CN116425899A - 一种普洱茶多糖及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种普洱茶多糖及其制备方法和应用。制备方法依次包括普洱茶预处理、蒸汽爆破处理、去除脂溶性化合物、加热回流提取普洱茶多糖、乙醇沉淀获得普洱茶粗多糖、除蛋白、冷冻干燥，得到普洱茶多糖粉末。本发明方法经响应面法优化参数，实现了高效提取，利用本发明制备得到的普洱茶多糖能够很好地保留加工特性及功效，能够用于制备具有降脂减肥作用的药物或保健食品。
Description
技术领域
本发明属于茶多糖技术领域，具体涉及一种普洱茶多糖及其制备方法和应用。
背景技术
普洱茶是云南的地理标志产品，是由云南特有的大叶种茶经特殊的渥堆发酵工艺发酵而得的一种黑茶，茶叶资源丰富。在普洱茶的生产过程中，会产生大量的低档茶、粗茶、茶末等低值副产物，提高这些副产物的利用价值，将具有显著的经济和社会价值。普洱茶中含有多种化学成分，包括茶多糖、茶多酚、茶色素等多种生物活性物质。其中，普洱茶多糖作为一种天然活性物质，其营养丰富，应用价值广泛。研究发现，普洱茶多糖具有调节免疫力、抗血栓、降血糖、抗氧化、抗癌等多种功效，而且几无毒副作用，显示出巨大的开发前景。
通常情况下，人们只能依靠饮茶来摄入茶多糖，这不仅存在摄入的茶多糖量小、难以达到药理效果，还因茶叶特殊的提神作用而不能被一些人接受。传统制备工艺是通过将茶叶粉碎，在一定的温度下，先用酸性、中性或者弱碱性水浸提，再通过沉淀分离或柱层析分离，制备出粗品。传统提取工艺流程多，难度大，花费成本比较高，提取的茶多糖抗氧化性差，方法重现性不好且产率极低。此外，不同的茶由于品类、发酵工艺等关系，其化学成分的含量有很大差异，也正是由于现有的从茶叶中提取多糖的方法存在结构被破坏、产率低等不足，因此，开发一种高效的普洱茶多糖制备方法并开辟其应用途径可为普洱茶副产物高值化利用提供重要依据。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种普洱茶多糖及其制备方法和应用，解决了上述背景技术中的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：提供了一种普洱茶多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)普洱茶预处理：将普洱茶复水处理；
(2)蒸汽爆破处理：将普洱茶进行蒸汽爆破处理，压力为0.3-1.8Mpa，保压时间为30-180s，得到普洱茶粉；
(3)去除脂溶性化合物：将步骤(2)处理后的普洱茶粉经烘干、粉碎、过筛后，加入乙醇，90℃回流提取1-2次，每次1-3h，离心后收集沉淀，置于真空干燥箱中干燥；
(4)加热回流：将步骤(3)干燥后的普洱茶粉进行加热回流提取，按照固液比1:10～1:30加入蒸馏水，采用75-100℃的热水浸提，反复浸提1～3次，每次1-3h，合并提取液，过滤，收集滤液；
(5)乙醇沉淀：将步骤(4)收集到的滤液减压浓缩至原体积的10-20％，加入3-5倍体积的乙醇，沉淀过夜，离心，收集沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀2-3次，得普洱茶粗多糖；
(6)除蛋白：将所述普洱茶粗多糖复溶于水中，将此水溶液与Sevage溶剂按体积比为3:1混合，收集上清液，重复处理2-5次；
(7)冷冻干燥：合并步骤(6)的上清液，冷冻干燥，得到普洱茶多糖粉末。
作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤(1)中，采用普洱熟茶的粗茶、老茶或茶末，预处理为将普洱茶隔夜复水处理，调整含水率至20-40％。
作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤(2)中，所述的蒸汽爆破压强为1.2MPa，保压时间为120s。
