA; 이를 포함하는 발현 벡터; 또는 상기 발현 벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 유효 성분으로 포함하는 상처 개선용 화장료 조성물.
  12. 서열번호 4 또는 6의 염기서열로 표시되는 종자 서열(seed sequence)을 포함하는 miRNA; 이를 포함하는 발현 벡터; 또는 상기 발현 벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 유효 성분으로 포함하는 상처 개선용 식품 조성물.
  13. 서열번호 4 또는 6의 염기서열로 표시되는 종자 서열(seed sequence)을 포함하는 miRNA; 이를 포함하는 발현 벡터; 또는 상기 발현 벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 유효 성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물로서,
    상기 피부 개선은 피부 보습, 피부 미백, 피부 탄력 개선, 피부 재생 또는 주름 개선인, 화장료 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 miRNA는,
    hsa-miR-4665-5p 또는 hsa-miR-4287의 miRNA인, 화장료 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 hsa-miR-4665-5p miRNA는 서열번호 13의 염기서열로 구성되거나,
    상기 hsa-miR-4287 miRNA는 서열번호 15의 염기서열로 구성되는 것인, 화장료 조성물.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 miRNA를 구성하는 핵산 분자 중 적어도 하나는,
    인산 뼈대 구조 (phosphate backbone structure)가 황 원소로 치환한 형태인 포스포로사이오에이트 (phosphorothiolate) 구조가 포함하는 형태;
    DNA, PNA(petide nucleic acids) 또는 LNA(locked nucleic acid) 분자로 치환된 형태; 또는
    당의 2'수산화기가 메틸화, 메톡시화 또는 플르오르화 구조로 치환된 형태인, 화장료 조성물.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 miRNA는 miRNA 전구체(miRNA precursor), 일차 miRNA (pri-miRNA) 또는 플라스미드 (plasmid) 형태의 miRNA 전구체인, 화장료 조성물.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 miRNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 형태인, 화장료 조성물.
  19. 제13항에 있어서,
    상기 발현 벡터는 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터인, 화장료 조성물.
  20. 제13항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 miRNA를 포함하는 엑소좀(exosome)을 유효 성분으로 포함하는, 화장료 조성물.
  21. 삭제
  22. 제13항에 있어서,
    상기 조성물은 NPM1, PDCD4, CCL5 또는 NUP62를 암호화하는 유전자의 발현을 억제하는, 화장료 조성물.
  23. 제13항에 있어서,
    상기 조성물은 인간 진피 유래 섬유아세포의 증식 또는 이주를 촉진하여 피부 섬유아세포의 재생력을 높이는 것인, 화장료 조성물.
  24. 삭제
  25. 서열번호 4 또는 6의 염기서열로 표시되는 종자 서열(seed sequence)을 포함하는 miRNA; 이를 포함하는 발현 벡터; 또는 상기 발현 벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 유효 성분으로 포함하는 피부 개선용 약학적 조성물로서,
    상기 피부 개선은 피부 보습, 피부 미백, 피부 탄력 개선, 피부 재생 또는 주름 개선인, 약학적 조성물.
  26. 서열번호 4 또는 6의 염기서열로 표시되는 종자 서열(seed sequence)을 포함하는 miRNA; 이를 포함하는 발현 벡터; 또는 상기 발현 벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 유효 성분으로 포함하는 피부 개선용 식품 조성물로서,
    상기 피부 개선은 피부 보습, 피부 미백, 피부 탄력 개선, 피부 재생 또는 주름 개선인, 식품 조성물.
  27. 서열번호 4 또는 6의 염기서열로 표시되는 종자 서열(seed sequence)을 포함하는 miRNA; 이를 포함하는 발현 벡터; 또는 상기 발현 벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 유효 성분으로 포함하는 피부 필러용 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021207126A1 (en) * 2020-04-06 2021-10-14 The Trustees Of Dartmouth College Compositions and methods for treating bacterial infections
WO2021251526A1 (ko) * 2020-06-11 2021-12-16 주식회사 프로스테믹스 신규한 mirna 유사체 및 이의 용도
CN116421629A (zh) * 2023-05-23 2023-07-14 源生生物科技(青岛)有限责任公司 干细胞外泌体在预防或治疗衰老的药物中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015052527A1 (en) * 2013-10-09 2015-04-16 Reneuron Limited Microparticles, mirna and wound therapy

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011029903A1 (en) * 2009-09-10 2011-03-17 Flemming Velin Method for the preparation of micro-rna and its therapeutic application
WO2014036429A1 (en) * 2012-08-31 2014-03-06 Aptamir Therapeutics, Inc. Mirna modulators of chronic visceral inflammation
RU2686313C2 (ru) * 2015-02-25 2019-04-25 Байонир Корпорейшн Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая микроРНК в качестве активного ингредиента

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015052527A1 (en) * 2013-10-09 2015-04-16 Reneuron Limited Microparticles, mirna and wound therapy

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