作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤(3)中，普洱茶粉的烘干采用鼓风干燥，烘干温度为50-70℃，所述普洱茶粉碎后过60目筛；所述乙醇的质量浓度为70-100％，按照g:mL计，普洱茶细粉与70-100％乙醇的用量比为1:5-10。
作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤(4)中，提取温度为100℃，提取时间1.5h，固液比为1：20。
作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤(6)中，Sevage溶剂为氯仿-正丁醇(4:1，v/v)的混合溶液。
作为本发明一种优选的具体实施方式，制备方法经过响应面优化方法，优化参数包括提取时间、提取温度、固液比。普洱茶多糖的提取率Y对提取温度A、提取时间B、固液比C三个因素的回归方程为：
Y＝13.53+1.28*A+0.2*B+0.053*C-0.28*A*B-8.750E-003*A*C+0.39*B*C+0.098*A2-1.04*B2-
0.37*C2。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：提供了一种普洱茶多糖，采用如权利要求1-6任一项方法制备而成。本方法制备而成的普洱茶多糖具有显著的减脂减肥功能，可明显降低饮食诱导的肥胖小鼠模型的体重增长率，减缓体重增长，降低脏器指数，降低脂肪质量和脂肪细胞数量，减少体内脂肪堆积；降低空腹血糖和胰岛素，改善胰岛素抵抗；降低甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白水平，升高高密度脂蛋白水平，改善高血脂症状；降低体内炎症细胞因子的水平，改善体内炎症状态。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：提供了一种普洱茶多糖的应用，用于具有降脂减肥功能的药品或保健食品，包括胶囊剂、片剂、口服液、压片糖果或冲泡粉剂型。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
(1)本发明采用蒸汽爆破后的普洱茶，去除脂溶性化合物、加热回流提取普洱茶多糖、乙醇沉淀获得普洱茶粗多糖、除蛋白、冷冻干燥，得到普洱茶多糖，该方法能够有效提高普洱茶多糖的产率，实现高效提取多糖的目的，同时，制备的普洱茶多糖较未经蒸汽爆破处理的普洱茶多糖具有更好的降脂减肥活性。
(2)本发明所提供的普洱茶蒸汽爆破工艺以及普洱茶多糖提取工艺条件的响应面优化方法将作为蒸汽爆破普洱茶多糖提取实际生产中的应用提供可靠的参考，为普洱茶多糖降脂减肥药物或功能食品的研发提供技术支撑，为普洱茶副产物高值化利用提供有效途径，具备良好的工业实用性。
附图说明
图1为提取温度对普洱茶多糖提取率的影响；
图2为提取时间对普洱茶多糖提取率的影响；
图3为固液比对普洱茶多糖提取率的影响；
图4为提取时间和提取温度对普洱茶多糖提取率的响应面三维图(a)和等高线图(b)；
图5为固液比和提取温度对普洱茶多糖提取率的响应面三维图(a)和等高线图(b)；
图6为提取时间和固液比对普洱茶多糖提取率的响应面三维图(a)和等高线图(b)；
图7为普洱茶多糖的红外光谱图；
图8为普洱茶多糖对小鼠体重和进食的影响；
图9为普洱茶多糖对小鼠体重增加量的影响；
图10为普洱茶多糖对小鼠进食量的影响；
图11的(a)、(b)为葡萄糖耐量测定的结果；
图12的(a)、(b)为胰岛素耐量测定的结果
图13为普洱茶多糖对肥胖小鼠血脂水平的影响，其中TC含量(a)，TG含量(b)，LDL含量(c)，HDL含量(d)；
图14为普洱茶多糖对肥胖小鼠血清中炎症因子的影响，其中TNF-α含量(a)，IL-6含量(b)，IL＝1β含量(c)。
具体实施方式
实施例1
本实施例一种普洱茶多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)普洱茶预处理：取普洱茶老茶或粗茶喷洒蒸馏水进行复水处理，放置过夜，让普洱茶充分吸收水分至含水率为30％。
(2)蒸汽爆破处理：取复水后的普洱茶放入蒸汽爆破机物料仓(约100g)中，通入饱和蒸汽，设置蒸汽爆破压力为1.2MPa，保压时间为120s，在0.0875s完成释压，实现蒸汽爆破处理，处理后的普洱茶样品置于50℃恒温热风烘箱中干燥至水分含量在10％以内，粉碎，过60目筛。
(3)去除脂溶性化合物：取蒸汽爆破后干燥、粉碎、过60目筛的普洱茶粉50g，置于1000mL圆底烧瓶中，加入95％乙醇250mL，于90℃下回流提取2次，每次2h，去除脂溶性化合物，回流结束后8000r/min离心10min后，弃去上清，收集沉淀，置于真空干燥箱中50℃干燥。
(4)加热回流提取普洱茶多糖：取干燥的脱脂普洱茶粉50g，置于圆底烧瓶中，加入1000mL蒸馏水，加热至100℃进行回流提取，一共提取3次，每次1.5h，合并提取液，过滤，收集滤液。
(5)乙醇沉淀获得普洱茶粗多糖：将普洱茶多糖提取液减压浓缩至原体积的10-20％，加入3倍体积的95％乙醇，充分搅拌放置过夜进行沉淀，收集沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀3次，得普洱茶粗多糖。
(6)除蛋白：将普洱茶粗多糖复溶于水中，将此多糖水溶液置于分液漏斗中，加入多糖水溶液3倍体积的Sevage溶剂，混合均匀，静置分层，下层乳白色的溶液层即被除去的蛋白质，收集上清液，再次加入3倍体积的Sevage溶剂进行混合，按照此方法处理3次，合并除去除蛋白的上清液，旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥，即得到普洱茶多糖粉末，称重，计算提取率。提取率计算公式如下：
提取率＝A/B*100％
其中，A为普洱茶多糖质量(g)，B为普洱茶粉质量(g)。
经计算，本实施例的普洱茶多糖提取率为16.73％，多糖产量为8.36g。
实施例2
与实施例1的区别在于：步骤(2)中蒸汽爆破压力为0.9MPa，保压时间为150s，步骤(4)中提取温度为80℃，提取次数为3次，每次2.0h，其余均与实施例1相同。
经计算，本实施例的普洱茶多糖提取率为13.46％，多糖产量为6.73g。
实施例3
与实施例1的区别在于：步骤(2)中蒸汽爆破压力为1.5MPa，保压时间为60s，步骤(4)中提取温度为90℃，提取次数为3次，每次1.5h，其余均与实施例1相同。
经计算，本实施例的普洱茶多糖提取率为13.81％，多糖产量为6.91g。
实施例4
与实施例1的区别在于：步骤(2)中蒸汽爆破压力为1.8MPa，保压时间为30s，步骤(4)中提取温度为100℃，提取次数为3次，每次1.0h，其余均与实施例1相同。
经计算，本实施例的普洱茶多糖提取率为14.67％，多糖产量为7.33g。
实施例5
与实施例1的区别在于：步骤(2)中蒸汽爆破压力为0.3MPa，保压时间为210s，步骤(4)中提取温度为100℃，提取次数为3次，每次1.5h，其余均与实施例1相同。
经计算，本实施例的普洱茶多糖提取率为15.14％，多糖产量为7.57g。
对比例1
与实施例1的区别在于：普洱茶老茶或粗茶不经复水、蒸汽爆破处理，直接干燥、粉碎、过60目筛后按照步骤(3)、(4)、(5)、(6)依次处理。
经过计算，本对比实施例的普洱茶多糖提取率为12.32％，多糖的产量为6.16g。。
一、以下为实施例1制备方法的优化实验：
1、单因素实验
选取5个水平进行提取温度的单因素实验：固定提取时间为2h，固液比为1：20，分别设置提取温度为60、70、80、90、100℃，计算在不同提取温度下普洱茶多糖的提取率。
提取温度对普洱茶多糖提取率的影响如图1所示，从实验结果可以看出，随着提取温度的升高，普洱茶多糖的提取率也在逐渐升高，在100℃的时候，普洱茶多糖的提取率最高，故最佳提取温度为100℃。
1.2提取时间的单因素实验
选取5个水平进行提取时间的单因素实验：固定提取温度为100℃，固液比为1：20，分别设置提取时间1h、1.5h、2h、2.5h、3.0h，计算在不同提取时间下普洱茶多糖的提取率。
提取温度对普洱茶多糖提取率的影响如图2所示，从实验结果中可以看出，提取时间在1.5h之前随着提取温度的升高，普洱茶多糖提取率呈线性增长，在1.5h之后，普洱茶多糖的提取率又呈逐渐下降趋势，故最佳提取时间为1.5h。
1.3固液比的单因素实验
选取5个水平进行固液比的单因素实验：固定提取温度为100℃，提取时间为1.5h，分别设置固液比为1:10，1:15，1:20，1:25，1:30，计算在不同固液比条件下普洱茶多糖的提取率。
固液比对普洱茶多糖提取率的影响如图3所示，从实验结果中可以看出，在固液比小于1:20时，随着固液比的增加，茶多糖的提取率呈上升的趋势，在固液比大于1:20时，茶多糖的提取率随着固液比的增加而减小，故最佳的固液比为1:20。
2.响应面分析试验
根据上述单因素试验结果，选择提取温度、提取时间、固液比为自变量，以普洱茶多糖提取率为响应值，采用Box-Behnken中心组合设计法设计三因素三水平的响应面分析试验，试验设计因素与水平如表1所示。
表1响应面试验设计因素与水平
根据Box-Behnken中心组合设计法设计三因素三水平的响应面分析试验，共计17组试验，根据试验结果进行方差分析，表2列出响应面实验矩阵和实验数据。
表2响应面实验设计与结果
采用Design Expert 8.0.6软件对表格中的数据进行拟合，得出普洱茶多糖的提取率对三个因素的回归方程为：
Y＝13.53+1.28*A+0.2*B+0.053*C-0.28*A*B-8.750E-003*A*C+0.39*B*C+0.098*A2-1.04*
B2-0.37*C2
其中，Y是普洱茶多糖的提取率，A，B，C分别是提取温度(℃)、提取时间(h)和固液比(g/mL)。
表3回归方程方差分析
注：R2＝0.9961，Radj 2＝0.8196，C.V.＝3.53％
A，提取温度(℃)；B，提取时间(h)；C，固液比(g/mL)
**代表P＜0.01；***代表P＜0.001。
表3为回归模型的方差分析表，二次回归模型具有较高的F值(200.35)和较低的P值(p<0.0001)，表明该模型的适用性非常显著。模型的决定系数R2＝0.9961，校正决定系数Radj 2＝0.8196，证明该模型与实际实验过程具有较高的拟合度。因此，该回归模型具有可行性，可以利用该模型对普洱茶多糖提取率与单因素水平变化的关系以及用于对茶多糖提取条件的优化。
从方差分析表中可以看出，失拟项P值为0.2884，P>0.05，F值为1.79，表明残差主要有随机误差组成，对优化结果的影响可以忽略不计。此外，方程中Y的变异系数C.V.值代表实验的置信度，本实验中C.V.为3.53％，表明实验操作科学，具有足够的准确性和普遍适用性。此外，参数优化系数表明单因素A和B对茶多糖的提取率的影响显著，因素C对实验结果不显著，而且三个因素对茶多糖提取率的影响顺序为A＞B＞C，温度对提取率的影响最大，其次是提取时间，固液比对提取率的影响最小。二次模型中AB、AC、B2、C2对茶多糖提取率的影响显著，AC和A2对茶多糖提取率的影响不显著。
图4、5、6显示了响应面预测结果的三维响应面图和等高线图。通常，响应面图中曲线越弯曲说明研究因素对结果影响越大，等高线呈椭圆形说明研究因素之间的交互作用显著，呈圆形则说明交互作用不显著。由图4、5、6可知，提取温度和提取时间、提取温度和固液比之间的相互作用是显著的。
通过响应面试验软件计算普洱茶多糖提取率得到的最佳提取工艺条件为：提取温度100℃，提取时间1.49h，固液比为1：20.22。普洱茶多糖提取率预测值为16.43％。为了实际操作方便，将上述条件调整为提取温度100℃，提取时间1.5h，固液比为1：20进行验证实验。采用以上条件，进行三次平行验证实验，分别得到普洱茶多糖的提取率为16.51％，16.83％，16.66％，得均值为16.67％，与理论值相差1.44％，说明响应面得到的工艺条件可靠，可用于普洱茶多糖提取工艺的优化，优化的提取工艺条件可推广至产业化应用。
二、普洱茶多糖理化性质测定
3.1普洱茶多糖总糖含量的测定
本发明中，普洱茶多糖总糖含量的测定如下:
(1)0.2mg/mL葡萄糖标准液：电子天平称取葡萄糖10mg，蒸馏水溶解，转移至50mL容量瓶，冷藏保存。
(2)5％苯酚溶液：精确称取2.5g的苯酚，蒸馏水溶解，定容至50mL，避光冷藏备用。
(3)总糖标准曲线的配制：按照表4配制溶液，静置20min，自然冷却至室温，摇匀，490nm处测定吸光度。
表4糖标准曲线的配制
(4)样品总糖含量的测定：分别配制0.05mg/mL的普洱茶多糖溶液，取样品溶液1mL，按照标准曲线测定方法，测样品的吸光度。
注：样品总糖含量的计算公式如下：
样品总糖浓度(mg/mL)＝(样品吸光度值-0.0103)/11.002；
样品总糖含量(％)＝(样品总糖浓度/样品溶液浓度)*100％
根据换算公式得普洱茶多糖样品总糖含量如表5所示。
表5普洱茶多糖总糖含量
3.2普洱茶多糖的糖醛酸含量测定
本发明中，普洱茶多糖的糖醛酸含量测定如下:
(1)0.5mg/mL葡萄糖醛酸标准液：精确称取25mg葡萄糖醛酸，蒸馏水溶解，转移至50mL容量瓶，冷藏保存。
(2)0.1％咔唑溶液：电子天平称取50mg咔唑，95％乙醇溶解，定容至50mL，冷藏备用。
(3)糖醛酸标准曲线：按照表6配制溶液，水浴中加入浓硫酸，摇匀，85℃水浴加热20min，静置冷却至室温，加入0.1％咔唑溶液，室温放置2h，530nm处测定吸光度值。
表6糖醛酸标准曲线的配置
样品糖醛酸含量的测定：配制0.25mg/mL普洱茶多糖样品溶液，取样品溶液1mL，按照标准曲线测定方法，测样品的吸光度。
注：样品糖醛酸含量的计算公式如下：
样品糖醛酸浓度(mg/mL)＝(样品吸光度值-0.0622)/3.3024；
样品糖醛酸含量(％)＝(样品糖醛酸浓度/样品溶液浓度)*100％
根据标准曲线计算得普洱茶多糖样品糖醛酸含量如表7所示。
表7普洱茶多糖糖醛酸含量
3.3普洱茶多糖的中性糖含量测定
本发明中，普洱茶多糖的中性糖含量测定如下:
依据总糖含量减去糖醛酸含量等于中性糖含量来换算普洱茶多糖的中性糖含量。
注：样品中性糖含量的计算公式如下：M中性糖＝M总糖-M糖醛酸；
式中，M中性糖，M总糖和M糖醛酸分别为普洱茶多糖中的中性糖含量、总糖含量和糖醛酸含量。
根据总糖含量减去酸性糖含量可获得中性糖含量如表8所示。
表8普洱茶多糖中性糖含量
3.4普洱茶多糖中的蛋白含量测定
本发明中，普洱茶多糖的蛋白质含量测定如下:
(1)100μg/mL牛血清白蛋白溶液的配制：取牛血清白蛋白10mg，用少量蒸馏水溶解，定容到100mL。4℃冰箱保存。
(2)考马斯亮蓝G-250的配制：精密称取50mg考马斯亮蓝G-250溶于25mL的95％乙醇中，加入85％(W/V)磷酸50mL，用蒸馏水定容到500mL，配好后用滤纸过滤。
(3)蛋白质标准曲线的配制：按照表9配制溶液，静置5min，自然冷却至室温，摇匀，595nm处测定吸光度。
表9蛋白质含量测定标准曲线
(4)样品蛋白质含量的测定：分别配制0.05mg/mL的普洱茶多糖溶液，取样品溶液1mL，按照标准曲线测定方法，测样品的吸光度。
注：样品蛋白质含量的计算公式如下：
样品蛋白质浓度(mg/mL)＝(样品吸光度值-0.0194)/0.0065；
样品蛋白质含量(％)＝(样品蛋白质浓度/样品溶液浓度)*100％
根据换算公式得普洱茶多糖样品蛋白质含量如表10所示。
表10普洱茶多糖中的蛋白质含量
3.5普洱茶多糖中的水分和灰分含量测定
本发明中，普洱茶多糖的水分和灰分含量测定如下:
取称量瓶置于烘箱内，105℃干燥至恒重，称重，称取普洱茶多糖样品适量，称重后放入此称量瓶中，105℃干燥至恒重，称重，计算普洱茶多糖的水分含量。
参照国标GB 5009.4-2016《食品中灰分的测定》测定灰分含量。
普洱茶多糖中的水分和灰分含量结果如表11所示。
表11普洱茶多糖的水分与灰分含量
4.普洱茶多糖的红外光谱分析
精密称取普洱茶多糖样品2mg和溴化钾200mg，压制成片，空白对照采用溴化钾粉末压片而成。分别置于傅里叶变换红外光谱仪FT IR650进行扫描记录。扫描波数范围500～4000cm-1，分辨率8cm-1，扫描次数16。
如图7所示，波数为3600～3200cm-1的吸收峰是-OH的伸缩振动吸收峰，这个区域的吸收峰是糖类的特征峰。3430cm-1是O-H的伸缩振动吸收峰，其宽峰形状为典型的-COOH峰。在2927cm-1有吸收峰，属于糖类不对称C-H伸缩振动。在1620cm-1有一个吸收峰，属于C＝O非对称伸缩振动。在1430cm-1有吸收峰，属于C-O伸缩振动。在1430cm-1～1030cm-1之间峰谱表现出不同的变化，主要是由于多糖的不同单糖组成及含量所导致。在1100cm-1～1030cm-1周围的强吸收峰吡喃环的醚键(C-O-C)和羟基的吸收峰。
5.普洱茶多糖的降脂减肥活性试验
采用经蒸汽爆破处理的普洱茶提取的普洱茶多糖进行降脂减肥活性试验。
图8显示了普洱茶多糖对小鼠体重的抑制作用以及对小鼠进食的影响。如图8所示，在试验期间，模型组小鼠体重一直处于快速增长的趋势，通过17周的喂养，模型组小鼠体重已经远远高于其他小组，其平均体重已经高达43.68±2.04g。空白组、经蒸汽爆破处理普洱茶提取的普洱茶多糖组和未经蒸汽爆破处理普洱茶提取的普洱茶多糖组则体重增长缓慢，在17周时，空白组小鼠的平均体重为28.40±2.06g，经蒸汽爆破处理普洱茶提取的普洱茶多糖组小鼠体重为31.39±1.78g，未经蒸汽爆破处理普洱茶提取的普洱茶多糖组小鼠体重为34.18±1.49g。可以看到，经蒸汽爆破处理普洱茶提取的普洱茶多糖对小鼠体重增长的抑制作用比未经蒸汽爆破处理普洱茶提取的普洱茶多糖明显更好。
图9为给药期间各组小鼠体重的增加量，可以看到模型组小鼠的体重增加远远高于其他组，与其他组存在显著性的差异；经蒸汽爆破处理普洱茶提取的普洱茶多糖组小鼠的体重增加量比未经蒸汽爆破处理普洱茶提取的普洱茶多糖组小鼠的体重增加量明显更少。而且，图10显示各组小鼠的每日进食情况差不多，说明给予普洱茶多糖对小鼠的食欲影响不大。
表12显示了普洱茶多糖对肥胖小鼠肝脏系数、附睾脂肪系数、肾周脂肪系数以及棕色脂肪系数的影响。如表12所示，与正常对照组相比，模型组小鼠的肝脏系数、附睾脂肪系数、肾周脂肪系数以及棕色脂肪系数都显著升高。给予普洱茶多糖后，肥胖小鼠的肝脏系数、附睾脂肪系数、棕色脂肪系数以及棕色脂肪系数明显下降，与模型组差异显著。其中，经蒸汽爆破处理普洱茶中提取的普洱茶多糖组小鼠的肝脏系数、附睾脂肪系数、肾周脂肪系数、棕色脂肪系数比未经蒸汽爆破处理普洱茶提取的普洱茶多糖组更低，说明经蒸汽爆破处理普洱茶提取的普洱茶多糖的降低脏器和脂肪系数的效果更好。
表12普洱茶多糖对小鼠脏器及脂肪系数的影响
注：不同字母代表差异显著，字母相同代表差异不显著
图11为葡萄糖耐量测定的结果。由图可知，模型组的血糖值在各个时间段都显著高于其他组，说明高脂诱导的肥胖使小鼠体内血糖升高。给予普洱茶多糖的2个组在注射完葡糖糖溶液后的15min，血糖值开始迅速上升，在30min后，各个组的血糖值逐渐下降，但是模型组的下降速度缓慢。在60min时，正常对照组与普洱茶多糖组的血糖水平都恢复到了原始水平，但是模型组小鼠的血糖则还处于一个较高的水平，在120min时仍未恢复到初始水平，说明肥胖小鼠对血糖的调节能力降低。通过葡萄糖耐量的曲面下面积图也可以看到，模型组的曲面下面积显著高于正常对照与普洱茶多糖的2个给药组，其中经蒸汽爆破处理普洱茶提取的普洱茶多糖组的曲面下面积与正常对照组类似。说明普洱茶多糖给药可以有效改善肥胖小鼠的血糖调节能力，显著提高肥胖小鼠对葡萄糖的耐受能力，其中，经蒸汽爆破处理普洱茶提取的普洱茶多糖的血糖调节能力更好。
图12为胰岛素耐量测定的结果。由图可知，模型组小鼠各时间点的血糖值显著高于其他组。在腹腔注射30min时，所有小鼠的血糖由于受到胰岛素的抑制作用，迅速下降，在60min时下降到最低点，60min后血糖有出现逐渐上升给的趋势。到120min时各组小鼠的血糖值基本都恢复到的初始水平。通过曲线下面积可以看出模型组的曲线下面积高于其他组，且存在显著差异，说明肥胖小鼠存在胰岛素抵抗。而给予普洱茶多糖后能明显改善肥胖小鼠的胰岛素抵抗，促进葡糖糖的利用与摄取，使小鼠血糖值处于稳定水平，且经蒸汽爆破处理普洱茶提取的普洱茶多糖较未经蒸汽爆破处理普洱茶提取的普洱茶多糖效果更好。
图13显示了普洱茶多糖对肥胖小鼠血脂水平的影响。由图可知，模型组的TC、TG、LDL-C水平显著高于其他组，而HDL-C水平则显著低于其他组。2种普洱茶多糖组小鼠的TC、TG、LDL-C水平均较模型组显著下调，HDL-C的含量显著提高，与空白对照组相近。说明普洱茶多糖给药可以明显降低TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，从而使高脂饮食小鼠的血脂水平恢复至正常。其中，经蒸汽爆破处理普洱茶提取的普洱茶多糖较未经蒸汽爆破处理普洱茶提取的普洱茶多糖的调节血脂效果更好。
图14显示了普洱茶多糖对肥胖小鼠血清中炎症因子的影响。由图可知，在肥胖小鼠血清中，TNF-α、IL-1β与IL-6三种促炎因子在模型组中的含量显著高于空白对照组与普洱茶多糖给药组，普洱茶多糖给药可以显著降低炎症因子TNF-α、IL-1β与IL-6的含量，进而改善肥胖，其中，经蒸汽爆破处理普洱茶提取的普洱茶多糖较未经蒸汽爆破处理普洱茶提取的普洱茶多糖的调节血脂效果更好。
综上，本发明以经蒸汽爆破处理后的普洱茶粉末为原料，以普洱茶多糖的提取率为考察指标，通过单因素实验结合Box-Behnken中心组合设计-响应面法优化了回流提取普洱茶多糖的最佳提取工艺条件，主要包括料液比、提取温度和提取时间和提取次数，并进行适当调整，最终确定提取温度100℃，提取时间1.5h，固液比为1：20为最佳提取工艺参数，在此条件下进行三次验证试验，普洱茶多糖的提取率为16.67±0.13％。
本发明进一步采用经蒸汽爆破处理的普洱茶提取的普洱茶多糖与未经蒸汽爆破处理的普洱茶提取的普洱茶多糖进行比较，考察其降脂减肥活性。结果表明，经蒸汽爆破处理和未经蒸汽爆破处理的普洱茶提取的普洱茶多糖均能显著降低肥胖小鼠的体重增长率，减缓体重增长，降低脏器指数，抑制脂肪累积和肝脏脂肪变性，改善小鼠糖耐量和胰岛素抵抗，降低血清总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)水平，升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)水平，显著降低血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。其中，经蒸汽爆破处理的普洱茶提取的普洱茶多糖的降低体重增长率、降低脏器指数、降低血清TC、TG和LDL-c水平，升高HDL-c水平，降低血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平的效果较未经蒸汽爆破处理的普洱茶提取的普洱茶多糖好。在本发明提取方案下制备的普洱茶多糖具有显著的降脂减肥活性，具有开发为降脂减肥药物或功能食品的巨大潜力。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种普洱茶多糖的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)普洱茶预处理：将普洱茶复水处理；
(2)蒸汽爆破处理：将普洱茶进行蒸汽爆破处理，压力为0.3-1.8Mpa，保压时间为30-180s，得到普洱茶粉；
(3)去除脂溶性化合物：将步骤(2)处理后的普洱茶粉经烘干、粉碎、过筛后，加入乙醇，90℃回流提取1-2次，每次1-3h，离心后收集沉淀，置于真空干燥箱中干燥；
(4)加热回流：将步骤(3)干燥后的普洱茶粉进行加热回流提取，按照固液比1:10～1:30加入蒸馏水，采用75-100℃的热水浸提，反复浸提1～3次，每次1-3h，合并提取液，过滤，收集滤液；
(5)乙醇沉淀：将步骤(4)收集到的滤液减压浓缩至原体积的10-20％，加入3-5倍体积的乙醇，沉淀过夜，离心，收集沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀2-3次，得普洱茶粗多糖；
(6)除蛋白：将所述普洱茶粗多糖复溶于水中，将此水溶液与Sevage溶剂按体积比为3:1混合，收集上清液，重复处理2-5次；
(7)冷冻干燥：合并步骤(6)的上清液，冷冻干燥，得到普洱茶多糖粉末。
2.根据权利要求1所述的一种普洱茶多糖的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，采用普洱熟茶的粗茶、老茶或茶末，预处理为将普洱茶隔夜复水处理，调整含水率至20-40％。
3.根据权利要求1所述的一种普洱茶多糖的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的蒸汽爆破压强为1.2MPa，保压时间为120s。
4.根据权利要求1所述的一种普洱茶多糖的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，普洱茶粉的烘干采用鼓风干燥，烘干温度为50-70℃，所述普洱茶粉碎后过60目筛；所述乙醇的质量浓度为70-100％，按照g:mL计，普洱茶细粉与70-100％乙醇的用量比为1:5-10。
5.根据权利要求1所述的一种普洱茶多糖的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，提取温度为100℃，提取时间1.5h，固液比为1：20。
6.根据权利要求1所述的一种普洱茶多糖的制备方法，其特征在于：步骤(6)中，Sevage溶剂为氯仿-正丁醇(4:1，v/v)的混合溶液。
7.根据权利要求1所述的一种普洱茶多糖的制备方法，其特征在于：制备方法经过响应面优化方法，普洱茶多糖的提取率Y对提取温度A、提取时间B、固液比C三个因素的回归方程为：
Y＝13.53+1.28*A+0.2*B+0.053*C-0.28*A*B-8.750E-003*A*C+0.39*B*C+0.098*A2-1.0
4*B2-0.37*C2。
8.一种普洱茶多糖，其特征在于：采用如权利要求1-7任一项方法制备而成。
9.如权利要求8所述的一种普洱茶多糖的应用，其特征在于：用于具有降脂减肥功能的药品或保健食品。
10.根据权利要求9所述的，其特征在于：用于胶囊剂、片剂、口服液、压片糖果或冲泡粉剂型。
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